Versi terjemahan dari Apoptosis Detection by Flow Cytometry.docx

Apoptosis Detection oleh Arus cytometry Paul Allen dan Derek Davies Ringkasan Apoptosis adalah bentuk biologis penting kematian sel dan karena itu deteksi dan pengukuran apoptosis telah menjadi keharusan. Sel apoptosis memiliki banyak karakteristik yang dapat diukur

dengan sitometri. Ini termasuk perubahan sel membran plasma, perubahan permeabilitas membran plasma, perubahan permeabilitas membran mitokondria, aktivasi caspase, dan pembelahan DNA. Penentuan salah satu atau kombinasi dari perubahan ini dengan flow cytometry

memungkinkan identifikasi dan kuantifikasi sel apoptosis dalam populasi campuran. Hal ini juga

dapat memberikan informasi berharga tentang jalur molekuler yang mengambil sel selama kematian sel. Keunggulan dan keterbatasan dari setiap prosedur yang dirancang untuk mengukur setiap karakteristik ini dibahas, dan beberapa protokol diilustrasikan dijelaskan. Kata Kunci: Apoptosis; caspases, pembelahan DNA, mitokondria, membran plasma; viabilitas. 1. Pengantar Apoptosis adalah suatu bentuk kematian sel yang telah berkembang untuk melawan proliferasi sel. Contoh apoptosis terlihat selama perkembangan janin (misalnya, kehilangan anyaman antara digit), dalam penghapusan sel kekebalan autoreaktif pada neonatus dan selama pemeliharaan jaringan dan organ homeostasis pada orang dewasa. Penyimpangan dalam hasil pengendalian apoptosis pada penyakit, kanker dan penyakit autoimun dapat berasal dari penghambatan apoptosis, dan penyakit degeneratif (misalnya, Parkinson penyakit) bisa menjadi konsekuensi dari aktivasi yang tidak diinginkan apoptosis. Apoptosis kontras dengan nekrosis, sering disebut sebagai "kematian sel disengaja," dalam arti bahwa membran sel plasma tetap utuh. Tanda-tanda klasik rubor, kalor, tumor, dan dolor (kemerahan, panas, bengkak, dan nyeri, masing-masing), identik dengan nekrosis, tidak terlihat, karena isi selular sel apoptosis tidak pernah dilepaskan ke ruang interstitial menyebabkan peradangan. Sebaliknya, sel apoptosis 147 Dari: Arus cytometry: Prinsip dan Aplikasi Diedit oleh: MG Macey © Humana Inc Pers, Totowa, NJ yang phagocytosed oleh sel sekitarnya. Perkiraan menunjukkan bahwa orang dewasa yang khas yang terdiri dari kira-kira 10 14 sel kehilangan 10 7 sel per hari melalui apoptosis, dalam tanpa rasa sakit dan tanpa disadari fashion. Apoptosis juga dapat diinduksi, atau diaktifkan langsung, daripada hasil dari acara terprogram seperti yang dikutip di atas. Sebagai contoh, agen terapeutik digunakan dalam pengelolaan penyakit neoplastik menginduksi kematian sel apoptosis pada

sel target pada konsentrasi fisiologis ditoleransi. Dengan demikian, pada kanker, blokade dari jalur apoptosis memberikan kontribusi tidak hanya untuk oncogenesis tetapi juga untuk obat resistensi (1). 2. Persiapan apoptosis dan Peran mitokondria Sel apoptosis menunjukkan karakteristik tertentu. Ini termasuk kondensasi kromatin, penyusutan sel, dan blebbing membran. Karakteristik terakhir ini bertanggung jawab untuk "mencubit-off" dari badan-badan apoptosis dari sel induk. Setiap tubuh apoptosis berisi berbagai macam acak nuklir dan sitoplasma materi, tetapi yang terpenting membran sel tetap utuh, dan in vivo, badan-badan ini dikeluarkan oleh fagositosis. Penanda lain dari apoptosis adalah pengaktifan caspase-diaktifkan deoxyribonuclease, endonuklease yang memotong DNA pada situs terpapar oleh histon. Situs-situs tersebut secara berkala (setiap pasangan basa 182 [Bp]) dan jika pembelahan selesai akan menghasilkan fragmen DNA yang terdiri dari multimers dari 182 bp (yaitu, 182, 364, 728, 1456, dll). Ketika fragmen ini berjalan pada elektroforesis gel agarosa, mereka memisahkan untuk membentuk karakteristik "Tangga DNA," ciri dari apoptosis. Fragmentasi DNA untuk gelar ini didahului oleh pembelahan DNA menjadi fragmen yang lebih besar dari 300 kbp sampai 50 kbp. Jika tahap akhir pembelahan DNA tidak terjadi, elektroforesis konvensional tidak akan menyelesaikan fragmen ini ke tangga. Bahkan, lapangan berdenyut elektroforesis diperlukan untuk mengidentifikasi tingkat fragmentasi DNA (1). Hal ini berlaku umum bahwa sebagian besar, tapi tidak semua, bentuk apoptosis adalah akhir hasil aktivasi caspase. Caspases yang sisteinil proteinase aspartat spesifik yang mengakui urutan tetrapeptide pada protein target. Aktivasi caspase bisa menjadi autocatalytic (misalnya, caspase 8) atau hasil dari generasi holoenzyme karena belahan dada dan asosiasi dengan kofaktor (misalnya, caspase 9) atau pembelahan dari caspases hulu (misalnya, caspases 3, 6, dan 7). Caspases telah sewenang-wenang dibagi menjadi caspases inisiator (misalnya, caspases 8 atau 9), yang adalah mereka yang mengaktifkan langsung ke induksi apoptosis (yang mengakibatkan caspase hilir lebih lanjut pembelahan), atau efektor caspases (misalnya, caspases 3, 6, dan 7), yang adalah mereka yang sekali diaktifkan oleh caspases inisiator, membelah caspase substrat yang bertanggung jawab untuk menciptakan fenotip karakteristik apoptosis (2). Induksi apoptosis dapat disebabkan oleh protein yang ekstrinsik sel, yaitu, mereka adalah ligan (misalnya, fas-L, tumor necrosis factor [TNF] - *, dan Apoptosis-inducing ligand TNF terkait [TRAIL]) yang mengikat ligan spesifik 148 Allen dan Davies

