univerza v ljubljani - ffa.uni-lj.si · 5.3.2 sarkoidoza ... krvi vezan na dbp, nato se odcepi ter...
TRANSCRIPT
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
NATAŠA PLAVLJANIĆ
PRIMERJAVA ENCIMSKOIMUNSKE IN RADIOIMUNSKE METODE ZA
DOLOČANJE 1,25 – (OH)2 VITAMINA D V PLAZMI
COMPARISON OF ENCIME – LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY AND
RADIOIMMUNOASSAY FOR DETERMINATION OF 1,25 – (OH)2 VITAMIN D
IN PLASMA
DIPLOMSKA NALOGA
Ljubljana 2008
Diplomsko nalogo sem opravljala v Laboratoriju za analitiko hormonov in tumorskih
markerjev Kliničnega inštituta za kemijo in biokemijo v Ljubljani pod mentorstvom doc.
dr. Milana Skitka, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom dr. Aleša Jerina, univ.
dipl. kem., spec. med. biokem..
Zahvaljujem se svojemu mentorju doc. dr. Milanu Skitku, mag. farm., spec. med. biokem.
za presojo in pregled dela, somentorju dr. Alešu Jerinu, univ. dipl. kem., spec. med.
biokem., ki mi je svetoval in me usmerjal pri izdelavi diplomske naloge.
Zahvaljujem pa se tudi Stanki Cankar, dipl. inž. lab. biomed. za pomoč pri izvedbi
praktičnega dela diplomske naloge.
Posebna zahvala pa gre mojim staršem in domačim, ki so mi omogočili študij in me
podpirali, spodbujali in mi potrpežljivo stali ob strani.
IZJAVA:
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod vodstvom mentorja doc. dr.
Milana Skitka, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorja dr. Aleša Jerina, univ. dipl.
kem., spec. med. biokem..
Ljubljana, 2008 Nataša Plavljanić
Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Vojko Kmetec
Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak
Kazalo vsebine:
SEZNAM OKRAJŠAV.................................................................................................................................- 2 - II. UVOD.......................................................................................................................................................- 3 -
1. SPLOŠNO O VITAMINU D ..................................................................................................................- 3 -
2. METABOLIZEM VITAMINA D ..........................................................................................................- 3 -
3. DNEVNE POTREBE VITAMINA D IN VSEBNOST V HRANI.......................................................- 5 -
4. BOLEZNI POVEZANE Z POMANJKANJEM VITAMINA D .........................................................- 7 - 4.2 KONGENITALNA HIPOFOSFATEMIJA........................................................................................- 9 - 4.3 OSTEOMALACIJA ...........................................................................................................................- 9 - 4.4 OSTEOPOROZA ...............................................................................................................................- 9 - 4.5 HIPOPARATIROIDIZEM ...............................................................................................................- 11 - 4.6 HIPERPARATIROIDIZEM.............................................................................................................- 12 -
4.6.2 Sekundarni hiperparatiroidizem................................................................................................- 13 - 5.1 TOKSIČNOST VITAMINA D IN KALCIFEDIOLA .....................................................................- 14 -
5.3.1 Granulomatozne bolezni ...........................................................................................................- 14 - 5.3.2 Sarkoidoza ................................................................................................................................- 15 -
6. FUNKCIJA VITAMINA D V LEDVICAH ........................................................................................- 15 - 6.1 BOLEZNI POVEZANE Z VITAMINOM D IN LEDVICAMI.......................................................- 15 -
6.1.1 Toksičen vpliv vitamina D na ledvice.......................................................................................- 15 - 6.1.2 Poškodba ledvic ........................................................................................................................- 16 - 6.1.3 Ostale bolezni: ..........................................................................................................................- 16 -
7. METODE ZA DOLOČANJE VITAMINA D.....................................................................................- 16 - 7.1.2 IMUNOLOŠKE METODE, KI TEMELJIJO NA REAKCIJI ANTIGEN - PROTITELO......- 18 - 7.1.3 RADIOIMUNOLOŠKA METODA ( RIA ).............................................................................- 18 - 7.1.4 ENCIMSKO IMUNSKA METODA ( ELISA ) .......................................................................- 19 -
III. NAMEN DELA.....................................................................................................................................- 25 - METODE IN MATERIALI ........................................................................................................................- 26 -
1. VZORCI.................................................................................................................................................- 26 - 2.1 ELISA METODA.............................................................................................................................- 27 -
NAMEN UPORABE .........................................................................................................................- 27 - PRINCIP TESTA...............................................................................................................................- 27 - ANALITČNA OBČUTLJIVOST......................................................................................................- 28 - NATANČNOST ................................................................................................................................- 28 - ANALITIČNA SPECIFIČNOST ......................................................................................................- 28 - OPOZORILA IN ROKOVANJE.......................................................................................................- 28 - VAKUUMSKA POSODA VAC ELUT SPS 24 VARIAN INC .......................................................- 30 - IZRAČUN REZULTATOV ..............................................................................................................- 33 - ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI...........................................................................- 34 - OMEJITVE POSTOPKA ..................................................................................................................- 34 - KONTROLA KAKOVOSTI .............................................................................................................- 34 -
2.2 RIA METODA .................................................................................................................................- 35 - NAMEN UPORABE .........................................................................................................................- 35 - PRINCIP TESTA...............................................................................................................................- 35 - ANALITIČNA OBČUTLJIVOST.....................................................................................................- 35 - NATANČNOST ................................................................................................................................- 35 - ANALITIČNA SPECIFIČNOST ......................................................................................................- 36 - 1470 WALAC WIZARD GAMA ŠTEVEC GMI INC .....................................................................- 36 - POTEK ANALIZE ............................................................................................................................- 38 - IZRAČUN REZULTATOV ..............................................................................................................- 41 -
ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI...........................................................................- 41 - OMEJITVE POSTOPKA ..................................................................................................................- 41 - KONTROLA KAKOVOSTI .............................................................................................................- 42 -
IV. PREGLED REZULTATOV ..............................................................................................................- 43 -
1. STATISTIČNO VREDNOTENJE METOD.......................................................................................- 43 - A.) Aritmetična sredina ..........................................................................................................................- 43 - B.) Standardna deviacija.........................................................................................................................- 43 - C.) Koeficient variacije...........................................................................................................................- 43 - D.) Passing in Bablok regresija...............................................................................................................- 43 - E.) Primerjava metod po Bland Altmanu................................................................................................- 44 - F.) t test...................................................................................................................................................- 45 -
2. IZRAČUN REZULTATOV .................................................................................................................- 45 - ELISA METODA...................................................................................................................................- 45 - RIA METODA .......................................................................................................................................- 46 -
3. PRIMERJAVA KONCENTRACIJ MED METODAMA .................................................................- 48 - V. RAZPRAVA...........................................................................................................................................- 49 - VI. SKLEP ..................................................................................................................................................- 52 - VII. VIRI IN LITERATURA ......................................................................................................................- 53 -
Literatura slik:...........................................................................................................................................- 54 - Kazalo slik:
Slika 1: Ergokalciferol - vitamin D2 in holekaciferol - vitamin D3 ..............................................................- 3 - Slika 2: Aktivacija vitamina D3 ....................................................................................................................- 4 - Slika 3: Ukrivljene noge zaradi rahitisa ........................................................................................................- 8 - Slika 4: prerez vretenc pri zdravem človeku in pri hudi osteoporozi ..........................................................- 10 - Slika 5: Zlom na vretencih in zlom kolka pri osteoporozi...........................................................................- 11 - Slika 6: Indirektna ˝Sendvič ˝ELISA...........................................................................................................- 20 - Slika 7: Analizator Personal Lab .................................................................................................................- 29 - Slika 8: Vac Elut SPS 24.............................................................................................................................- 30 - Slika 9: Walac Wizard gama števec ............................................................................................................- 36 - Slika 10: Passing in Bablok regresijska premica .........................................................................................- 44 - Slika 11: Bland Altman ...............................................................................................................................- 44 - Slika 12: Standardna krivulja za ELISA metodo.........................................................................................- 46 - Slika 13: Standardna krivulja za RIA metodo .............................................................................................- 47 - Kazalo tabel:
Tabela 1: Viri vitamina D v hrani..................................................................................................................- 6 - Tabela 2: Material prisoten v kompletu.......................................................................................................- 31 - Tabela 3: Material prisoten v kompletu.......................................................................................................- 37 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
I. POVZETEK
Vitamin D je antirahitični vitamin, ki ga pogosto imenujemo ˝vitamin sonca˝, saj je
ultravijolična svetloba odgovorna za njegovo produkcijo. Lahko nastaja v koži pod
vplivom ultravijolične svetlobe ( endogeni vir vitamina D ) ali pa ga vnašamo v telo s
prehrano ( eksogeni vir vitamina D ). Če je dovolj sonca, se sintetizira v koži iz
provitamina D in ga v idealnih okoliščinah ni potrebno vnašati v telo s hrano. Vitamin D
pa lahko vnašamo v telo tudi s prehrano, ki vsebuje naravno nizke ravni vitamina D2 ( npr.:
mleko, maslo, kosmiči z dodatkom vitamina D), ali pa z prehranskimi dopolnili, ki so
pripravljeni in se dobijo v trgovinah, ter s terapevtskimi formulacijami vitaminov D2. Vit.
D lahko prepreči ali pa zdravi rahitis.
Vit. D sam po sebi ni dejaven, ko stopi v krvni obtok. Biološko dejavnost dobi šele z
kompleksnim nizom v presnovi. Skupaj z PTH regulira homeostazo kalcija v plazmi.
Pospešuje absorpcijo kalcija in fosfatov in je nujno potreben za normalno rast in
mineralizacijo kosti in zob.
Pri tej diplomski nalogi smo določali koncentracijo 1,25-(OH)2 D v serumu z dvema
metodama; in sicer z encimskoimunsko metodo in radioimunsko metodo. Pri obeh
metodah smo uporabili iste vzorce, saj smo hoteli metodi primerjati med seboj in ugotoviti
katera metoda je zanesljivejša in enostavnejša za uporaba ter katera je boljša. Do sedaj se
je za določanje 1,25-(OH)2 D uporabljala radioimunska metoda, pri kateri se uporabljajo
radioaktivni izotopi, ki so zdravju škodljivi in nevarni. Zato smo poizkusili ali bi
encimskoimunska metoda lahko nadomestila radioimunsko metodo.
Dobljeni rezultati so pokazali, da metodi ne dajeta enakih rezultatov. Da bi ugotovili,
katera metoda je boljša, smo pri vrednotenju rezultatov upoštevali kontrolni karti obeh
metod. Radioimunska metoda se je izkazala za bolj zanesljivo kot encimskoimunska
metoda.
Na podlagi eksperimentalnega dela smo zaključili, da encimskoimunska metoda ne more
nadomestiti dolgoletno in preverjeno radioimunsko metodo.
