· Cytoskelet = 94000 µm²
· Cytosol = waterige gedeelte buiten celorganellen
· Lumen = waterige gedeelte in celorganellen
AFM (Atomic Force Microscopy): 3D-structuur plasmamembraan verkrijgen door zeer gevoelige combinatie van naald en laser.
Fosfolipide dubbellaag: bestaat uit twee rijen amfipatische fosfolipiden (hydrofiel naar buiten, hydrofoob naar binnen) en is ongeveer 3-4 nm dik.
Amfipatische fosfolipiden in waterige oplossing: bestaat uit twee delen:
· Hydrofiele hoofdgroep: polaire groep, fosfaat, glycerol
· Hydrofobe vetzuurstaarten
· Micelle (gesloten bol, één rij)
· Liposoom (open bol, twee rijen)
· Fosfolipidendubbellaag
Exoplasmatische en cytosolische zijden: blijven allebei behouden, ook als er een ventrikel gevormd wordt.
De soorten lipiden in biomembranen (zie slides):
· Fosfoglyceriden: van de triacylglycerol verandert één staart in een fosfaat met kopgroep. (diacylglycerol + fosfaat = fosfatidyl)
· Plasmalogenen: fosfoglyceriden maar dan zonder de dubbelgebonden O op de eerste staart.
· Sfingolipiden: stoffen met sfingosine als basis.
· Glycosfingolipiden: sfingolipiden met als derde staart een suikergroep/suikergroepen.
· Gangliosiden: glycosfingolipiden met zeer complexe suikergroepen/suikerbomen/oligosachariden.
· Komen enkel exoplasmatisch voor (buitenste laag plasmamembraan).
· Zijn een aanhechtingsplaats voor antilichamen, toxines, eiwitten, glycolipiden, …
· De oligosachariden bepalen ook welke bloedgroep men heeft -> bloedgroeptransfusieregels -> zie slides.
· Sterolen: zijn afgeleid van steroïden.
· Cholesterol: een amfipatisch sterool. Dient als precursor voor stoffen zoals cortisone, estradiol, vitamine D (, testosteron, deoxycholisch zuur, …).
· Vitamine D: wordt o.i.v. Uv-licht uit cholesterol gemaakt. Is essentieel voor de calciumopname. Bij gebrek aan zon -> rachitis (verstoorde botopbouw).
Beweeglijkheid van lipiden in een biomembraan:
· Axiale rotatie: rotatie rond eigen as.
· Laterale diffusie: opschuiven in rij van membraan. Kan gemeten worden door FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) -> zie slides.
Opmerking: diffusie gebeurt 10x sneller in een artificiële fosfolipidendubbellaag.
· Flip-flop: omspringen van rij in membraan.
· Energetisch onwaarschijnlijk.
· Meting -> zie slides.
· Temperatuur: hoe warmer, hoe meer chaotische bewegingen.
· Aard/samenstelling van vetzuurstaarten:
· Hydrofoob effect: apolaire stoffen (dit geval vetzuurstaarten) gaan aggregeren omdat de ordening van het water dan energetisch beter uitkomt.
· Van der Waals-krachten: atomen stoten elkaar af zodra hun van der Waals-radius met elkaar in contact komt -> stabiliteit.
· Intermezzo: soorten vetzuren:
· Essentieel <-> niet essentieel: nodig om te overleven (omega-3, omega-6) <-> niet nodig om te overleven (omega-9).
Het cijfer na de omega wijst op de eerste dubbel binding geteld vanaf het einde van de vetzuurstaart.
· Verzadigd <-> onverzadigd: korte vetzuren zonder dubbele binding (meer VdW-krachten) <-> lange vetzuren met dubbele binding(en) (minder VdW-krachten -> verhoogde vloeibaarheid)
· Cholesterol: cholesterol rekt de vetzuurstaarten meer uit -> ontstaan van ‘lipid rafts’
Kromming van de membraan: wordt bepaald door de lipidensamenstelling. Hoe kleiner de hoofdgroep, hoe meer de membraan verkromt zal zijn.
Functies van de plasmamembraan:
· Barrière: de proteïnen in de membranen regelen voor welke stoffen de membraan permeabel is. Stoffen als CO2, N2, O2 en ethanol kunnen er sowieso door, H2O half.
· Intermezzo: osmotische druk: water vloeit naar de zone met de meest opgeloste stof.
· Is nodig bij planten zoals bomen om water tot boven te krijgen.
· Formule: π = RT(CB – CA) in Pa.
· Hypotonisch, isotonisch, hypertonisch.
