UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

V Simpósio em Neurociências - UFF

Rede Brasileira de Programas

de Pós-Graduação em Neurociências

Livro de Resumos

Niterói

6/Julho/2015

P-01

MITOMYCIN-TREATED UNDIFFERENTIATED EMBRYONIC STEM CELLS AS

A SAFE AND EFFECTIVE THERAPEUTIC STRATEGY IN A MOUSE MODEL OF

PARKINSON’S DISEASE

Acquarone M1, de Melo TM

1, Meireles F

1,2, Brito-Moreira J

3, Oliveira G

4, Ferreira ST

3,

Castro NG1, Tovar-Moll F

1,2, Houzel JC

1, Rehen SK

1,2.

1) Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil, 2) D’Or

Institute for Research and Education (IDOR), Rio de Janeiro, Brazil, 3) Institute of Medical Biochemistry

Leopoldo de Meis, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil, 4) Oswaldo Cruz Institute,

Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil

Parkinson’s disease (PD) is an incurable progressive neurodegenerative disorder. Clinical

presentation of PD stems largely from the loss of dopaminergic neurons in the nigrostriatal

dopaminergic pathway, motivating experimental strategies of replacement based on cell

therapy. Transplantation of dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells

significantly improves motor functions in rodent and non-human primate models of PD.

However, protocols to generate dopaminergic neurons from embryonic stem cells generally

meet with low efficacy and high risk of teratoma formation upon transplantation. To address

these issues, we have pre-treated undifferentiated mouse embryonic stem cells (mESCs) with

the DNA alkylating agent mitomycin C (MMC) before transplantation. MMC treatment of

cultures prevented tumorigenesis in a 12 week follow-up after mESCs were injected in nude

mice. In 6-OH-dopamine-lesioned mice, intrastriatal injection of MMC-treated mESCs

markedly improved motor function without tumor formation for as long as 15 months.

Furthermore, we show that halting mitotic activity of undifferentiated mESCs induces a four-

fold increase in dopamine release following in vitro differentiation. Our findings indicate that

treating mESCs with MMC prior to intrastriatal transplant is an effective to strategy that

could be further investigated as a novel alternative for treatment of PD.

This work is part of the PhD Thesis of MA. Funding agencies: FAPERJ, CNPq, BNDES,

CAPES.

P-02

DEVELOPMENTAL EXPRESSION OF APP SECRETASES IN THE VISUAL

LAYERS OF RAT SUPERIOR COLLICULUS

Oliveira, A.V.S.*, Vasques, J.F.**, Gonçalves, R.G.J.**, Serfaty, C.A., Campello-Costa, P.,

Faria-Melibeu, A.C.

Universidade Federal Fluminense - UFF

Neural development refers to the processes that generate, plasticity of the nervous system.

Sensory systems formation is essential for normal brain development and function. Amyloid

precursor protein (APP) plays a central role in neuropathology of Alzheimer’s disease (AD)

but is also important to physiological processes such as synapse formation and neural

plasticity. Our group investigates the relationship between the APP and the plasticity of

visual connection during early postnatal development. Post-translational modifications of

APP includes proteolytic processing by enzymes known as α-, β- and γ- secretases to

generate peptide fragments. In non-amyloidogenic pathway, cleavage by α-secretase releases

soluble neurotrophic α-APP (sAPPα). In amyloidogenic pathway, sequential cleavage by β-

secretase and γ-secretase generates β-amyloid peptide (Aβ), which can aggregate in

neurotoxic oligomers. We have previously reported that the expression of APP and its

fragments in the visual layers of the SC is chronologically correlated with the critical period

of the retinocollicular pathway development, suggesting a functional role for this protein in

the multiple events that occur within this time window. In this pathway, activity-dependent

synaptic plasticity results in axonal/synaptic remodeling and topographic organization of

afferent terminals in the visual layers of the superior colliculus (SC). In this work, we studied

the ontogeny of the enzymes involved in APP proteolysis, ADAM10 (a constitutive alpha-

secretase), BACE (for β-site APP-cleaving enzyme) and presenilin-1 (PS1), a critical

component of theγ-secretase complex, in the visual layers of the SC. Lister hooded rats at

different ages ranging from PND7 to PND70 were used for biochemical experiments.

Animals were euthanized and superficial layers of the SC were extracted and processed for

western blot analysis using specific antibodies to the proteins of interest. All experimental

procedures were approved and conducted in agreement with the Animal Research Ethic

Committee (Protocol CEPA/No. 00205/10). Our results show that similar to APP and its

fragments both BACE and PS1 levels seem to be developmentally regulated, with relative

peaks at PND10 and gradually decline after the end of the critical period. On the other hand,

ADAM10 levels remain constant during the period analyzed. Our findings suggest that the

metabolism of APP may be involved in the multiple steps of retinocollicular pathway

development.

Proppi-UFF, CNPQ, Faperj, CAPES

P-03

Role of EGFR in ERK, CREB and calcium signaling in P2Y-induced proliferation of

retinal cells in culture

Lopes, C.G., Jacques, F.J., Loiola, E.C., Ornelas, I.M., Ventura, A.L.M.

Neurobiology Department, Fluminense Federal University, Niterói/RJ.

Introduction: ATP is involved in the proliferation of neural precursors in the developing

chick retina. It can induce Ca2+ mobilization in this tissue, a response that declines in parallel

with the decrease in mitotic activity during retinal development. Since ATP-dependent cell

proliferation can rely on trophic factors such as EGF, we investigated the influence of EGF

receptors (EGFR) on P2Y-dependent cell proliferation and calcium mobilization in cultured

retinal cells. In addition, the effect of EGFR activation and blockade on ERK and CREB

signaling pathways was investigated.Methods: Retinal cells obtained from retinas of 7-day-

old chick embryos were cultured for 2 or 3 days. Cell proliferation was estimated by the

incorporation of [3H]-thymidine. Phosphorylation of ERK and CREB was determined by

western blot using specific antisera. Calcium imaging was carried out on confocal

microscopy using the Fluo-3 AM calcium indicator.Results: Cultures treated for 24 h with

250 µM ADP increased [3H]-thymidine incorporation (213 ± 15 %compared to control, n=9),

an effect that was prevented by 5 µM AG1478, an EGF receptor inhibitor (91 ± 17%

compared to control compared to ADP, n=5). Levels of p-ERK and p-CREB were also

increased by treating the cells with 250 µM ADP (respectively 425 ± 71 %, and 152 ±

1%,compared to control levels, n=3) a response that was decreased by the incubation of the

cultures with 10 µM AG1478 for 3 h (ERK: 195 ± 28 % and CREB: 80 ± 4 % compared to

control and ADP n=3). In contrast to ADP, 100 ng/ml EGF did not induce cell proliferation

(127 ±10%, n=6), neither ERK (73 ± 9%, n=3) nor CREB (127 ± 7, n=4) phosphorylation.

Moreover, activation of nucleotide receptors induced transient increases in intracellular

calcium concentration in the retina cell cultures. Peak values of the increases represented 208

± 8% of the resting levels when cells were treated with 250 µM ADP. The ADP-induced

calcium responses were attenuated when cultures were treated with 5 µM AG1478 for 24 h

(143 ± 5% of the resting level,compared to ADP, n=59 cells).Conclusion: These results

suggest that ADP-induced proliferation as well as ERK and CREB phosphorylation in retinal

cultures are dependent on the activation of EGF receptors. Furthermore, since AG1478

attenuated ADP-dependent calcium responses, our results raise the possibility that EGF

regulates nucleotide responses by affecting the expression of P2Y receptors in the retinal

cultures.

CNPq,Faperj,Proppi-UFF,Pronex-MCT,CAPES

P-04

EFEITO DA INTERLEUCINA-2 NO SISTEMA COLINÉRGICO EM CULTURAS

DE CÉLULAS DA RETINA DE RATOS

1,2Colares, T.G.**,

1,2Granja, M.G.,

1,3Rabelo, A.A.S.,

1,2Giestal-de-Araujo, E.G.

1 Programa de Pós-graduação em Neurociências. Universidade Federal Fluminense - UFF, Niterói - Rio de

Janeiro – Brasil. 2 Departamento de Neurobiologia, Instituto de Biologia. 3 Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, Instituto Biomédico.

O sistema colinérgico se caracteriza pelo neurotransmissor acetilcolina, de seus receptores

(muscarínicos e nicotínicos), dos transportadores CHT1 e VAChT, enzimas de síntese ChAT

e degradação. Dados prévios do nosso laboratório demonstram que o tratamento de células da

retina de animais neonatos com IL-2 por 48h, regula a captação de [H3]Colina de maneira

dose-dependente, sugerindo um efeito modulatório desta citocina sobre o no fenótipo

colinérgico.

O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da IL-2 na modulação dos marcadores

colinérgicos.

Ratos neonatos (P0-P2), da linhagem Lister Hooded, foram sacrificados e suas retinas

dissecadas em solução salina sem cálcio e magnésio (CMF). Posteriormente, as células

passaram por processo de dissociação química em tripsina 0,1%. Depois de dissociadas, essas

células foram plaqueadas na densidade de 105 cel/cm2 em placas de Petri de duas formas:

culturas controle (1 mL de meio 199 com células, acrescido de 1 mL de meio 199) e culturas

tratadas (1 mL de meio 199 com células, acrescido de meio199 contendo IL-2 50U/mL). As

culturas foram incubadas em atmosfera controlada com 5% de CO2 e 95% de ar, mantidas a

37°C por 48 horas. Posteriormente as células foram lisadas e a quantificação proteica foi

realizada pelo método de Bradford. Os níveis de receptores muscarínicos (M1, M2, M3, M4 e

M5), do transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) e do receptor nicotínico alfa 7

foram analisados por Western Blot. Os experimentos foram realizados em triplicata,

considerando diferença significativa com valor de p<0,05. Os procedimentos experimentais

com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFF

(projeto 00124/09).

Nossos resultados demonstram que o tratamento com IL-2, por 48h, induz uma diminuição

significativa nos níveis dos receptores M1 (CT=100%; IL-2=33,36% EPM=4,73%), M2

(CT=100%; IL-2=34,88% EPM=12,13%) e M4 (CT=100%; IL-2=44,48% EPM=6,73%) e

um aumento nos níveis do receptor M5 (CT=100%; IL-2=125% EPM=2,8%) e do VAChT

(CT100%; IL-2=114% n=2). Entretanto, não interferiu nos níveis do receptor M3, e do

receptor nicotínico alfa 7.

Podemos concluir que a IL-2 é capaz de regular o fenótipo colinérgico através da regulação

dos níveis dos receptores muscarínicos e do VAChT em culturas de células da retina de ratos

neonatos no período de 48h de tratamento, com possíveis efeitos no processo de

diferenciação do tecido retiniano.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI e PRONEX

P-05

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF NMDA RECEPTOR IN THE RAT LINE

SELECTED FOR HIGH AND LOW ANXIETY-LIKE RESPONSE

**Goulart, V. G1.

; **Mendonça, H. R1.

; Maisonnette, S2; Rosseti, F

2; Pandolfo, P

1.; Landeira-

Fernandez, J2.; Campello-Costa, P

1.

1.UFF, NITERÓI - RJ - BRAZIL; 2.PUC, RIO DE JANEIRO - RJ - BRAZIL.

Introduction: Anxiety is the emotional dysfunction that afflicts more the quality of human

life. Therefore, the basic nature of research that seeks to understand the neural mechanisms

underlying these disorders are extremely important. Glutamate is the major excitatory

neurotransmitter in the mammalian brain and is important in neural development, plasticity

for learning and memory, and it is also implicated in pathological conditions such as anxiety.

Its actions are mediated by different receptors, including the ionotropic NMDA receptor

(NMDAr) consisting of different protein subunits. The combination of two subunits GluA1

and GluA2 compose two receptors present in greater numbers in the CNS. The aim of this

study was a comparative neurochemical analysis in animal model with a genetic basis of

anxiety. Methods: For this study, we used male Wistar rats previously selected through the

freezing paradigm and characterized as high (CHF) and low (CLF) anxiety-like response,

compared to control animals (CTL). Behavioral tests to evaluate the levels of anxiety, such as

elevated plus-maze (EPM) and light-dark box and memory tests, such as object recognition

task and Y-maze were also used. Moreover, we evaluated the expression and localization of

GluN1, GluN2A and GluN2b subunits of NMDAr. Results and Conclusion: CHF animals

were more anxious than control rats and CLF animals were less anxious than control rats in

terms of both the number of entries into EPM open arms and the percentage of time spent in

these arms. No statistical differences were found in locomotor activity, as measured by the

number of entries into the closed arms of the EPM. In light-dark box, no statistical

differences were found among the groups. In the object recognition task the results indicated

no difference between the three groups. In Y-maze only CHF animals avoided the new arm,

compared to animals CLF and CTL, with impaired memory in this test. Biochemical analyzes

showed a significant increase in the content of GluN1 subunit for CHF and CLF animals

compared to the control. The results also point to an increase in GluN2A subunit in CLF

animal compared to control and CHF animals and increased GluN2B subunit in CHF animals

for CTL and CLF animals. Taken together, these results support the hypothesis that the

differential composition of NMDA subunits participates in the regulation of anxiety-like

behavior in these animals.

CNPq, FAPERJ, CAPES

P-06

CAFFEINE TREATMENT DURING LACTATION DISRUPTS RETINOTECTAL

TOPOGRAPHY IN PUPS: POSSIBLE INVOLVEMENT OF GLIAL CELLS

Silva, B.T.*¹; Menezes, G.D.**¹; Cabral-Miranda, F.² & Campello-Costa, P.¹

1 - UFF - Universidade Federal Fluminense (Outeiro São João Batista, s/n, Instituto de Biologia - Centro -

Niterói/RJ), 2 - UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro (CCS, Av. Brigadeiro Trompowiski S/N, Cidade

Universitaria - Ilha do Governador)

Retinotectal pathways have been used as a model to investigate the mechanisms governing

the development and plasticity in the central nervous system. Adenosine is an important

neuromodulator, which are present in neurons and glial cells. In previous studies, our group

demonstrated the presence of the A1 and A2A adenosine receptors in the superior colliculus

(SC) at different stages of development. Moreover, the treatment with caffeine, a non-

selective antagonist of these receptors, led to a disruption in the visual connection. This study

aims to investigate the indirect effect of caffeine during lactation on the distribution of

retinotectal axons of pups as well as possible modulations on the activation of glial cells in

the retina and SC. Methods: Lister Hooded rats were used. From the day of the birth of their

young, mothers were submitted to oral treatment with caffeine (1g/L) to postnatal day 13 or

21 (PND13 or PND21) of the pups. Control animals received water. We establish fluid intake

monitoring standards for infants and weight gain of the animals submitted to indirect

treatment with caffeine, to observe metabolic changes. After treatment, one group of animals

received intraocular injection of HRP, an anterograde tracer to map the retinotectal

connections or were processed for western blot analysis to compare the contents of GFAP, a

biomarker of activated glial cells. Results: Our results demonstrated that caffeine intake by

the mother during lactation leads to an increase in the retinotectal plasticity at PND13 (n=4).

This effect is characterized by the presence of many fibers in atypical regions of the visual

layer in the SC. Furthermore, there was a tendency to fall in pCREB content in the SC of the

pups in the PND13 (7565±51) compared to the control group (8243±62) (n=3/group). At

PND21, pCREB content decreased significantly (1494±90.41) (n=3/group) compared to the

control group (2650±102.6). At PND21 a marked decrease in glial reactivity (n=3) was

observed both in the retina and superior colliculus when compared to the control. These

effects were reversed by treatment withdrawal. Conclusions: Our results indicate that caffeine

treatment during lactation inhibits CREB phosphorylation and leads to a disruption of the

visual connectivity of the pups. Therefore, we hypothesized that blocking A2aR in glial cells

by caffeine decreases the cAMP-PKA-CREB pathway, weakening the synaptic contacts and

leading to a reorganization of retinotectal circuitry.

UFF-PIBIC, FAPERJ, CNPq, CAPES

P-07

INTRAVITREAL TREATMENT WITH INTERLEUKIN-4 OR INTERLEUKIN-6

RECRUITS DIFFERENT SIGNALING MOLECULES TO MODULATE RETINAL

ACTIVITY

MENEZES, G. D.**, GOULART, V. G.**, CAMPELLO-COSTA, P.

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, NITERÓI - RJ - BRAZIL.

Objectives: Interleukin- 4 (IL-4) and interkeukin-6 (IL-6), are classically known as

antiinflammatory and pro-inflammatory cytokines, respectively. Some studies have

demonstrated effects of both cytokines in different aspects of CNS development. Accordingly

we have previously shown the effect of exogenous application of IL-4 or IL-6 upon

development of visual circuit, using the retinotectal pathway of rodent as a model. Our data

show that both molecules alter the distribution of retinal axons upon superior colliculus in

different stages of development. However the molecular mechanisms underlying these

responses are unknown. The aim of the present research is to investigate the signaling

pathway that is activated after intravitreal injection of IL4 or IL6 in the retina. Methods:

Lister Hooded rats were injected with either IL-6 or IL-4 in the right eye at PND10. Control

matched-group received PBS injection. At PND11 or PND14, animals were euthanasiated.