- 1 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
SEZNAM OKRAJŠAV
VDR – vitamin D receptor
1,25-(OH)2 D – 1,25-dihidroksivitamin D
Vit. D – vitamin D
PTH – paratiroidni hormon
iPTH – imunoreaktivni paratiroidni hormon
Ag – antigen
Ab – protitelo
TMB – tetrametilbenzidin
NSB – kalij fosfatni želatinski pufer
GAR precipitacijski kompleks- kozji proti kunčji precipitacijski kompleks
DBP - vitamin D vezujoči protein
MEN - multipla endokrina neoplazija
DHH - družinska hipokalciurična hiperkalcemija
µg - mikrogram
µL - mikroliter
- 2 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
II. UVOD
1. SPLOŠNO O VITAMINU D
Vitamin D je edini vitamin, ki ga telo lahko proizvede samo, in sicer s pomočjo obsevanja
kože z ultravijolično svetlobo. Človeške potrebe po vitaminu D zadovolji že 10 do 15
minutno izpostavljanje soncu 2 do 3 krat na teden. Ljudje, ki živijo bolj severno ali pa so
pretežno v zaprtih prostorih, so manj izpostavljeni soncu, si lahko dovolj vitamina D
zagotovijo le z ustrezno prehrano ali pa z jemanjem vitaminskih dopolnil.
Vitamin D je netopen v vodi, topi pa se v maščobi, alkoholu, kloroformu,etru in
rastlinskih oljih. Pospešuje absorpcijo kalcija in fosforja iz prebavnega sistema in vpliva na
nalaganje in absorpcijo kalcija v kosteh. Potreben je za normalno rast in mineralizacijo
kosti in zob. 1
2. METABOLIZEM VITAMINA D
Vitamin D se uvršča med vitamine, čeprav gre za hormon (zaradi steroidne strukture in
načina delovanja). Obravnava se kot prohormon z različnimi aktivnimi metaboliti, ki
delujejo kot hormoni. Najučinkovitejši obliki, ki se uporabljata v terapevtske namene sta
vitamina D2 - ergokalciferol in D3 - holekalciferol. 1
Slika 1: Ergokalciferol - vitamin D2 in holekaciferol - vitamin D3
- 3 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Koža
Holekalciferol (vitamin D3)
jetra
inhibicija
25 – hidroksiholekalciferol
aktivacija
ledvice Paratiroidni hormon
1,25 – dihidroksikalciferol
Intestinalni epitelij
Kalcij Kalcij stimulirajoča alkalna fosfataza
vezoči ATP-aza
protein
Inhibicija
Intestinalna apsorbcija kalcij
Plazemska koncentracija kalcijevih ionov
Slika 2: Aktivacija vitamina D3
Ergokalciferol oz. vitamin D2 je antirahitična substanca, ki se pridobiva z ultravijoličnim
sevanjem iz ergosterola (sterol v glivicah in kvasovkah). To je glavna naravna oblika
vitamina D v rastlinah. Rastlinojedci uporabljajo vitamin D2 kot glavni vir vitamina D.
- 4 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Lahko se metabolizira v različne oblike, ki predstavljajo analoge vitamina D3. ena od teh
oblik je tudi hormonsko aktivna oblika vitamina D2 1,25 – dihidroksivitamin D.
Vitamin D3 – holekalciferol nastaja v koži z fotolizo pod vplivom UV- radiacije ( β žarki)
iz 7 – dehidroholesterola, ki je normalno prisoten v koži. Ko je koža izpostavljena soncu,
pride do razčlenitve B-obroča v steroidni strukturi, pri čemer se tvori provitamin D3, ki se
spontano izomerizira v vitamin D3.
Holekalciferol se v jetrih aktivira in se v procesu 25 – hidroksilacije pretvori v kalcifediol
oz. 25 – hidroksiholekaciferol. Kalcifediol lahko s povratno zvezo inhibira reakcijo
pretvorbe, ta povratna zveza pa je pomembna zaradi zelo natančnega nadziranja
koncentracije kalcifediola v plazmi ter zaradi nadziranja pretvorbe vitamina D3 v
kalcifediol. V taki obliki pa se v jetrih skladišči za nadaljnjo uporabo.
V procesu 1α – hidroksilacije se kalcifediol nadalje hidroksilira v glavno biološko aktivno
obliko kalcitriol ( 1,25- dihidroksiholekalciferol). Do te hidroksilacije pride v proksimalnih
tubulih ledvic. Ta oblika je najaktivnejša oblika vitamina D. Kalcitriol nekaj časa potuje po
krvi vezan na DBP, nato se odcepi ter vstopi v tarčno celico z difuzijo in prid v stik z
VDR. Kalcitriol se veže s transkripcijskim faktorjem, ki regulira gensko ekspresijo
transportnih proteinov, ki so vključeni v absorpcijo kalcija v črevesju. Rezultat tega je
vzdrževanje koncentracije kalcijevih in fosfatnih ionov v krvi in kosteh. Pri tem pa še
sodelujeta paratiroidni hormon in kalcitonin. Če ledvice odstranimo, vitamin D izgubi ves
svoj učinek. Če ni PTH-ja je tvorba kalcitriola popolnoma prekinjena, zato PTH močno
vpliva na funkcionalne učinke vitamina D v organizmu. 2
3. DNEVNE POTREBE VITAMINA D IN VSEBNOST V HRANI
Izpostavljanje kože sončni svetlobi zagotovi 80 – 90 % potrebne količine vitamina D.
zadostuje že kratek čas na soncu, in sicer 5-10 min 2-3 krat na dan, ta pa je odvisen tudi od
tipa kože, starosti in prisotnosti UVB radiacije. Izpostavljeni morajo biti roke, obraz in
hrbet. Če uporabljamo kreme z visokimi zaščitnimi faktorji, ne pride do sinteze vitamina
D, prav tako pa je sinteza zmanjšana ob slabem vremenu in v zimskem obdobju.
- 5 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Ko se proizvede dovolj vitamina D, se dodatni vitamin D pretvori v neaktivno obliko in
se skladišči v telesu. Prekomerno izpostavljanje soncu ne poveča nivoja vitamina D,
poveča pa tveganje za dolgotrajne poškodbe kože.
Tabela 1: Viri vitamina D v hrani
HRANA VSEBNOST VITAMINA D V µg
Losos ( kuhan ) 9
Sardine v olju 6,25
Tuna v olju 5
Mleko obogateno z vitaminom D,
en kozarec
2,45
Margarina ( 1 žlica) 1,5
Fruchtzwerge 2 lončka( 100 g ) 1,25
Ementalec ( 1 rezina ) 1,10
Jajce (v rumenjaku) 0,5
Mleko, 1 kozarec 023
Jogurt ( 125 g) 0,08
Ribje olje polenovke 1 žlica 0,034
Vitamin D pa se nahaja tudi v kosmičih in mleku z dodatkom vitamina D in v prehranskih
dopolnilih, ki so že pripravljena ( AD3 kapljice, Alpha D3, Plivit D3, Rocatrol).
Priporočene dnevne količine vnosa vitamina D v telo so:
200 – 600 IE na dan oz.
5 – 15 µg na dan
Zgornja meja tolerance vitamina D pa znaša 2000 IE oz. 50 µg na dan, kar je 10 krat
povečana normalna priporočena količina.
Do pomanjkanja vitamina D ponavadi pride zaradi neustrezne prehrane, premalo
izpostavljanja sončni svetlobi, upočasnjene absorpcije, povišanje izločanja ter ob
- 6 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
nezmožnosti pretvorbe v ledvicah. Pri dojenčkih in v otroštvu pomanjkanje vitamina D
povzroča rahitis, pri odraslih pa pomanjkanje tega vitamina povzroča mehčanje kosti.
Prevelika količina vitamina D pa povzroča zmanjšanje apetita, telesne teže, morsko
bolezen, glavobol, depresijo in pa prenakopičenje kalcija v mladosti. 4
4. BOLEZNI POVEZANE Z POMANJKANJEM VITAMINA D
Večjo možnost za razvoj pomanjkanja vitamina D imajo starejši ljudje ( nad 50 let ), saj
je pri starejših zmanjšana sposobnost pretvorbe 7 – dehidroholesterola v provitamin D3 v
koži. Prav tako pa tudi ledvice, ki pretvarjajo kalcifediol v aktivno obliko ne delujejo
brezhibno kot pri mladih ljudeh. Za pomanjkanjem vitamina D pa trpijo tudi ljudje, ki niso
dovolj izpostavljeni sončni svetlobi. Tem ljudem se zato priporoča jemanje nadomestkov
vitamina D kot so šumeče tablete ali pa prehranska dopolnila, ki vsebujejo vitamin D. 1
4.1 RAHITIS
Ob pomanjkanju vitamina D se pojavi rahitis, saj je proces v kosteh skoraj prekinjen. Gre
za nezadostno mineralizacijo kosti, ki je posledica pomanjkanje kalcijevih in fosfatnih
ionov v ekstracelularni tekočini. Pojavlja se samo pri otrocih, ki jim kosti še rastejo. Zaradi
vse pogostejše uporabe nadomestkov vitamina D, so problemi v povezavi z rahitisom pri
otrocih vse redkejši.
Rahitis se pojavlja večinoma spomladi, saj se vitamin D ustvarjen prejšnje poletje, ki se
je skladiščil v jetrih, porabi preko zime. Absorpcija kalcija in fosforja iz kosti pod vplivom
PTH, lahko za nekaj časa prepreči klinične znake vitamina D.
Pri rahitisu se v plazmi rahlo zniža koncentracija kalcija, veliko bolj pa se zniža
koncentracija fosfata. Do takšnih razlik pride, ker paratiroidne žleze preprečujejo, da bi se
koncentracija kalcija znižala in ob najmanjšem znižanju koncentracije povečajo absorpcijo
kalcija iz kosti. To pa ni zadosten regulacijskih sistem, ki bi preprečeval znižanje vrednosti
fosfata, in zato povečano delovanje paratiroidnih žlez pravzaprav poveča izločanje fosfatov
preko urina.
Pri dolgotrajnem rahitisu se zaradi kompenzacijskega povečanja izločanja PTH pretirano
poveča demineralizacija kosti. Posledica tega je, da kosti slabijo. Kost postaja vedno
šibkejša, ker osteoblasti izgubljeno kostno maso nadomeščajo z osteidom, ki pa se zaradi
- 7 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
pomanjkanja kalcija in fosfata ne more mineralizirati. To vse pa vodi v motnje razvoja in
hude deformacije kosti.
V zgodnjih fazah rahitisa se tetanija ne pojavi skoraj nikoli. Paratiroidne žleze konstantno
stimulirajo osteoklastno absorpcijo iz kosti in s tem vzdržujejo normalno koncentracijo
kalcija v ekstracelularni tekočini. Ko se zaloge kalcija v kosteh izčrpajo toliko, da vrednost
kalcija v krvi pade pod 1 mmol/L se običajno razvijejo znaki tetanije. Otrok lahko umre
zaradi tetaničnega krča laringealnih ( respiratornih ) mišic, zato mu je potrebno
intravenozno vbrizgati kalcij, ki takoj prepreči tetanijo.
Simptomi:
- mišični krči
- počasnejše zaraščanje lobanjskih kosti
- hrbtenična krivina je pri otrocih od enega do štirih let nenormalna
- noge so ukrivljene
- otroci shodijo pozneje
- starejše otroke in mladostnike med hojo boli
- zaradi sploščitve medeničnih kosti in zoženja porodnih poti pri mladostnicah pozneje
oteženo rojevanje
Slika 3: Ukrivljene noge zaradi rahitisa
Terapija pri rahitisu pomeni po eni strani priskrbeti zadostne količine kalcija in fosfata v
prehrani, po drugi strani pa dodati zadostne količine vitamina D. Če vitamin D ni dodan, se
le majhne količine kalcija in fosfata absorbirajo iz črevesja.
