uv vis spektrofotometrija
TRANSCRIPT
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 1/56
Optič ke metodeUV-VIS spektrofotometrija
Atomska apsorpciona spektrofotometrija
Plamena fotometrija
Fluorescentne metode
Turbidimetrija i nefelometrija
Masena spektroskopija
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 2/56
Analitič ki signal: svetlost Svetlost:
ČESTICA (FOTON-roj fotona)
ELEKTROMAGNETNI TALAS
Talasna dužina (λ)
Frekvencija ( ν)Energija (E)
E=h ν νν ν= h c/ λλλλ
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 3/56
E – energija fotona, odnosno svetlosti,h – Plankova konstanta h = 6,625×10-34 J s),ν – frekvencija svetlosti,
c – brzina prostiranja svetlosti, c = 300 000 km/s (uvakuumu)λ – talasna dužina svetlosti.
Jedinica za energiju fotona - nije Joul, već eV
1eV = 1,602 × 10-19 J
λ ν chhE ==
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 4/56
Talasna dužinaAmplituda
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 5/56
S pek t ar
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 6/56
Spektar
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 8/56
Podela spektara
Prema izgledu:Linijski (atomi)Trakasti (molekuli)Kontinualni (usijana čvrsta tela)
Prema mehanizmu nastajanja:
Apsorpcioni (uzorak apsorbuje)Emisioni (uzorak emituje)
Ramanski (uzorak rasejava)
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 9/56
TrakastiLinijski
Kontinuirani
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 10/56
Apsorpciona spektrofotometrija
UV-VIS spektrofotometrija
UV znači: ultra (iznad, preko) +violet (ljubič asto) 200-380 nm
VIS-visible (vidljivo) 380-780 nm
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 11/56
Apsorpcija zrač enja dovodi do prelaza
valentnih elektrona iz osnovnog u pobuđ eno stanje
h ν = Eviše-Eniže
hromoforna grupa ili hromofora
Molekul ili deo molekula
koji je odgovoran za apsorpcijuu UV delu spektra
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 12/56
Pobuđ uju se valentni elektroni:
sigma (σ)elektroni
pi (π) elektronislobodni elektronski parovi (n)
Pobuđivanje:
Iz vezivne u antivezivne
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 13/56
Dozvoljenielektronski prelazi
σ→σ*n→σ*
π→π*n→π*
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 14/56
Jedan elektronski prelaz-jednaapsorpciona traka A=f( λ λλ λ )
λ max -ona talasna dužina koju jedinjenje najviše apsorbuje
1.Mesto u spektru2. Intenzitet3. Poluširina
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 15/56
Koliko je λ max ?
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 16/56
Šta utič e na λ max ?
1.Priroda supstanceRazličita jedinjenja imaju
različite hromofore (molekulili deo molekula koji je
odgovoran za apsorpciju uUV-VIS oblasti)
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 17/56
Apsorpcioni spektar benzena (1) oko
255 nm i fenola (2) oko 270 nm
180 200 220 240 260 280 300
2
1
n-π∗
π−π∗
A
λ, nm
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 18/56
Više dvostrukih veza
pomeranje ka većim talasnimdužinama- batohromno pomeranje
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 19/56
Proteini (belanč evine) apsorbuju u
UV oblasti spektraBelance je belo!
Hromofore:
Peptidna veza (-CONH-)Aromatične aminokiseline u bočnom
lancuProstetične grupe
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 20/56
UV spektri :
a)proteina b) nukleinskih kiselina
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 21/56
Pored strukture, na položaj
apsorpcione trake utič u:
pHSlaba baza ili slaba
kiselina-u jonskom ili
molekulskom obliku uzavisnosti od pH
Izobestična tačka
Provera:Kapnite par kapi
limuna u čaj…
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 22/56
Rastvarač
Jod u etru je ljubičastJod u vodi je žućkasto-braon
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 23/56
Šta znač i reč HROMOFORA?
Grčki:NOSILAC BOJE chroma + phoros
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 24/56
Bo ja jed injenja
Selektivna apsorpcijau vidljivom delu spektra(400-800 nm)
Komplementarne bojeKomplementarno-
koje se dopunjuje,
nadopunjujuće
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 25/56
Predmeti su one boje koju
reflektuju
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 26/56
Rastvori su one boje koju propuštaju,
a ne apsorbuju
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 27/56
Zašto je NaCl bezbojan, a
NiCl2 obojen?
11Na→1s2
2s2
2p6
3s1
Na+ →1s2 2s2 2p6 isto kao i Ne
Velika E da se prevede u pobuđenostanje ⇒u UV oblasti
28Ni → 1s22s22p63s23p64s23d8
Ni2+ → 1s22s22p63s23p64s23d6
Mala E da se prevede u pobuđeno
stanje⇒ u VIS oblasti
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 28/56
Koje je boje ovo jedinjenje?
600 620 640 660 680 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
λλλλ, nm
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 29/56
Šta nam govore UV-VIS spektri?
Kvalitativna analiza:Koja supstanca je u uzorku?
Ali ne možemo biti 100% sigurni
Aktivnost enzima preko pojave ili
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 30/56
Aktivnost enzima preko pojave ili
nestanka spektara njihovih supstrata.
NADH ima maxna 340 nm
NAD+ nema max na
340 nm
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 31/56
Ispitivanja aktivnosti brojnih enzima koji katalizujureakcije koje uključuju učešće redoks para
NAD+ /NADH.
Alkohol-dehidrogenaza katalizuje:
C2H5OH + NAD+
→ CH3CHO + NADH + H+
Raste apsorbancija na 340 nm
Sorbitol-dehidrogenaza katalizuje:D-Fruktoza +NADH → D-Sorbitol +NAD+
Smanjuje se apsorbancija na 340 nm
l
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 32/56
Kvantitativna analiza
kolika je koncentracija?