reseptor permukaan sel yang memiliki transmembran dan domain sitosol. Itu perubahan konformasi yang dihasilkan dari domain intraseluler mengikat adaptor protein (misalnya, FADD [Fas-terkait domain kematian]) yang pada gilirannya merekrut caspase 8 molekul. Ini caspase autocatalytic memulai peristiwa hilir dari jalur ekstrinsik. Sebagian besar rangsangan apoptosis-inducing lain mengaktifkan jalur intrinsik. Jalur ini dapat disebabkan, misalnya, oleh perubahan dalam lingkungan seluler seperti kehilangan faktor pertumbuhan (s), perubahan suhu atau pH, hipoksia, atau bentuk lain dari "stress" seperti kerusakan DNA. Kuncinya pemain dalam jalur ini adalah mitokondria (2 - 4). Mitokondria adalah sumber produksi ATP untuk sel. Untuk produksi ATP terjadi, harus ada jaring muatan negatif pada membran mitokondria bagian dalam. Namun, pada induksi apoptosis, acara mitokondria kunci berlangsung yang dikenal sebagai membran luar mitokondria permeabilization, atau MOMP. Protein yang biasanya ditemukan di ruang antarmembran mitokondria yang dilepaskan ke dalam sitosol, dan transmembran potensial listrik dalam (** m) hilang. Satu protein dirilis adalah sitokrom C. Ini memicu perakitan sitokrom C / caspase 9/Apaf 1 kompleks, yang juga dikenal sebagai apoptosome. Ini adalah kompleks caspase-aktif yang kemudian mengaktifkan caspases hilir efektor yang mendorong apoptosis selanjutnya (4 - 6). MOMP adalah point of no return untuk sel itu, setelah diinduksi, sel secara efektif pada kursus ireversibel ke sel kematian. MOMP dibawa oleh masuknya ke dalam pori-pori luar mitokondria membran. Salah satu mekanisme mungkin melibatkan perakitan permeabilitas pori transisi yang terdiri dari transporter nukleotida adenin ditambah tegangan tergantung saluran anion membentang dari bagian dalam ke luar mitokondria membran, masing-masing. Hasilnya adalah runtuhnya ** m dan penyerapan molekul air (3, 5). Membran mitokondria sehingga membengkak, pecah membran luar mitokondria. Model lain didasarkan pada eksperimen menunjukkan peran untuk anggota keluarga Bcl-2 protein. Protein ini berbagi daerah homologi dikenal sebagai BH (Bcl-2 homologi) domain; beberapa protein mempromosikan MOMP dan karenanya apoptosis, dan lain-lain mencegah MOMP dan karenanya menghambat apoptosis. Dua Bcl-2 protein (Bax dan Bak) bahwa setiap mengandung tiga BH domain (BH1, BH2, dan BH3) oligomerize dan membentuk pori-pori dalam membran luar mitokondria, sehingga menghasilkan MOMP. Oligomerisasi adalah hasil dari aktivasi oleh subfamili dari Bcl-2 protein yang hanya berisi yang BH3 domain (misalnya, tBid). Eponymous Bcl-2 protein ditambah multidomain lainnya protein antiapoptotic dapat memblokir Bax dan Bak dengan mengikat mereka dan mencegah aktivasi mereka (4, 5, 7). 3. Apoptosis dan Nekrosis Necrosis sering disebut sebagai "kematian sel disengaja." Hal ini karena sel-sel