- 8 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
4.2 KONGENITALNA HIPOFOSFATEMIJA
Kongenitalna hipofosfatemija ali vitamin D rezistenten rahitis je vrsta ledvične bolezni, ki
izzove rahitis in osteomalacijo. Nastane kadar je absorpcija fosfata v ledvičnih tubulih
zmanjšana. Pri ljudeh, ki so jim odstranili ledvico ali je bila ta poškodovana in se zdravijo s
hemodializo, lahko izzove hude zaplete. To obliko rahitisa zdravimo z fosfatnimi
substancami in ne s kalcijem in vitaminom D.
4.3 OSTEOMALACIJA
Osteomalacija je rahitis odraslih. Tu gre za mehčanje, slabljenje in demineralizacijo kosti
zaradi pomanjkanja vitamina D. Ker imajo odrasli že zgrajen skelet, ne potrebujejo toliko
kalcija in vitamina D kot otroci. Osteomalacija tako nastopi le, če je resno motena
absorpcija maščob ( steatoreja ). Občasno je absorpcija kalcija in fosfata pri odraslih tako
slaba, da se lahko pojavi rahitis. Ta praktično nikoli ne napreduje do tetanije, vseeno pa
težko poškoduje kosti. Klinični znaki osteomalacije so oslabelost kosti ( gumijasta
konsistenca ), zelo redko pa pride do tetanije. Najpogostejši vzrok za slabšo absorpcijo
vitamina D so nekatera zdravila
( antikonvulzivi, holestiramin), za moteno črevesno absorpcijo fosfatov ali ledvično
reasorpcijo pa toksične snovi ( aluminij, kadmij, fluoridi).
Poznamo še ledvični rahitis, ki je tip osteomalacije, ki nastane kot posledica
dolgotrajnega obolenja ledvic ( ledvična insuficienca, ledvična odpoved ). Glavni vzrok
tega stanja je predvsem nezmožnost ledvic, da tvori 1,25 – dihidroksiholekalciferol. Pri
ljudeh, ki so jim odstranili ledvico ali pa je ta bila poškodovana in se zdravijo z
hemodializo, pojav ledvičnega rahitisa predstavlja hud zaplet. Pojavi se lahko tudi
hipokalcemija. 4
4.4 OSTEOPOROZA
Je najpogostejše obolenje kosti pri odraslih, še posebej pogosta pa je v visoki starosti.
Definirana je kot zmanjšanje kostne mase na volumsko enoto kosti. Tej definicij ustreza
širok spekter motenj z različnimi vzroki, v ožjem smislu pa osteoporozo pojmujemo kot
bolezen, kjer je primarno moteno nastajanje organskega matriksa kosti.
- 9 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Slika 4: prerez vretenc pri zdravem človeku in pri hudi osteoporozi
Od osteomalacije in rahitisa se razlikuje prav po tem, da je primarno prizadeto nastajanje
organskega matriksa kosti, kot sekundarni učinek pa je zmanjšana mineralizacija kosti, saj
se ob izgubi kostnega matriksa kristali kalcijevega hidroksiapatita nimajo kam vezati. Pri
osteoporozi se aktivnost osteoblastov v kosteh običajno zniža, posledično pa je zmanjšano
tudi odlaganje osteoida. Včasih pa je vzrok za zmanjšanje kostnega tkiva tudi prekomerna
aktivnost osteoklastov. Osteoporoza je pogosta pri ženskah v postmenopavzalnem
obdobju, ker pomanjkanje estrogena pospeši kostno resorpcijo in zavre nalaganje osteoida,
s tem pa je onemogočeno nalaganje mineralov na organski kostni matriks. Vzroki za
osteoporozo so lahko dedni ali pa pridobljeni, pogosto pa so kombinirani.
Pridobljeni vzroki:
- fizična neaktivnost
- pomanjkanje vitamina C, ki nujen za nemoteno sintezo kolagena, ki je osnovna
sestavina organskega matriksa
- podhranjenost ( ne more se tvoriti zadosten proteinski matriks)
- zmanjšana sekrecija estrogena po menopavzi
- starost ( zmanjšana koncentracija rastnega hormona )
- Cushingov sindrom
- hipogonadizem pri moških
- alkohol
- 10 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Pri osteoporozi se pojavijo pogostejše frakture in deformacije, najhujša komplikacija pa je
zlom kolka.
Slika 5: Zlom na vretencih in zlom kolka pri osteoporozi
Diagnostika temelji na merjenju gostote kostne mase, kar naredimo z denziometrom, ki
deluje na osnovi rentgenskih žarkov. Merjenje je neboleče, sevanje pa je zanemarljivo
majhno. Osteoporozo lahko preprečimo z ustrezno zdravo prehrano, ki vsebuje veliko
kalcija, z redno telesno aktivnostjo oz. vadbo, na razpolago pa imamo tudi zdravila, kot so
hormoni, bifosfonati, kalcitonin, kalcij, vitamin D. Preprečimo pa jo tudi tako, da
prenehamo kaditi in z zmernim uživanjem alkohola. 4
4.5 HIPOPARATIROIDIZEM
Hipoparatiroidizem je stanje zmanjšanega izločanja obščitničnega hormona PTH, ki je
odgovoren za uravnavanje aktivnosti osteoklastov. Lahko je posledica kirurške odstranitve
obščitnice, genetske motnje, avtoimunske bolezni, Wilsonove bolezni ali zmanjšanega
odzivanja tarčnih celic na PTH. V primeru premajhnega izločanja postanejo osteoklasti
skoraj popolnoma neaktivni, kar privede do zmanjšane reabsorpcije kalcija iz kosti in
posledično do hipokalcemije. Izmed vseh mišic so na tetanični spazem najbolj občutljive
mišice grla.
Za zdravljenje hipoparatiroidizma se zelo redko uporablja PTH, ker je ta hormon zelo
drag, in deluje le nekaj ur, prav tako pa organizem zanj ustvarja protitelesa. Večinoma se
za zdravljenje uporablja vitamin D v velikih količinah ( 100000 IE na dan ) skupaj z
kalcijem v obliki kalcijevega glukonata ( 25 do 50 mmol), saj skupaj vzdržujeta
koncentracijo kalcija v telesnih tekočinah v normalni ravni. Včasih pa se namesto
- 11 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
inaktivnega vitamina D dodaja kalcitriol, saj je močnejši in deluje hitreje, vendar pa ta
povzroča tudi stranske učinke.
4.6 HIPERPARATIROIDIZEM
4.6.1 Primarni hiperparatiroidizem
Primarni hiperparatiroidizem nastane zaradi prekomerne produkcije in sproščanja PTH-ja
iz obščitnic. Pogostejši je pri ženskah, ker nosečnost in laktacija dražita paratiroidne žleze
in ustvarjata predispozicijo za razvoj tovrstnih tumorjev. Povzročijo ga lahko adenom,
karcinom ali pa difuzna hiperplazija.
1. Adenom
Je najpogostejši vzrok za nastanek primarnega hiperparatiroidizma. Večina paratiroidnih
adenomov prizadene posamezno žlezo. Tumorske celice obščitnic izločajo prevelike
količine PTH-ja, saj se na spremenjeno koncentracijo kalcija v krvi odzivajo slabše ali pa
se sploh ne odzivajo.
2. Karcinom obščitnic
Je zelo redek. Vaskularna ali kapsularna invazija s tumorskimi celicami je zelo dober
indikator malignosti, vendar ta karakteristika ni vedno prisotna. V večini primerov
podpirajo diagnozo lokalne ponovitve ali metastaze v jetrih, pljučih ali kosteh.
3. Paratiroidna hiperplazija
Ponavadi se nanaša na povečanja ali abnormalnosti vseh štirih žlez. Lahko je del
sindroma avtosomne dominantne multiple endokrine neoplazije ( MEN ) oz. družinske
hipokalciurične hiperkalcemije (DHH ). Gre za bolezen, kjer je gen za receptor. Ki je
občutljiv za kalcijeve ione mutiran. Ta receptor je izražen v različnih tkivih. V obščitnicah
zazna plazemsko koncentracijo kalcijevih ionov in določi koliko PTH-ja se izloči. V
ledvicah pa določa nivo ekskrecije kalcijevih ionov z urinom. Pri DHH je okvarjena
zmožnost receptorja za zaznavanje kalcijevih ionov v serumu, zato se kljub normalni
serumski koncentraciji kalcijevih ionov iz obščitnic izloča PTH, izločanje kalcijevih ionov
z urinom pa se zmanjša. Posledica tega je koncentracija kalcijevih ionov v serumu
- 12 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
povišana v urina pa znižana. DHH zajame vse štiri žleze, zato je v takih družinah povečana
možnost za nastanek raka na obščitnicah.
Obščitnice takih pacientov so tipično povečane. Prekomerno izločanje PTH-ja poveča
aktivnost osteoklastov, ki razgrajujejo kostnino. Posledično se koncentracija kalcijevih
ionov v ekstracelularni tekočini poveča, koncentracija fosfatnih ionov za zmanjša. PTH
zmanjša tudi reabsorpcijo bikarbonatnega iona v ledvicah, zato se njegova koncentracija v
ekstracelularni tekočini zniža in pride do metabolne acidoze.
Klinični znaki so pri večini bolnikov asimptomatski, pri nekaterih pa je klinična slika zelo
raznolika:
- težave s skeletom ( zlomi, kostne ciste )
- hiperkalcemija
- ledvični kamni
- metastatične kalcifikacije
- znaki depresije živčevja
- bruhanje
- poliurija
4.6.2 Sekundarni hiperparatiroidizem
Pojavlja se visoka vrednost PTH-ja, in sicer kot kompenzacijska reakcija na
hipokalcemijo, in ne nastaja zaradi primarne spremembe v obščitničnih žlezah. Pri
pacientih s kronično renalno okvaro se pojavlja veliko dejavnikov, ki prispevajo k
povečanju obščitnic. To pa vključuje zmanjšano produkcijo 1,25-dihidroksivitamina D,
zmanjšano absorpcijo kalcija v črevesju, odpornost na PTH in zadrževanje fosfata v
ledvicah. Če pa ne gre za renalno okvaro pa se sekundarni hiperparatiroidizem lahko
razvije zaradi pomanjkanja vitamina D ali kalcija.
Klinični znaki:
- pomanjkanje vitamina D → to vodi do osteomalacije
- velike količine izločenega PTH → to povzroča absorpcijo kostnine
Diagnostika hiperparatiroidizma temelji na merjenju koncentracije kalcijevih ionov v
serumu in na merjenju imunoreaktivnega PTH ( iPTH ). 1
- 13 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
5. BOLEZNI POVEZANE Z PREKOMERNO KOLIČINO VITAMINA D
Vitamin D ima v človeškem telesu dolgo razpolovno dobo in širok razpon distribucije.