Retinas were prepared for western blot or immunohistochemistry procedures. We used glial

markers such as GFAP and Iba1 and intracellular proteins such as pSTAT3, pSTAT6, pERK

and pAkt. Nissl staining was also performed in order to evaluate retinal cytoarchitecture after

intraocular injection. Results: The thickness of retinal layers was similar between PBS- and

cytokines treated groups and no pyknotic nuclei or inflammatory profile cells were detected

with Nissl staining. Also, no difference was observed in Iba1 levels in all groups. Concerning

astrocyte marker, IL-4 treated animals presented a lower level of GFAP content compared to

control (PBS-treated rats). On the other hand, the level of GFAP was unchanged in IL-6

treated animal. The data from biochemical analysis revealed that IL-4 treated animals

presented a transient increase in pSTAT6 24h after injection and a more sustained increase in

pERK levels which was detected at PND11 through PND14. IL-6 treated animals presented

an increase in pSTAT3 levels. No difference was observed in pAKT content in any group.

Conclusion: Our data show that exogenous in vivo treatments with IL-4 or IL-6 modulate

different intracellular pathways in the retina, without inducing an inflammatory response.

Moreover these modifications seem to trigger a different pattern of retinal activity, which in

turns could be responsible for the reorganization of retinal afferent in the target.

UFF-Proppi, FAPERJ, CAPES, CNPq

P-08

ENDOCANNABINOIDS PROTECTION AGAINST ISCHEMIC DAMAGE TO THE

RETINA

Araújo, D. S. M.**; Pandolfo, P.; Calaza, K. C.

Laboratório de Neurobiologia da Retina, Laboratório de Neurobiologia do Comportamento Animal.

Departamento de Neurobiologia, Universidade Federal Fluminense – Niterói, RJ.

Objective: the aim of this study is to investigate the functions of anandamide and 2-

arachidonoylglycerol in retinal ischemic events.

Methods: 2-7 days post-hatching (PH) chicks (Gallus domesticus) are killed (CEUA/UFF

no112/12) and, after enucleation, retinal segments are randomly addressed to be control

(incubated in a Ringer with glucose/aerated with 95%O2 e 5% CO2) or ischemic condition

(incubated in a Ringer without glucose/aerated with 95%N2 e 5%O2 – oxygen and glucose

deprivation, OGD) for 50 minutes. In some cases, antagonists were pre-incubated for 10

minutes. Then, retinal segments and their respective incubation solution were collected to

quantify the activity of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH) with a colorimetric

commercial kit (Promega), for the cell viability assay. The percentage of LDH release was

used as a marker of cell viability. We analyzed the data by Kruskal-Wallis test with post-test

SNK through the program BioEstat (versão 5.3, 2007).

Results: We observed that retinal treatments, with different concentrations of the inhibitors of

degradation enzymes of endocannabinoids, URB597 (CTR=100% n=5; OGD=195,2±31,61%

n=5; OGD+URB597 0,1µM=173,1±35,49% n=5; OGD+URB597 1µM=214,7±54,60% n=3;

OGD+URB597 10µM=245,5±47,00% n=5), and URB602 (CTR=100% n=3;

OGD=244,6±17,99% n=3; OGD+URB602 0,1µM=323,8±24,98% n=3; OGD+URB602

1µM=295,6±38,87% n=3; OGD+URB602 10µM=237,5±49,24% n=3) had no effect on

reducing the LDH release induced by OGD. However, the co-exposure to inhibitors of

degrading enzymes and the antagonist of CB1 receptors AM251 (CTR=100% n=4;

OGD=493,3±99,59% n=3; OGD+AM251 10µM=457,7±74,21% n=3; OGD+URB597

0,1µM=414,2±62,18% n=3; OGD+URB597 0,1µM+AM251 10µM=90,17±18,79% n=3)

(CTR=100% n=3; OGD=727,0±15,87% n=2; OGD+AM251 10µM=435,7±35,71% n=2;

OGD+URB602 10µM=639,0±44,26% n=3; OGD+URB602 10µM+AM251

10µM=232,3±26,91% n=3) or CB2 receptors AM630 (CTR=100% n=3;

OGD=317,1±72,60% n=3; OGD+AM630 10µM=286,0±70,60% n=3; OGD+URB597

0,1µM=324,7±76,68% n=3; OGD+URB597 0,1µM+AM630 10µM=82,06±26,80% n=3)

(CTR=100% n=3; OGD=727,0±15,87% n=2; OGD+AM630 10µM=740,3±119,0% n=3;

OGD+URB602 10µM=639,0±44,26% n=3; OGD+URB602 10µM+AM630

10µM=266,1±41,58% n=3) decrease the LDH release, suggesting a neuroprotection.

Conclusion: The data suggest that endocannabinoids can have a protective role in this model

of retinal ischemia. Additionally, the protective effect is dependent on the inactivation of at

least one of the CB receptors.

FAPERJ, CNPq, INCT/INNT/CNPq, PROPPi/UFF, CAPES.

P-09

A2A ADENOSINE RECEPTOR ACTIVATION MODULATES SRC KINASE

ACTIVITY IN cAMP-DEPENDENT MANNER

Silva, P.C.S.*, Vardiero, E. ,Paes-de-Carvalho, R., Pereira, M.R.

UFF

Src kinase is a member of the family of tyrosine kinases involved in many developmental

processes such as cell proliferation, differentiation and survival. The phosphorylation sites

which regulate Src activity include tyrosine 416 (Tyr416), which results in Src activation by

autophosphorylation, and tyrosine 527 (Tyr527) which promotes Src inhibition mediated by

C-terminal Src kinase (Csk) phosphorylation. Thus, Src activity is regulated by

phosphorylation levels at Tyr527 and Tyr416 residues.

Adenosine, a neuromodulator in the CNS, activates different metabotropic receptors,

including the A2a receptor which is coupled to Gs protein and cyclic AMP production. Our

previous results showed that A2a receptor activation decreases Src phosphorylation at

Tyr416. Thus, our objective here was to evaluate the signaling pathways involved in the

regulation of Src activity by A2a receptor activation in retinal cultures.

Retinal cultures were stimulated with CGS21680 (A2a agonist) for 5 minutes and p-Src

levels were evaluated by Western Blot. We observed a decrease in p-Src (Tyr416) induced by

A2a receptor stimulation that was blocked by ZM241385 (antagonist A2a) and SQ22536

(adenylyl cyclase inhibitor). In addition, A2a receptor activation promoted an increase in p-

Src (Tyr 527) and p-Csk induced by A2a receptor stimulation. Similar results were observed

in retinas from 9-day-old chick embryos where CGS21680 promoted a decrease of p-Src

(Tyr416) and an increase of p-Csk.

These results demonstrate that stimulation of A2a receptors induces a decrease of p-Src and

this effect involves the cAMP pathway. Our working hypothesis is that activation of PKA by

A2a receptors leads to Csk activation and Tyr527 phosphorylation, with a consequent

decrease of Tyr416 phosphorylation and Src activity.

CNPq, CAPES, FAPERJ, PRONEX-MCT

P-10

NEUROCIÊNCIAS E SEUS PRIMÓRDIOS

SOUZA, N A P de

Centro Universitário Celso Lisboa

A mente humana sempre foi um dos fascínios ao longo da história, cientistas e filósofos

sempre estiveram em busca por desvelar a mente humana e a relação da mesma com o

funcionamento cerebral. Muitos dos conceitos utilizados atualmente na neurociência moderna

têm suas origens nos antigos médicos e filósofos gregos. Encontramos registros de pesquisas

desde a antiguidade sobre os sintomas de danos no cérebro, porém à época, o coração que era

considerado a sede da alma e o repositório das memórias. Com o passar dos anos houve a

necessidade de dissociar o estudo anatômico da abordagem funcional do sistema nervoso, e

deu-se a criação do termo Neurociência, que engloba o estudo da estrutura e de todas as

funções normais ou patológicas, do sistema nervoso. Os avanços que ocorrem nos dias de

hoje permitem que compreendamos cada vez mais as circuitarias neurais associadas às

diferentes funções mentais, porém questionamentos fundamentais da natureza da mente

humana permanecem em aberto, como por exemplo qual a origem da mente humana, a real

natureza dos processos mentais, são algumas das questões que permanecem sem resposta.

P-11

OMEGA-3/DHA NUTRITIONAL RESTRICTION DELAYS DEVELOPMENT OF

RETINOFUGAL CONNECTIONS AND THE DIFFERENTIATION OF

CHOLINERGIC MARKERS IN THE RODENT VISUAL SYSTEM

Sandre, P. C.** 1; de Velasco, P. C.

2; Rung, P.

1; dos Santos, R. M.

1; Melibeu, A. F.**

1;

Costa, P. C.** 1; Guedes, R. C. A.

3; da Costa, B.A.

3; Serfaty, C. A.**

1

1.UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, NITEROI - RJ - BRAZIL; 2.UNIVERSIDADE FEDERAL

DO RIO DE JANEIRO, RIO DE JANEIRO - RJ - BRAZIL; 3.UNIVERSIDADE FEDERAL DE

PERNAMBUCO, RECIFE - PE - BRAZIL.

In the present work, we studied the impact of a dietary restriction of omega-3 fatty acids on

the development of eye specific segregation and topographical specificity of retinofugal

pathways. We also studied the impact of low omega-3 diets on the differentiation of retinal

layers and cholinergic markers in the retina. Female Lister Hooded rats and their litters were

fed with either control (soy oil) or restricted (coconut oil) omega-3 diets. At various postnatal

ages, rat pups received eye injections of neuronal tracers to visualize retinal axons at their

brain targets. Fatty acids profile analysis indicated that the experimental diet led to a selective

reduction in DHA content in the visual system. Omega-3 restriction induced an increase in

the density of retinal axons in the superficial layers of the SC. This effect was observed

throughout the stratum griseum superficiale (SGS), including the ventral and intermediate

SGS layers at post-natal day (PND) 13, PND28 and PND42. The same pattern of expanded

terminal fields was observed in the retinogeniculate pathways. The supplementation with fish

oil (omega-3 fatty acids) for two weeks was able to reverse the abnormal expansion of the

retinocollicular projection. We also studied possible mechanisms involved in the loss of

synaptic stabilization. Restricted omega-3 groups showed, in the visual layers of the SC

decreased levels of GAP-43 phosphorylated form (pGAP-43) consistent with a reduction in

synaptic stabilization. Omega-3 restriction increased the content of AMPAR subunits (GluR1

and GluR2) and decreased NMDAR (NR1, NR2A and NR2B) subunits. Omega-3 restricted

groups showed a decrease in RXRα content and CREB phosphorylation (pCREB) in the

visual layers of the superior colliculus. Retinal differentiation was also affected by omega-

3/DHA deprivation. We describe a reduction in rhodopsin immunolabeling and also a

reduced labeling of cholinergic markers such as VAchT in the inner nuclear layer and β2-

nicotinic receptors in the ganglion cell layer and inner nuclear layer. The data indicate,

therefore, that the chronic dietary restriction of omega-3 fatty acids delays axonal

elimination, interfering with the maintenance of synaptic connections in the visual system.

Also, the results show that the development of the retina is also delayed, specially the

development of retinal cholinergic transmission.

CAPES

P-12

TRATAMENTO COM IL-1 BETA É CAPAZ DE MODULAR OS NÍVEIS DE TNF-

ALFA EM CULTURAS MISTAS DE CÉLULAS DA RETINA

Oliveira, T. M.** , Giestal-de-Araujo, E.

Universidade Federal Fluminense - UFF

Sabendo do envolvimento desta citocina na sobrevida de CGR, resolvemos analisar se a

própria IL-1 beta (5,0ng/mL) seria capaz de modular os níveis de TNF-alfa em culturas

mistas de células da retina por diferentes intervalos de tempo. Os procedimentos

experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais

(CEUA) da UFF (projeto 00124/09). Ratos neonatos (P0-P2) da linhagem Lister Hooded

foram sacrificados e suas retinas dissecadas em solução salina sem cálcio e magnésio (CMF).

Em seguida, as retinas foram incubadas com 0,1% de tripsina. Posteriormente ocorreu

dissociação mecânica com pipeta Pasteur de ponta afilada. As células foram plaqueadas na

densidade de 100000 cels/cm2 em placas de Petri. As culturas foram mantidas em meio

completo (meio 199, 5% de soro fetal bovino, glutamina e antibióticos) na presença ou não

de IL-1 beta. As culturas foram incubadas em atmosfera controlada com 5% de CO2 e 95%

de ar, mantidos a 37ºC por 15min, 24 e 48h. Todos os experimentos foram realizados em

triplicata. Os níveis de TNF-alfa foram determinados pela análise de Western Blot. Ao

tratamos nossas culturas com IL-1 beta a 5,0ng/mL, observamos uma modulação dos níveis

de TNF-alfa em relação ao controle logo no início do tratamento, em 15 minutos (CT100%

IL-1 beta 25,7±4,525). No período de 24 horas de tratamento com IL-1 beta, observamos uma

discreta diminuição nos níveis do TNF-alfa (CT 100% IL-1 beta 14,59±3,167). Ao

investigarmos os níveis de TNF-alfa em nossas culturas no período de 48 horas, observamos

que o tratamento com IL-1 beta é capaz de aumentar os níveis desta citocina (CT 100% IL-1

beta 34,80±9.970). Nossos dados sugerem que haja uma importante modulação entre as

citocinas TNF-alfa e IL-1 beta em células da retina de ratos, à semelhança do que acontece

em outros sistemas. Baseados nesses resultados podemos sugerir que esta modulação possa

contribuir para o efeito trófico da IL-1 beta na população de CGR.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX, PROPPI-UFF

P-13

Fator ativador de plaquetas resgata a pluripotência de células-tronco embrionárias

murinas diferenciadas espontâneamente

Silva, L. O**¹; G, T, B*¹; Pereira, P. V²; Fragel-Madeira, L.¹

1- Universidade Federal Fluminense 2- Universidade Federal do Rio de Janeiro

As células tronco embrionárias murinas (mES), da linhagem USP-1, são células pluripotentes

e por isso apresentam um potencial ilimitado de auto renovação além da habilidade de se

diferenciar em tipos celulares dos três folhetos embrionários. A capacidade de auto renovação

das mES é mantida in vitro pela ação do fator de inibição de leucemia (LIF) conhecido por

ser secretado por uma série de tipos de células. Dados da literatura demonstram que o

fosfolipídio bioativo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) participa da fisiopatologia de

diferentes processos patológicos e regula várias atividades biológicas, incluindo a

proliferação e diferenciação celular.

Alguns resultados prévios do grupo mostraram também que o PAF estaria resgatando a

expressão de marcadores de pluripotência e diminuindo a expressão de marcadores de

diferenciação após a diferenciação espontânea destas células. Para verificar tal fenômeno,

fizemos um tratamento por 24 horas com PAF após 7 dias de diferenciação espontânea sem

adição de LIF. Analisamos a expressão, através de imunocitoquímica, de marcadores de

pluripotência, como Oct-4 e SSEA-1 e marcadores de diferenciação, como o PAX-6 e

Nestina e a atividade da fosfatase alcalina. Com o objetivo de caracterizar e analisar o efeito

do PAF sobre a pluripotencialidade das células-tronco embrionárias murinas após sua

diferenciação espontânea e visando o entendimento dos mecanismos celulares e moleculares

da manutenção e o possível resgate, através do tratamento com PAF, do estado pluripotente

destas células-tronco. Os resultados demonstraram que quando tratadas com PAF durante

24h, após a diferenciação espontânea, a expressão de marcadores de diferenciação (Pax-6 e

Nestina) diminuem. Em contrapartida, os marcadores de pluripotência (Oct-4, SSEA-1 e

atividade da fosfatase alcalina) aumenta em relação ao controle não tratado com PAF e

diferenciado espontaneamente.

CAPES

P-14

ATP AND GLUTAMATE: MODULATION OF GLIOTRANSMITTERS RELEASE

IN CHICK MÜLLER CELLS IN CULTURE

Loiola, E.C.**; Ventura, A.L.M

Departamento de Neurobiologia, Universidade Federal Fluminense

Objectives: Herein, we investigated the effect of purinergic receptors on glutamate release

and of glutamate receptors on ATP release in addition to their effects on calcium mobilization

in cultured retinal cells.

Methods: Müller glia cultures were obtained from 8-day-old chick embryos and cultivated for

2-3 weeks. To measure glutamate release, cultures were incubated with [3H]-glutamate.

Then, cells were incubated in Hanks´ solution for 15 minutes in the presence or absence of

nucleotides. The supernatant was collected and the radioactivity measured by scintillation

spectroscopy. Exocytosis of ATP-filled vesicles was estimated by examining quinacrine

staining before and after treatments. The release of ATP by the cells was evaluated by

luminescence, using an ATP determination kit of Invitrogen. Calcium imaging was carried

out on confocal microscopy using the Fluo-3 AM calcium indicator.