dibunuh oleh pecahnya membran plasma, mengingatkan peristiwa terlihat pada Apoptosis Detection 149 luka bakar dan luka. Yang dihasilkan kebocoran isi sel ke sekitarnya lingkungan mengaktifkan peradangan. Namun, nekrosis dapat dibawa oleh penghinaan kurang parah yang tetap menyebabkan pecahnya membran. Salah satu contoh adalah Racun natrium azida, yang menghambat aktivitas ion energi tergantung pompa. Penurunan Ca 2 Mg 2 K, dan Na 2 bawah konsentrasi masing-masing Hasil gradien dalam asupan kompensasi air oleh sel-sel. Mitokondria membran juga membengkak, glikolisis anaerobik terjadi, dan ada penurunan pH. Plasma pecah membran sel dan enzim lysomal dan merendahkan fosfolipase dilepaskan, yang mengakibatkan peradangan karakteristik (1). Oleh karena itu, ada dikotomi yang jelas dalam kematian sel diwakili oleh apoptosis di satu sisi dan di sisi lain nekrosis. Apoptosis adalah diprogram Acara yang mempertahankan homeostasis jaringan. Ini juga merupakan respon terhadap rangsangan ringan dari lingkungan atau dari induser fisiologis seperti TNF-*, Fas-ligan, atau TRAIL. Necrosis diinduksi oleh penghinaan berkepanjangan atau ekstrim atau hasil pecahnya mekanik dari membran sel. Namun, proses ini adalah peristiwa yang sama sekali terpisah? Bukti bahwa mereka tidak berasal dari beberapa sumber. Necrosis sering terlihat setelah respon apoptosis awal; stimulus yang sama dapat menginduksi apoptosis atau nekrosis baik, tergantung pada konsentrasi dan / atau Lamanya waktu penghinaan, penghambatan caspase akan memblokir apoptosis, namun sel dapat masih mati melalui nekrosis dan MOMP ditambah hilangnya ** m, dan sitokrom C rilis terjadi di kedua apoptosis dan nekrosis. Dengan demikian, apoptosis dan nekrosis bisa dua ekstrem kontinum. Ini berarti bahwa mengambil satu pun parameter kematian sel dalam isolasi mungkin tidak mendefinisikan bentuk kematian sel di bawah Pemeriksaan (1). Banyak karakteristik apoptosis dijelaskan di atas setuju untuk identifikasi dan kuantifikasi dengan sitometri. Beberapa teknik yang dijelaskan kemudian dalam bab ini. 4. Viabilitas dan Necrosis Menghamburkan cahaya yang diukur dengan aliran cytometer adalah campuran kompleks dari partikel cara mencerminkan, membiaskan, dan lentur cahaya. Jumlah cahaya yang tersebar akan tergantung pada beberapa faktor, terutama ukuran sel, rasio nuklir / sitoplasma, granularity dari sitoplasma, topografi permukaan, dan perbedaan dalam bias yang Indeks antara media intra dan ekstraseluler. Hal ini juga akan tergantung di mana sudut cahaya yang tersebar dikumpulkan. Namun, plot dot maju dibandingkan 90 ° sisi pencar akan sering membiarkan perbedaan antara sifat menghamburkan cahaya dari

sel hidup, mati, dan apoptosis untuk dilihat. Kondensasi sel selama apoptosis awal dipandang sebagai penurunan maju menghamburkan cahaya saja. Sebagai hasil apoptosis, baik depan dan 90 ° sisi pencar berkurang. Dalam kematian nekrotik, sel membengkak awalnya dan kemudian isi seluler dirilis cepat. Ini terlihat pada aliran cytometer sebagai peningkatan awal dalam 150 Allen dan Davies maju menghamburkan cahaya diikuti oleh penurunan cepat dalam kedua maju dan 90 ° sisi pencar. Perubahan ukuran sel dapat digunakan dalam hubungannya dengan permukaan fenotipik penanda untuk mengidentifikasi populasi sekarat. Perubahan permeabilitas membran plasma mewakili lebih diskriminatif fitur sel-sel mati. Pewarna kationik (misalnya, propidium iodida [PI] atau 7-aminoactinomycin D [7-AAD]) tidak permeant untuk sel layak. Dalam nekrosis, atau akhir apoptosis, pecah membran plasma memungkinkan penyerapan zat pewarna. Namun, selama apoptosis, perubahan energi yang tergantung pompa membran ionik mengizinkan entri seluler 7-AAD untuk beberapa derajat. Dengan demikian, nekrosis dan sel apoptosis akhir berpendar terang, sedangkan sel apoptosis berpendar kurang cerah dan layak sel termasuk pewarna sama sekali dan karena itu negatif untuk fluoresensi. Contoh lain adalah Hoechst 33342. Pewarna ini diambil jauh lebih lambat dalam sel yang layak daripada baik sel apoptosis atau sel mati. Hoechst 33342 dan yang penting dye PI membuktikan kombinasi yang berguna. Setelah masa pewarnaan singkat, layak sel-sel mengambil tidak Hoechst maupun PI, sel apoptosis mengambil hanya Hoechst (Biru), dan kedua Hoechst dan PI ditemukan dalam sel nekrotik. Selain itu, ini pewarna mengizinkan penggunaan fluorochrome ketiga seperti fluorescein isothiocyanate (FITC) untuk karakterisasi lebih lanjut dari sel-sel mati. Pewarna cyanine monomer alternatif untuk pewarna tersebut dan juga memanfaatkan pada permeabilitas membran berubah sel apoptosis. Yang biasa digunakan Contohnya adalah neon pewarna asam nukleat hijau, YO-PRO-1. Perubahan apoptosis membran plasma sel memungkinkan sel normal-impermeant YO-PRO-1 memasuki sel apoptosis dan mengikat DNA. Sel-sel ini juga akan mengecualikan PI, sehingga diskriminasi antara sel-sel yang layak, sel apoptosis, dan sel-sel mati. 4.1. Deteksi Apoptosis Menggunakan Serapan 7-AAD 1. Cuci sel dalam PBS dan resuspend pada 1 10 6 / mL PBS. 2. Tambahkan 7-AAD ke 1 mL sel (yaitu, 10 6 sel) untuk memberikan konsentrasi 7-AAD akhir 20 * g / mL. 3. Menetaskan sel pada 4 ° C selama 20 menit. 4. Pelet sel dan resuspend dalam 500 * L 2% paraformaldehyde. 5. Menganalisis sel dalam 30 menit fiksasi dengan plot dot menggunakan pencar maju pada

