Institute of Marine & Coastal Sciences, Rutgers

University, New Brunswick, NJ, USA

Profesora visitante UABC: monica.bricelj@gmail.com

V. Monica Bricelj

Impactos y manejo de algas

tóxicas en moluscos

PSP = VPN

ASP = VAM

U.S. National Office for Marine Biotoxins and HABs, Woods Hole MA

1970

2006

Expansion global de toxinas PSP

Presencia del productor de PSP (Gymnodinium catenatum) en Baja y Sur de Mexico (Bandt-Schmidt et al 2010))

Expansión de PSP causado por Alexandrium catenella en Chile,1972 -

2009 (cortesía de L. Guzmán, Inst. De Fomento Pesquero, 2015)

Aisén

43°38’ – 49°16’

109,444 Km2

Los Lagos

40°13’ – 43°03

48,583 Km2

Magallanes

48°39’ – 56°32’ 132,033 Km2

• Zona afectada entre 41o y 55o

• Expansión de sur a norte

2001. APEC #201-MR-01.1 & IOC Tech Series No 59, Paris

Programa GOMTOX (2007-2011)

Deep Sea Res. 103 (2014)

Hong Kong

USA CANADA

Spisula

solidissima

surfclam

Placopecten

magellanicus

escalopa

Arctica

islandica

ocean quahog

US$ 3 billones

OBJETIVOS DE GOMTOX

• Evaluar si las 3 spp. de moluscos de aguas profundas podían ser

explotadas desde el cierre por PSP en 1989

• Establecer un protocolo de monitoreo de toxinas PSP en moluscos en 2

fases (aprobado por la ISSC):

1) Detección rápida (“screening”) a bordo

2) Análisis confirmatorio del producto que llega al punto de

embarque (ensayo ratón) previo a la comercialización

• Determinar la fuente de contaminación de moluscos de aguas profundas

Transferencia de toxinas en la red trófica

Acido demoico en la costa Pacífica de Estados Unidos

(CA, WA)

Cangrejos Cancer magister

Anchoas Pájaros, e.g. pelícanos

Navajas Siliqua patula

Mamíferos marinos , e.g. nutrias de mar

Humanos

+

Pseudo-nitzschia spp. – microalgas productoras de ácido demoico

Acumulación de brevitoxinas (PbTxs) en macrofauna bentónica durante un florecimiento

de 9 días de Karenia brevis (100 to 1200 cells ml-1) en la Bahia de Sarasota, Forida

0

1

2

3

4

5

6

2-Feb 8-Feb 9-Feb 11-Feb

µg

Pb

Tx

-3 (

g p

es

o h

úm

ed

o )

-1

Bivalvos

Gastrópodos carnívoros

Crustáceos

(anfípodos)

Poliquetos

Los bivalvos son los principales vectores de ficotoxinas a los humanos

pero también pueden trasferirlas a consumidores secundarios en el

bentos

Bricelj et al. Harmful Algae (2012)

Nivel Regulatorio

Clausura de cosecha de moluscos - 5 cells/ml

DIFERENCIAS EN LA TOXICIDAD

Y RIESGO A LA SALUD PUBLICA

ENTRE ESPECIES DE BIVALVOS

• Las especies difieren en un factor de hasta 100x en su capacidad de acumular toxinas. Se debe a diferencias en la susceptibilidad de los nervios a la saxitoxina

•Algunas spp. son mejores candidatos para la acuicultura en regiones afectadas por mareas rojas

Toxicidades máximas de spp. de NorteAmérica contaminadas en el ambiente natural Diferencias entre especies de bivalvos en la acumulación de PSP

Nivel Regulatorio = 80 µgSTXeq/100g

Crassostrea virginica

Argopecten irradians

Crassadoma gigantea

Chlamys hastata

Ostras Mejillones Escalopas Almejas

Siliqua patula

0 5 10 15 20 25 30 35

Mercenaria mercenaria Siliqua costata

Ensis directus

Arctica islandica Tresus capax

P. staminea R. philippinarum

Saxidomus nuttalli

Spisula solidissima Mya arenaria

Saxidomus giganteus

S. nuttalli

Mytilus edulis

Ostrea edulis

Chlamys rubida

Crassostrea gigas

Placopecten magellanicus

30 25 20 15 10 5 0

Toxicidad PSP (mg STXeq/100g) x 103

• El ranking de toxicidad entre especies difiere para distintas toxinas (PSP vs. DA)

Contaminación por ácido demoico (DA)

Whole body (< 100 mg.g-1

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Do

mo

ic a

cid

co

nte

nt

( m

g.g

-1)

(> 100 mg.g-1

)

100

300

500

700

900

1100

1300

1500

Ostras Alemejas

Mejillones Escalopas

Otros

Nivel Regulatorio = 20 mg.g-1

Crassostrea gigas

Conte

nid

o d

e á

cid

o d

em

oic

o (

µg g

-1)