· Elektrische condensator: formule: Q = CVm in F, met specifieke capaciteit = 0,01 pF/µm². Zie slides voor rekenvoorbeeld.
· Reservoir voor signaalmoleculen.
· Intermezzo: fosfolipasen (PLA1, PLA2, PLC, PLD) splitsen fosfoglyceriden. Vb: PLC splitst PIP2 in DAG en IP3. PIP2, DAG en IP3 zijn alle drie signaalmoleculen.
· 2D-vloeistof: de membraan bestaat uit drie soorten membraanproteïnen:
· Integrale membraanproteïnen:
· Gaan meerdere keren door de membraan.
· Hebben een hydrofobe kern en een hydrofiele AZ-keten -> zorgt voor een probleem: hoe komen ze best voor in vorm? Oplossing:
· α-helix: heeft hydrofobe zijketens. Heeft 6 windingen (20-25 AZ) nodig om het hydrofobe gedeelte te overbruggen.
Intermezzo: Hydropathy Analysis: identificatie van transmembranaire helices door onderzoek van de AZ-sequentie. Positief = transmembranaire sequentie = hydrofoob gedeelte. Negatief = hydrofiel gedeelte.
Intermezzo: Single-pass membraanproteïnes <-> multi-pass membraanproteïnes: vb: resp. kaliumkanaal <-> waterkanaal (aquaporine)
· β-barrel: ‘tonnetje’ van β-sheets. Vb: porines in de buitenste membraan van bacteriën.
· Membraanproteïnen met vetanker: soorten:
· Prenylanker: zit niet in ‘lipid rafts’ (NH3+)
· GPI-anker (glucosylfosfatidylinositol): zit in ‘lipid rafts’ (suikers)
· Perifere membraanproteïnen: interageren op twee manieren niet-covalent:
· Met membraanproteïnen:
· ‘Coats’ op de membraanproteïnen.
· Vetankers.
· Oligomerisatie (aggregeren van membraanproteïnen).
Opmerking: proteïnen doen nooit aan flip-flop. Opmerking: het binden van stoffen aan signaalproteïnen in de ‘lipid rafts’ zal ze laten aggregeren (vb: cholera-toxine).
HOOFDSTUK 2: MEMBRAANTRANSPORT:
Passieve diffusie: diffusie van deeltjes in hogere concentratie naar deeltjes in lagere concentratie:
· Formule (1ste wet van Fick): J = -D x (Dc/Dx) met
· J = flux (mol/m²s)
· D = diffusiecoëfficiënt (m²/s)
· C = concentratie (mol/m³)
· P = (DK/L) met
Hoe hoger K, hoe beter oplosbaar in membraan.
· L = dikte van membraan (m)
Vb: zie slides.
· Stoffen die door passieve diffusie door een membraan kunnen geraken:
· Gassen (O2, CO2, NO)
· Transport volgens elektrochemische gradiënt <-> transport tegen elektrochemische gradiënt.
· Vereist geen energie <-> vereist energie.
· Daling concentratieverschillen <-> Stijging concentratieverschillen.
· Uniporters:
· Onafhankelijk van partitiecoëfficiënt.
· Formule: v = (Vmax/1+(Km/C)) met
· v = snelheid.
· Vmax = maat voor snelheid van conformatieverandering.
· Km = maat voor affiniteit voor glucose (hoe lager, hoe hoger affiniteit).
· C = concentratie aan beginkant.
· GLUT1: rode bloedcellen (Km = 1,5 mM).
· GLUT2: lever- en bètacellen in pancreas (Km = 20 mM).
· GLUT3: hersenen en zenuwcellen (Km = 1,5 mM).
· GLUT4: vet- en spiercellen.
· GLUT5: transporteert fructose, geen glucose.
Glucose- en insulinewerking: glucose wordt opgenomen in bètacellen -> glucose wordt omgezet naar pyruvaat door ADP tot vorming van ATP -> ATP blokeert de K+-kanalen (bij 70 mV) -> depolarisatie tot 40 mV -> spanningsgeschakelde kanalen openen zich en Ca2+ stroomt binnen -> Ca2+ activeert secretie van insuline.
K+-kanaal-openers worden gebruikt tegen hyperinsulemie (te veel insuline in bloedbaan). K+-blokkers worden gebruikt tegen diabetes mellitus (te weinig insuline in bloedbaan).
Effecten van insuline:
· Daling: omgekeerde.
Opmerking: door ‘low carb’ diets verlaagt de glucosespiegel -> minder insuline -> minder glucose-opname en glycogeen en vet worden afgebroken.