Hrana in vitaminske tablete vsebujejo zelo majhne koncentracije vitamina D, da je
prekomeren odmerek v normalnih pogojih skoraj nemogoča. Prekomerni vnos pa lahko
vodi do hiperkalcemije in ateroskleroze. 1
5.1 TOKSIČNOST VITAMINA D IN KALCIFEDIOLA
Običajen vzrok, da pride do te toksičnosti je nepravilna uporaba farmakoloških sredstev,
zlasti kadar je vitamin D predpisan kot terapija, in sicer pri hipoparatiroidizmu, renalnih
motnjah, osteoporozi, osteomalaciji, … Lahko pa se pojavi tudi pri pretiranem jemanju
vitaminskih nadomestkov. Prevelika izpostavljenost soncu pa ne vpliva preveč na
toksičnost vitamina D. Drugi dejavniki, ki še vplivajo na to toksičnost so povečan vnos
kalcija s hrano, zmanjšana ledvična funkcija, dodajanje vitamina A in pa granulomatozne
motnje. 1
5.2 TOKSIČNOST KALCITRIOLA
Kalcitriol se uporablja za zdravljenje številnih metabolnih kostnih bolezni, saj ima
sposobnost zaviranja sinteze PTH. Tudi v tem primeru pride do toksičnosti zaradi
nepravilne uporaba farmakoloških sredstev. Dnevne doze nad 0,75 µg so lahko že toksične. 1
5.3 OBLIKE ENDOGENE TOKSIČNOSTI VITAMINA D
5.3.1 Granulomatozne bolezni
Bolniki z granulomatoznimi obolenji so preobčutljivi na vitamin D, zato se pri njih
razvije hiperkalcemija tudi brez pretiranega vnosa vitamina D. Ta sindrom je povzročen z
ektopično produkcijo 1,25-(OH)2 D toksičnosti. To toksičnost povzroča samo
granulomatozno tkivo. 1
- 14 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
5.3.2 Sarkoidoza
Je najbolj pogosta granulomatozna bolezen, ki je povezana s hiperkalcemijo. Pri tem
nastanejo v mnogih organih granulomi. Sarkoidni granulomi ustvarjajo aktivirani vitamin
D, ki stopnjuje vsrkavanje kalcija iz črevesa. Visoka koncentracija kalcija v krvi povzroči
izgubo apetita, slabost, bruhanje, žejo in čezmerno nastajanje seča. Pogosto se razvije tudi
hiperkalciurija. Če visoka koncentracija kalcija v krvi traja predolgo, povzroči nastanek
ledvičnih kamnov in posledično lahko tudi odpoved ledvic. 1
6. FUNKCIJA VITAMINA D V LEDVICAH
Ledvice imajo življenjsko pomembno funkcijo pri nadzoru kalcija in fosforja v plazmi. V
času 24-ih ur se 8g kalcija filtrira skozi glomerule, okoli 7,8g pa se ga reabsorbira v
proksimalnih in distalnih tubulih ter v Henleyjevi zanki. Koncentracija kalcija v urinu se
mora izenačiti s koncentracijo kalcija, ki se je absorbiral v tankem črevesju. Reabsorpcijo
kalcija v ledvicah kontrolirajo številni faktorji: celotna filtracija natrija, aktivnost številnih
hormonov, tok urina…
Ledvice predstavljajo mesto sinteze kalcitriola, ter izražajo številne proteine, ki so odvisni
od vitamina D kot so: Ca črpalka, natrij/kalcijev izmenjevalec in kalbindin-D, izražajo pa
tudi VDR, poleg tega pa še kalcifediol in kalcitriol. 1
6.1 BOLEZNI POVEZANE Z VITAMINOM D IN LEDVICAMI
6.1.1 Toksičen vpliv vitamina D na ledvice
Sposobnost koncentriranja urina je lahko zmanjšana , saj visoka koncentracija kalcija
spremeni delovanje vazopresina na ledvične tubule. Pojavi se lahko poliurija in posledično
tudi polidipsija. Prvi znak pojava toksičnosti vitamina D je hiperkalciurija, ki se pojavi
pred hiperkaclemijo.
- 15 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
6.1.2 Poškodba ledvic
Ledvice so tiste, ki vitamin D preoblikujejo v aktivno obliko kalcitriol. Če pride do
oslabitve ledvic, kosti ne dobijo dovolj kalcija, ker ledvice ne pretvarjajo zadostno količino
vitamina D v kalcitriol in pa ker se v krvi nabira preveč fosforja. Zato morajo bolniki s
poškodovanimi ledvicami jemati sintetični kalcitriol ali sintetični vitamin D.
6.1.3 Ostale bolezni:
- osteomalacija pri kronični napaki ledvic, povzročena z zmanjšano produkcijo vitamina D
in z zadrževanjem fosforja v ledvicah
- zastrupitev s PTH-jem in metastazne kalcifikacije
- tvorba ledvičnih kamnov pri hiperparatireoidizmu
7. METODE ZA DOLOČANJE VITAMINA D
7.1 IMUNOKEMIJSKE TEHNIKE
Odkar se je imunologija pojavila kot veja medicine pred več kot dvema stoletjema,
obravnava nove pristope k nadzorovanju nalezljivih bolezni pri človeku in živalih. Že od
začetka je bila obravnavana kot znanost, ki je tesno povezana z mikrobiologijo. Zdaj se je
imunologija razvila v eno od najbolj kreativnih vej medicine. Razumevanje mehanizma
imunskega sistema in imunoloških lastnosti patogenov je tlakovana pot za razvoj različnih
pristopov za izdelavo učinkovitih cepiv proti različnim človeškim in živalskim boleznim.
Prav tako pa razumevanje in znanje interakcij antigen protitelo v in vitro pogojih omogoča
razvoj različnih imunoloških testov, ki se uporabljajo za diagnostiko nalezljivih in tudi
nenalezljivih bolezni. Zelo velika natančnost interakcij antigen protitelo je vodila do
razvitja različnih, ekstremno uporabnih in visoko občutljivih imunokemijskih tehnik. 5
- 16 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
7.1.1 IMUNSKI SISTEM
V obrambo proti mikroorganizmom so večceličarji razvili specializirana, po telesu
razporejena obrambna tkiva, v katerih imunske celice prepoznavajo, uničujejo in
odstranjujejo te mikroorganizme. Med evolucijo so se razvile različne imunske celice, ki se
razlikujejo glede na mehanizem delovanja.
- fagocitne celice: najpreprostejše, fagocitoza
- limfociti: natančno prepoznajo tujke in ustrezno ukrepajo
- limfociti B
- limfociti T
- monociti
Antigen ( Ag )
Antigen je snov, ki v telesu oz. organizmu povzroči imunski odziv. Nanje se specifično
vežejo protitelesa, ki imajo specifična mesta – epitop, na katera se antigeni vežejo.
Protitelo (Ab )
Protitelo je topna glikoproteinska molekula, ki spada v skupino imunoglobulinov.
Sposobna je prepoznati tujek in se nanj vezati, ter s tem prepreči, da bi tujki škodovali
organizmu. Protitelesa razvrščamo v več razredov:
- IgG
- IgM
- IgA
- IgD
- IgE
Med seboj se razlikujejo po velikosti in po vlogi, ki jo imajo. Sestavljena so iz dveh lahkih
in dveh težkih verig. 11
- 17 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
7.1.2 IMUNOLOŠKE METODE, KI TEMELJIJO NA REAKCIJI ANTIGEN - PROTITELO
● precipitacijske tehnike
● aglutinacijski test
● radioimunološka metoda (RIA)
● encimsko imunska metoda (ELISA)
● encimsko oligonukleotidna metoda (ELOSA)
● imunoblotting
● fluorescenčna metoda
● …
7.1.3 RADIOIMUNOLOŠKA METODA ( RIA )
RIA se uporablja v biomedicinskem področju za raziskovanje in diagnostiko človeških in
živalskih bolezni. Ta tehnika omogoča hitro meritev antigena v pikogramih ter omogoča
relativno natančnost z uporabo radioaktivno označenih antigenov. RIA vključuje reakcijo
specifičnih protiteles z mešanico radioaktivno označenih in neoznačenih antigenov.
Označeni in neoznačeni antigeni med seboj tekmujejo za vezavo na protitelo. Po koncu
reakcije ločimo vezane in nevezane antigene, ter kvantitativno merimo radioaktivnost z
uporabo primernih standardov. Na ta način lahko ocenimo količino inhibicije od
radioaktivno označenega in neoznačenega antigena. Ker je test zelo občutljiv ga lahko
uporabljamo za kvantitativno določanje določenih proteinov, kot so encimi,
imunoglobulini, virusni proteini, hormoni, antibiotiki, steroidi, id… Pri tej metodi se
največ uporabljajo reagenti označeni z I125 ali I131. Oba izotopa emitirata energijo, ki jo
lahko detektiramo z scintilacijskim spektrofotometrom, ki je opremljen z detektorjem.
Direktna RIA
Če določamo antigen je protitelo označeno z radioizotopom in se inkubira in redči z
različnimi razredčitvami pripravkov, ki vsebujejo antigen. Če pa določamo protitelo pa
inkubiramo označen antigen z raztopinami, ki vsebujejo protitelo.
- 18 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Indirektna RIA
Pri tej metodi nista radioaktivno označena niti protitelo niti antigen. Označen pa je
antiglobulin oz. sekundarno protitelo, ki ga pripravimo z vbrizgavanjem Ig. Tako je
posredno primarna reakcija merjena s sekundarno imunološko reakcijo.
Kompetetivna RIA
Med reakcijo Ag-Ab nastane kompleks, ki je premo sorazmeren s koncentracijo Ag v
vzorcu. Nato dodamo standardno količino označenega Ag v reakcijsko zmes in re –
inkubiramo. Označen Ag reagira samo z preostalimi mesti na Ab, ki niso zasedena.
Količina označenih Ag povezanih z Ab so zato obratno sorazmerna količini Ag v vzorcu.
Najbolj pogosto za ločevanje označenih in neoznačenih reagentov uporabljamo centrifugo.
7.1.4 ENCIMSKO IMUNSKA METODA ( ELISA )
ELISA je eden od najbolj občutljivih in specifičnih imunskih metod za kvantitativno
določanje Ag in Ab. Princip metode je podoben RIA metodi, vendar tu namesto
radioaktivnega izotopa za označevanje imunskega kompleksa uporabimo encim. Za
določanje protiteles se uporablja indirektna ELISA, za določanje antigenov pa se uporablja
direktna ELISA.
Direktna ELISA
Pri direktni ELISI je označen encim konjugiran z bodisi Ag ali Ab specifičnim za Ag.
Mikrotitrsko ploščo je obloženo z antigenom inkubiramo z primarnimi protitelesi za Ag,
ki ga določamo. Prisotnost kompleks Ag – Ab detektiramo s pomočjo encima, in sicer
prvo kompleks speremo, da odstranimo nevezane Ag, dodamo substrat, ki ob prisotnosti
encima spremeni barvo, katere intenzivnost merimo. Koncentracija Ag in prisotnost
encima sta obratno sorazmerni. Največkrat se uporabljata encima peroksidaza in alkalna
fosfataza.
- 19 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Indirektna ELISA
Pri indirektni ELISI pa je encim pritrjen na Ab. Na nosilcu imamo vezan znan Ag.