Results: The activation of purinergic receptors induced transient increases in intracellular

calcium concentration in cultured Mülller glia cells. Peak values of the increases represented

224 ± 8%***, 241 ± 15%*** and 213 ± 10%*** (n>12 cells; ***p<0,001) of the resting

levels when cells were treated with 1 mM ATP, 100 µM Bz-ATP and 100 µM ATP,

respectively. We analyzed labeled glutamate release in cultured glia using the same

purinergic agonists and found an increase in the extracellular content of the amino-acid after

15 min. stimulation (3 mM ATP = 145 ± 10%***, 100 µM Bz-ATP = 149 ± 13%** and 100

µM ATP = 139 ± 6%***; n>5, **p<0,01). On the other hand, 1 mM glutamate induced

calcium increases corresponding to 150 ± 5%*** (n=8) of the resting level. While no change

was detected in quinacrine stained, ATP-containing vesicles for at least 10 min in control

cultures, treatment of the cells with 1 mM glutamate resulted in reduced intracellular levels of

quinacrine fluorescence at the same time interval. Incubation of the cells for 5 min with 1mM

glutamate was also able to increase the levels of ATP in extracellular medium by 179 ± 15 %

(p<0.001, n=19), a response that was blocked by the calcium chelator BAPTA-AM.

Conclusion: These results suggest that cultured glial cells from chick embryo retina can

release glutamate following activation of the calcium-inducing purinergic receptors.

Furthermore, cultured Müller cells have ATP-containing vesicles that can be released in a

calcium-dependent way by activation of glutamate receptors.

CNPq,Faperj,Proppi-UFF,Pronex-MCT,CAPES

P-15

MOUSE EXPERIMENTAL MODEL OF PARKINSON'S DISEASE INDUCED BY 6-

OHDA PRESENTS TEMPORAL MODULATION OF STRIATAL CHOLINERGIC

SYSTEM

FERNANDES, A.C.M.N; HAYASHIDE, L.S; RIBEIRO, M.G.L.; FARIA-MELIBEU, A.C.

Universidade Federal Fluminense, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Campus

Valonguinho, Rua Outeiro São João Batista, Centro, Niterói, Rio de Janeiro, CEP 24210130.

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disease characterized by a severe and

progressive motor impairment due to progressive and specific degeneration of A9

dopaminergic neurons of the substantia nigra compacta. Acetylcholine (ACh) is present in the

striatum via cholinergic interneurons and several studies have shown that cholinergic activity

in the striatum regulates the release of dopamine (DA) through the action of nicotinic

receptors (nAChRs). The nicotinic ACh receptors are expressed in dopaminergic nerve

terminals and the normal activity of striatal neurons depends on the balance between DA and

ACh. Disruption of this balance may contribute to the development of PD. Our group has

shown that the lesion by 6-OHDA induces modulation of the mechanisms of ACh synthesis

and degradation, what suggests the existence of a biochemical machinery that may be

involved in the response to tissue damage within a time window.Therefore, we aimed to

investigate the biochemical changes in the cholinergic system during different survival

periods (1, 2 and 4 weeks after injection of 6-OHDA) in a mouse model of PD, in order to

study the possible striatal cholinergic modulation of these animals. Adult C57Bl6 mice were

anesthetized and submitted to unilateral injection of 6-OHDA (2 μl at a rate of 0.5 µl/5 min)

into the left medial forebrain bundle using stereotaxic procedures. The behavioral test was

performed 1-4 weeks later, when animals were injected intraperitonealy with apomorphine

(0,5mg/kg) and visualized through an open field. Then, the mice were euthanized and

striatum was dissectioned to prepare samples for western blot analysis (we used antibodies

against nicotinic ACh receptors α7, β2 and α6). We have observed a reduction in α6 subunit

content, which was expected since this subunit is exclusively localized in nigrostriatal

dopaminergic terminals. Conversely, α7 and β2 subunits content had a progressive increase

that was accompanied by improvements in motor behavior of the animal. Several studies

have shown that α7 subunit, in dopaminergic neurons is involved in neuroprotection

pathways and that β2 subunit is constitutively expressed. These data suggest that the

availability of ACh may be involved in the remodeling of nAChRs as a result of the

dopaminergic loss, what might contribute to partial improvement in motor behavior observed

in animals submitted to 6-OHDA lesion.

CAPES, PROPPi-UFF, Universal - CNPq

P-16

Interleucina 6 induz autofagia em Células da Retina in vitro

Silva, MS**; Corrêa, GR**; de Araujo, EG**.

UFF

Avaliar o papel da autofagia no efeito trófico da IL-6 sobre as Células Ganglionares da

Retina. Utilizamos ratos neo-natos Lister Hooded. Na sobrevida, a peroxidase foi injetada nos

colículos superiores antes da cultura, que foi tratada com IL-6 (50ng/mL), mantida na estufa

por 48hr, fixada, revelada e as CGR contadas em microscópio de campo claro. Para as

amostras, células mistas da retina foram tratadas com IL-6 por 15, 45 min e 48 hr e utilizadas

no Westernblot para avaliação dos níveis dos componentes da via autofágica (Beclina 1 e

LC3) e também do modulador da via NF-kB. O marcador Laranja de Acridina (LA)

identificou organelas autofágicas por citoquímica. Na análise estatística, a intensidade das

bandas foi analisada pelo programa ImageJ e expressas em percentual do controle. Os

resultados foram expressos na forma de histograma e na apresentação das bandas reveladas.

Os experimentos foram representados graficamente utilizando o programa GraphPad Prism.

Os valores representam a média ± erro padrão, obtidos pelo teste-t Student. Foi significativo

quando p<0,05. Não há diferença nos níveis da Caspase 3 ativada entre as células da retina

tratadas com IL-6 e o CT tanto em 45 min (CT=100%; Casp3=114%±3,79 n=3), quanto em

48hr (CT=100%; Casp3=100%±9,849 n=3) excluindo um possível papel anti-apoptótico.

Inibindo a autofagia nas culturas mistas de células da retina, o efeito trófico da IL-6 sobre as

CGR desapareceu (CT4hr=100%; CT48hr=46,5±1,2; IL-6=100%±3,5;

Inib.Autofagia=43,6±3,2; IL-6+Inib.Autofagia=48,7±2,4 n=3) . O LA demonstrou de forma

qualitativa que a presença de organelas autofágicas é maior nas culturas tratadas com IL-6

comparadas ao CT. A IL-6 se mostrou capaz de alterar os níveis do NF-kB com um aumento

em 45 min (CT=100%; NF-kB= 127%±29,48 n=3) e uma redução em 48 hr (CT=100%; NF-

kB=56%±10,73 n=3). Ela provocou uma tendência de aumento, em 15 min, nos níveis de

Beclina 1 (CT=100%; BECN1=48,5±25,5 n=2). Além de aumentar os níveis de LC3 em 45

min (CT=100%; LC3=95%±9,018 n=3) e reduzi-los em 48 hr (CT=100%;LC3=36%±8,083

n=3). Baseado em nossos resultados observamos que o tratamento das células da retina com

IL-6 foi capaz de alterar os níveis da BECN1 e a LC3, e do fator de transcrição NF-kB. Além

disso, vimos que a inibição da via autofágica é capaz de abolir a sobrevida das células

estudadas. Portanto,os dados obtidos no nosso estudo, nos permitem sugerir que a autofagia

parece mediar o efeito trófico da IL-6 sobre as CGR.

CNPq; CAPES; FAPERJ & PROPPI-UFF

P-17

IL-13 MODULA OS NÍVEIS DE BDNF E pTrkB EM CULTURA DE CÉLULAS

MISTAS DA RETINA DE RATO

Braga, E. P. , Teixeira, T. D. , Braga, L. E. G. Oliveira, R.M., Araujo E. G.

Departamento de Neurobiologia – UFF, Departamento de Fisiologia e Farmacologia – UFF, Programa de Pós-

Graduação em Neurociências

A interleucina 13(IL-13) é uma citocina de 10 kDa, cujos efeitos são bem conhecidos no

sistema imune. Trabalhos anteriores de nosso laboratório mostraram que essa citocina, na

concentração de 5ng/mL, aumenta a sobrevida das células da retina de rato in vitro. A IL-13 é

conhecida por compartilhar funções semelhantes aos da IL-4, já que seus receptores formam

um heterodímero. Dados prévios de nosso grupo, mostram que a IL-4 (50U/mL) aumenta

significativamente os níveis intracelulares de BDNF e, que a neutralização extracelular do

BDNF inibe o efeito trófico da IL-4 na população de células ganglionares. No presente

trabalho, avaliamos o efeito da IL-13 sobre os níveis de BDNF e de seu receptor fosforilado

(p-TrkB) em cultura de células da retina de rato após diferentes períodos de tempo.

Ratos neonatos da linhagem Lister Hooded foram sacrificados e suas retinas dissecadas em

solução salina. Em seguida, foram incubadas em solução de 0.1% de tripsina e, após 20 min,

dissociadas com pipeta Pasteur. As células foram plaqueadas (105 cel/cm2 ) em placas de

petri tratadas com poli-L-ornitina (25μg/mL). As culturas foram mantidas em meio 199(CT)

ou na presença de meio contendo IL-13 (5 ng/ml) e incubadas em atmosfera controlada com

5% de CO2 e 95% de ar, a 37º C por diferentes intervalos de tempo. Os níveis de BDNF e

pTrkB foram determinados pela técnica de Western Blot. Os procedimentos experimentais

com animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFF(00294/12).

Nossos resultados demonstram que o tratamento com IL-13 por 45min não altera os níveis de

BDNF , porém induz um , os níveis intracelulares de BDNF não foram alterados

significativamente em relação ao controle (CT: 100% ; IL-13: 105,8 ± 6,9% n=3).

Entretanto, houve um aumento de aproximadamente 30% os níveis de pTrkB (CT: 100% ;

pTrkB: 129,3±5,1 % n=3). Em 24h os níveis de BDNF apresentaram um decréscimo de

aproximadamente 20% e os níveis de pTrkB permaneceram aumentados (CT: 100% ;

pTrkB: 121,87±9,65 % n=3). Em 48 horas, observamos um aumento dos níveis

intracelulares de BDNF (CT: 100% ; BDNF: 152,5±7,78% n=3) e uma diminuição nos

níveis de pTrkB (CT: 100% ; pTrkB: 88,58±1,72 % n=3).

Baseados nesses resultados, sugerimos que o tratamento com IL-13 na concentração de 5

ng/ml induz uma modulação tanto dos níveis de BDNF intracelular como do pTrkB,

possivelmente pela liberação de BDNF para o meio extracelular o que levaria a fosforilação

de seu receptor.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX, PROPPI-UFF

P-18

IL-13 MODULA O EFEITO PROLIFERATIVO DO EGF EM CÉLULAS DA

RETINA DE RATOS: ENVOLVIMENTO DA SRC E DO NFkB

Teixeira, T. D. , Braga, E. P., Braga, L. E. G. , Araujo, E. G.

Departamento de Neurobiologia – UFF, Departamento de Fisiologia e Farmacologia – UFF, Programa de Pós-

Graduação em Neurociências

O Fator de Crescimento Epidermal (EGF) pertencente a família do EGF. A interleucina 13

(IL-13) pleotropica e seus efeitos bem conhecidos no sistema imune. Trabalhos do nosso

laboratório mostraram que essas citocinas isoladamente aumentam a proliferação das células

da retina de rato in vitro, porém o tratamento concomitante de EGF e IL-13 induz uma

diminuição do efeito proliferativo do EGF. Objetivos: No presente trabalho avaliamos o

envolvimento da via da Src e do fator de transcrição NFkB no efeito da IL-13 sobre a

proliferação induzida pelo EGF. Métodos: Ratos neonatos da linhagem Lister Hooded foram

sacrificados e suas retinas dissecadas em solução salina. Em seguida, foram incubadas em

solução de tripsina e após triturada com pipeta Pasteur. As células foram plaqueadas na

densidade de 105 cel/cm2 em placas de Petri. As culturas foram mantidas em meio 199 (CT)

ou na presença de meio contendo IL-13 e ou EGF e incubadas em atmosfera controlada com

5% de CO2 e 95% de ar, mantidos a 37ºC. Os níveis de p-Src e p-NFkB foram determinados

pela técnica de Western blot. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de

Ética no Uso de Animais da UFF (00294/12). Resultados: Dados prévios já demonstraram

que o tratamento com IL-13 (1ng/mL) induz aumento de 30% na proliferação e que o

tratamento com EGF (0,1ng/mL) aumenta em até 100% a proliferação de células da retina em

48h. Quando tratamos as culturas com EGF, na presença de IL-13, houve uma diminuição no

efeito proliferativo do EGF em 48, 72 e 96h. Neste trabalho mostramos que o tratamento com

IL-13 (1ng/mL) induz aumento em 40% nos níveis do p-NFkB (CT 100% p-NFkB 140,4±6,8

n=3) em 48h em relação ao controle e na cultura tratada com EGF altera os níveis do NFkB

em 50% (CT 100% p-NFkB 166,5±12,2 n=3), porém quando tratamos as culturas com EGF,

na presença de IL-13, houve uma pequena alteração de 20% do p-NFkB (CT 100% p-NFkB

119,8±2,3 n=3). Avaliamos também o envolvimento da p-Src, quando tratamos as culturas

com IL-13 ocorreu um aumento nos níveis da p-Src em 40% (CT 100% p-Src 149,5±4,9 n=3)

e na cultura tratada com EGF não houve alteração nos níveis da p-Src (CT 100% p-Src

121,4±7,0 n=3), em contrapartida o tratamento em conjunto dessas duas citocinas aumentou

em 90% os níveis da p-Src (CT 100% p-Src 202,1±3,4 n=3). Conclusão: Nossos dados

sugerem que o tratamento concomitante com IL-13 e EGF induza uma diminuição da

proliferação celular possivelmente através da ativação da via da Src e da via do NFkB.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX, PROPPI-UFF

P-19

PROTEIN SYNTHESIS INHIBITION INDUCES NITRIC OXIDE-DEPENDENT

NEURONAL SURVIVAL VIA AKT ACTIVATION

Gladulich, L**. , Cossenza, M, Socodato, R, Mejía-García, T.A, Portugal, C.C, Paes-de-

Carvalho, R.

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Nitric oxide (NO) regulates death and survival events in the CNS. Our group has shown that

NO is capable to activate AKT by Ser 473 phosphorylation in retinal nerve cells in vitro. We

have also demonstrated that protein synthesis inhibition increases intracellular free L-Arg and

can also promote NO synthesis via nNOS. Inhibition of protein synthesis has been described

as a classical paradigm to prevent developmentally-regulated neuronal loss since it abrogates

the expression of cell death-associated factors. Therefore, we try to investigate if protein

synthesis inhibition could be involved in NO/AKT activated cell protection.

Initially we sought to observe if classical protein synthesis inhibitors (CHX and anisomycin)

could increase intracellular NO levels and if said increase was due to increase of L-Arg

availability. Using Griess method, a clear raise in intracellular NO concentration was

observed in cultures treated with CHX or anisomicyn. Furthermore, this raise was completely

inhibited by NOS inhibitor L-NAME. In order to directly evaluate NO accumulation induced

by CHX we used DAF-FM-DA, a NO-sensitive fluorescent probe and the same effect was

observed.

In order to evaluate protein synthesis inhibition effects on cell survival we maintained our

cultures in serum-deprived medium containing or not CHX. Indeed, serum-deprivation

strongly promoted cell death, an effect completely abolished when cultures were also treated

with CHX. In addition, when these tratments were associated with nNOS or AKT inhibitors

(7-NI and trisciribine, respectively),CHX loses its neuroprotective effects. In a more

aggressive death approach, we induce neurotoxicity death using NMDA for 20 hours

(100µM). Once again, CHX treatment proved effective in preventing cell death, and this

protection was lost in the presence of 7-NI.

We hypothesized that protein synthesis inhibition might also increase intracellular L-Arg

availability to induce a NO-dependent AKT activation, leading to neuronal survival in retinal

cultures.

FAPERJ, CAPES, CNPQ, PROPPI-UFF

P-20

SULFASALAZINE AND VALPROIC ACID REDUCE GLIOBLASTOMA CELL

VIABILITY

CARLOS GUSTAVO GARCIA1; DEBORAH CHRISTINE LIMA E SILVA1; SUZANA

ASSAD KAHN2; FERNANDO ASSUNCAO2; LUIZ HENRIQUE M. GERALDO2;

MARCOS JOSE FERREIRA1; ANNIBAL DUARTE PEREIRA NETTO1; FLAVIA R.S.

LIMA2; VIVALDO MOURA NETO2; MARCELO P.A. COSSENZA1.

1.UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, NITEROI - RJ - BRAZIL; 2.UNIVERSIDADE FEDERAL

DO RIO DE JANEIRO, RIO DE JANEIRO - RJ - BRAZIL.