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12 14

Dias de contaminación

Aci

do

do

mo

ico

en

te

jid

os

(µ

g g-1

)

Mejillones

Osteones

Nivel Regulatorio En el campo mejillones, Mytilus edulis,

alcanzaron 200 mg DAg-1); ostiones,

Crassostrea virginica 0.9 mg g-1

Florecimiento anómalo de Pseudo-nitzschia a bajas

temperatures resultó en cierre de toda la explotación

costera de bivalvos en el NO de Canada

En el laboratorio mejillones alcanzaron 70x la toxicidad de

ostiones (Mafra et al. Aquatic Toxicol. 27 – 2010)

• Se debe a diferencias fisiológicas, morfológicas entre las 2 spp

• Es viable el manejo de biotoxinas por especie para reducer las pérdida económicas

12oC

Efecto de la temperatura en el ostión Americano Crassostrea virginica

• Esta especie generalmente no acumula biotoxinas PSP o DA > Nivel Regulatorio

a temperaturas ≤ 10oC debido a su baja tasa de filtracion a bajas temperaturas

• El riesgo de toxicidad por la ingestión de algas tóxicas en esta spp. es mínimo

hasta que la temperatura supera este nivel. El monitoreo en CT/NY USA

generalmente no se inicia hasta Abril-Mayo

y = 0.001x 2.53

R 2 = 0.99

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 5 10 15 20

Temperature ( °

C)

Ta

sa

de

filt

ració

n (

ml m

in )

-

- Crassostrea virginica

0

20

40 60

80

100

0 10 20 30

Temperatura (oC)

% b

om

be

an

do

Temperatura (oC)

Mactromeris polynyma – Arctic surf clam – Hoki Gai

Músculo aductor

en escalopas

Pie

Roe-on product

(músculo + gonada)

Gonada

Compartimentalización anatómica de toxinas PSP

• El tejido muscular (músculo aductor de escalopas y pie de almejas) en general no contiene toxinas PSP CON EXCEPCIONES (pie de Concholepas chileno)!

• La gonada de Placopecten magellanicus ocasionalmente alcanzo niveles de PSP > 80 µg STX/100 g en Georges Bank, pero no en el mid-Atlantico entre 2004-2007, sugiriendo que estas poblaciones podrian ser explotadas comercialmente (adductor + gonada = “roe-on market”)

• No existe una buena correlacion entre la toxicidad del digestivo y la de la gonada – dificil de predecir

Acido demoico (DA)

30+ derivados de toxinas PSP

Liga a receptores de ácido glutámico - causa pérdida de memoria

Ligan al poro del canal de Na+, bloquean la

entrada de Na+ y causan parálisis

Potencia muy variable

MODO DE ACCIÓN Bioensayo ratón

NEUROTOXINAS

l

312.1

Time (min) 0 5 10 15 20

694.5

708.5

822.5

836.5

894.5

1060.7

1104.7 DA

SpiroB

SpiroD

OA DTX2

DTX1

PTX2sa

C16:0-OA

C16:0-DTX2

876.5

842.5

856.5

828.5

PTX2

AZA

AZA2

AZA3

m/z

1086.7

"DTX3"

C16:1

C18:1

LC-MS/MS Espectrometría

de masas

Métodos químicos para análisis de ficotoxinas

HPLC-FD Cromatografía líquida de

alta resolución

Flu

ore

scen

cia

• La ventaja del LC-MS/MS, aunque más costoso es que permite el monitoreo de

la mayoría de las toxinas con un solo análisis

Flu

ore

scencia

(Immunocromatografía de flujo lateral)

Tests rápidos, immunológicos para análisis in situ de toxinas

PSP

Abraxis test kit (foto

de DeGrasse/FDA

JRT

• Los ensayos in situ son útiles como pre-screening, cuando el sitio de producción

esta muy alejado, y la zona a minto es muy extensa

PROBLEMAS:

- Falsos + cuestan al productor (alto # del JRT durante GOMTOX)

- Falsos - afectan la salud pública

- No siempre son cuantitativos

- No indican el perfil de toxinas PSP

• El Jellet kit fue calibrado con una cepa de alga tóxica (Gt429) con un perfil de

toxinas que puede ser muy ≠ de las cepas locales. Ejemplo de florecimientos en

Long Island, NY (~90% C), y en el Golfo de Maine, GoM (1% C+B).