Dodamo vzorec s Ab in speremo nevezana Ab. Nato dodamo še Ab, ki so označena z
encimom, ki se vežejo na že vezana Ab, in spet speremo, da odstranimo še nevezana
označena Ab. Na koncu dodamo substrat, ki ob prisotnosti encima spremeni barvo, katere
intenzivnost merimo.
1. vezano Ab na plošči
2. preiskovani Ag vezan na Ab
3. detekcijsko Ab vezano na kompleks
Ag –Ab
4. Ab označeno z encimom vezano na
detekcijsko Ab
5. sprememba barve zaradi prisotnosti
encima
Slika 6: Indirektna ˝Sendvič ˝ELISA
Kompetitivna ELISA
Kompetitivna ELISA se uporablja za določanje Ag. Prosti Ag in Ab se inkubirajo, da
nastane kompleks Ag – Ab. Ta kompleks vežemo na Ag, ki je vezan na nosilno ploščo. S
spiranjem odstranimo vse snovi, ki niso reagirale. Dodamo sekundarna Ab, ki so označena
z encimom. Na koncu pa spet dodamo substrat, da pride do barvne spremembe.
Koncentracija Ag in intenzivnost barve sta obratno sorazmerna. 5
- 20 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
7.2 KROMATOGRAFSKE METODE
Kromatografske metode opisujejo skupino laboratorijskih tehnik, kjer gre za separacijo
zmesi. V postopku kromatografije je možno spremljati, kako preiskovana zmes potuje
skozi mobilno in stacionarno fazo, pri tem pa se deli zmesi ločujejo in izolirajo, kar
omogoča, da jih lahko analiziramo in kvantitativno določamo. Kromatografija se lahko
uporablja v analitične metode za določanje prisotnosti in koncentracije analita v vzorcu,
lahko pa se uporablja tudi za ločevanje substanc iz zmesi. Te metode omogočajo ločevanje
in kvantitativno določanje substanc, ki imajo zelo podobne lastnosti. Ločevanje poteka
tako, da se substance razdelijo v dve fazi, v stacionarno in mobilno.
7.2.1 RAZDELITEV KROMATOGRAFSKIH METOD
Kromatografske metode se lahko razdelijo glede na različne kriterije: glede na fizično
stanje, obliko sistema in mehanizem ločevanja.
Kromatografske metode glede na fizično stanje:
- tekočinska kromatografija:
tekoča-tekoča LLC (porazdelitev)
tekoča-trdna LSC, PC, (adsorpcija)
tekoča-trdna IEC (ionska izmenjava)
tekoča-trda EC (izločitev)
- plinska kromatografija:
plin-tekoča GLC (porazdelitev)
plin- trdna GSC (adsorpcija)
Kromatografske metode glede na mehanizem ločevanja:
- ionsko izmenjevalna
- ločevanje glede na velikost substanc
- 21 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
7.2.2 HPLC
HPLC metoda je oblika tekočinske kolonske kromatografije, ki se uporablja za ločevanje
substance iz zmesi na osnovi kemijskih interakcij med substancami, ki jih analiziramo in
stacionarno fazo v koloni. Pri tej metodi pod visokim pritiskom substance potujejo skozi
kolono. V mobilno fazo se vnese majhna količina vzorca in na osnovi specifičnih
kemijskih in fizičnih interakcij prihaja do različnega zadrževanja substance v koloni. Čas
zadrževanja je odvisen od lastnosti substance, ki se analizairajo, od stacionarne faze in
sestave mobilne faze. Čas v katerem se eluira substance se imenuje retencijski čas, ta pa je
karakterističen za vsako substance.
7.2.3 KOMPONENTE HPLC SISTEMA:
rezervoar z mobilno fazo,
črpalka,
injektor,
kolona
detektor
rekorder
Značilna topila mobilne faze:
ADSORPCIJA/PORAZDELITEV: heksan, metilenklorid, kloroform, metanol, acetonitril
REVERZNA FAZA: metanol/voda, acetonitril/voda, reagenti z ionskimi pari
IONSKA IZMENJAVA: vodne puferske raztopine
IZLOČITVENA KROMATOGRAFIJA: tetrahidrofuran, kloroform
- 22 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Zahteve HPLC črpalk:
1. Črpanje konstantnega volumna (tekočine) mora biti neodvisno od "povratnega pritiska"
(upora) kolone.
2. Pretok mobilne faze (tekočine) mora biti brez "pulziranja" (nihanja), kar zmanjšuje šum
detektorja
3. Na izhodu naj bi bil dosežene visok tlak(do 600 barov).
4. Dobro je, če lahko črpamo neomejeno množino topila (mobilne faze) z možnostjo
recikliranja, izokratskega in gradientnega izpiranja.
5. Zaželeno je široko območje pretokov mobilne faze (do 10 ml/min) za različne HPLC
tehnike.
HPLC kolone
Kolona je napolnjena z delci polnila (običajno velikost <10 µm), ki so prekriti s
stacionarno fazo. Z izbiro ustreznih faz in ostalih pogojev je dosežena separacija
večkomponentne mešanice v nekaj minutah.
7.2.4 VRSTE DETEKORJEV:
Detektorji imajo pomembno vlogo pri določanju analitov. Detektor zazna spremembo, ki
jo pretvori v električni signal, ki je propocionalen intenziteti neke lastnosti mobilne faze ali
substance, ki jo določamo. Detektorji morajo imeti visoko občutljivost, visoko dinamično
območje in linearnost v širokem območju.
- 23 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Vrste detektorjev:
spektrofotometrični
fluorescenčni
elektrokemijski
refraktometrični
masni spektrometer
- 24 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
III. NAMEN DELA
Namen dela te diplomske naloge je bil primerjati encimskoimunsko metodo za določanje
vitamina D z radioimunsko metodo, ki se trenutno uporablja za določanje vitamina D v
Hormonskem laboratoriju v sklopu KC Ljubljana.
Pri primerjavi smo uporabili iste vzorce, nekatere smo tudi redčili, želeli pa smo preveriti
ali bo encimskoimunska metoda boljša in ali bomo z njo lahko nadomestili radioimunsko
metodo. Razlog za vpeljevanje nove metode je predvsem narava radioimunskih metod, saj
se pri njih uporabljajo radioaktivne snovi, ki pa so škodljive zdravju.
Za lažje ovrednotenje smo rezultate statistično obdelali in dobljene rezultate med seboj
primerjali.
- 25 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
METODE IN MATERIALI
1. VZORCI
Za analizo smo izbrali 14 vzorcev preiskovanih oseb različnega spola in starosti, v
katerih smo določali vitamin D z dvema metodama in sicer; z ELISA in z RIA metodo. Vsi
vzorci so bili pravilno prineseni v laboratorij, ker smo jih takoj vnesli v računalnik in
zabeležili potrebne preiskave. Preverili smo tudi, če so vzorci pravilno odvzeti, če je
zadostna količina vzorca in ali so hemolizirani ali lipemični, ter vse zabeležili. Vzorce smo
do analize zmrznili na – 4° C.
Vse vzorce in reagente smo pred analizo za nekaj časa pustili na sobni temperaturi, da so
se odtalili, nato pa smo jih rahlo premešali z vortexom, da so bili homogeni. Reagenti,
standardi, kontrole in ves ostali material iz kompleta pa je že bil pripravljen za uporabo,
tako, da ga ni bilo potrebno posebej pripravljati. Spiralni pufer smo razredčili z destilirano
vodo v razmerju 1:10 ( 100 ml koncentrata in 900 ml destilirane vode ).
Vzorce smo na kolono nanesli tako da smo najprej dodali toliko vzorca kolikor ga je bilo
nato pa še TRIS HCl pufer, da smo dosegli količino 500 µl. Za analizo smo prvotno izbrali
40 vzorcev, vendar ker ni bilo vseh vzorcev dovolj za obe metodi, smo jih za primerjavo
metod izbrali le 14. Standarde in vzorce smo analizirali v dvojnikih.
Pri RIA metodi smo standarde od 1 do 5, ki so bili liofilizirani rekonstituirali tako, da
smo dodali vsakemu standardu 3 ml osnovne standardne raztopine. Ostali reagenti so že
bili pripravljeni za uporabo. Pred pričetkom analize smo tudi pripravili organska topila za
ekstrakcijo.
Razmerje topila Vrsta topila Volumen ( 1 l )
70 : 30 metanol
deionizirana voda
700 ml
300 ml
90 : 10 heksan
metilen klorid
900 ml
100 ml
99 : 1 heksan
izopropanol
990 ml
10 ml
92 : 2 heksan
izopropanol
920 ml
80 ml
- 26 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
2. METODI ZA DOLOČANJE VITAMINA D
Vitamin D smo določali z ELISA metodo in RIA metodo, kateri smo tudi primerjali med
seboj.
2.1 ELISA METODA
NAMEN UPORABE
To imunodiagnostično metodo uporabljamo za kvantitativno in vitro določanje 1,25(OH)2
D v plazmi ali serumu.
PRINCIP TESTA
Pri tej metodi se mora biološko aktiven metabolit vitamina D 1,25 – (OH)2 D ločiti z
dvema ločenima kolonama ( ekstrakcija ). Ekstrakcijo oziroma ločitev se mora narediti
predvsem zato, da se loči 1,25 – (OH)2 D od ostalih metabolitov vitamina D, predvsem od
25 – dihidroksivitamina D in 24,25 – dihidroksivitamina D. Ta metoda je kompetitivna
encimsko imunokemijska metoda, zato temelji na tekmovanju med 1,25 – (OH)2 D v
vzorcu z 1,25 – (OH)2 D označenim z encimom peroksidaza za prosto vezavno mesto na
specifičnem protitelesu za vitamin D.
Po ekstrakciji je treba narediti predinkubacijo in vzorce inkubirati. Po tej stopnji se vzorci
nanesejo na mikrotitrsko ploščo, kjer 1,25 – (OH)2 D prisoten v vzorcu tekmuje z
označenim 1,25 – (OH)2 D za prosto vezavno mesto na specifičnem protitelesu. Z
naraščanjem koncentracije 1,25 – (OH)2 D v vzorcu upada količina označenega 1,25 –
(OH)2 D. Po spiranju se odstranijo nevezane komponente, dodati pa je treba encimski
substrat. Reakcija se ustavili tako, da se doda reagent za to pripravljen reagent (žveplova
kislina). Meri se ekstinkcija vzorcev pri valovni dolžini 450 nm. Intenziteta barve je
obratno sorazmerna z koncentracijo 1,25 – (OH)2 D v vzorcu. Krivulja absorbanc v
odvisnosti od koncentracij se dobi z rezultati kalibratorjev. Koncentracija 1,25 – (OH)2 D
se določili direktno iz krivulje.
- 27 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
ANALITČNA OBČUTLJIVOST
Občutljivost te metode je 10,4 pmol/L
NATANČNOST
Natančnost metode so pri firmi Immundiagnostik 1,25 (OH)2 D izračunali tako, da so en
vzorec določili v 21 replikah in dobili CV = 6,6 %
ANALITIČNA SPECIFIČNOST
Analitična specifičnost nam kaže sposobnost metode, da v kemijski zmesi podobnih
analitov izmeri samo tisti analit, ki ga določamo.