sumbu x dan 7-AAD fluoresensi pada sumbu y. 6. Tiga populasi yang berbeda harus diamati: populasi dengan 7-AAD fluoresensi setara dengan kontrol negatif (paraformaldehyde nonstained tetap sel, yang merupakan sel-sel yang layak), sel-7 AAD-terang yang orang mati atau akhir sel apoptosis, dan sel-7 AAD-dim yang merupakan penduduk apoptosis. Catatan: Sel tidak harus tetap dalam protokol ini, sehingga langkah 4 dapat dihilangkan. Namun, jika fiksasi lebih disukai, dapat dilakukan baik sebelum atau setelah pewarnaan dengan 7-AAD. Adalah penting bahwa flow cytometry akan dilakukan dalam 30 menit pewarnaan sel setelah fiksasi. Apoptosis Detection 151 4.2. Deteksi Apoptosis dan Nekrosis Menggunakan Hoechst 33342 dan PI 1. Panen 1 10 6 sel dan resuspend dalam 1 mL PBS. 2. Tambahkan Hoechst 33342 ke konsentrasi akhir 1 * g / mL (misalnya, tambahkan 100 * L saham Solusi Hoechst dari 10 * g / mL dengan 900 * L suspensi sel). 3. Tambahkan PI ke konsentrasi akhir 5 * g / mL (misalnya, satu tetes PI dari stok 50 * g / mL menggunakan pastette a). 4. Menetaskan selama 5 menit dan menganalisa menggunakan dot blot PI pada sumbu x dan Hoechst pada sumbu y. Catatan: Hoechst 33342 spektrum emisi bergeser ke arah merah apoptosis sel. Untuk mencegah hilangnya Hoechst fluoresensi, gunakan 400 lama-pass filter gantinya yang biasa Hoechst DNA kombinasi saringan dari 400 panjang-pass dan shortpass 480 filter. 4.3. Deteksi Perubahan Membran Menggunakan YO-PRO-1 (Gambar 1) 1. Panen 1 10 6 sel dan mencuci sekali dalam PBS. 2. Resuspend sel dalam 1 mL medium dengan 1 * M YO-PRO-1. 3. Menetaskan sel pada suhu kamar selama 20 menit. 4. Cuci sekali dalam PBS dan menganalisa segera (menjaga sel-sel di dalam es sampai analisis). 5. YO-PRO-1 fluoresensi, setelah 488-nm eksitasi, diukur antara 515 dan 545 nm. Penambahan diskriminator sel mati seperti PI akan memungkinkan sel-sel hidup (YOPRO- 1 - dan PI-negatif) harus dipisahkan dari apoptosis (YO-PRO-1-positif, PI-negatif) dan mati (YO-PRO-1-positif, PI-positif) sel. Selain itu, sebagai sel mati dan menjadi semakin nekrotik, mereka mengikuti kursus parabola pada dot plot yang awalnya cerah bagi kedua pewarna dan kemudian semakin kurang begitu. 5. Apoptosis Yang banyak karakteristik apoptosis dapat dimanfaatkan untuk mengidentifikasi apoptosis sel antara populasi sel hidup. Hilangnya DNA dari sel sebagai akibat dari Fragmentasi DNA secara teknis yang paling mudah untuk dideteksi. Fragmen kecil yang terdiri multimers DNA 182 bp-dapat dielusi dari sel apoptosis setelah permeabilization dengan etanol 70% dan pencucian dalam buffer fosfat. Permeabilization The juga memungkinkan masuknya pewarna PI ke dalam sel yang intercalates dengan DNA. Itu

menghasilkan profil DNA untuk berkembang biak sel layak menunjukkan distribusi DNA untuk sel dalam G 0 / G 1 fase, S-fase, dan G 2 / fase dari siklus sel M, tapi elusi DNA dari sel apoptosis memberikan populasi sel dengan kandungan DNA lebih kecil dari sel-sel di G 0 / G 1. The nucleosomal fragmentasi DNA dimulai dengan awal terbentuknya 300-kbp dan / atau fragmen 55-kbp. Hanya setelah tahap ini primer yang Fragmen 182-bp yang dihasilkan. Dalam beberapa jenis sel, fragmentasi ini yang terakhir tidak terjadi. Ini fragmen besar terlalu besar akan dielusi dari sel, seterusnya 152 Allen dan Davies alat tes kandungan DNA, tidak akan ada kerugian nyata dari DNA dalam apoptosis sel. Peneliti harus resor untuk berdenyut lapangan elektroforesis gel untuk menyelesaikan, dan karenanya mengidentifikasi, fragmentasi alam ini. Namun, istirahat dalam untaian DNA yang penting untuk fragmentasi DNA dapat dideteksi menggunakan teknik yang disebut TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase [TdT] deoxyuridine trifosfat [dUTP] nick akhir pelabelan). The nick, atau istirahat, di DNA disebabkan oleh aktivasi caspase-deoxyribonuclease diaktifkan. Teknik ini tergantung pada kemampuan TdT sampai akhir-label dengan torehan dUTP nukleotida independen dari setiap template dari untai berlawanan. Biotinylation atau konjugasi dUTP dengan digoxygenin dapat digunakan untuk mengidentifikasi baru dimasukkan nukleotida dalam DNA. Untuk aliran cytometry, biotin dapat dideteksi dengan menggunakan avidin FITC-terkonjugasi dan digoxygenin dapat Deteksi 153 Apoptosis Gambar. 1. Apoptosis deteksi oleh YO-PRO-1 (perubahan dalam membran plasma sel). Hidup sel (L) adalah negatif untuk kedua YO-PRO-1 dan PI. Apoptosis dini (A) menunjukkan peningkatan YO-PRO-1 fluoresensi tetapi tetap PI-negatif. Sel-sel mati (D) yang YO-PRO-1-dan PI-terang, tetapi sebagai sel menjadi nekrotik, DNA degradasi dan fluoresensi dari kedua pewarna berkurang (N). dideteksi dengan antibodi membawa fluorochrome. Lebih baik lagi adalah dengan menggunakan protokol menggabungkan dUTP terkonjugasi secara langsung. Tidak ada reagen sekunder yang diperlukan dan ini menghilangkan kemungkinan mengikat spesifik reagen sekunder. Teknik ini memungkinkan untuk diskriminasi apoptosis, nekrosis, dan viabilitas karena torehan terjadi dengan frekuensi yang lebih tinggi daripada di dalam apoptosis sel nekrotik. (Lihat Subpos 5.1. Dan 5.2.). Perubahan dalam distribusi protein membran, glikoprotein, dan fosfolipid selama apoptosis dapat digunakan untuk mendeteksi apoptosis sebagai alternatif untuk DNA fragmentasi. Satu perubahan tertentu yang mudah untuk mengeksploitasi adalah bahwa phosphatydylserine (PS) distribusi. Dalam sel yang layak normal, membran plasma batin lapisan berisi fosfolipid anionik dan lapisan luar lipid netral. Oleh karena itu, distribusi PS asimetris dan ditemukan terutama pada leaflet dalam membran. Namun, selama apoptosis, distribusi