Human multiform glioblastomas (GBM) are very aggressive central nervous system tumors

and resistant to chemo/radiotherapies, leading patients do decease in 12 months. It has been

demonstrated that inhibition of xC- system, a glutamate (relase)/cystine (uptake) exchanger,

represents the rate-limiting step of glutathione (GSH) synthesis, an essential component for

protection against oxidative stress. The xC- system is composed by a catalytic (xCT) and

regulatory (4F2hc) subunits and it’s described that sulphasalazine (SAS) is a potent inhibitor

of the system, diminishing GSH synthesis. Valproic acid (VPA) presents a histone

deacetylase family (HDAC) inhibitory activity and the effect of enhancing reactive oxygen

species (ROS). These effects have been associated to death induction on glioma cells. The

aim of this work is to verify how SAS and VPA act solely or in a combined way related to

xC- system and the generation of oxidative stress in GBM cells in culture. Methods: U87MG

human glioblastoma cell lines, GBM02 and GBM95 human glioblastoma cells (CONEP nº

2340), rat cortex, rat astrocyte and human astrocyte cells were harvested for 24h and treated

with SAS and/or VPA for 48h with various concentrations. After, cells were submitted to cell

count; immunocytochemistry for KI67 proliferation marker; ethidium homodimer (EtD-1)

death marker incorporation; western blot assay for xCT protein; L[³H]glutamate uptake and

relative intracellular ROS determination by fluorescence microscopy. We were able to

observe the treatment with SAS and/or VPA was able to diminish glioma cell number in vitro

and the combination of both drugs resulted in a most robust effect compared to drugs alone

after 48h treatment. The same effect was observed for EtD-1 incorporation and KI67

immunoreactivity in glioma cells, but rat cortex or astrocytes cultures, as well as human

astrocytes’, maintained the same parameters unaltered with combined or alone treatments.

We verified that treatment with SAS and SAS+VPA did not alter xCT protein levels after 48h

treatment, although a robust inhibition of total intracellular content GSH (next to 50%) and

xC- system uptake was observed on SAS or SAS+VPA treated U87MG and GBM02 cells.

We observed that SAS treatment is able to diminish intracellular antioxidant defenses while

and enhance ROS intracellular content, as well as VPA. Thus, combined treatment with SAS

and VPA get both effects together, leading glioblastoma to augment cell death.

FAPERJ, CAPES, CNPq, PROAES/UFF

P-21

The coffee component Chlorogenic acid activates the Csk/Src pathway in microglia and

blocks glutamate-mediated retinal neuronal death

Domith, I**., Socodato, R., Portugal, C. C., Oliveira, N. A**., Paes-de-Carvalho, R.,

Cossenza, M.

1.DEPARTMENT OF NEUROBIOLOGY, INSTITUTE OF BIOLOGY, PROGRAM OF NEUROSCIENCE,

FLUMINENSE FEDERAL UNIVERSITY, NITERÓI RJ BRAZIL;2.DEPARTMENT OF PHYSIOLOGY

AND PHARMACOLOGY, BIOMEDICAL INSTITUTE, PROGRAM OF NEUROSCIENCE, FLUMINENSE

FEDERAL UNIVERSITY, NITERÓI RJ BRAZIL.

Phenolic acids display several antioxidant properties and have been associated with

decreasing inflammation in different cellular

paradigms. Chlorogenic acid (CGA) is a phenolic acid that has been shown to regulate

activation of microglial cells at high doses.

Microglia represents a class of resident immune cells of the central nervous system which

release neuromodulators and can regulate

synaptic transmission. However, microglia may be involved in neuronal loss during

neuroinflammatory conditions mainly by the release of cytotoxic doses of glutamate. The

activity of cytoplasmic tyrosine kinases, such as those from the Src family, is enhanced

during neuroinflammation but the role of Src in microgliamediated glutamate extracellular

accumulation or microgliainduced neuronal damage is elusive. We used the microglial cell

line N9 and purified cultures of 8dayold chick embryo retinal neurons as experimental

models. To evaluate protein expression, we used the western blot technique and

immunocytochemistry with specific antibodies to measure protein expression and

morphological parameters. We used ethidium homodimer1 as a probe to evaluate cell death

on both cell culture models. Extracellular glutamate was measured in N9 cultures by the

formation of alphaketoglutarate and NADH in a reaction catalyzed by glutamate

dehydrogenase. We show that CGA is a potent inhibitor of basal or LPSevoked microglial

activity evaluating the CD11b expression by immunocytochemistry, CGA also decreased Src

function by activating its endogenous repressor Csk. Blocking Src expression with

lentiviruses containing specific shRNAs for this proteins decreased microglial extracellular

glutamate accumulation (73.6% ± 6.4, N=3). On the other hand, shCsk promoted and increase

of extracellular glutamate (149.6% ± 10.3, N=4). Furthermore, microgliadependent glutamate

extracellular accumulation activates NMDA receptors to trigger retinal neuronal cell death.

Microglia treatment with CGA prevented this glutamate excitotoxicity in retinal neurons. In

conclusion, we found that 1) increased Src activity in microglia promotes an accumulation of

extracellular glutamate and triggers retinal neuronal cell death, and 2)CGA is strongly

efficient in counteracting this microgliainduced excitotoxicity by inhibiting Src. The results

also support the hypothesis that Src inhibition by CGA is mediated through activation of the

PKA/Csk pathway.

FAPERJ, PIBIC/CNPq e CAPES

P-22

INIBIÇÃO MEDIADA POR AMP CÍCLICO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS

GLIAIS APÓS LESÃO MECÂNICA DE CULTURAS DE RETINA DE EMBRIÃO DE

GALINHA

*Santos, L, R, D., *Silva, I, C. **Silva, T. M., Pereira, M. R., Ventura, A. L. M.

Departamento de Neurobiologia, Universidade Federal Fluminense.

INTRODUÇÃO: O AMP cíclico (AMPc) é um sinalizador intracelular produzido a partir da

ativação da adenilil ciclase por receptores acoplados à proteína Gs. Neste trabalho

investigamos o papel deste nucleotídeo cíclico no crescimento de células gliais de retina em

culturas submetidas à lesão mecânica.

MÉTODOS:

Culturas de retinas de embrião de galinha com oito dias (E8) foram cultivadas por sete dias

(E8C7) e lesadas mecanicamente para gerar uma área livre de células. A área da lesão das

culturas foi fotografada sob iluminação de contraste de fase em microscópio Nikon Eclipse

(objetiva de 10x) e a área livre de células determinada pelo programa Image J.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

O tratamento prolongado das culturas lesadas com 0,5 mM de RO 20-1724, um inibidor da

fosfodiesterase dependente de AMPc foi capaz de inibir o crescimento das células gliais para

a área de lesão. Enquanto a área livre de células nas culturas controle diminuiu de 19,4 ± 0,9

em E8C7 para 4,7 ± 1,3 mm2 x 10-2 em E8C10, esta área diminuiu de 19,1 ± 1,8 para 14,8 ±

2,1 mm2 x 10-2 (N = 5) nas culturas tratadas com RO 20-1724. Já o tratamento das culturas

com 100 µM de IBMX, outro inibidor da fosfodiesterase, também foi capaz de inibir o

crescimento das células gliais para a área da lesão após 3 dias de tratamento (E8C10: controle

= 9,8 ± 0,9 mm2 x 10-2; IBMX = 16,2 ± 1,5 mm2 x 10-2; N = 3). Para confirmar um efeito

inibitório do AMPc sobre o crescimento de células gliais, culturas submetidas à lesão foram

tratadas com forskolina 10 μM, um potente ativador da adenilil ciclase. Este tratamento foi

capaz de inibir o crescimento das células após 3 dias de tratamento (E8C10: controle = 6,3 ±

0,8 mm2 x 10-2; forskolina = 16,4 ± 1,8 mm2 x 10-2, N = 4). Resultados semelhantes foram

obtidos após 3 dias de tratamento com 8-CPT-AMPc 200 µM, um análogo permeável do

AMPc (E8C10: controle = 6,3 ± 0,8 mm2 x 10-2; 8-CPT-AMPc = 19,9 ± 1,5 mm2 x 10-2,

n=4).

CONCLUSÕES: Estes resultados em conjunto sugerem que o aumento intracelular de AMP

cíclico seja capaz de inibir o crescimento glial em culturas de células de retina de embrião de

galinha submetidas à lesão mecânica.

CAPES, CNPq, PROPPi-UFF, FAPERJ.

P-23

EFEITOS DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DAS ALGAS VERMELHAS Amansia

multifida E Meristiella echinocarpa EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE

CONVULSÃO INDUZIDO POR PENTILENOTETRAZOL E ESTRICNINA

NONATO D.T.T.1**, ADJAFRE B.L.

1**, NOGUEIRAA. O.

1*, FARIAS L. G. O.

1*,

ALENCAR D. B.2**, ASSREUY A. M. S.

1 ARAGÃO G. F.

1, CHAVES E. M. C.

1

1. Instituto Superior de Ciencias Biológicas- ISCB, Laboratório de Fisio-Farmacologia da Inflamação,

Universidade Estadual do Ceará (UECE). Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Itaperi, 60714-903, Fortaleza-CE,

Brasil; 2. Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias/CCA, Departamento de Engenharia de

Pesca, Laboratório de Produtos Naturais Marinhos, Campus do Pici, Av. Mister Hull, s/n, Caixa Postal 6043,

60455-970 Fortaleza, CE, Brasil

Macroalgas marinhas são ricas em compostos bioativos com atividades anti-inflamatória,

antimicrobiana, antitumoral, antiviral e antioxidante (Mayer et al. 2011). Desta forma, o

estudo de produtos extraídos de algas marinhas vermelhas tem despertado interesse, como

novas estratégias de tratamentos de várias patologias. No entanto, no sistema nervoso central

(SNC) até o momento, não há relatos das potencialidades terapêuticas de tais produtos. O

objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos dos extratos alcoólicos das algas vermelhas

Amansia multifida e Meristiella echinocarpa em modelos experimentais de convulsão

química induzida por Pentilenotetrazol (PTZ) e Estricnina (EST). As algas vermelhas

Amansia multifida e Meristiella echinocarpa foram coletadas durante a maré baixa, em

Paracuru (São Gonçalo do Amarante, Ceará, Brasil). Em seguida foram lavadas com água

destilada, para remover epífitas e outros organismos do solo, secadas, maceradas e

liofilizadas. A amostra liofilizada foi submetida à extração duas vezes com etanol a 70% em

1:20 (m/v). Os extratos etanólicos de A. multifida (EEAm) e M. echinocarpa (EEMe) foram

concentrados por destilação sob pressão reduzida antes da sua utilização nos ensaios

biológicos. Camundongos Swiss fêmeas (25 a 35 g) foram mantidos em ciclo claro/escuro de

12 h, com livre acesso a água e ração. EEAm (2.5, 5, 10 mg/kg) e EEMe (10, 20, 40 mg/kg)

foram dissolvidas em salina estéril (NaCl 0,9%) e administradas por via intraperitoneal (i.p.)

30 min. antes da administração de PTZ (100 mg/kg; i.p.) ou EST (20 mg/kg; i.p.). O grupo

controle recebeu salina. Imediatamente após a administração do PTZ ou EST, os animais

foram colocados em caixas individuais e observados por 20 min. Os experimentos foram

aprovados pelo Comitê de Ética e para o uso de animais de experimentação da UECE (CEUA

n°3319515129/14). O EEAm não inibiu as atividades convulsivantes promovidas por EST e

PTZ. O EEMe também não inibiu a atividade convulsivante promovida pela EST, mas

aumentou a latência de morte no modelo de convulsão induzida pelo PTZ na dose de 20

mg/kg (446,6 ± 112,3 vs controle: 37,67 ± 6,433). Podemos concluir que a EEMe, mas não a

EEAm apresenta efeito neuroprotetor no modelo de convulsão induzida por PTZ.

CNPQ

P-24

ACTIONS OF CAFFEINE ON GABAERGIC SYSTEM OF DEVELOPING CHICK

EMBRYO RETINA

Pereira-Figueiredo, D**; Brito, R**; Paes-de-Carvalho, R; Calaza, K.C

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Objectives: To evaluate the effects of 2-day in vivo exposure to caffeine on GABAergic

system of chick embryo retina.

Materials and Methods: This project was approved by the animal research ethics committee

of the Federal Fluminense University (no 112/09). Eggs of Gallus domesticus with 14

embryonic days (E14) were injected with caffeine (30mg/mL), or vehicle (control). At E16,

retinas were collected and submitted to western blot, immunohistochemistry, or [³H]-GABA

uptake and release techniques. The results obtained from western blot and GABA

immunoreaction were quantified through optical densitometry mediated by ImageLab and

ImageJ softwares and analyzed by teste T. Number of GABA+ cells were counted in 5 fields

in each triplicate and analyzed (test T). Results of [³H]-GABA uptake and [³H]-GABA-

release induced by glutamate were obtained as CPM through a liquid scintillation technique

and statistically analyzed.

Results: Caffeine induced an increase in the immunoreactivity of GABA in amacrine cells

(vehicle=100% n=4; caffeine=124.8±9.21 n=4 P<0.05), horizontal cells (121.6±6.8% n=4

p<0.05) and cells in the ganglion cell layer (145.9±19.9% n=4 p<0.01). Although, caffeine

reduced the levels of GAT-1, a GABA transporter subtype (vehicle= 100% n=4

caffeine=60.71±11.48% p<0.05 n=7) we were not able to find changes in [³H]-GABA uptake

during 1 hour (vehicle=100%, n=6; Caffeine=103±11.71%, n=6), or 40 minutes of incubation

(vehicle=100% n=8; caffeine=101.6±7.44% n=8). Glutamate-induced [³H]-GABA release

was also unaffected by caffeine treatment (vehicle=6.54±1.31% n=5; caffeine=6.84±1.11%

n=6)

Even though GAD protein levels did not suffer any effect upon caffeine treatment,

(vehicle=100% n=10, caffeine=104.2 ± 8.944% n=10), we noticed a decrease in the number

of GAD+ amacrine cells (vehicle=100% n=4; caffeine=60.7917% p<0.01 n=4).

Conclusions: This data suggests that caffeine can modulate some aspects of GABAergic

system in the developing chick embryo retina. However, the mechanism responsible for the

increase in the GABA cell content remains to be elucidated.

CAPES, CNPq, Faperj, PROPPI

P-25

ABORDAGEM DE ENFERMAGEM SOBRE A PLASTICIDADE CEREBRAL NA

RECUPERAÇÃO DO IDOSO: UMA INTEGRAÇÃO ENTRE CORPO E MENTE

1Lídia Marina do Carmo Souza. Enfermeira. Especialista em Educação. Discente do

(MPES/EEAAC/UFF) – limarcas@oi.com.br. 2Rose Mary Costa Rosa Andrade Silva.

Enfermeira. Filósofa. Doutora. Orientadora do MPES/EEAAC/UFF –

roserosauff@gmail.com. 3Eliane Ramos Pereira. Enfermeira. Pós-Doutora. Coorientadora do

MPES/EEAAC/UFF – elianeramos.uff@gmail.com. 4Lígia Cordeiro Matos Faial. Médica.

Discente do MPES/EEAAC/UFF – licordeiromatos@yahoo.com.br. 5Sueli Maria Refrande.

Enfermeira. Mestrada e Doutoranda pela EEAAC/UFF. susurefrande@gmail. 6Priscila da

Silva Miranda. Discente do Bacharelado em Enfermagem pela EEAAC/UFF. Monitora em

Imunologia e Bolsista em desenvolvimento acadêmico. primiranda23@gmail.com.

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF, ESCOLA DE ENFERMAGEM AURORA DE

AFONSO COSTA – EEAAC, MESTRADO PROFISSIONAL ENSINO NA SAÚDE – MPES

Descritores: Plasticidade cerebral; Idosos; Enfermagem.

INTRODUÇÃO: Atualmente, as doenças crônicas como o diabetes e a hipertensão arterial

sistêmica representam um importante problema de Saúde Pública para o Brasil1,2. Dado ao

seu potencial de provocar o acidente vascular encefálico (AVE), que cursa com a perda

repentina da função neurológica, decorrente à interrupção do fluxo sanguíneo para o encéfalo,

privando-o de oxigênio e de nutrientes essenciais3. O AVE isquêmico é o tipo de agravo

comum entre pessoas idosas, impingindo-lhes imobilidade física. MÉTODOS: Revisão de

literatura, utilizando livros didáticos e os recursos da biblioteca virtual de saúde (BVS), entre

2008-2014. OBJETIVO: Demonstrar a capacidade cerebral, de reconstituição dos

movimentos musculares perdidos em pacientes idosos, acometidos por AVE.

RESULTADOS: Foram 05 os textos disponíveis on line em língua vernácula e 01 livro

didático, que fundamentaram a DISCUSSÂO: Quando o cérebro apresenta uma área com

funcionamento precário, o mesmo utiliza-se de áreas adjacentes, para suprir tal necessidade4.

Ainda que os movimentos adquiridos pós-precariedade cerebral, não correspondam aos

antecessores, os mesmos demonstram que a Plasticidade – um processo adaptativo cerebral4,

com propriedades de atuar na estrutura e função do sistema nervoso afetado, a partir da

interação com o meio externo, levando informações ao meio interno5. O Brain-derived

neurotrophic factor (BDNF), uma proteína, importante ao desenvolvimento do sistema

nervoso adulto, exerce ações neuroprotetoras em doenças neurodegenerativas, como a

depressão, a esquizofrenia, o transtorno obsessivo-compulsivo, a doença de Alzheimer e a

esclerose múltipla ou após lesão cerebral5. Apresentando influência na plasticidade cerebral,

assim como no aprendizado e na memória. Tal proteína é também responsável pela

neuroplasticidade relacionada ao exercício físico, sendo sintetizada e liberada pelo músculo

esquelético, exercendo uma função trófica nos neurônios motores5. CONCLUSÂO: Sendo o

corpo dotado de uma interioridade, não explicável somente pela imanência da consciência e

nem pela sua exterioridade6, pode-se conceber que a essência entre o campo externo e o

interno, seja a multiplicidade que envolve a integralidade, a subjetividade e singularidade das

pessoas, que a enfermeira busca estimular, quando administra cuidados técnicos focados no

corpo e, espirituais focados nas estruturas mentais.