SUBSTANACA Navzkrižna reakcija v %
1,25 – ( OH )2 Vit D3 100 %
Vit D2 in D3 < 0,01 %
24,25 – ( OH )2 Vit D3 < 0,1 %
25 – OH Vit D2 < 0,1 %
25 – OH VIT D3 < 0,01 %
Alfakalcidol < 0,003 %
OPOZORILA IN ROKOVANJE
Standardni in kontrolni vzorci vsebujejo humane materiale, ki so bili testirani in
negativni na HBsAG, anti – HIV in anti – HCV. Vendar, ker nobena metode ne nudi 100
% sigurnost, da vzorci ne vsebujejo infektivne snovi smo s temi vzorci ravnati kot z
potencialnimi infekcijskimi vzorci. Reagent stop vsebuje žveplovo kislino, ki je močna
kislina, zato smo z njim ravnali previdno. Reagente moramo porabiti do navedenega roka
uporabnosti.
- 28 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Analizator Personal Lab ADALTIS
Personal Lab je funkcionalen in intenziven analizator z dvema ploščama, kjer je možna
polna avtomatizacija laboratorijskih testov v imunoencimskih tehnikah. Dokazana in
utrjena izvedenska mnenja tega analizatorja omogočajo prilagodljive instrumente za
uporabo širokega območja od diagnostičnih potreb iz avtoimunosti do rodnosti oz.
nosečnosti, od bolezni ščitnic do nalezljivih bolezni ( HIV ), retrovirusov in tudi hepatitisa
tipov A, B, C, D in E.
Analizator se pa tudi prilagaja proizvajalčevim metodam in nudi učinkovito alternativo
tradicionalnim ročnim metodam, kot to omogočajo dosedanji EIA analizatorji z zaprtim
sistemom.
Analizator Personal Lab omogoča dva osnovna modula:
- instrument, ki vsebuje vse sestavne dele za obdelavo vzorcev in reagentov
- vodstven sistem, ki vsebuje instrumente za kontroliranje s programsko opremo in
podatkovno upravljanje dela
Analizator je zgrajen tako, da ima pokrov, ki ga je možno odpreti in tako omogoča
preprost dostop in enostavno upravljanje in obratovanje z kompatibilno strojno opremo
Microsoft Windows 98.
Slika 7: Analizator Personal Lab
- 29 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
VAKUUMSKA POSODA VAC ELUT SPS 24 VARIAN INC
Varian Vac Elut SPS 24 je vakuumska posoda, ki se uporablja za fazno ekstrakcijo in
vzorčno filtriranje. Istočasno sprejme 24 kolon. Steklene stene omogočajo, da spremljamo
vzorec tekom cele analize. Iz vseh kolon se zbirajo odpadne snovi, ki se izločijo skozi lijak
v kontejnerje odpadnih snovi, kar preprečuje navzkrižno kontaminacijo vzorca in pa tudi
zmanjša izpostavljenost nevarnim odpadkom. Tako se odpadne snovi odstranjujejo ne da bi
bilo potrebno odstranili pokrov. Zbiralna stojala se lahko postavijo v notranjost pred
pričetkom ekstrakcije.
Slika 8: Vac Elut SPS 24
- 30 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Tabela 2: Material prisoten v kompletu
SESTAVINE KOLIČINA
testna ploščica z vrsticami 96
ELISA spiralna tekočina 10x koncentrirana 1 x 100 ml
TRIS – HCL pufer 1 x 30 ml
etanol ( pripravljen za uporabo ) 1 x 1,5 ml
raztopina protiteles ( mišja – anti 1,25 – (OH)2
Vitamin D ) pripravljena za uporabo
1 x 2,5 ml
standardi in NSB, pripravljeni za uporabo
(0; 11; 27; 69.1; 172,8; 432 pmol/L)
7 x 2,5 ml
kontrola, pripravljena za uporabo 2 x 2,5 ml
konjugat, pripravljen za uporabo 1 x 22 ml
TMB substrat, pripravljen za uporabo 2 x 15 ml
ELISA stop substrat, pripravljen za uporabo 1 x 7 ml
Vsi reagenti morajo biti primerno shranjeni in sicer na temperaturi 2 – 8° C. Tudi po
odprtju so reagenti stabilni na temperaturi 2 – 8 °C do roka uporabe, ki je natisnjen na
škatli kompleta.
Uporabili smo še naslednji material:
- kromabond kolone
- silikatne kolone
- destilirana oz. deionizirana voda
- diizopropileter p.a.
- izopropanol p.a.
- heksan p.a.
- metanol p.a.
- deionizirana voda
- 12 mm steklene epruvete
- 31 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
- nastavljive pipete ( 20 – 1000 µl )
- avtomatsko pipeto
- Vortex
- Vac Elut SPS 24
- analizator Adaltis Personal Lab
POSTOPEK:
Ekstrakcija
Na vakuumsko posodo VAC ELUT SPS 24 smo nastavili kromabond kolone, pod njimi
pa prazne označene epruvete kamor so se na koncu zbirali eluati.
- na kromabond kolone smo pipetirali 500 µL NSB, standarde in vzorce, kjer je bilo
vzorca manj kot 500 µL smo dodali Tris-HCL pufer ( najprej smo nanesli pufer in
nato še vzorec), pustili smo da se vse adsorbira ( približno 10 minut)
- nastavili smo silikatne kolone in nanj kromabond kolone, tako da se je eluat iz
naslednje stopnje lahko zbiral direktno na silikatne kolone
- nato smo kolone spirali z diisopropiletrom in sicer 4 x po 1ml ( 3 minute za vsako
spiranje ), s tem smo ekstrahirali vitamin D iz kolon, eluat pa se je zbiral direktno v
silikatne kolone
- zatem smo kolone spirali z pripravljeno raztopino izopropanol/heksan v razmerju
4/96 in sicer 5 x po 2 ml
- nato smo spirali še z pripravljeno raztopino izopropanol/heksan v razmerju 6/94 3 x
po 2 ml
- nazadnje smo še 1,25 – dihidroksivitamin D eluirali iz kolon z 2 x po 2 ml
raztopine izopropanol/heksan v razmerju 25/75
- Po spiranju smo eluate uparili pod tokom dušika
- 32 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Pred inkubacija
Po izhlapevanju smo vsem vzorcem dodali 20 µL etanola ter rahlo premešali, in 450 µl
reagenta, ki vsebuje protitelesa ter prav tako rahlo premešali. Vse skupaj smo prekrili z
parafilmom ter pustili, da se je inkubiralo 1 uro.
ELISA ( avtomatizirani del analize )
- po inkubaciji smo pipetirali 200 µL preinkubiranih vzorcev na mikrotitrsko ploščo (
delali smo v dvojniku)
- mikrotitrsko ploščo smo prekrili z parafilmom in inkubirali 18 ur na temperaturi 4ºC
- po inkubaciji smo ploščo vstavili v analizator Personal Lab Adaltis, ki smo ga prej
vključili, naredili samokontrolo, spirali in napolnili celico ter namestili spiralni pufer,
konjugat, substrat ter stop reagent
- ploščo se je nato spirala z spiralnim pufrom 5 x po 300 µL
- dodali smo 200 µL konjugata v vsak vzorec ter inkubirali eno uro
- nato se je spiralo s spiralnim pufrom 5 x 300 µL
- dodali smo 200 µL substrat ter inkubirali na sobni temperaturi v temnem 20 minut
- na koncu smo dodali še 50 µL stop reagenta in rahlo premešamo ter zmerimo
absorbanco pri 450 nm
Rezultate smo odčitali direktno iz krivulje.
IZRAČUN REZULTATOV
Rezultate odčitamo direktno iz standardne krivulje.
- 33 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI
Orientacijske referenčne vrednosti 1,25 (OH)2 D v serumu so naslednje:
odrasli (20 – 50 let) 36,7 – 114,5 pmol/L
otroci do 12 let približno 40 % večje
nosečnice (8. – 42. teden) približno 60 % večje
starejši od 70 let približno 40 % večje
Orientacijske referenčne vrednosti pa so tudi odvisne od letnega časa, in sicer pozimi so
nekoliko manjše, poleti, ko smo pa več izpostavljeni sončnim žarkom pa so te vrednosti
nekoliko višje.
OMEJITVE POSTOPKA
Vzorce v katerih je koncentracija 1,25 (OH)2 D višja kot najvišji standard, je potrebno
ponovno analizirati.
KONTROLA KAKOVOSTI
Za kontrolo kakovosti smo uporabili kontrolna vzorca, ki bi morala padati v interval
podanih vrednosti za kontrolna vzorca. V primerih, če eden ali več kontrolnih vzorcev ne
pada v podani interval, rezultati vzorcev mogoče niso veljavni.
- 34 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
2.2 RIA METODA
NAMEN UPORABE
Ta kompetitivna radioimunska metoda se uporablja za kvantitativno in vitro določanje
1,25-(OH)2 D v serumu ali plazmi.
PRINCIP TESTA
DiaSorin 1,25-(OH)2 vitamin D test je sestavljen iz dvostopenjskega postopka. Test
vključuje predhodno ekstrakcijo in pozneje še prečiščevanje metabolitov vitamina D iz
seruma ali EDTA krvne plazme z uporabo C18OH kolon. Po ekstrakciji se za določanje
uporablja RIA kompetitivno metodo. Pri RIA postopku se uporabljajo poliklonska
protitelesa, ki so specifična za oba 1,25-dihidroksivitamin D2 in 1,25-dihidroksivitamin
D3. Vzorci, protitelesa in tracer se morajo inkubirati. Faza ločitve je dosežena po 20-
minutah inkubacije z dodatkom precipitacijskega kompleksa sekundarnih protiteles. Po
centrifugiranju in odlitju supernatanta ostanejo vezne frakcije v kroglicah, ter se
preračunajo v gama števcu. Vrednosti so izračunane direktno iz standardno krivulje.
Končne koncentracije 1,25-dihidroksivitamina D v serumu in EDTA krvni plazmi so
podani v pg/mL, zato smo jih preračunali v pmol/L.
ANALITIČNA OBČUTLJIVOST
Analitična občutljivost te metode je ≤ 4,32 pmol/L.
NATANČNOST
Pri firmi DiaSorin so izvedli teste in določili, da je med meritvami CV = 7,7 %, med
dnevi CV = 11,1 % in totalni CV = 12,3%.
- 35 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
ANALITIČNA SPECIFIČNOST
SUBSTANCA NAVZKRIŽNA REAKCIJA
1,25 Vit D3 100 %
1,25 –Vit D2 109%
24,25- ( OH )2 Vit D3 < 0,08 %
25,26 – ( OH )2 Vit D3 < 0,08 %
25 Vit D3 < 0,01 %
1470 WALAC WIZARD GAMA ŠTEVEC GMI INC
Gama števci imajo to prednost, da se snovi ne dotikajo. Štetje epruvet poteka tako, da se
gama žarki sipljejo na material, prestreza pa jih detektor. Povečan signal na detektorju
pomeni navzočnost snovi, ki je radioaktivno označena.
Gama števec 1470 Wallac Wizard prenese signal iz vzorcev na konvektor, tudi
potencionalno mesto onesnaženja je odstranjeno. Visoka resolucija MCA tehnologije je
narejena za geometrijsko štetje. Ta gama števec ima 1, 2, 5 ali deset cevi za nosilnost in
lahko sprejme vse RIA stekleničke.