lipid anionik membalik dan PS kemudian ditemukan terutama pada leaflet luar membran. Annexin V adalah protein fosfolipid-mengikat kalsium bergantung dengan afinitas tinggi untuk PS dan karena itu dapat digunakan untuk mendeteksi externalized PS. Annexin V tersedia konjugasi berbagai fluorochromes dan karena itu cocok untuk digunakan dalam analisis multiparameter. (Lihat Subpos 5.3.). Mitokondria juga dapat ditargetkan untuk deteksi apoptosis karena generasi MOMP dan berakibat pada penurunan ** m dapat diukur pada aliran cytometer. Distribusi asimetris ion H di mitokondria membran dalam mempertahankan muatan negatif internal yang bersih yang dibutuhkan untuk fungsi mitokondria normal. Para pewarna fluorescent kation lipofilik CMXRos (klorometil-X-rosamine), TMRE (tetramethylrhodamine etil ester), JC-1 (5,5 * 6,6 *-tetrakloro-1, 1 *, * 3,3-tetraethylbenzimidazol iodida carbo-sianida), DiOC 6 (3) (dihexyloxacarbo-sianida iodida), dan rhodamine 123 yang diambil dan didistribusikan di seluruh membran dalam dengan cara yang tergantung pada H distribusi (yaitu, ke mitokondria bagian membran matriks layak yang normal sel). Hal ini terjadi hanya karena efek ** m jauh lebih besar dalam hal distribusi pewarna kationik dibandingkan dengan membran plasma. Ini diilustrasikan oleh aplikasi 137 m M KCl, yang mengganggu potensial membran plasma dan hanya menyebabkan penurunan kecil dalam fluoresensi seluler. Protonophore The carbonylcyanide m-klorofenil hydrozone (mClCCP) mengganggu ** m dan menghasilkan penurunan lebih besar dalam fluoresensi. Pewarna DiOC 6 diambil ke dalam mitokondria sel-sel sehat dan mencerminkan H distribusi ion dalam sel-sel. Runtuhnya ** m apoptosis, mengakibatkan redistribusi ion H juga mengakibatkan hilangnya bersamaan dari DiOC 6 dari mitokondria dan karenanya penurunan fluoresensi pada aliran cytometer. JC-1, bagaimanapun, adalah sedikit lebih informatif. JC-1 bentuk agregat dengan adanya potensi membran tinggi dan berfluoresensi dalam merah wilayah di 590 nm. Dalam apoptosis, para ** m runtuh dan JC-1 agregat 154 Allen dan Davies berdisosiasi untuk membentuk monomer yang berpendar di kawasan hijau di 527 nm. Oleh karena itu, adalah mungkin untuk plot fluoresensi hijau terhadap fluoresensi merah untuk populasi sel. Bahkan dalam sel-sel sehat, maka akan mungkin untuk membedakan kedua JC-1 agregat dan JC-1 monomer, yang keduanya merupakan indikasi tingkat heterogenitas mitokondria dalam sel-sel individual. Dengan demikian, mayoritas mitokondria akan memiliki tinggi ** m tetapi beberapa akan rendah. Namun, dalam populasi apoptosis, sebagian besar sel akan kehilangan apapun ** m dan ini kerugian akan tercermin pada hilangnya JC-1 agregat dan karenanya fluoresensi merah. (Lihat Subpos 5.4.-5.6.). Aktivasi caspase dalam sel apoptosis juga dapat dideteksi. Hal ini dapat dicapai