P-26

INTERFACE ENTRE EDUCAÇÃO E A ERGONOMIA MENTAL DOS

TRABALHADORES DA SAÚDE

1Lídia Marina do Carmo Souza. Enfermeira. Especialista em Educação. Discente do

(MPES/EEAAC/UFF) – limarcas@oi.com.br. 2Rose Mary Costa Rosa Andrade Silva.

Enfermeira. Filósofa. Doutora. Orientadora do MPES/EEAAC/UFF –

roserosauff@gmail.com. 3Eliane Ramos Pereira. Enfermeira. Pós-Doutora. Coorientadora do

MPES/EEAAC/UFF – elianeramos.uff@gmail.com. 4Lígia Cordeiro Matos Faial. Médica.

Discente do MPES/EEAAC/UFF – licordeiromatos@yahoo.com.br. 5Sueli Maria Refrande.

Enfermeira. Mestrada e Doutoranda pela EEAAC/UFF. susurefrande@gmail. 6Priscila da

Silva Miranda. Discente do Bacharelado em Enfermagem pela EEAAC/UFF. Monitora em

Imunologia e Bolsista em desenvolvimento acadêmico. primiranda23@gmail.com.

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF, ESCOLA DE ENFERMAGEM AURORA DE

AFONSO COSTA – EEAAC, MESTRADO PROFISSIONAL ENSINO NA SAÚDE – MPES

INTRODUÇÃO: A Política Nacional de Educação Permanente em Saúde (PNEPS1, 2004)

visa fortalecer o SUS, através da educação dos profissionais da saúde2. MÉTODO: Revisão

integrativa de literatura, utilizando os recursos virtuais no espaço 2004-2013, mediante

utilização dos descritores: Enfermagem; Educação continuada; Saúde, para atender ao

OBJETIVO: Conhecer como a PNEPS, pode contribuir com a ergonomia mental dos

trabalhadores da saúde? RESULTADOS: Selecionou-se 05 publicações disponíveis na

biblioteca virtual de saúde. DISCUSSÂO: A ergonomia coloca-se como aliada da PNEPS,

uma vez que o prefixo Ergon e o sufixo Nomos, provenientes do grego indicam “trabalhar” e

“legislação”3. A ergonomia tem como finalidades, promover a adequação ou modificação

dos sistemas de trabalho e das atividades, às características, habilidades e limitações das

pessoas3; já a PNEPS - também com caráter humanitário, busca além de educar para a saúde

no trabalho, atender a saúde física e mental, integralizando outras dimensões humanas, na

busca do bem-estar físico, mental e social4, dignificado o trabalhador, com a promoção do

equilíbrio entre a satisfação profissional e a vida dentro e fora do ambiente de trabalho5.

CONCLUSÃO: A PNEPS como um instrumento voltado à construção de um saber-fazer e

refazer as ações profissionais age como um processo ergonômico, auxiliando o trabalhador,

na criação de novas habilidades individuais e coletivas, permeadas por mudanças que

somente a educação pode promover, na transformação dos comportamentos cognitivos,

afetivos e psicomotores das pessoas, permitindo a construção ou a reconfiguração de atitudes

seguras e humanizadas, durante a prestação da assistência na área da saúde.

P-27

P2Y1 receptor modulates cell proliferation in vivo of rat retina

¹ Pereira, L. A.¹**, ¹ Magalhães, C.F.**, ¹ Repossi, M.* , ² Sholl-Franco, A., ¹ Ventura, A. L.

M. and ¹ Fragel-Madeira, L.

¹Department of Neurobiology, Institute of Biology, Fluminense Federal University; ²Institute of Biophysics

Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro.

In vertebrates the histogenesis of the retina is guided by extrinsic and intrinsic mechanisms,

in which adenine nucleotides have been widely studied as being important to many processes

involved with nervous system development. Previous studies from our group demonstrated

that exogenous ATP was able to regulate the proliferation of retinal progenitor cells in vitro

via P2Y1 receptor, a G protein coupled receptor. Based on these results, the objective of this

study was to evaluate the function of adenine nucleotides in vivo during the development of

the retina of newborn rats. The intravitreal injection of PPADS, a P2 receptors inhibitor,

decreased the number of proliferating cells labeled with BrdU in approximately 23% at the

concentration of 1000 µM in the P2 animals. Furthermore, we identified the presence of

P2Y1 receptor in all layers of the retina at P2 animals, including proliferating Ki-67 positive

cells in neuroblast layer, suggesting that it is a possible candidate receptor for the action of

adenine nucleotides on the neuroblasts proliferation. Indeed, intravitreal injection of

MRS2179, a selective antagonist of P2Y1 receptor, at the concentration of 100 µM reduced

approximately 21% of the neuroblasts proliferation at P2 animals. No profile of cell death

was observed during the treatment with this drug. There was no change in expression of the

p27 protein, a cyclin-dependent kinase inhibitor, and no alteration in the number of phospho-

histone H3 cells after the treatment with MRS2179. Intravitreal injection ADPβ-S and ATPɣ-

S, a non-hydrolysable analog of ADP and ATP respectively, at the concentration of 100 µM

did not affect the proliferation rate. However, in the presence of apyrase, an enzyme that

hydrolyzes nucleotides, both ADPβ-S and ATPɣ-S, at the same concentrations described

above, increased the number of proliferating cells in about 30%. Increasing endogenous ATP

at P4 animals by the treatment with ARL67156, an ectonucleotidase inhibitor at the

concentration de 200 µM, stimulated the proliferation of retinal cells in approximately 50%.

Therefore, we concluded that adenine nucleotides modulated proliferation of neuroblasts

during early stages of retinal development through P2Y1 receptor and probably changes in

this modulation could affect the histogenesis of retina and consequently it function.

Financial Support: Capes, CNPq, Proppi-UFF

P-28

OUABAÍNA REGULA A SINTESE E LIBERAÇÃO DE IL1-β EM CULTURAS DE

CELULAS DA RETINA

OLIVEIRA,A.C.R**; OLIVEIRA,T.M**; ALBUQUERQUE, C.F.G (1); NETO, H.C.C.F

(1); KALAZA, K.C; Giestal-de-Araujo, E

Departamento de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói – RJ, Brasil. email:

amanda.oliveira2909@gmail.com

Departamento de Fisiologia e farmacêutica, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro-RJ (1)

Ouabaína (OUA) é um hormônio esteróide que se liga à enzima Na+, K+ -ATPase e estimula

diferentes vias de sinalização intracelulares. Dados previos demonstraram a participação da

IL1-β, mediando o efeito trófico da ouabaína (3nM), sobre a população de células

ganglionares da retina (CGR) em cultura. Baseados nisso objetivamos avaliar o papel da

OUA na modulação da resposta inflamatória desta citocina, visando compreender os

mecanismos pelos quais a IL-1β contribui para a sobrevida das CGR.

Ratos da linhagem Lister Hooded (P0-P2) foram mortos, suas retinas dissecadas e as células

dissociadas e plaqueadas na densidade de 105 cels/cm2 em placas de Petri. As culturas foram

mantidas em meio 199 (CT) ou na presença de meio e OUA numa atmosfera de 5% CO2

/95% ar à 37ºC. Os níveis de IL1-β, IL1-RI (receptor de IL-1 do tipo 1) foram determinados

pela técnica de Western Blot e sua liberação através da técnica de ELISA (kit R&D systems

RatIL-1β/IL-1F2). A marcação da IL1- β for determinada pela técnica de imunohistoquímica

utilizando anticorpos biotinilados. Os procedimentos experimentais com animais foram

aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFF (00294/12).

Nossos resultados mostram que o tratamento com a OUA modula a produção de IL1-β:

15min (CT 100% OUA 168,46 ±2,7 n=4 p=0,008), 45mim (CT 100% OUA 101,16±2,18 n=3

p=0,7), 24h (CT 100% OUA 40,87±1,37 n=4 p=0,0001), 48h (CT 100% OUA 99,81±2,7 n=3

p=0,9); bem como os níveis de seu receptor IL1-R1: 15min (CT 100% OUA 124,56±6,08

n=3 p=0,0003), 45min (CT 100% OUA 112±2,3 n=4 p=0,02), 24h (CT 100% OUA

84,03±5,4 n=3 p=0,04) e 48h (CT 100% OUA128,56±7,1 n=4 p=0,03). A liberação desta

citocina também é modulada pela OUA: 15min (CT 6,31 pg/mL ±2,04 p=0,01 OUA 7,41

pg/mL ±1,93 p=0,006 n=8), 45 min (CT 13,7pg/mL ±2,35 p=0,0011 OUA 7,2pg/mL ±1,36

p=0,002 n=7), 24 horas (CT 6,57pg/mL ±2,2 p=0,02 OUA 19,52pg/mL ±3,7 p=0,002 n=7),

48 horas (CT 15,6pg/mL ±4,8 p=0,04 OUA 22,2pg/mL ±6,4 p=0,04 n=4). A

imunohistoquímica revelou a marcação para IL-1β na camada de células ganglionares.

Nossos dados demonstram que a OUA é capaz de modular a produção e a liberação desta

citocina, bem como os níveis do seu receptor, indicando que a presença deste esteróide em

baixas concentrações, regula a resposta inflamatória nas culturas de células da retina o que

pode estar relacionado ao seu efeito na sobrevida das CGR.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX, PROAP, PROPPI-UFF.

P-29

ESTUDO COMPORTAMENTAL EM MODELO 6-OHDA DA DOENÇA DE

PARKINSON

Figueiredo, R.C.*, Hayashide, L.S.**, Fernandes, A.C.M.N***; Pandolfo, P; Faria-Melibeu,

A.C.

Universidade Federal Fluminense

A doença de Parkinson é caracterizada pela degeneração progressiva e específica de

neurônios dopaminérgicos A9 da substância nigra compacta (SNc) que enviam aferências

para o corpo estriado, levando a sintomas motores característicos como bradicinesia, tremor

de repouso, rigidez e instabilidade postural. Além destes, sintomas não-motores também

podem ser observados, como depressão, alterações do sono, déficits cognitivos e alterações

gastrointestinais. Existem vários modelos para o estudo deste distúrbio, sendo o da lesão

unilateral com a 6-hidroxidopamina um dos mais utilizados. Nos últimos anos, nosso grupo

vem estudando o curso temporal das alterações bioquímicas que ocorrem após a lesão

dopaminérgica característica deste modelo. Neste trabalho, nosso objetivo foi avaliar o

comportamento rotacional no teste da apomorfina e a capacidade de memória de

reconhecimento de camundongos adultos C57Bl16 submetidos à lesão por 6-OHDA. Os

animais foram anestesiados e submetidos à injeção unilateral de veículo ou 6-OHDA (2µl a

uma taxa de 0,5 µl/5 min). 1, 2 e 4 semanas após a cirurgia, realizamos diferentes testes

comportamentais como o do campo aberto, análise do número de rotações para ao lado

contralateral da lesão após a injeção intraperitoneal de apomorfina (0,5 mg/kg) e o teste de

reconhecimento de objetos para avaliar a capacidade de memorização. Nossos resultados

mostraram que os camundongos lesionados apresentam um padrão rotacional para o lado

contralateral da lesão e os animais com 4 semanas de sobrevida deste grupo têm o menor

número de rotações. No teste de reconhecimento de objetos, os animais exploraram os

objetos de maneira igual na fase treino, mostrando que não há nenhum prejuízo motor que

pudesse afetar os resultados. Na fase teste, os animais lesionados obtiveram um índice de

discriminação negativo, sugerindo um déficit no reconhecimento de objetos.

PIBIC

P-30

DEVELOPMENT OF RETINOGENICULATE AND RETINOTECTAL

CONNECTIONS AT MICE WITH RETINAL DEGENERATION.

Vieira, F1.; Menezes**, G.D.1.; Goulart,** V. G1.; Serfaty, C.A.1.; Petrs-Silva, H.2.;

Campello-Costa, P1.

1 - Program of Postgraduation at Neuroscience, Biology Institute, UFF; 2 -Program of Postgraduation of

IBCCF, UFRJ

The retina is responsible for capturing light through the photoreceptor cells, and transmit

visual signals through the ganglion cells to subcortical targets as dorsal lateral geniculate

nucleus (NGLd) and superior colliculus (SC). Initially, the formation of topographic maps of

the retina at the targets depends on attractive/repulsive cues that guide the growth of axons to

specific areas on target. Subsequently, the pattern of spontaneous and evoked electrical

activity induced by opening of the eyes, is responsible for refining the initial projections,

generating a high specificity pattern of connections. The administration of drugs that

interfere with neuronal electrical activity compromises the formation of sub-cortical maps

and primary visual cortex. Retinal diseases affecting the electrical activity can influence the

formation of retinotopic maps. Retinitis pigmentosa (RP) is a group of inherited diseases that

cause degeneration of retinal photoreceptors leading to gradual loss of vision. RDS mice

(slow retinal degeneration) have a progressive loss of photoreceptor by apoptosis during the

first two postnatal weeks, with peak degeneration at postnatal day 18 (DPN18). The

electroretinogram of these animals are always reduced and becomes absent within 4 weeks.

The aim of this study was to evaluate the retinofugal projections in RDS animals comparing

them to control animals at different stages of development. Our results showed that the

distribution of retinal fibers in RDS animals of the second postnatal week is normal. It is

possible to note the visual clusters at ventral layer of the superior colliculus and axons from

ipso and contrallateral retina slightly segregated in the thalamus. Animals of the third week

(DPN21) have presented some fibers dispersed in the visual ventral layer of the SC and also

in the thalamus, but no quantitative difference was observed. Adult animals of two months

have a pattern still compatible with normal animals with the presence of retinal afferents in

the subcortical targets analyzed, even in the absence of retinal electrical activity. Taken

together, these results show that retinofugal projections are formed even during normal

degeneration of photoreceptor. Moreover, the retinal ganglion cells maintained their synaptic

contacts the target even long after the complete loss of photoreceptors, suggesting that the

prolonged maintenance of these pathways may contribute to the maintenance of cortical

activation.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI-UFF, PROAP-UFF

P-31

CARACTERIZAÇÃO DO CONTEÚDO E ATIVIDADE DE ENZIMAS

COLINÉRGICAS ESTRIATAIS EM UM MODELO ANIMAL DE DOENÇA DE

PARKINSON INDUZIDA POR 6-OHDA

HAYASHIDE, L. S.1**, FERNANDES, A.C.M.N.2**; NUNES-TAVAES, N.3; FARIA-

MELIBEU, A.C.2; RIBEIRO, M.G.L.1

1 Departamento de Biologia Celular e Molecular, 2 Departamento de Neurobiologia, Instituto de Biologia,

Universidade Federal Fluminense. Niterói-RJ, Brasil; 3 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade

Federal do Rio de Janeiro. RJ, Brasil

Objectives: Acetylcholine (ACh) is present in the striatum via cholinergic interneurons. ACh

is synthesized by choline acetyltransferase (ChAT) and it can be hydrolyzed by

acetylcholinesterase (AChE), which ensures a rapid decrease of ACh after its release from pre

synaptic terminals in the synaptic cleft. Studies have shown that the normal activity of striatal

neurons depends on the balance between dopamine (DA) and ACh and those disruptions in

this balance may contribute to the development of Parkinson's disease (PD), a

neurodegenerative disease characterized by a severe and progressive motor impairment due

to progressive and specific degeneration of A9 dopaminergic neurons of the substantia nigra

compacta. Therefore, we aimed to investigate, in a mouse experimental model of PD,

biochemical changes in the cholinergic system during different survival periods (1, 2 and 4

weeks) after PD induction, in order to study the possible striatal cholinergic modulation in

these animals.

Methods: Adult C57Bl6 mice were anesthetized and submitted to unilateral injection of 6-

OHDA (2μl at a rate of 0.5 µl/5 min) into the left medial forebrain bundle using stereotaxic

procedures. Mice were then allowed to survive for either 1, 2 or 4 weeks thereafter. The mice

were euthanized and striatum was dissectioned to prepare samples for western blot (WB)

analysis (we used anti-AChE and anti-ChAT) and determination of AChE and ChAT activity

according to the colorimetric method of Ellman et al. (1961) and Fonnum (1975)

respectively.

Results: Our data show that the injured side presented a higher activity of ChAT and lower

AChE activity in the early stage after injection of the drug. Increased ChAT activity can be

explained at least in part by the increased expression at this time. The expression of AChE

did not change during the time period studied, suggesting the existence of another regulatory

mechanism that does not involve changes in transcription processes. The modulation of the

cholinergic system which occurs in response to the injection of 6-OHDA in this model

indicates a biochemical reorganization in response to the striatal dopaminergic loss.