Slika 9: Walac Wizard gama števec
- 36 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Tabela 3: Material prisoten v kompletu
SESTAVINE KOLIČINA
1,25 – (OH)2 D NSB pufer,
pripravljen za uporabo
3ml
1,25 – (OH)2 D standard 0,
pripravljen za uporabo
20 ml
1,25 – (OH)2 D3 standard 1-5,
liofilizarni reagent
5× 3 ml
1,25 – (OH)2 D antiserum,
pripravljen za uporabo
35 ml
125 I 1,25 – (OH)2 D3,
pripravljen za uporabo
10 ml
1,25 – (OH) D3 pretreatment raztopina,
pripravljen za uporabo
50 ml
1,25 – (OH)2 D GAR precipitacijski kompleks 2 × 35 ml
1,25 – (OH)2 D kontrolni serum,
pripravljen za uporabo
2 × 3 ml
95 % etanol 7 ml
Reagenti v kompletu so lahko shranjeni na temperaturi – 15 ° C do 6 mesecev.
Uporabili smo še:
- C18OH kolone
- borosilikatne steklene epruvete
- stojalo za epruvete
- parafilm
- centrifugo
- gama števec
- vortex mešalec
- 37 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
- pipete
- deionizirano vodo
- Vac Elut SPS 24
- tekoči dušik
- vodno kopel
- organska topila: - acetonitril
- metanol
- heksan
- diklorometan
- izopropanol
POTEK ANALIZE
PREDHODNA EKSTRAKCIJA
1. rekonstituirali smo liofilizirane standarde z dodatkom 3.0 mL standarda 0, rahlo
premešali in pustili stati 20 minut, da je bila rekonstrukcija popolna. Zamrznjene
reagente smo dali na sobno temperaturo. Pred uporabo smo reagente rahlo
premešali.
2. pipetirali smo po 500 L standardov, kontrol in vzorcev v borosilikatne steklene
epruvete
3. dodali smo 500 L acetonitrila v vsako epruveto, premešali na vortexu 3 krat v
času 10 minut
4. centrifugirali smo 10 minut pri 25 C pri 760 g
5. supernatant smo prelili v testne epruvete, kroglice oz.usedlino pa zavrgli
6. dodali smo 500 L pretreatment raztopine v vsako epruveto in rahlo premešali
7. vzorci so bili pripravljeni na nanos na C18OH kolono
- 38 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
REGENERACIJA C18OH KOLONE
Kolone smo sprali z 5 mL raztopine 90 : 10 heksan / diklorometan, 5 mL izopropanolom in
5 mL metanola pred prvo uporabo. Vsaka raztopina je popolnoma pretekla skozi kolono
preden smo dodali drugo raztopino.
EKSTRAKCIJA
Opis in analiza ekstrakcije Korak ekstrakcije Pozicija na
VacElut-u
Regeneracija kolone
Odstranimo vse moteče snovi
iz prejšnjega koraka
1. dodali smo 1 mL metanola in
vklopili vakuum
2. izklopili smo vakuum
WASTE
Nanesemo vzorce
pripravljene iz predhodne
ekstrakcije
3. nanesli smo vzorce
in vklopili vakuum
WASTE
Odstranjevanje metabolitov
vitamina D
Odstranimo polarne lipide, soli
in pigmente
Odstranimo 25(OH)D
Odstranimo 25(OH)D;
24,25(OH)2D;
25,26(OH)2D
4. dodali smo 5 mL 70:30
metanol/destilirana voda
5. dodali smo 5 mL 90:10
heksan/metilklorid
6. dodali smo 5 mL 99:1
heksan/izopropanol
7. izklopili smo vakuum
WASTE
- 39 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Zbiranje 1,25-(OH)2D
Spiranje čistega 1,25- (OH)2D
8. dodali smo 3 mL 92:8
heksan/izopropanol in vklopili
vakuum
9. izklopili smo vakuum
COLLECT
SUŠENJE IN REKONSTRUKCIJA ELUATOV
1. epruvete z vzorcu smo postavili v kopel ( 37C), da se posušijo
2. vzorce smo uparili pod tokom dušika (20 minut)
3. vzorce smo odstranili takoj ko so bili suhi
4. vzorce smo rekonstituirali z 50 L 95 % etanolom, narahlo premešali in dodali 125
L tracerja v vsako epruveto ter rahlo premešali. ( dodali smo eno epruveto za
celotno štetje in eno za NSB, ter v vsako dodali 50 L 95 % etanola in 125 L
tracerja )
5. analizo smo naredili takoj, ko so bili vzorci rekonstituirani
POSTOPEK ANALIZE
1. pripravili smo borosilikatne epruvete v dvojniku in napipetirali 75 L
rekonstituiranih vzorcev (standardi, kontrole in vzorci)
2. v epruvete za TC in NSB smo dodali 75 L TC in NSB, ki smo jih pripravili (korak
4)
3. dodali smo 300 L NSB pufra v NSB epruveto
4. dodali smo 300 L primarnih protiteles v vse epruvete razen v TC in NSB
5. dobro smo premešali in inkubirali 2 uri na 25 C ( rekonstituirali smo GAR
precipitacijski kompleks z 35 mL destilirane/deionizirane vode in mešali dokler
- 40 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
raztopina ni bila homogena , nato smo jo pustili stati 30 minut pred uporabo-vmes
smo premešali)
6. dodali smo 500 L GAR precipitacijskega kompleksa v vsako epruveto razen v TC
in inkubirali 20 minut pri 25 C
7. centrifugirali smo vse epruvete razen TC 20 minut pri 25 C in 1800 g
8. odlili smo vse supenatante razen TC (primerno odstranimo-posesamo); vsa
tekočina je morala biti odstranjena
9. merili smo radioaktivnost z štetjem vseh epruvet z gama števcem (epruvete so se
štele najmanj 1minuto)
IZRAČUN REZULTATOV
Rezultate smo odčitali direktno iz standardne krivulje. Standardna krivulja predstavlja
razmerje cpm vrednostmi standardov ( B ) in cpm vrednostmi ničelnega standarda ( B0 ).
Z dobljenimi vrednostmi smo izračunali B / B0 koeficient za vsak standard in vzorec.
ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI
Orientacijske refernčne vrednosti : 54,2 – 142,8 pmol/L (pri populaciji 21 – 68 let
starosti)
OMEJITVE POSTOPKA
Čas, ki ga porabimo za štetje z gama števcem mora biti pravšnje, da preprečimo
prisotnost napak (akumulacija od 2000 cpm lahko prinese 5 % napako, 10000 cpm pa 1 %
napako ). Karakteristike testa niso utemeljene za otroško populacijo.
- 41 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
KONTROLA KAKOVOSTI
Za kontrolo kakovosti smo uporabili kontrolna vzorca, ki imata določen interval
normalnih vrednosti, v katerega morata ta kontrolna vzorca spadati.
- 42 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
IV. PREGLED REZULTATOV
1. STATISTIČNO VREDNOTENJE METOD
A.) Aritmetična sredina
Aritmetična sredina pri RIA metodi = 92,92 pmol/L
Aritmetična sredina pri ELISA metodi = 78,21 pmol/L
B.) Standardna deviacija
Standardna deviacija pri: RIA metodi = 59,83
ELISA metodi = 45,17
C.) Koeficient variacije
CV pri RIA metodi = 0,6439 ( 64,4 % )
CV pri ELISA metodi = 0,5775 ( 57,7 % )
D.) Passing in Bablok regresija
Z regresijo določimo enačbo medsebojnega odnosa.
Enačba premice:
Y a b x ; kjer a določa odsek na ordinatni osi, b pa naklon premice ali regresijski
koeficient.
Y = 19,7178 + 0,8659 x
- 43 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Passing in Bablok regresijska premica s 95 % mejami odstopanja in napovedi
Slika 10: Passing in Bablok regresijska premica
E.) Primerjava metod po Bland Altmanu
Slika 11: Bland Altman
- 44 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
F.) t test
t - test je najbolj enostavna statistična metoda za analizo razlik oz. sprememb v primeru da
primerjamo dva vzorca. Pri tem testu testiramo razlike med aritmetičnima sredinama dveh
vzorcev. Ločimo t test neodvisnih vzorcev in t test odvisnih vzorcev.
Razlika aritmetičnih sredin Standardna deviacija Standardna napaka P
14,71 53,01 20,03 0,4695
Iz t testa vidimo, da je nivo statističnega rizika 46,95 %.
2. IZRAČUN REZULTATOV
ELISA METODA
Standardni vzorci :
standard A ( 0 pmol/ l ): 1,178 pmol / l
standard B ( 11 pmol / l ): 11,077 pmol / l
standard C ( 27 pmol / l): 27,125 pmol / l
standard D (69,1 pmol /l ): 70,418 pmol l
standard E ( 172,8 pmol /l ): 172,81 pmol / l
standard F ( 432 pmol / l ): 432 pmol / l
Kontrolni vzorci:
kontrolni vzorec 1 ( 4,32 – 56,16 pmol / l ) : 43,76 pmol / l
kontrolni vzorec 2 (56,16 – 146,88 pmol / l ) : 54,088 pmol / l
- 45 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Umeritvena krivulja za ELISA metodo
Standardna krivulja
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400 500
Koncentracija v pmol / l
Ab
sorb
anca
Slika 12: Standardna krivulja za ELISA metodo
RIA METODA
Standardni vzorci:
standard 0 ( 0 pmol / l ) : 0 pmol / l
standard 1 ( 10,8 pmol / l ) : 13,66 pmol / l
standard 2 ( 32,4 pmol / l ) : 32,06 pmol / l
standard 3 ( 64,8 pmol / l ) : 65,8 pmol / l
standard 4 ( 162 pmol / l ) : 161,1 pmol / l
standard 5 ( 432 pmol / l ) : 442,1 pmol / l
Kontrolni vzorci
Kontrolni vzorec 1 ( 46,22 – 107,57 pmol / l ) : 82,29 pmol / l
Kontrolni vzorec 2 ( 122,9 – 287,06 pmol / l ) : 285,09 pmol / l
- 46 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Umeritvena krivulja za RIA metodo
CPM standarda / vzorca – CPM NSB x 100 = B / Bo ( % )
CPM 0 standard – CPM NSB
Standardna krivulja
0102030405060708090
100
0 100 200 300 400 500
Koncentracija v pmol / l
% B
/ B
0
Slika 13: Standardna krivulja za RIA metodo
- 47 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
3. PRIMERJAVA KONCENTRACIJ MED METODAMA
Vzorec ELISA
pmol/L
RIA
pmol/ L
1 100,9 109,2
2 42,4 55,3
3 48,7 109,8
4 159 51,1
5 133,9 134,5
6 51,5 57,9
7 70,6 42,9
8 20,5 38,6
9 87,6 82,4
10 78,7 133,4
11 23,9 80,6
12 136,7 91,8
13 28,2 46,3
14 112,4 267,1
- 48 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
V. RAZPRAVA
Vitamin D uvrščamo med vitamine, čeprav gre za hormon in sicer spada v skupino
steroidnih hormonov. Ta vitamin je edini, ki ga človeško telo proizvede samo s pomočjo
UV svetlobe. Vitamin D tako nastaja v koži, lahko pa ga v telo vnesemo z prehrano. Sam
po sebi ni dejaven, biološko dejavnost dobi šele v presnovi. Vitamin D se obravnava kot
prohormon z aktivnimi metaboliti, ki delujejo kot hormoni. Tako imamo več oblik
vitamina D in sicer ergokalciferol, holekalciferol, kalcifediol, kalcitriol. Najaktivnejša
biološka oblika je kalcitriol, ki s pomočjo PTH-ja in kalcitonina vzdržuje koncentracijo
kalcijevih in fosfatnih ionov v krvi in tudi v kosteh.