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 33/56
LAMBERT-BEEROV ZAKON
I k db
dI =−
∫∫ =−b I
J
dbk I dI p
00
bk I
I p=−
0ln
kb
p
e I I −=
0
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 34/56
Eksponencijalni oblik Lambertovog
zakona
kb p e I I −= 0
Intenzitet propuštene svetlosti eksponencijalno opada sa
debljinom sloja kroz koju svetlost prolazi.
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 35/56
U zakon se “ubacuje” i Beer sa
koncentracijom…
cba A =
Apsorbancija nekog rastvora srazmerna je koncentraciji
tog rastvora, debljini sloja kroz koji svetlost prolazi
i apsorptivnosti rastvorene supstance.
Beerov zakon:
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 36/56
Lambert-Beerov zakon
A- apsorbancija I
o- intenzitet upadne svetlosti
I p- intenzitet propuštene svetlosti a-(molarni) apsorpcioni koeficijent ili (molarna) apsorptivnost
b-dužina optičkog puta
c-koncentracija
cba
I
I A p
== 0log
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 37/56
Transparencija
Izražava se u procentima:
Veza između apsorbancije itransparencije:
0 I
I
T p
=
100%0
⋅= I
I T p
T T I
I
A
p 1
logloglog 0
=−=−=
T
T
A %log2
100
1001log −=⋅=
Važna veličina, jedino se može meriti
Ip
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 38/56
Veza izmeđ u A i T
IZMEĐU 20 - 80%T, ODNOSNO 0,1 - 0,7 A
T A log−=
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 39/56
Kalibraciona kriva
Beerov zakon:nagib=ab, odseč ak =0
cba A=
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
koncentracija
y= kx + n jednačina prave
A
Metoda kalibracione krive
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 40/56
Metoda kalibracione krive
(standardna, analitič ka kriva)
A=f(c)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,0
0,2
0,4
Ax
cx
A
c,%
Serija standardnihrastvora (najmanje 6)
poznatih koncentracija.Sa krive se odredinepoznata
koncentracija
O ič j L b B
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 41/56
Ogranič enja Lambert-Beerovog
zakonaJedan do dva reda veličine
U intervalu od 1x10-5 do 5x10-4mol/dm3 ili
1x10-4 do 1x10-3 mol/dm3
Dve grupe razloga: Zbog rastvorka i rastvarača,
t°C slabo Zbog aparata (pozadinsko
zračenje)
Isključivo zamonohromatskusvetlost!
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 42/56
Izbor radne talasne dužine
Zašto je najbolja kalibraciona kriva br. 1?
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 43/56
Instrumenti
mere APSORBANCIJU i TRANSPARENCIJU
FotometriSpektrofotometri
IZVOR ZRAČENJA
MONOHROMATORDETEKTOR
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 44/56
Izvori zrač enja-lampe VIS deo spektra: volframova lampa
(360- 950 nm)
UV deo spektra: deuterijumova i
vodonič na (190-420 nm)cevi za pražnjenje živina lampa- linijske spektre
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 45/56
Monohromator
Od polihromatske treba da izdvojimonohromatsku svetlost.
Sastoji se od:
1. Ulaznog i izlaznog razreza2. Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)
3. Disperzionog elementa: prizma ilidifrakciona rešetka
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 46/56
Disperzioni element PRIZMA
DIFRAKCIONAREŠETKA
U VIS oblasti spektra-stakleneU UV oblasti spektra- kvarcne
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 47/56
KiveteStaklene- za VIS oblast
Kvarcne-za UV oblast
Najčešćeprečnika 1 cm (dužina
optičkog puta)
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 48/56
Kivete
Detektor: fotoćelija
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 49/56
Detektor: fotoć elija,
fotomultiplikator i fotodiode
Intenzitet fotostrujesrazmeran
intenzitetu svetlosti
i= k × ×× × Ip
Sheme
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 50/56
Sheme
spektrofotometra
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 51/56
Sheme spektrofotometara
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 52/56
Fotometar Jednostavniji uređaji od spektrofotometara
Samo u VIS oblasti spektra Meri se apsorbancija i transparencija obojenih rastvora- određuje se
koncentracija
Kao monohromatori FILTERI
Kako izabrati filter prema boji
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 53/56
Kako izabrati filter prema boji
ispitivanog rastvora?
Boja filtera jekomplementarna boji
ispitivanog rastvora.
To znači da filter trebamaksimalno da propustisvetlost one boje koju rastvormaksimalno apsorbuje.
Ako merimo apsorbanciju žutom
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 54/56
Ako merimo apsorbanciju žutom
rastvoru, izabraćemo filter:
CrveniŽuti
Zeleni
Narandžasti
Plavi
Ljubičasti
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 55/56
Šta je slepa proba?Rastvor = rastvorak + rastvarač
Apsorbuje i rastvorak i rastvarač
Eliminisati apsorbanciju (transparenciju)
rastvarača tako što se kazaljka instrumentadovede na 0 apsorbancije, odnosno 100%transparencije
Na taj način merenjem se dobija samoapsorbancija (transparencija) rastvorka.
Praktične vežbe
7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija
http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 56/56
Praktič ne vežbe
1. SpektrofotometrijaSnimiti apsorpcioni spektar A=f(λ), naći λmax, na toj
talasnoj dužini izmeriti apsorbanciju standardnih
rastvora (koji ste prethodno napravili), nacrtatikalibracionu krivu i sa nje odrediti nepoznatukoncentraciju i molarni apsorpcioni koeficijent.
2. Fotometrija
Izmeriti apsorbanciju i transparenciju standardnog inepoznatog rastvora i izračunati koncentracijukoristeći metodu standarda.