CNPQ; CAPES

P-32

O TRATAMENTO COM PMA MODULA A LIBERAÇÃO DAS CITOCINAS

INFLAMATÓRIAS TNF ALFA E IL-1 BETA EM CÉLULAS DA RETINA DE

RATOS NEONATOS

Ferreira, E.C.¹;Braga, L.E.G¹,De Albuquerque,C.F.G²; Faria Neto,H.C.²;Araujo, E.G³;

Santos, A.A¹

1- Instituto Biomédico-Laboratório de Fisiologia das Interações Neuroquímicas, 2-Departamento de Fisiologia e

Farmacologia- Laboratório de Imunofarmacologia, 3-Instituto de Biologia- Laboratório de Tecido Hertha Meyer

A proteína cinase C (PKC) está envolvida em vários eventos no desenvolvimento do sistema

nervoso(SN). O tratamento com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), ativador da PKC,em

células da retina de ratos neonatos, em 48 horas aumenta a sobrevida das células ganglionares

(CGRs). Dados mostraram que o tratamento das culturas da retina com TNFα e IL-1β

aumenta a sobrevida das CGRs.Demonstramos que o PMA modula os níveis intracelulares de

TNFα e IL-1β,causa aumento no início e queda a partir de 24h. O objetivo do presente

trabalho foi analisar o efeito temporal do PMA 50ng/mL na liberação das citocinas IL-1β e

TNFα em culturas de células da retina.

Ratos Lister Hooded (P0-P2) foram decapitados, suas retinas dissecadas, incubadas em

solução de tripsina a 0,1%,dissociadas por pipeta Pasteur. As células foram plaqueadas na

densidade de 105 céls/cm2. As culturas, mantidas em meio 199 (CT), ou na presença do

PMA 50ng/mL, em atmosfera de 5% CO2/95% ar/37ºC por diferentes períodos de tempo. Os

níveis extracelulares foram medidos pela técnica de ELISA com o kit “Quantikine ELISA

ReD systems rat TNFα e rat IL-1β/IL-1F2”. Os valores constitui a média ± erro padrão. As

diferenças foram analisadas por ANOVA one-way e o teste post-hoc Newman-Keuls. Os

dados foram significativos quando p<0,05. Os procedimentos com animais foram aprovados

pela CEUA da UFF (00294/12).

Nossos resultados mostram que o PMA não altera a liberação de IL-1β em relação ao

controle após 15min (CT 67,8±27pg/ml;PMA 147,4±55pg/ml; n=8) e 45min (CT

74,7±18,8pg/ml;PMA 92,4±17,2pg/ml; n=6). O tratamento por 24h induz um aumento, em

relação ao controle 24h (CT 43,4±14,9pg/ml;PMA 86,6±25pg/ml; n=7). Após 48h de

tratamento não há diferença nos níveis em relação ao controle CT 101,5±16,9pg/ml;PMA

161±50pg/ml; n=5). Em relação aos níveis extracelulares de TNFα, não há alterações por

15min (CT 6,3±2pg/ml;PMA 10,3±2,35pg/ml; n=6) e 45min (CT 13,8±2,3 pg/ml;PMA

8±1,35 pg/ml; n=7). Após 24h de tratamento observamos um aumento significativo nestes

níveis (CT 6,5±2,2pg/ml;PMA 21,6±4,66pg/m; n=7), sem diferença em relação ao controle

após 48h (CT 20,6±4,8pg/ml;PMA 15,8±4,08pg/ml; n=4).Nossos dados mostram que a

ativação crônica da PKC modula a liberação de TNFα e IL-1β. Há um aumento nos níveis

intracelulares no início, sugerindo regular a produção, aumentando a liberação em relação ao

controle em 24h. A regulação sobre a produção e liberação das citocinas pode ser notável

para o efeito do PMA na sobrevida das CGRs

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI.

P-33

THE BLOCKADE OF P2Y1 RECEPTORS ALTER HORIZONTAL CELL IN VIVO

OF RETINA RAT

¹ Repossi, M.*,¹ Pereira, L. A**, ¹ Magalhães, C.F.**, ² Sholl-Franco, A., ¹ Ventura, A. L. M.

and ¹ Fragel-Madeira, L.

1 Department of Neurobiology, Institute of Biology, Fluminense Federal University; ² Institute of Biophysics

Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro.

The retina is a tissue member of the central nervous system, it consists of six different types

of neurons (cone and rods photoreceptors, horizontal, amacrine, bipolar and ganglion) and a

type of glial cell (Müller glia), divide in nuclear and plexiform layers in the adult. Changes

that occur during development can cause alterations in histology and consequently in its

functioning. Adenine nucleotides are known to modulate neuroblasts cell proliferation in the

early stages of retinal development. Previous results of our group reported that intravitreal

injection of MRS2179, a selective antagonist for the P2Y1 receptor, at concentration of 50

μM and 100 μM reduced cell proliferation approximately 20% in rats at 3-postnatal (P3).

Based on this data, the purpose of this study was to evaluated how the reduction in the

number of proliferating cells in the retina, induced by the blockade of P2Y1, could affect the

histogenesis of this tissue. The treatment with MRS 2179 at concentration of 50 μM,

decreased 30% in the number of calbindin positive horizontal cells and apparently there was a

reduce dendritic arborization in these cells, after 20 hours of treatment. To exclude the

possibility of death induction by this drug, the assessment of apoptotic profiles was

performed during the treatment period, but did not identify any patterns of death. Amacrine

cells and photoreceptors were evaluated after 20, 48 and 72 hours of treatment, and did not

change in cell number and morphology was observed in these populations. We conclude that

adenine nucleotides acts during early stages of retinal development, in P2 apparently

modulated the horizontal cells differentiation. But it is necessary to assay other population

after MRS 2179 treatment, so as to obtain overview of P2Y1 blockade in the differentiation

of retinal cells.

Capes, CNPq, Proppi-UFF

P-34

CUIDADO MATERNO NEONATAL E EXPRESSÃO DE FATORES

NEUROTRÓFICOS NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Souza, A.M*; Araújo, E. G*

Departamento de Neurobiologia, Programa de Neurociências, Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de

Janeiro

Objetivos:

A separação materna tem sido empregada como modelo experimental para avaliar os efeitos

do estresse neonatal ao longo do desenvolvimento. Ratos neonatos privados da mãe

apresentam alterações na citoarquitetura do hipocampo e na expressão de fatores tróficos

nesta região, destacando-se o fator trófico derivado do cérebro (BDNF). Algumas dessas

alterações vêm sendo correlacionadas com a propensão ao desenvolvimento de

psicopatologias como, por exemplo, a depressão maior. O objetivo de nosso trabalho foi

analisar o efeito da separação materna, por 30 minutos e por 6 horas, durante a primeira

semana pós-natal, na expressão de BDNF e IGF-1 no hipocampo e na retina.

Métodos e Resultados:

Animais da linhagem Lister Hooded na idade de P2 (72h pós nascimento) foram separados

das mães, durante sete dias, por trinta minutos a cada dia. Sempre foi obedecido o mesmo

horário para a separação dos animais (15:30 -16:30 para privação por 30 minutos e 17:00 -

23:00 para animais privados por 6 horas). No oitavo dia os animais foram sacrificados as

retinas e o hipocampo foram retirados e processados para a extração de proteínas. Os níveis

de BDNF e IGF-1 foram avaliados através da técnica de western blot. Todo o procedimento

com animais foi feito de acordo com os princípios éticos de experimentação animal da

SBCAL cuja aprovação nos fora previamente dada pelo comitê de ética e pesquisa animal

(CEPA) da Universidade Federal Fluminense (projeto # 00196/10). Nossos resultados

indicam que a privação materna por 30m dia, induz um aumento significativo nos níveis de

BDNF e IGF-1 na retina e no hipocampo em p9. O animais privados por 6 horas dia (p2 até

p8) foram avaliados em P30. Interessantemente observamos que estes animais apresentam os

níveis de BDNF aumentados.

Conclusão:

Nossos dados indicam que a privação materna, por curto espaço de tempo, aumentou os

níveis de BDNF sugerindo uma possível resposta adaptativa. Além disso, nossos resultados

sugerem que as alterações na retina possivelmente reflitam os efeitos sistêmicos do estresse.

Esse resultado nos leva a sugerir também que o sistema visual como mais uma região a ser

analisada visando a compreensão dos efeitos sistêmicos do estresse.

CAPES; PROPPi-UFF; CNPq; PRONEX.

P-35

DETERMINATION OF CALPAINS AND METALLOPROTEASES ACTIVITIES IN

MDX MOUSE SKELETAL MUSCLE ON THE PHASE OF MYONECROSIS AND

REGENERATION

Gaglianone, R.B., Jussara Lagrota Candido, Thereza Quirico-Santos

Universidade Federal Fluminense, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular e Molecular,

Laboratório de Patologia Celular.

Objetivos:

Context: Duchene muscular dystrophy (DMD) in humans and in the mdx mouse is a genetic

inflammatory myopathy with mutations/deletions in locus Xp21 coding for dystrophin, a

protein of the sarcolemma which associates actin filaments and transmembrane glycoprotein

complex. Lack of dystrophin compromises the integrity of the sarcolemma resulting in

greater intracellular influx of calcium ions by activating the autoproteolysis cascade and cell

death by necrosis with further activation of inflammation. Calpains are calcium dependent

enzymes with major role on cytoskeletal remodeling. Metalloproteases (MMPs) are Ca+2 and

Zn-dependent endopeptidases, with two isoforms: MMP-2 and MMP-9. MMP-9 is secreted

mainly by inflammatory leukocytes, and MMP-2 in constitutive form by myoblasts is

associated with proliferation, migration and fusion of myogenic cells for efficient muscle

regeneration. Objective: Relate the activity of Calpains and MMPs with myonecrosis in the

mdx mouse. Methods: We used 4 and 12 weeks-old male mdx mice at the height of

myonecrosis and muscle inflammation, and C57BL10 as control nondystrophic.

Gastrocnemius and brachial muscle of both lineages was processed in appropriate buffer for

gel zymography 7.5% with gelatin for identification of MMPs, as described by Heussen e

Dowdle (1980). And gel 10% with casein for µ and m Calpains activity according to protocol

described by Arthur e Mykles (2000). The results analysis was done by densitometry in L-Pix

Image (Loccus, Brazil). Results: It was observed an increase in the activity of MMP-9 and

Calpains in gastrocnemius muscle of mdx mice. The data indicate the presence of elevated

levels of intracellular Ca+2 activation in mdx dystrophic muscles thus suggesting intense

activation of Calpains proteolytic cascade associated with myonecrosis and also

inflammatory infiltrate due to an increase in the MMP-9 activity. Discussion: At the peak of

mdx myonecrosis the release of inflammatory cytokines by activated leukocytes contribute to

muscle degeneration due to necrosis and apoptosis of myofiber, and further development of

peripheral neuropathy due to loss of innervations. Conclusion: By using this methodology we

were able to demonstrate that mdx skeletal muscle presents at the height of myonecrosis

increased activity of Calpains related to muscle degeneration and increased inflammatory

activity (MMPs) mediated by activated leukocytes.

FOPESQ-UFF, CAPES-DGU

P-36

A ATIVAÇÃO DA PROTEÍNA CINASE C MODULA OS NÍVEIS DE IL1-BETA EM

CULTURA DE CÉLULAS DA RETINA DE RATOS NEONATOS

Conceição,T.Q.S., Ferreira, E.C., Santos, A.A.

Universidade Federal Fluminense, Instituto Biomédico, Laboratório de Fisiologia das Interações Neuroquímicas

A proteína cinase C (PKC) é uma serina-treonina cinase mediadora de diversos eventos

intracelulares tais como proliferação, diferenciação, apoptose e sobrevida. O tratamento das

culturas de células da retina de ratos com forbol 12- miristato 13-acetato (PMA), um ativador

da PKC, por 48h promove um aumento na sobrevida das células ganglionares da retina

(CGR). Dados do nosso grupo demonstraram que o tratamento das culturas da retina com IL-

1beta, uma citocina pró-inflamatória, em uma faixa estreita de concentração, aumenta a

sobrevida das CGRs. O objetivo do presente estudo foi de analisar o efeito do tratamento

com PMA 50ng/mL nas células da retina, sobre os níveis da IL1-beta em diferentes períodos

de tempo.

Ratos Lister Hooded (P0-P2) foram decapitados, suas retinas dissecadas e incubadas em

solução de tripsina a 0,1%, e em seguida dissociadas por pipeta Pasteur. As células foram

semeadas (1,0 X105 céls/cm2) em placas de Petri de 35mm. As culturas foram mantidas em

meio 199 (CT), ou na presença do PMA 50ng/mL, em atmosfera umidificada de 5% CO2

/95% ar/37ºC) por diferentes períodos de tempo. Os níveis de IL1-beta foram determinados

pela técnica de Western blot. Os procedimentos experimentais com animais foram aprovados

pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFF (00294/12).

Nossos resultados demonstram que o tratamento com o PMA aumenta os níveis intracelulares

de IL1-beta em culturas tratadas por 15 minutos (CT 100% PMA 143,3% ±0,56 n=3) e por 45

minutos (CT 100% PMA 167,25% ±10 n=3). Já as culturas tratadas com PMA por 24 horas

exibem uma diminuição significativa nos níveis de IL1-beta (CT 100% PMA 52,1% ±9,3

n=3) e essa queda persiste após 48 horas em cultura (CT 100% PMA 79% ±11 n=3).

Nossos dados demonstram que a ativação da PKC produz um aumento inicial nos níveis

intracelulares de IL1-beta, seguido por uma queda após 24 horas em cultura. Essa modulação

dos níveis de IL1-beta pode estar relacionada ao aumento na sobrevida das células

ganglionares da retina mediado pelo tratamento com PMA.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI.

P-37

TRATAMENTO COM OUABAÍNA REGULA PROTEÍNAS DA FAMILIA DA IL-1

EM CULTURAS DE CÉLULAS DA RETINA

1)Rodrigues dos Santos, M. 2)Oliveira,A.C.R.; 3)Giestal-de-Araujo, E.

Instituição : Anhanguera e UFF

Ouabaína (OUA) liga à enzima Na+, K+ -ATPase e estimula diferentes vias de sinalização

intracelulares.Nossos estudos demonstraram que o tratamento com OUA é capaz de modular

a produção e liberação de IL1-β e que esta citocina atua mediando o efeito trófico da

OUA(3nM), nas células ganglionares da retina (CGR) em cultura.Objetivamos avaliar se o

tratamento com a OUA é capaz de modular também a produção de IL-1Ra, molécula com

perfil anti-inflamatório, membro da família da IL-1. O objetivo é compreender de que forma

a modulação das moléculas da família da IL-1 contribui para o efeito de sobrevida das

CGR.Ratos da linhagem Lister Hooded (P0-P2) foram mortos, suas retinas dissecadas e as

células dissociadas e plaqueadas na densidade de 105 cels/cm2 em placas de Petri.Culturas

mantidas em meio 199 (CT) ou na presença de meio e OUA numa atmosfera de 5% CO2

/95% ar à 37ºC. Os níveis de IL-1Ra e de IL-1α determinados pela técnica de Western

Blot.Os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pela Comissão de Ética

no Uso de Animais da UFF (00294/12).Resultados preliminares mostraram que o tratamento

com a OUA modula a produção de IL1-β: 15min (CT 100% OUA 168,46 ±2,7 n=4 p=0,008),

45mim (CT 100% OUA 101,16±2,18 n=3 p=0,7), 24h (CT 100% OUA 40,87±1,37 n=4

p=0,0001), 48h (CT 100% OUA 99,81±2,7 n=3 p=0,9); bem como os níveis de seu receptor

IL1-R1: 15min (CT 100% OUA 124,56±6,08 n=3 p=0,0003), 45min (CT 100% OUA

112±2,3 n=4 p=0,02), 24h (CT 100% OUA 84,03±5,4 n=3 p=0,04) e 48h (CT 100%

OUA128,56±7,1 n=4 p=0,03). A liberação desta citocina também é modulada pela OUA:

15min (CT 6,31 pg/mL ±2,04 p=0,01 OUA 7,41 pg/mL ±1,93 p=0,006 n=8), 45 min (CT

13,7pg/mL ±2,35 p=0,0011 OUA 7,2pg/mL ±1,36 p=0,002 n=7), 24 horas (CT 6,57pg/mL

±2,2 p=0,02 OUA 19,52pg/mL ±3,7 p=0,002 n=7), 48 horas (CT 15,6pg/mL ±4,8 p=0,04

OUA 22,2pg/mL ±6,4 p=0,04 n=4). Diante destes dados avaliamos se nosso tratamento

modulava a produção de IL-1Ra e IL-1alfa e verificamos que os niveis de IL-1Ra foram

modulados pela ouabaína: 45mim (CT 100% OUA 129,2±2,5,87 n=3 p=0,03), 48 horas (CT

100% OUA 142,2±3,39 n=3 p=0,006). No entanto a ouabaína não alterou os níveis de IL-

1alfa: 15mim (CT 100% OUA 103,4±10,3 n=3 p=0,6), 24 horas (CT 100% OUA 95,62±5,7

n=3 p=0,52).Nossos resultados mostram que o tratamento com OUA além de ser capaz de

modular ao longo do tempo a produção e a liberação da IL-1β, bem como os níveis do seu

receptor, também modula os níveis da citocina anti-inflamatoria IL-1Ra.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PRONEX, PROAP, PROPPI-UFF.