Če pride do pomanjkanja vit D se lahko pojavijo bolezni kot so rahitis, ki se pojavlja pri
otrocih, osteoporoza, ki se pojavlja pri odraslih, pojavijo pa se tudi druge bolezni npr.
kongenitalna hipofosfatemija, ki izzove rahitis ali osteomalacijo, osteomalacija, ki je
rahitis odraslih ter hipo- in hiperparatiroidizem.
Lahko pa se tudi pojavijo težave pri prekomernem vnosu vitamina D v organizem. Pojavi
se lahko toksičnost vit D, kalcifediola in kalcitriola, ter tudi granulomatozne bolezni in
sarkoidoza.
Ker se pa kalcitriol sintetizira v ledvicah, se lahko ob neprimernih količinah vit D v
organizmu pojavijo tudi težave povezane z ledvicami in sicer lahko pride do toksičnega
vpliva na ledvice, do poškodb ledvic, do tvorbe ledvičnih kamnov,…
V tej diplomski nalogi smo primerjali ELISA metodo za določanje 1,25-(OH)2 vit D z
RIA metodo. Naš namen je bil ugotoviti ali bi lahko ELISA nadomestila do sedaj
uporabljano RIA metodo, saj se pri RIA metodi uporablja radioaktivno izotop I125, ki je
zdravju škodljiv.
V analizo smo vzeli 14 vzorcev preiskovancev, katerim smo izmerili koncentracijo 1,25-
(OH)2 vit D v plazmi z obema metodama.
- 49 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Vzorci so bili pravilno odvzeti in pripravljeni. Vzorci so bila odvzeti z EDTA ali
heparinom in so v laboratorij bili prineseni na ledu, do analize pa so bili zmrznjeni.
Prvo smo preizkušali RIA metodo, ki je ročna metodo in pri kateri se uporablja izotop
I125, ki je radioaktiven. Ta metoda je kompetitivna in se uporablja za kvantitativno
določanje 1,25(OH)2 Vit D v serumu ali plazmi.
Princip te metode je v kompetitivnem odnosu med 1,25-(OH)2 vit D v vzorcu
preiskovanca in 1,25-(OH)2 vit D označenimi z I125 za prosta vezavna mesta na Ab.
Protitelesa so pri tej metodi pritrjena na steni epruvete. Po inkubaciji in precipitaciji smo
presežek odsesali in s tem prekinili kompetitivni odnos. Z gama števcem smo izmerili
radioaktivnost
Nato smo še izvedli ELISA metodo. Tudi ta metoda je kompetitivna in se uporablja za
kvantitativno določanje 1,25-(OH)2 vit D v plazmi ali serumu. Za izvedbo meritev smo
uporabili analizator ADALTIS Personal Lab, s katerim smo ELISA metodo izvedli
avtomatizirano in ne ročno. Pri tej metodi smo najprej z ekstrakcijo odstranili 1,25-(OH)2
vit D od ostalih metabolitov vit D. Tudi pri tej metodi gre za tekmovanje med 1,25-(OH)2
vit D v vzorcu in z encimom označenim 1,25-(OH)2 vit D za prosta vezavna mesta na
specifičnem Ab. ELISA metodo smo izvedli na mikrotitrski ploščici. Proste nevezane
komponente smo odstranili s spiranjem, za odkrivanje 1,25-(OH)2 vit D pa smo uporabili
encimski substrat. Po zaustavljeni reakciji smo merili absorbanco pri valovni dolžini
450nm , kjer je bila absorbanca obratno sorazmerna z koncentracijo 1,25-(OH)2 vit D v
vzorcu.
Metodi se razlikujeta po tem, da so pri RIA metodi Ab vezana na epruveto in moramo
prebitek nevezanih Ab izsesati, pri ELISA metodi pa je prebitek Ab v isti reakcijski
posodi. Pri ELISA metodi so zato vrednosti nekoliko višje, saj ima manjšo analitično
specifičnost in je manj občutljiva.
Enako smo pri ELISA metodi odčitali rezultate direktno iz standardne krivulje, ki smo jo
dobili s pomočjo standardnih vzorcev.
- 50 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
Izmerjene vrednosti koncentracije 1,25-(OH)2 vit D v vzorcih z RIA metodo se bistveno
razlikujejo od izmerjenih vrednosti istih vzorcev izmerjenih z ELISA metodo. Glede na
dobljene ovrednotene rezultate lahko sklepamo, da je ena metoda boljša kot druga.
Za ugotovitev katera metoda je boljša oziroma za ugotovitev ali bi lahko
encimskoimuunska metoda zamenjala RIA metodo smo obe med seboj primerjali.
Analitična specifičnost nam kaže sposobnost metode, da v kemijski zmesi podobnih snovi
izmeri samo koncentracijo preiskovane snovi. Ugotovili smo tudi da je RIA metoda bolj
specifična.
RIA metoda je tudi bolj občutljiva saj je meja občutljivosti ≤ 2 pg/ml, občutljivost ELISA
metode pa je 4,8pg/ml.
Pri ugotavljanju katera metoda je boljša smo upoštevali tudi ponovljivost metode, kar
smo izvedli z večkratnim merjenjem kontrolnih vzorcev. Pri ELISA metodi smo še
dodatno pripravili nekaj vzorcev, ki smo jih večkrat izmerili. In sicer en vzorec smo
analizirali v dvojniku in smo ga 4x razredčili, nato pa smo še isti vzorec analizirali v
trojniku in smo ga 8x razredčili. Za vzorec pa smo uporabili standard 5, ki smo ga
uporabili pri RIA metodi, njegova koncentracija pa je 432 pmol/l.
Rezultate ponovljivosti so bili:
4x redčen
vzorec
4x redčen
vzorec
8x redčen
vzorec
8x redčen
vzorec
8x redčen
vzorec
5219,2 pmol/L 3532,8 pmol/L 6049,6 pmol/L 12668 pmol/l 20766,4 pmol/L
Glede na dobljene rezultate smo ugotovili, da je ELISA metoda zelo slabo ponovljiva, saj
je razlika med rezultati istega vzorca večkrat merjenega zelo velika.
Če povzamemo vse parametre, ki smo jih primerjali za ugotovitev katera metoda je
boljša, pridemo do ugotovitve, daje do sedaj uporabljena RIA metoda veliko boljša kot
ELISA metoda, vendar je tudi ELISA metoda primerljiva in bi se lahko uporabljala.
- 51 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
VI. SKLEP
Za določanje koncentracije vitamina D v serumu smo uporabili dve metodi. S tem smo
želeli ugotoviti ali lahko dobljene vrednosti obeh metod med seboj primerjamo.
Vitamin D smo določili z radioimunsko metodo nato pa še z encimskoimunsko metodo.
Naš namen je bil ugotoviti ali lahko encimskoimunska metoda nadomesti radioimunsko
metodo, saj se pri slednji uporablja radioaktivni izotop, ki je zdravju škodljiv.
Na podlagi dobljenih rezultatov, ki smo jih dobili z uporabo obeh metod, lahko
zaključimo, da bi encimskoimunska metoda lahko zamenjala oz. nadomestila do sedaj
uporabljeno zanesljivo radioimunsko metodo.
RIA metoda pa sicer daje boljše rezultate, ki so tudi bolj zanesljivi zaradi večje
občutljivosti in specifičnosti metode in čeprav se pri tej metodi uporablja radioaktivni
izotop, ki je zdravju škodljiv, je bolje, da bi jo zaradi zanesljivejših rezultatov uporabljali
še naprej.
- 52 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
VII. VIRI IN LITERATURA
1. A. Guyton, J. Hall : Textbook of Medical Physiology; 10 edition, Saunders 2000
poglavje 79
2. http://sl.wikipedia.org/wiki/Vitamin_D
3. http ://sl.wikipedia.org/wiki/ELISA
4. Feldman D.: Vitamin D; Academic press, California, 1997
5. S. K. Sawhney, RAndhir Singh : Introductory Practical Biochemistry; Alpha
Science International Ltd. Harrow U.K. 2005 str. 306 -350
6. A. Guyton, J. Hall : Textbook of Medical Physiology; 10 edition, Saunders 2000
poglavje 79
7. J. Lange: pathophysiology of Disease; 3rd Edition, poglavje 17
8. http ://www.vitamins-supplements.org/vitamin-D.
9. http://info.cancerresearchchuk.org/healthyliving/sunsmart/howdoweknow/vitamind
10. B. Štraus: medicinska biokemija; Jumena Zagreb 1988
11. M. Vozelj: Temelji imunologije; DZ Slovenije, Ljubljana 2000
12. http://sl.wikipedia.org/wiki/Kromatografija
13. http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC
14. G. Beckett, S. Walker, P. Rae, P. Ashby: Clinical Biochemistry; 7th edition,
Blackwell Publising, USA 2005
15. N. V. Bhavagan: Medical Biochemistry; 4th edition, Harcourt/Academic Press, San
Diego 2002
16. http://www.adaltis.com/content/product/instruments/personalLAB/default.aspx
17. http://www.alpha-omega-diagnostics.com/instruments/processors/elisa/index.php
18. http://www.gmi-
inc.com/BioTechLab/Wallac%20Wizard%201470%20gamma%20counter.htm
19. http://www.uphs.upenn.edu/ifem/ins/wallac_wizard_1470_gamma_counter.htm
20. http://www.chromtech.com/2001catalog/SeparatePgs/139.pdf
21. http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistasearchdetails.cfm?LVid=4887673&rv=
1
22. http://en.wikipedia.org/wiki/Radioimmunoassay
23. http://www.antibodystation.com/elisa-radioimmunoassay/
- 53 -
DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi
- 54 -
24. http://www.immundiagnostik.com/index.html
25. http://www.diasorin.com/en/
26. http://www.ezdravje.com/si/vitmin/vitamini/koliko/vitaminD/
27. http://www.waichung.demon.co.uk/webanim/125DWeb.htm
Literatura slik:
1. http://sl.wikipedia.org/wiki/Slika:Ergocalciferol.gif,
http://www.icgeb.trieste.it/~p450srv/ligand/D3.gif
2. http://www.plivazdravlje.hr/img/news/rahitis.jpg
3. http://www.ezdravje.si/si/zenska/osteo/
4. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/4b/ELISA-
sandwich.svg/300px-ELISA-sandwich.svg.png
5. http://www.adaltis.com/content/product/instruments/personalLAB/default.aspx
6. http://www.chromtech.com/2001catalog/SeparatePgs/139.pdf
7. http://www.gmi-inc.com/BioTechLab/Wallac%20Wizard%201470%20gamma
%20counter.htm