dengan menggunakan antibodi diarahkan terhadap situs katalitik caspases tertentu atau oleh menggunakan substrat nonfluorescent yang dibersihkan oleh enzim untuk menghasilkan terdeteksi produk neon. (Lihat Subpos 5.7.). 5.1. Deteksi Apoptosis Menggunakan PI DNA Assay Konten (Gambar 2) 1. Panen sekitar 2 10 5 sel dan mencuci sekali dalam phosphate-buffered saline (PBS). 2. Resuspend sel dalam 0,5 mL es dingin-etanol 70% dan menetaskan atas es untuk lebih dari 2 jam. 3. Cuci sel sekali dalam PBS dan resuspend dalam campuran 1 mL 50 * g / mL PI dan 200 * g / mL RNase dalam PBS selama 30 menit pada 37 ° C. 4. Jangan mencuci sel sebelum analisis pada aliran cytometer. PI adalah intercalasi agen dan akan bocor keluar dari sel jika populasi disuspensi dalam buffer tidak mengandung PI. 5. Menganalisis menggunakan pengolahan pulsa ke pintu gerbang keluar sel dikumpulkan dan puing-puing sel. Pada Plot histogram fluoresensi merah melawan jumlah sel, sel-sel apoptosis jatuh ke kiri G 0 / G 1 puncak. 5.2. Deteksi Apoptosis oleh Teknik TUNEL 1. Panen 1,5 10 6 sel dan mencuci di PBS. 2. Resuspend dalam 1 mL PBS, tambahkan 1 mL 2% b / v paraformaldehyde, dan tempat di atas es selama 15 menit. 3. Cuci dua kali dalam PBS dan resuspend pelet dalam 2 mL etanol 70%. 4. Place at -20 ° C selama minimal 30 menit, tapi semalam (sekitar 16 jam) dapat memberikan yang lebih baik hasil. Sel dapat disimpan sampai 3 d pada tahap ini. 5. Rehydrate sel dalam PBS dengan pelet sel, aspirating etanol, dan resuspending sel-sel dalam 1 mL PBS. 6. Pelet dan resuspend sel dalam 50 * L cacodylate penyangga (0.2 M kalium cacodylate, 2,5 m M Tris-HCL, pH 6,6, 2,5 m M CoCl 2, 0,25 mg / mL bovine serum albumin, 5 unit TdT, dan 0,5 M n dUTP-FITC) dan menetaskan selama 60 menit pada suhu 37 ° C. 7. Cuci dua kali dalam PBS. 8. Menganalisa pada plot histogram fluoresensi hijau terhadap jumlah sel. Catatan: Sebuah sampel kontrol harus menghilangkan TDT pada Langkah 6. Apoptosis Detection 155 5.3. Deteksi PS sebagai Marker dari Apoptosis Menggunakan Annexin V (Gambar 3) 1. Cuci 1 10 6 sel di PBS dan resuspend dalam 1 mL buffer inkubasi (10 m M HEPES, pH 7,4, 150 m M NaCl, dan 5 m M CaCl2). 2. Tambahkan FITC-label annexin V hingga konsentrasi akhir 2,5 * g / mL. 3. Cuci sekali dalam inkubasi penyangga, resuspend dalam 1 mL buffer inkubasi, dan menganalisa sel menggunakan histogram fluoresensi hijau pada nomor sumbu x dan sel pada sumbu y. 4. Gunakan sel nonstained dan sel yang tidak diobati sebagai kontrol negatif. 5. Atau, jika PI (5 * g / mL) yang tergabung dalam buffer inkubasi pada langkah 4, sebuah dot plot PI pada sumbu x terhadap annexin V pada sumbu y dapat digunakan untuk membedakan sel layak (yang negatif untuk kedua PI dan annexin V), sel apoptosis (Yang annexin V-positif tetapi tidak termasuk PI dan karena itu PI-negatif), dan sel apoptosis atau nekrosis akhir (yang ganda-positif untuk penyerapan PI dan annexin V pewarnaan).

156 Allen dan Davies Gambar. 2. Propidium iodida / baris sel RNase-bernoda menunjukkan (panel atas) gentar distribusi siklus sel dan (panel bawah) sub G 0 / G 1 populasi apoptosis pada M 1 selang gerbang. HL-60 sel ditampilkan pada sebelah kiri panel, dan K562 sel ditampilkan di sebelah kanan. 5.4. Deteksi Perubahan m Menggunakan Pewarna Nonfixable (Gambar 4A) 1. Panen 1 10 5 sel dan mencuci sekali dalam PBS. 2. Resuspend sel dalam 1 mL media yang mengandung 40 n M DiOC 6 atau alternatif 1 * M JC-1. 3. Menetaskan sel selama 15 menit pada 37 ° C. Apoptosis Detection 157 Gambar. 3. (A) FITC-terkonjugasi annexin V pewarnaan untuk paparan phosphatidylserine pada sel apoptosis (kanan) dibandingkan dengan sel kontrol yang layak (kiri). (Gambar yang ramah disediakan oleh Ulrike Jahnke, Barts dan The London School Kedokteran dan Kedokteran Gigi.) (B) Dual-pewarnaan sel kontrol (kiri) dan sel apoptosis (kanan) diwarnai dengan propidium iodida (PI) (sumbu x) dan annexin V (sumbu y). Analisis kuadran menunjukkan sel layak negatif untuk Annexin V dan mengecualikan PI (kiri bawah). Sel apoptosis noda dengan annexin V tetapi diluar PI (kiri atas). Sel nekrotik sekunder (yaitu, nekrosis setelah apoptosis) positif untuk kedua PI dan annexin V (kanan atas). Nekrotik atau rusak mekanis sel positif untuk PI hanya ditunjukkan pada kuadran kanan bawah (sangat sedikit). 158 Allen dan Davies Apoptosis Detection 159 4. Cuci sekali dalam PBS. 5. Resuspend dalam 1 mL PBS dan menganalisa segera. 6. DiOC sel 6 bernoda dapat dianalisis menggunakan fluoresensi hijau pada sumbu x terhadap jumlah sel pada sumbu y. Penurunan fluoresensi hijau menunjukkan hilangnya ** m. 7. Sel JC-1-bernoda dapat dianalisis dengan menggunakan fluoresensi merah (590 nm) pada sumbu x terhadap jumlah sel pada sumbu y. Penurunan fluoresensi merah menunjukkan kerugian dari ** m. Atau, dua warna fluoresensi dapat digunakan dengan plot titik hijau fluoresensi pada sumbu x dan merah fluoresensi pada sumbu y. 5.5. Deteksi Perubahan m Menggunakan CMXRos (diperbaiki) 1. Panen 1 10 5 sel dan mencuci sekali dalam PBS. 2. Sel resuspend dalam 1 mL media yang mengandung 30 m M CMXRos. (Larutan stok CMXRos dapat dibuat dalam dimetil sulfoksida pada konsentrasi 100 - 200 kali lipat lebih pekat daripada yang diperlukan dan disimpan pada suhu -20 ° C) 3. Menetaskan sel pada suhu 37 ° C selama 15 menit. 4. Menganalisis sel menggunakan fluoresensi hijau terhadap jumlah sel. Atau, sel dapat disuspensi dalam medium yang mengandung 150 m M CMXRos, dan setelah inkubasi mereka bisa diperbaiki dengan resuspending yang CMXRos bernoda pelet sel dalam paraformaldehyde 4% dalam PBS selama 15 menit pada suhu kamar. Sel dapat disimpan pada suhu 4 ° C dan / atau ternoda untuk antigen kedua bunga melalui prosedur permeabilization membran seperti aseton, etanol, atau deterjen.