STXNEO

GTX2/3

B1

C1/2

GTX1/4GTX1,4

GTX2,3

C

B

Las cepas en GoM

tienen ~90% de GTXs

Importancia de la disponibilidad de estandards de toxinas puras

NRC Certified Reference Materials Program (CRMP), Halifax,

Canada

• Acido Demoico

• Acido Okadaico

• Toxinas PSP (STX, NEO, GTX1-4)

• Otras toxinas emergentes:

PTXs, AZAs, YTX, SPX

CRMs de tejidos de moluscos

• Acido demoico (ASP-Mus)

• Acido Okadaico (DSP-Mus)

• Toxinas PSP, AZP

Transformación/metabolismo de toxinas PSP en la almeja S. solidissima

60% 28%

0.8% STX

% M

ola

r

Dias

0 10 20 30 40 50 60 70 80

100

0

20

40

60

80

21oC

dcGTX3

GTX3

STX

NEO

dcGTX2

dcSTX

Cx

GTX2

GTX4 GTX1

A. fundyense

GtCA29

VISCERA

Detoxificación

• Esta spp. es lenta en eliminar toxinas (años)

• Tiene alta capacidad de transformación de toxinas ingeridas (proceso

enzimático) de menos a más potentes, y retención de toxinas PSP

Bricelj et al. Harmful Algae (2014)

PROGRAMAS DE MONITOREO

Programas de monitoreo de biotoxinas en moluscos de aguas

costeras

• Utilizan especies (bivalvos con altas tasas de filtración del plancton) que proveen

detección precoz porque acumulan toxinas rápidamente, y alcanzan altos niveles de

toxicidad – Spp. de amplia distribución geográfica - el mejillón

• La época del año, los sitios y la frecuencia de muestreo se basan en

informacion histórica regional, i.e. probabilidad de que ocurran florecimientos

• Los cierres de explotación de zonas costeras pueden diferir entre especies

comerciales o producto consumido – menor impacto ecónomico

• El monitoreo puede 2ariamente incluir el plancton como

complemento o pre-aviso pero no exclusivamente

Desarrollo de tecnologías avanzadas de detección

de algas tóxicas in situ: Environmental Sample Processor

ESP

ESP

Elementos importantes de un programa de monitoreo regional

• Definición de los objectivos

• Definición clara de las responsabilidades entre

agencias/organismos de gobierno

• Flexibilidad (e.g. cambiar la frecuencia del muestreo

dependiendo de la situación)

• Identificar las especies a muestrear (especie indicadora

y/o especies explotadas)

• Colaboración entre instituciones

CONCLUSIONES

• El conocimiento de la biología del organismo y la

química de las toxinas es clave para entender

procesos a nivel del ecosistema y para el manejo

eficiente de recursos en areas afectadas

• No se puede extrapolar fácilmente entre especies

o entre ficotoxinas

Población

Ecosystem

+: block; (+): partial block; 0: no effect; nd: not determinedaTwarog et al. 1972; bKvitek & Beitler 1991; cBricelj et al. 2005

In vitro nerve sensitivity of bivalves to saxitoxin

SE

NS

ITIV

ITY

Block of action potential by STX (g/ml)BIVALVE sp

COMMONNAME 10

-810

-710

-610

-510

-410

-3

Mytilus edulisa blue mussel 0 0 0 0 0 ndPlacopecten magellanicus

asea scallop 0 0 0 0 0 nd

Humilaria kennerleyib

Kennerly venus 0 0 0 0 0 (+)Mercenaria mercenaria

anorthern quahog 0 0 0 0 (+) nd

Saxidomus giganteusb

butter clamSaxidomus nuttalli

bWashington clam 0 0 0 0 (+) +

Geukensia demissaa

ribbed mussel 0 0 0 0 + ndMya truncata

btruncate softshell 0 0 0 (+) + +

Argopecten irradiansa

bay scallop 0 0 0 (+) (+) ndMya arenaria sensitive c softshell 0 0Tresus capax

bfat gaper 0 0 (+) + + +

Protothaca stamineab

Pacific littleneck 0 (+) (+) + + +Crassostreavirginica

aeastern oyster 0 + + + + nd

(+) + + +

Mya arenaria resistant c softshell 0 0 0 0 0 nd

0 0 0 0 (+) +

3.34 mMT

OX

ICIT

Y

Mamíferos marinos

herbívoros –

Manatíes (Trichetus) vacas

de mar

Algas epífitas adheridas a

pastos marinos de Zostera

marina

Karenia brevis,

microalga productora

de berevitoxinas en el

Golfo de Mexico Inhalación de

aerosoles en las

playas

Problemas respiratorios en

humanos

Riesgos en la transferencia de semilla de moluscos de regiones afectadas for biotoxinas

Desarollo de protocolos para permitir la transferencia de semilla de areas afectadas por florecimientos de algas toxicas • Considerar la presencia de celulas vegetativas o quistes de dinoflagelados

toxicos en los biodepositos como fuente de contaminacion.

• Diferencias en las tasas de detoxificacion entre especies de moluscos y en base a la talla