P-38

INIBIÇÃO DA ENZIMA ADAM10 INTERFERE NA PLASTICIDADE DAS

PROJEÇÕES RETINOTECTAIS DE ROEDORES

Heringer, P. V. B.*; Vasques, J. F.**; Gonçalves, R. G. J.**; Campello-Costa, P.**; Serfaty,

C. A.**; Melibeu, A. C. F**

Universidade Federal Fluminense

A Doença de Alzheimer é um mal que acomete milhões de pessoas no mundo atualmente.

Sua fisiopatologia está associada a um desbalanço proteolítico no processamento da Proteína

Precursora do Amilóide (APP), resultando em um aumento na produção do peptídeo beta

amiloide e na redução dos níveis da forma solúvel α (sAPPα). Sua função fisiológica, assim

como de seus metabólitos, ainda não é completamente compreendida, apesar de diversos

grupos sugerirem funções como participação nos processos de sinaptogênese, sobrevivência,

crescimento celular e plasticidade sináptica. Nosso grupo, nos últimos anos, vem buscando

decifrar o papel da APP na plasticidade das conexões retinocoliculares utilizando o sistema

visual de roedores como modelo de estudo. Nossos dados prévios mostram que a expressão

da APP no CS de ratos é alta até a terceira semana pós-natal e que, no modelo de plasticidade

, enucleação monocular (EM) esta sofre redução transitória nos seus níveis, assim como um

favorecimento da via não amiloidogênica, levando a um aumento dos níveis de sAPPα. Neste

contexto, este trabalho visa investigar os efeitos da inibição da principal α-secretase,

ADAM10, sobre a distribuição das projeções retinocoliculares ipsolaterais de animais

submetidos à EM. Ratos pigmentados (Lister Hooded) foram submetidos ao implante

intracraniano de ELVAX contendo GI204523X (10 e 20mM) ou veículo (DMSO) em DPN7.

Em DPN10, os animais, implantados ou não, foram anestesiados e submetidos à EM. A

distribuição dos terminais ipsolaterais foi examinada em cortes cerebrais coronais após a

injeção intraocular de HRP. Nossos resultados mostraram que os animais implantados com o

inibidor na concentração de 10mM apresentaram uma ausência da expansão dos terminais

ipsolaterais, com clusters bem delimitados e poucas fibras nas regiões mais dorsais, perfil

semelhante ao visto em um animal não enucleado. Estes dados foram confirmados pela

análise quantitativa baseada na densidade óptica da marcação da camada visual total, assim

como da camada de clusters. Neste contexto, nosso trabalho sugere que a ADAM10 promova

o aumento de sAPPα e que esta proteína tenha um papel crucial na plasticidade das fibras

retinocoliculares induzida por EM.

Palavras Chave: Plasticidade sináptica, APP e colículo superior

PROPPI, FAPERJ e CNPQ

P-39

MODELO DA DOENÇA DE PARKINSON INDUZIDO POR 6-OHDA PROMOVE

INFLAMAÇÃO E ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO SISTEMA NERVOSO

ENTÉRICO

Thomasi, BBM¹*, Valdetaro, L¹*, Fernandes, ACMN¹**, Serfaty, CA¹, Campello-Costa, P¹,

Melibeu, ACF¹, Moura-Neto, V², Tavares-Gomes, AL¹.

¹. Universidade Federal Fluminense, ². Universidade Federal do Rio de Janeiro

Objetivos e Métodos

O objetivo deste trabalho é investigar se o modelo animal da Doença de Parkinson (DP)

induzido por 6-OHDA promove alterações funcionais, morfológicas e quanto a presença de

marcadores inflamatórios no Sistema Nervoso Entérico (SNE) colônico. Para a indução do

modelo, camundongos C57Bl6 adultos foram submetidos à administração unilateral de 6-

OHDA na região do estriado esquerdo por procedimentos estereotáxicos. Um segundo grupo

de animais operados não lesionados (sham) foi utilizado como controle. Ambos os grupos

tiveram tempos de sobrevida de 1, 2 e 4 semanas. O ensaio de constipação foi realizado a fim

de acessar a proporção relativa de água nas fezes dos animais e analisar o estado funcional do

SNE. Após este ensaio os animais foram eutanasiados e o cólon removido para realização de

procedimentos de histoquímica e imunofluorescência. Utilizamos anticorpos anti-IBA1

(proteína presente em macrófagos) e anti-GFAP (proteína marcadora de células gliais).

Resultados

Os resultados de histoquímica demonstram a partir de 1semana pós-lesão a camada muscular

intestinal comprometida nos animais tratados com 6-OHDA. Também neste grupo, a partir do

tempo de 2 semanas de sobrevida, foi possível notar descaracterização da estrutura da mucosa

intestinal, nas porções oral e anal do cólon e o contínuo comprometimento da camada

muscular. O plexo mioentérico da porção oral nas sobrevidas 1 e 2 semanas mostrou-se

hipertrofiado. Especificamente nos animais tratados com 6-OHDA com 1 semana pós-lesão,

notou-se a presença de infiltrado inflamatório na porção oral. Com 4 semanas pós-lesão o

quadro alterado da citoarquitetura continuou sendo observado e células hipertrofiadas no

plexo mioentérico anal puderam ser observadas. Quanto à imunofluorescência, houve um

aumento da expressão da proteína IBA1 na mucosa intestinal dos animais tratados com 6-

OHDA 1, 2 e 4 semanas comparados aos animais sham. Além disso, também ocorreu

aumento da expressão de GFAP nos animais tratados com 6-OHDA nos tempos de 1 e 2

semanas. Estas alterações ocorreram em ambas porções oral e anal do cólon.

Conclusão

As alterações apresentadas pelos animais tratados com 6-OHDA demonstram que o SNE e o

trato gastrintestinal encontram-se comprometidos neste modelo animal da DP. O aumento da

expressão de IBA1 na mucosa intestinal demonstra a ocorrência de inflamação local enquanto

o aumento de GFAP sinaliza a ocorrência de reatividade glial entérica no cólon de animais

modelo da DP.

PIBIC UFF, FAPERJ

P-40

GLUTAMATERGIC SIGNALING AND PSD-95 PROTEIN MODULATES NITRIC

OXIDE LEVELS IN A MICE MODEL OF PARKINSON´S DISEASE

Carvalho,,M.B.; Fernandes, A.C.M.N. , Melibeu,A.C.F. , Serfaty, C.A., Campello-Costa,P

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INTRODUCTION: Parkinson’s disease (PD) is a progressive motor disorder characterized by

dopaminergic neuronal degeneration in the substantia nigra and severe motor symptoms. In

the postsynaptic density, dopamine receptors physically associates with scaffolding protein

PSD-95 that organizes the molecular architecture of postsynaptic sites and regulates

interactions between NMDA glutamate receptors and downstream-signaling molecules.

Alterations in PSD-95 levels and glutamatergic signalling were found in several

neuropsychiatric and neurological disorders such PD. This effect may influence dopamine

and NMDA receptors interactions and also nitric oxide (NOx) production. Synapsins are

phosphoproteins localized within presynaptic terminals and are thought to participate in the

regulation of the synaptic vesicle life cycle and neurotransmitter release. According to their

important roles in synapses formation, maintenance and plasticity, we focusing in evaluate

the levels of these pre- and post-synaptic proteins in a 6-OHDA model of PD in different

periods post-lesion.

METHODS: We used male C57BL/6 animals that underwent to unilateral striatal lesions

with intracranial injection of 6-hydroxydopamine neurotoxin, a dopamine analogue that

induce the selective death of dopaminergic neurons. After 1, 2 or 4 weeks post-injury, the

animals were subjected to behavioral analysis to assess motor behavior in an open field after

apomorphin ip injection. Then we proceed with Griess reaction to analyze NO production,

western blot and immunofluorescence techniques for PSD-95, synapsin and NMDAr subunits

(GluN1, GluN2a, GluN2b) in striatal samples.

RESULTS: In behavioral test, mice exhibited contra-lateral rotational activity and remarkable

difficulties in coordinating movements. 6-OHDA lesion into striatum induced an up-

regulation in PSD-95 levels and modification in GluN1, GluN2a, GluN2b subunits of NMDA

receptor composition. Synapsin expression tends to decrease two weeks post-lesion in the

injured side. Comparing control x lesioned side, NO production was diminished in lesioned

striatum 1,2 or 4 weeks post-lesion, wich correlates with PSD-95 increase and GluN2a

and/GluN2b shift.

CONCLUSION: In this study 6-OHDA induced pre and postsynaptic terminals

modifications. Indeed, NMDAR changes composition may reflect an adaptive system

response to dopamine depletion and rearrangement of theirs subunits together with PSD-95

increasing may influence NOx levels in striatum

CAPES, CNPQ,FAPERJ

P-41

Plasticidade neuroglial no modelo experimental da Doença de Parkinson

Valdetaro, L. R. F.*¹, Thomasi, B.*¹, Fernandes, A. C.**¹, Serfaty, C.¹, Melibeu, A.¹,

Campello-Costa, P.¹, Moura-Neto, V.², Gomes, A.L.T.¹

1- Universidade Federal Fluminense, 2- Universidade Federal do Rio de Janeiro

Objetivos: O objetivo do trabalho é investigar se o modelo da DP induzido por 6-OHDA

apresenta alterações na rede neuroglial em porções proximais e distais do intestino grosso 1,

2 ou 4 semanas pós-cirurgia.

Métodos: Camundongos C57Bl6 foram submetidos à administração unilateral de 6-OHDA no

estriado esquerdo. Outro grupo de animais operados não lesionados (sham) foi utilizado

como controle. Após a eutanásia, o intestino grosso foi coletado e dividido em duas porções

(oral e anal) para realização de imunofluorescência utilizando anticorpos anti-GFAP

(marcador de glia) e anti-α-sinucleína (marcador de terminais pré-sinápticos).Este trabalho

faz parte do projeto de pesquisa aprovado pelo comitê de ética em pesquisa animal local sob

o número 00129/09.

Resultados e Conclusões:

Podemos observar que o grupo 6-OHDA apresenta um aumento na marcação para GFAP na

mucosa da porção oral do intestino grosso com até 2 semanas de sobrevida, enquanto neste

mesmo grupo notamos uma tendência à diminuição na presença da célula glial na camada

muscular oral, que se acentua com 4 semanas sobrevida em relação ao controle. O cólon

distal parece ser mais sensível à administração de 6-OHDA, apresentando diminuição da

presença da célula glial a partir da 1ª semana pós-cirurgia, sendo mais expressivo na 4ª

semana. O conteúdo de α-sinucleína encontrou-se reduzido em todas as camadas avaliadas

tanto da porção oral, quanto na anal do intestino grosso de animais tratados com 6-OHDA.

Esses resultados indicam que reatividade glial encontra-se aumentada na mucosa e diminuída

na camada muscular dos animais submetidos ao modelo da DP. Há ainda uma evidente perda

de marcação neuronal no modelo da DP em todo intestino grosso. Diante deste cenário,

podemos sugerir que o modelo da DP induzido por 6-OHDA é capaz de causar uma ruptura

na circuitaria neuroglial entérica.

FAPERJ, PROAP, PROPPI

P-42

A COMPUTATIONAL MODEL OF LGN-V1 DYNAMICS AND THE EMERGENCE

OF GAMMA-BAND RHYTHMS

ESMERALDO, HBS* 1; BASTOS, AM** 1,2,3; ALITTO, H** 1; MANGUN, GR** 1;

USREY, WM** 1

1. UNIVERSITY OF CALIFORNIA DAVIS, DAVIS - UNITED STATES; 2. PICOWER INST. FOR LEARNING AND MEMORY, CAMBRIDGE, MA - UNITED STATES; 3. ERNST STRÜNGMANN INSTITUTE (ESI) FOR NEUROSCIENCE IN COOPERATION WITH MAX PLANCK SOCIETY, FRANKFURT - GERMANY

Gamma oscillations have been hypothesized to play a central role in active vision,

contributing to inter-areal information selection and routing. Furthermore, emerging evidence

suggests that gamma oscillations play a fundamental role in feedforward neuronal

communication. In order to constrain these hypotheses it would be useful to know under what

conditions gamma is prominent during active vision. We recently showed (Bastos et al.,

2014) that gamma oscillations are an emergent property of the cortex, and are not present in

the LGN of alert behaving monkeys. Here, we set out to explain these results in terms of an

underlying biophysically realistic network model composed of Hodgkin-Huxley neurons. The

prime candidate mechanism to explain our experimental results was recurrent inhibition: the

anatomy of the cortex is full of recurrence, allowing excited pyramidal cells to activate

inhibitory cells, which can then inhibit a large number of pyramidal cells and set the pace of

the gamma oscillation (the classical "PING" mechanism - Pyramidal Interneuron Network

Gamma rhythm). However, this recurrence of excitation back onto local inhibitory cells,

appears to be lacking within the primate LGN (but perhaps not in the feline LGN) at an

anatomical level. In our model of the LGN lacking local recurrence, the circuit did not

engage in gamma oscillations even when the Thalamic Reticular Nucleus (TRN), a structure

that provides inhibition onto relay cells and is excited by geniculocortical collaterals, was

included. However, the cortex, which did contain recurrent inhibition, entered a rhythmic

mode despite receiving arrhythmic LGN input. Intriguingly, even when the cortex projected

back onto the LGN in a gamma rhythmic mode, this did not rhythmically entrain the LGN.

The primary reason for this appears to be the synaptic time constants of corticothalamic

synapses, which due to their slow time constants act as a low-pass filter. However, when we

did include local recurrent inhibition in the LGN (as a putative model of feline LGN), gamma

oscillations did emerge - which may explain interspecies differences between cats and

primates. We conclude that the circuitry of the primate LGN is well-suited to ignore cortical

gamma rhythms, to focus on a sparse and temporally precise neuronal code, and to maximize

the feedforward throughput of information from the retina to the cortex.

University of California, Davis

P-43

INHIBITION OF PHOSPHATASES ALTERS TOPOGRAPHIC ORGANIZATION

AND ENHANCES SYNAPSE MATURATION IN THE SUPERIOR COLLICULUS

OF THE RAT

Lanzillotta-Mattos** B 1, Trindade P 2, Serfaty, CA 1

1 - Universidade Federal Fluminense, 2- University of Maryland

Molecular processes of synaptic plasticity such as long-term depression and long term

potentiation (LTD and LTP) have been correlated with the establishment of topographical

maps, essential to the proper sensory system processing. Protein phosphatase 1 (PP1) and

calcineurin are phosphatases highly related to synaptic plasticity, acting as inductors of LTD

and synapse elimination. In this context, the objective of this work is to evaluate the roles of

PP1 and calcineurin and some of their main cellular targets in the development and

maintenance of retinocollicular topography in Lister Hooded rats. All experimental

procedures were approved by the local Animal Care Committee. Analysis of the ipsilateral

topography, using the anterograde labeling of horseheadish peroxidase (HRP), showed that

local inhibiton of PP1 using ELVAX inplants increased the density in terminal labeling of the

ipsilateral pathway when compared with the control group. This increase was consistent with

a sprouting of the ipsilateral axonal projections during the second postnatal week. We also

showed that pCREB content was increased six hours after either PP1, PP2B or PP1+PP2B

local inhibition. PSD95 content was also analyzed and we observed an increase in this protein

content following either PP1 and/or calcineurin inhibition in the SC during the second

postnatal week. Other markers of synapse maturation, such as a decrease in NR2B content

and an increase in NR2A glutamate receptors were also observed. Our results suggest,

therefore, that PP1 and PP2B may act together in the refinement of topographical maps in the

SC thought the control of mechanisms involved in the dynamics of synapse maturation and

elimination in the developing visual system.

CAPES, PRONEX, FAPERJ

P-44

EARLY ALCOHOL EXPOSURE CAUSES ABNORMAL TOPOGRAPHY IN

DEVELOPING VISUAL PATHWAYS, REDUCES PLASTICITY AND INDUCES

BEHAVIORAL CHANGES IN RODENTS

González, E.M.C**; Geraldo, A.S*; Pandolfo, P.; Medina A.J.; Serfaty, C.A.S

1 Laboratório de Plasticidade Neural, Depto. de Neurobiologia, Universidade Federal Fluminense, UFF, Niterói, Rio de Janeiro - RJ., 2 Maryland University, University of Maryland School of Medicine, 655 West Baltimore Street Baltimore, Maryland.

One the remarkable features of sensory systems is the precise targeting of connections

between sets of neurons conveying information along sensory pathways. In the visual system,

retinal ganglion cells axons form organized connections with the lateral geniculate nucleus

(LGN) and superior colliculus. The topographical fine-tuning is acquired by a combination of

activity-dependent and molecular cues-based processes that sculpts sensory pathways during

a critical period of brain development correspondent to the human last gestational

trimester/early years and to the first three postnatal weeks in rodents. Fetal alcohol spectrum

disorders are a major cause of mental retardation in western countries and children present

many alterations in sensory processing and activity-dependent neuronal plasticity that may

result from deficits in the correct wiring pattern of cortical afferents from subcortical nuclei.