Catatan: kontrol positif untuk eksperimen ini adalah untuk mengobati sel dengan agen uncoupling (misalnya, 50 * M mClCCP), yang benar-benar menghapuskan transmembran potensial. 5.6. Deteksi Perubahan m Menggunakan TMRE (Gambar 4) 1. Panen 1 10 6 sel dan mencuci sekali dalam PBS. 2. Resuspend sel dalam 1 mL medium dengan 40 n M TMRE. (Larutan stok adalah 1 m M dalam etanol, larutan kerja adalah 40 * M). 3. Menetaskan sel pada suhu 37 ° C selama 20 menit. 4. Cuci sekali dalam PBS dan menganalisa segera (menjaga sel-sel di dalam es sampai analisis). 5. TMRE fluoresensi diukur, setelah 488-nm eksitasi, antara 560 dan 600 nm. Gambar. 4. (A) membran mitokondria potensial (** m) diukur dengan DiOC 6. Sebuah populasi sel dicemarkan ditampilkan di sebelah kiri, dan populasi kontrol yang sehat DiOC sel 6-positif ditunjukkan di sebelah kanan. Populasi di tengah terdiri dari sel dengan mengurangi ** m. (B) deteksi Apoptosis oleh TMRE (** m) dan TO-PRO-3 (Perubahan permeabilitas membran plasma). Sel-sel hidup yang cerah bagi TMRE tetapi TO-PRO-3-negatif (L). Sel apoptosis dini telah mengurangi pewarnaan TMRE namun tetap negatif untuk penyerapan TO-PRO-3 (A). Sel-sel mati telah kehilangan ** m dan positif Serapan TO-PRO-3 (D). 160 Allen dan Davies Penambahan diskriminator sel mati seperti 7-AAD (488-nm eksitasi) atau TO-PRO-3 (eksitasi 633 nm) akan memungkinkan sel-sel hidup (TMRE-terang, 7-AADnegative) harus dipisahkan dari apoptosis (TMRE-redup, 7-AAD-negatif) dan mati (TMRE-redup, 7-AAD-positif) sel. 5.7. Deteksi Aktivitas Caspase Menggunakan Antibodi Activated Caspases (Gambar 5) 1. Panen 1 10 6 sel dan mencuci sekali dalam PBS. 2. Resuspend sel dalam 1 mL 1% paraformaldehyde. 3. Menetaskan sel pada suhu kamar selama 10 menit. 4. Sel berputar, menghapus supernatan, dan menambahkan 0,5 mL 0,1% saponin. 5. Menetaskan pada suhu kamar selama 20 menit. 6. Tambahkan jumlah yang tepat (0,25 * g) fluorescently berlabel antibodi primer dan menetaskan pada suhu 4 ° C selama 30 menit. 7. Cuci dua kali dalam 0,1% saponin dan kemudian resuspend dalam 0,5 mL PBS. 8. Menganalisis sel, merencanakan fluoresensi dibandingkan jumlah sel. Antibodi terhadap beberapa caspases aktif tersedia secara komersial, terutama caspases 3, 8, dan 9. Tindakan pencegahan biasa pewarnaan antibodi perlu diambil (Yaitu, titrasi antibodi menggunakan kontrol positif dan penggunaan yang tepat kontrol ketika menilai positif). 6. Keuntungan dan Kerugian Metodologi Secara umum, keuntungan besar aliran cytometry dibandingkan teknik lainnya adalah kecepatan di mana sejumlah besar sel dapat dianalisis. Namun, aliran cytometer juga cocok untuk menganalisis kematian sel, dan teknik telah memanfaatkan karakteristik biologis apoptosis dan nekrosis untuk mengidentifikasi dan menghitung kematian sel dan untuk membedakan antara dua bentuk. Ini telah ditingkatkan dengan munculnya fluorochromes baru yang memungkinkan pengukuran lebih dari satu parameter secara simultan untuk identifikasi proses sel. Contohnya, (1) Hoechst pewarnaan dengan annexin V untuk menentukan fase dari siklus sel memproduksi sel apoptosis dan (2) kopling penanda apoptosis dengan ekspresi antigen untuk menentukan jenis sel yang

apoptosis dalam populasi campuran, dan (3) menghubungkan mitokondria studi apoptosis ekspresi penanda fenotipik. Juga, analisis multiparameter karakteristik apoptosis (misalnya, TMRE dan annexin V) dapat membantu untuk menjelaskan jalur apoptosis yang bersangkutan. Kelemahan utama dari metode flow cytometry untuk kematian sel lebih interpretasi data. Apa cytometer aliran memberitahu kita adalah jumlah apoptosis yang terdeteksi pada saat sampling. Ini memberitahu kita apa-apa tentang tingkat apoptosis atau apa-apa tentang jumlah total kematian sel yang mungkin ada dalam populasi sel secara keseluruhan. Ini tidak memberikan kita gambaran kumulatif jumlah kematian yang diinduksi atau sedang diamati. Misalnya, kematian sel 10% setiap 4 jam adalah kematian sel lebih dari 20% setiap 24 jam, namun hasil dari cytometer adalah 20% setiap kali. Masalah-masalah ini dapat diselesaikan dengan menggunakan teknologi selain aliran cytometry (misalnya, waktu selang video). Apoptosis pada sel individu adalah peristiwa yang cepat, sehingga dalam semua tes sel hidup, penting untuk sampel pada titik-titik waktu yang berbeda untuk memantau perkembangan apoptosis secara populasi. 7. Masalah Terkait dengan Tes DNA Konten Reproduktifitas bisa menjadi masalah dalam tes DNA konten, dan setiap langkah harus menjadi standar untuk mengurangi masalah ini untuk minimum. Variabel termasuk jenis sel, saat pengobatan dengan etanol untuk permeabilize sel, dan cuci (atau elusi) prosedur. Pengamatan bahwa mencuci sel dalam 0,2 M penyangga phospho-sitrat pada pH 7.8 sangat meningkatkan ekstraksi DNA terfragmentasi menggambarkan titik terakhir. Hal ini dimungkinkan untuk melebih-lebihkan jumlah apoptosis bila menggunakan hilangnya DNA sebagai parameter. Populasi apoptosis sering disebut sub G 0 / G 1 populasi karena ditemukan di sebelah kiri G 0 / G 1 puncak dalam suatu profil DNA dari layak sel. Namun, sel yang rusak secara mekanis akan jatuh di sini seperti yang akan biasa sel hypodiploid. Selanjutnya, wilayah ini juga akan mencakup buruk bernoda materi jika gerbang utama tidak mengecualikan puing-puing sel dari analisis. Sekarang juga memungkinkan untuk meremehkan jumlah apoptosis dengan metode ini, khususnya jika sel-sel apoptosis yang dihasilkan dari sel-sel di celah kedua fase dari siklus sel (G 2) atau mitosis, karena hilangnya DNA dari sel-sel akan memberikan konten DNA yang akan menempatkan sel-sel baik dalam S-fase atau G 0 / G 1 Apoptosis Detection 161 Gambar. 5. Deteksi diaktifkan caspase 3 di sel Jurkat staurosporine-diobati. (A) Sel kontrol tidak diobati dengan penanda yang menunjukkan positif. (B) Ditangani sel yang menunjukkan baik negatif dan positif (diaktifkan caspase 3) populasi. fase dari siklus sel pada cytometer aliran, daripada memberikan sub G 0 / G 1 populasi. Juga, karena sel-sel telah dipermeabilisasi untuk mengekstrak DNA, tidak ada diskriminasi antara apoptosis dan nekrosis, karena kedua bentuk kematian sel akan mengambil PI saat dipermeabilisasi. Dalam semua kasus, logis dan

strategi gating konsisten untuk menilai tingkat apoptosis penting. 8. Masalah Terkait dengan TUNEL dan PS Teknik Teknik TUNEL akan mendeteksi torehan dalam DNA terkait dengan pembelahan DNA ke dalam fragmen 300-kbp dan 55-kbp serta dalam DNA selanjutnya fragmentasi ke multimers 182-bp. Namun, tidak semua untai DNA istirahat berhubungan dengan apoptosis. Nicks dapat dilihat pada sel nekrotik dan bisa juga didorong secara mekanis selama persiapan sampel. Kekhususan PS deteksi untuk apoptosis sangat bergantung pada sel apoptosis mempertahankan membran plasma integritas. Selama nekrosis, membran sel pecah, memungkinkan Annexin V untuk masuk ke dalam sel dan mengikat untuk PS pada leaflet bagian dalam membran sel plasma. Oleh karena itu, sel-sel nekrotik muncul positif untuk PS. Masalah ini dapat diatasi dengan counterstaining sel dengan PI, yang dikeluarkan dari sel apoptosis. Oleh karena itu, sel nekrotik positif untuk PI dan annexin V; sel apoptosis adalah annexin V-positif tetapi tidak termasuk PI. Namun, sel B yang normal juga bisa menjadi positif untuk annexin V (8). 9. Masalah Terkait dengan Deteksi m Perangkap menggunakan pewarna kationik untuk mendeteksi hilangnya ** m dalam mitokondria termasuk potensi untuk salah menafsirkan data karena artefak. Contoh artefak adalah oksidasi fluorochromes, autoquenching pewarna pada intramitochondrial tinggi konsentrasi, dan fakta bahwa penyerapan pewarna mungkin merupakan cerminan dari perubahan dalam ukuran mitokondria daripada potensial transmembran. Juga, sel diwarnai dengan DiOC 6 atau JC-1 harus dianalisis segera setelah pewarnaan jika sel aktif metabolisme, karena fiksasi tidak mungkin dengan zat pewarna. Sebaliknya, adalah mungkin untuk memperbaiki sel-sel diwarnai dengan CMXRos dengan paraformaldehyde, yang memungkinkan penyimpanan sel atau pewarnaan selanjutnya sel untuk mitokondria atau protein nuklir. 10. Protokol Catatan: Semua metode ini memberikan penilaian dari jumlah apoptosis, biasanya sebagai persentase dari populasi terjaga keamanannya pada saat pengambilan sampel dan bukan dari apoptosis kumulatif selama periode waktu. Dinamika apoptosis mungkin dinilai oleh beberapa sampel dari waktu ke waktu, setelah induksi apoptosis.