We studied the impact of an early ethanol exposure on the development of retinofugal

topographical fine-tuning, eye-specific segregation and plasticity using the anterograde

transport of neuronal tracers in pigmented rats. We found that even low doses of ethanol

(1mg/kg ip) at postnatal days 4, 6 and 8 were able to induce alterations in the organization of

subcortical visual pathways. Retinocollicular axons/terminals displayed a shift towards the

lateral aspect of the superior colliculus with decreased density of terminals in the medial

aspect. This shift became more pronounced two weeks after the end of the treatment (P21),

suggesting that ethanol-treated rats presented a progressive distortion of topographical

representation in the SC. The data also showed that eye-specific segregation in the LGN was

altered by ethanol treatment with overlapping ipsi and contralateral terminal fields. Unilateral

retinal lesion at P14 showed that ethanol exposure significantly reduced the plasticity of

intact axons from the non-lesioned eye, a result that is consistent with a premature closure of

the critical period. Behavioral tests were performed in P90 to assess cognitive and motor

changes. In the Open Field test the ethanol-treated animal had a lower overall locomotion. In

turn, the Elevated Plus Maze showed that ethanol group remained less time in enclosed-arm.

The data suggest that ethanol induced a severe impact on organization of subcortical visual

pathways with an impairment of activity-dependent plasticity with negatives consequences in

sensory and motor systems.

CNPq, FAPERJ, CAPES, PRONEX, Proppi UFF

P-45

NUCLEOTIDE RECEPTORS MODULATE RETINAL GLIA ADHESION AND

MIGRATION FOLLOWING SCRATCH INJURY OF MONOLAYER CULTURES

1Silva, T.M.**, 1França, G.R., 1Ornelas, I.M., 1Loiola, E.C.**, 2Ulrich, H., 1Ventura,

A.L.M.

1Departamento de Neurobiologia, Programa de Neurociências, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói/RJ. 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo/SP.

Objectives: In the present work, we investigated if nucleotides regulate the growth of Müller

cells in scratched chick embryo retinal monolayer cultures.

Methods and results: When retinal cell cultures cultivated for 7 days were mechanically

scratched, a significant growth of glial cells at the empty area was detected between the 1st

and 3rd days after scratch and the area devoid of cells decreased by ~70%. Incubation of

cultures with 2.5 U/ml apyrase (APY) significantly attenuated the growth of glial cells and

while in control cultures the area free of cells represented 31.4 % of the original area after 3

days, in apyrase-treated cultures, it represented 74.8 % of the original area. Incubation of

cultures with the P2 antagonists, 100 µM Suramin and 40 µM Reactive Blue 2 (RB-2) and

also the P2X7 receptor antagonists, 10 µM BBG and 200 µM ATPo, significantly attenuated

the growth of glial cells, the area free of cells representing 68.2, 52.3, 76.2 and 88.4 % of the

original area, respectively, suggesting that nucleotide receptors are involved in the growth of

glial cells. UTPγS (10 µM) but not ADPβS (50 µM) antagonized apyrase-induced growth

inhibition in scratched cultures, suggesting the participation of UTP-sensitive receptors. In

apyrase-treated cultures, glial cytoplasm protrusions were smaller and unstable. Actin

filaments were less organized and alfa-tubulin-labeled microtubules were mainly parallel to

scratch. In contrast to control cultures, very few vinculin-labeled adhesion sites could be

noticed in these cultures. Treatment with 0,2 µM Src inhibitor-1, 10 µM LY294002, a

PI3K/Akt inhibitor and 10 µM PF573228, a FAK inhibitor, also decreased glial growth over

the scratch, the area free of cells representing 74.5, 51.4 and 64.5 % of the original area,

respectively. RB-2 decreased dissociated glial cell attachment to fibronectin-coated dishes

(50 µM RB-2 = 37.5 % inhibition and 100 µM RB-2 = 58.9 % inhibition of the control

values). Treatment with 100 µM RB-2 also decreased by 62.9 % the migration of purified

glial cells through transwell membranes. Treatment with the P2X7 receptor agonist, 100 µM

Bz-ATP also inhibited the adhesion of glial cells by 34.6 %. These data suggest that

nucleotide receptors regulated adhesion and migration of glial cells.

Conclusion: Mechanical scratch of retinal cell cultures induces growth of glial cells over the

empty area through a mechanism that is dependent on activation of nucleotide receptors,

SRC, PI3K and FAK.

Capes, CNPq, PROPPi-UFF, Faperj

P-46

CONSEQUÊNCIAS COMPORTAMENTAIS DA SEPARAÇÃO MATERNA EM UM

MODELO ANIMAL DO TRANSTORNO DE DÉFICIT DE ATENÇÃO E

HIPERATIVIDADE.

HAUAGGE, R. R.; SIQUEIRA, P. S.; CALAZA, K.; PANDOLFO, P.

Departamento de Neurobiologia, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal

Fluminense. Niterói/RJ

Estudos em animais indicam que aplicar situações de estresse a neonatos, como a separação

maternal, pode influenciar na plasticidade do sistema neural, provocando efeitos abrangentes

na atividade neuroendócrina, função imunológica e processo de neurotransmissão. Diversos

trabalhos mostram que a separação materna em ratos pode causar prejuízos cognitivos e

alterações locomotoras em animais adultos, características também observadas no transtorno

de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH). Porém, existem poucos trabalhos que avaliam

os efeitos comportamentais da separação maternal no período da adolescência. O objetivo do

presente estudo foi investigar as consequências comportamentais da separação materna em

um modelo animal de TDAH.

Métodos: Foram utilizados 17 ratos machos das linhagens WKY e SHR (modelo animal do

TDAH), provenientes do biotério da Universidade Federal Fluminense (UFF). Cada linhagem

foi dividida em 2 grupos: controle e separação materna (n=3 a 6). Diariamente durante 3h,

animais entre P02 e P10 foram retirados das gaiolas e isolados em recipientes plásticos, com

temperatura de 37ºC. Durante o período da adolescência, P22 e P34, os animais foram

submetidos a 5 dias consecutivos de testes comportamentais. No primeiro dia, o animal foi

posicionado no centro do labirinto em cruz elevado (LCE) e filmado por 5 minutos. Nos

segundo e terceiro dias, cada animal foi colocado no campo aberto (CA) por 10 minutos. No

quarto, foram realizadas 2 sessões de 5 minutos, com intervalo de 30 minutos, para avaliar a

memória discriminativa no reconhecimento de objeto. No último dia, os animais foram

submetidos a 2 sessões de 5 minutos, com intervalo de 1 hora, ao labirinto em Y. Análise dos

vídeos realizada com Any-Maze e estatística através do StatSoft Statistica 8.

Resultados: No LCE, a separação maternal diminuiu a atividade motora seletivamente em

animais SHR. No CA, a separação materna aumentou a locomoção na linhagem WKY e

diminui na linhagem SHR. No reconhecimento de objetos, a separação materna causou

prejuízo na discriminação dos objetos. Os demais parâmetros não foram alterados pela

separação materna.

Conclusão: O estudo, ainda em fase preliminar, sugere que a separação materna piora o

desempenho cognitivo e locomotor em um modelo animal do TDAH durante a adolescência.

CNPq, CAPES, FAPERJ, PROPPI/UFF.

P-47

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS NA PROLE DE RATAS PREVIAMENTE

EXPOSTAS A IL-6: UM MODELO DE AUTISMO

Oliveira,S.M; Silva,C.A.C.N; Dantas,M.C.L; Magalhães, P.H.L, Silva,P.O; Pandolfo,P.

Universidade Federal Fluminense.

O autismo é um distúrbio do neurodesenvolvimento que afeta menos de 2% da população,

ocorrendo mais em homens. É uma doença que afeta a interação social, a comunicação e os

padrões de comportamento, eventualmente ocasionando estereotipia. Recentemente, foi

mostrado que a interleucina 6 (IL-6) está relacionada com as causas desse transtorno. Ratos

com níveis de IL-6 elevados no cérebro apresentam habilidades cognitivas prejudicadas,

déficits de aprendizagem, traços de ansiedade anormal e diminuição da interação social.

Essas são consequências do prejuízo à plasticidade neural. O objetivo deste trabalho foi

observar as alterações comportamentais na prole de fêmeas tratadas com IL-6.

Ratas fêmeas, adultas, da linhagem Lister Hooded receberam uma única injeção de IL-6

recombinante (5μg/kg) no dia gestacional 12,5 (E12,5). O grupo controle recebeu o veículo

utilizado para dissolver a IL-6 (PBS). A prole obtida a partir dessas fêmeas foi submetida aos

testes comportamentais de campo aberto (CA) e labirinto em cruz elevado (LCE), para

avaliar alterações de ansiedade, cognição e motricidade.

No LCE, administração de IL-6 diminuiu o comportamento relacionado à ansiedade como

observado pelo aumento da porcentagem do número de entradas nos braços abertos. Em

relação ao percentual de tempo gasto nos braços abertos, estatisticamente não se observou

diferenças, assim como o número de entradas nos braços fechados. Em relação ao CA, no

primeiro dia observou-se uma diferença relacionada à locomoção total entre o grupo IL-6 e o

PBS, de forma que o grupo IL-6 apresentou menor locomoção. No segundo dia, a mesma

diferença foi observada. Não houve diferença de locomoção entre os dois dias. Já em relação

à locomoção central, não houve diferença entre os dois grupos.

A partir dos resultados preliminares obtidos é possível concluir que o modelo animal de

autismo utilizado no presente estudo apresenta mudança no perfil motor e no comportamento

relacionado à ansiedade. Esse modelo pode ser uma ferramenta útil para estudar as

características comportamentais e neuroquímicas observadas no autismo.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI/UFF

P-48

Efeitos da acupuntura em um modelo animal do Transtorno de Déficit de Atenção e

Hiperatividade

Mendonça PC*; Gomes AP**; Geraldo AS*; Pandolfo P**

Departamento de Neurobiologia. Programa de Pós-Graduação em Neurociências Universidade Federal

Fluminense. Niterói – Rio de Janeiro

O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) caracteriza-se pelos sintomas

de desatenção, hiperatividade e impulsividade, os quais parecem resultar de desequilíbrios

dopaminérgicos nos circuitos do estriado e córtex pré-frontal. Trabalhos anteriores

demonstraram que a acupuntura pode modular os níveis de dopamina extracelular no núcleo

accumbens. Contudo, há uma carência de estudos avaliando os efeitos da acupuntura em

modelos animais do TDAH. Ratos da linhagem SHR, quando comparados aos WKY, são

amplamente utilizados como um modelo animal do TDAH.

O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade motora e o comportamento relacionado à

ansiedade em um modelo animal do TDAH. Para isso foram utilizados ratos adultos das

linhagens SHR e WKY. Ambas as linhagens foram separadas em três grupos: controle

(naïve), acuponto (HT7), não-acuponto (cauda). Os animais foram manipulados por um

minuto durante três dias consecutivos. No quarto dia, os animais foram contidos

manualmente e as agulhas foram inseridas nos grupos acuponto e não acuponto, utilizando

como estímulo o movimento manual de puxar/introduzir durante um minuto seguido de um

minuto sem estímulo. Este procedimento foi repetido por três vezes consecutivas. O grupo

controle foi contido durante o mesmo período de tempo e sem a inserção de agulha. Após 30

minutos do procedimento de acupuntura, os animais foram submetidos os testes

comportamentais. A atividade motora foi avaliada no teste do campo aberto durante 10

minutos. O comportamento relacionado à ansiedade foi avaliado no labirinto em cruz elevado

durante 5 minutos. O tratamento de acupuntura no HT7 diminuiu a locomoção seletivamente

em animais da linhagem WKY. Por outro lado, a estimulação do não-acuponto causou

aumento da locomoção apenas em animais WKY. A atividade motora dos animais SHR não

foi afetada por nenhum dos tratamentos. Além disso, o tratamento no acuponto HT7 diminuiu

o comportamento relacionado à ansiedade seletivamente em animais SHR. E o tratamento no

não-acuponto (cauda) aumentou o comportamento relacionado à ansiedade. Os resultados são

preliminares e indicam que a acupuntura deve ser realizada em pontos específicos para,

eventualmente, ser promissora para melhorar algumas características observadas no TDAH.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI/UFF

P-49

Avaliação antidepressiva da metformina em roedores

Macedo EO*; Pandolfo P**

Departamento de Neurobiologia. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. Universidade Federal

Fluminense. Niterói/RJ

A depressão não possui etiologia definida, sendo o transtorno psiquiátrico mais prevalente em

todo o mundo. A atrofia hipocampal tem sido relatada em casos de depressão maior. O

tratamento crônico com antidepressivos clássicos pode induzir neurogênese e restaurar o

volume hipocampal (Nestler et al, 2012). Além disso, algumas evidências apontam para

alterações nos níveis glicêmicos em indivíduos com depressão (Park et al., 2012). Estudos

recentes mostram que o hipoglicemiante metformina pode induzir neurogênese no hipocampo

de roedores (Stein SC et al., 2005; Kahn BB et al.,2000). O objetivo deste trabalho foi

investigar os efeitos da metformina no comportamento relacionado à depressão em roedores.

Para isso, ratos da linhagem Lister Hooded e camundongos Swiss, ambos durante a idade

adulta, foram utilizados. Após 30 minutos da administração de metformina (300 mg/kg),

fluoxetina (20 mg/kg) ou veículo (NaCl 0,9%), pela via intraperitoneal (ip), os animais foram

submetidos aos testes comportamentais. O comportamento relacionado à depressão foi

avaliado no teste do nado forçado (TNF). Para ratos, o TNF foi realizado em dois dias. No

primeiro dia, os animais foram expostos ao TNF durante 15 minutos. No segundo dia, os

animais foram expostos ao TNF durante 5 minutos e o tempo de imobilidade foi registrado.

Para camundongos, o TNF foi realizado em apenas uma sessão de 6 minutos e o tempo de

imobilidade foi registrado. A temperatura da água, para ambas as espécies, foi ajustada a 25 ±

1 °C. O teste do campo aberto foi realizado em uma arena (60 cm x 60 cm x 60 cm) e foi

utilizado para avaliar a atividade motora dos animais. O tratamento com metformina ou

fluoxetina não alterou o tempo de imobilidade em ambas as espécies. Por outro lado, a

metformina diminuiu a locomoção seletivamente em camundongos. Os resultados mostram

que a metformina, na dose testada, não altera o comportamento relacionado à depressão. Mais

estudos, com diferentes doses e em um esquema de tratamento crônico, precisam ser

realizados para descartar o possível efeito antidepressivo do hipoglicemiante.

CAPES, CNPq, FAPERJ, PROPPI/UFF

P-50

MICROGLIAL ACTIVATION IS NECESSARY FOR RETINOTECTAL

PLASTICITY INDUCED BY UNILATERAL MONOCULAR ENUCLEATION

1Chagas, L.S.**;

1,2Trindade, P.;

1Serfaty, C.A.

1 Instituto de Biologia - Universidade Federal Fluminense; 2 University of Maryland - School of Medicine.

Lesions in the central nervous system (CNS) can often induce structural reorganization within

intact circuits of the brain. In literature, several recent studies show advances in the

understanding of mechanisms of brain plasticity and the role of the immune system

activation. In the present study, we evaluated role of microglial activation in the sprouting of

intact axons following lesions of converging visual pathways (Serfaty et al 2005). Microglia

is a cell population with immune functions colonizing the CNS during early phases of

development. Their activation is dependent of calcineurin (CaN), a phosphatase also

associated with the process of synaptic stabilization/elimination (Trindade et al 2011).

Therefore, we evaluated the temporal course of microglial activation in the superior

colliculus following a contralateral monocular enucleation (ME) and the possible

involvement of microglial cells in the plastic reorganization of the uncrossed retinotectal

pathway from the intact eye. Lister Hooded rats were enucleated at PND 10 and submitted to

a chronic and/or acute systemic treatment with inhibitors of microglial activation: cyclosporin

A, (10 mg/kg, SC - chronic treatment/ 50mg/kg, SC - acute treatment), and minocycline (125

mg/kg, SC - acute treatment), a specific inhibitor of microglial activation. The use of

neuroanatomical tracers allowed us to evaluate the structural plasticity and

immunofluorescence together with western blot techniques allowed us to observe the

expression and morphology of microglial cells and its main transcription factor, NFAT.

Following a ME, Iba-1 immunoreactivity showed a progressive increase of microglial

activation in the contralateral SC after 24h, peaking at 72h after the lesion and its activation

correlated with CaN expression. Treatment with inhibitors of microglial activation reduced

the structural plasticity of intact uncrossed retinotectal axons and microglial activation as

seen by the decrease of Iba-1 immunoreactivity, 24h after the lesion. The data support the

hypothesis that microglial activation is a necessary step for the regulation of neuroplasticity

induced by lesions during early brain development. This study was approved by CEUA/UFF

under de protocol number 0015109.

FAPERJ, CNPq, CAPES and PROPPI-UFF