· Kanalen:
· Zijn homotetrameren, waarbij elk monomeer een pad is voor water.
· Komen veel voor in de nier -> concentreren urine door reabsorptie.
· Diabetes insipidus: normale bloedglucose, maar slechte werking van ADH -> veel water wordt uitgescheiden en niet gereabsorbeerd.
· Ionenkanalen: zie verderop.
· R = universele gasconstante = 8,315 J/Kmol
· Z = valentiewaarde
Opmerking: T = 300 K als niks gegeven is.
· Evenwichtspotentiaal voor ionen:
· Lijstje van standaard evenwichtspotentialen voor ionen bij zoogdieren:
Actief transport: zorgt voor asymmetrische ionenverdelingen. Kan dit doen door een energetisch ongunstige reactie (A) te koppelen aan een energetisch gunstige reactie (B) zodat ΔGA + ΔGB < 0
Verschillen tussen primair en secundair actief transport:
· ATP <-> energie uit ‘samenwerking’ ionen
· Pompen <-> symporters/antiporters
Opmerking: ATP is geen energie-opslagplaats maar een betaalmiddel -> moet direct verbruikt worden.
Primair actief transport: soorten ATP-pompen/ATPases:
· P-type:
· Zorgen voor de asymmetrische ionenverdeling van K+, Na+ en Ca2+.
· Soorten:
· Na+/K+-ATPase: 3x Na+ naar buiten en 2x K+ naar binnen.
· Verbruikt 1/3 van de totale ATP.
· Werking (zie slides):
3. Conformatieverandering.
4. 2x K+ bindt via extracellulaire kant, 3x Na+ komt los aan extracellulaire kant.
5. Defosforylatie, P komt terug los aan intracellulaire kant.
6. Conformatieverandering.
· Rollen:
· Opbouw van Na+ en K+ gradiënt -> negatieve Em, prikkelbaarheid voor actiepotentiaal, Na+-gekoppeld transport.
· Daling celvolume en netto uitwaartse stroom (elektrogeen) door netto export van één ion.
· Farmacologie: digoxine van digitalis: inhibeert de Na+/K+-ATPases -> middel tegen hartziekten, maar ook toxine in juiste dosis (lage therapeutische index/t.i. -> snel vergiftigd).
· Ca2+-ATPases:
Werking:
2. Fosforylatie, ADP komt los intracellulair.
3. Conformatieverandering.
6. Conformatieverandering.
· Rollen:
· Spiercontractie.
· Activering enzymes, ionenkanalen, genen.
· H+/K+-ATPases: 1x H+ naar buiten, 1x K+ naar binnen.
· Komt voor in maagwandcellen.
· V-type: H+-ATPases: 1x H+ naar binnen:
· Cl- kanalen zorgen voor balans
· In synaptische vesikels, lysosomen, vacuolen, endosomen, osteoclasten, …
· Osteopetrose: defect in H+-ATPases in osteoclasten -> extreme verharding van botten -> misvormingen.
· F-type: ATP-synthetiserende proteïnen in binnenste wand van mitochondriën, chloroplasten, …: vereist instroom van H+-ionen.
· ABC-type (ATP Binding Casette): voor transport van ionen, lipiden, AZ, farmaca, … via binding met ATP.
Secundair actief transport: symporters en antiporters:
· Symporters:
· Na+-influx betekent een verlaging van de vrije energie (meer negatief). De combinatie van een Na+/glucose-symporter geeft een glucose-concentratieverhouding (GCV) van maar liefst 110000 (intra/extra).
· Effect stoichiometrie bij Na+/glucose-symporter: 1x Na+ = 165 als GCV, 2x Na+ = 27000 als GCV.
· Opmerking: bij deze berekeningen moet ge de ΔGm van glucose weglaten omdat deze geen lading draagt.
· Komt voor in de darmen (met 2x Na+).
· Rehydratatietherapie: men neemt een drankje in met glucose en zouten, wat de opname van Na+ en H2O versnelt -> minder last van diarree door drogere darminhoud.
· Glucoserie/glycosurie: aanwezigheid van glucose in de urine door slechte absorptie (of) door hoge bloedsuiker -> diabetes mellitus: slechte insulinewerking -> slechte glucose-opname.
· Andere Na+/…-symporters (vooral in de nieren)
· Antiporters:
· Na+/Ca2+-antiporter: 3x Na+ naar binnen, 1x Ca2+ naar buiten.
· ENCX = 3x ENa – 2x ECa
Als Vm < ENCX -> forward mode (Ca2+ naar buiten)
Als Vm > ENCX -> reverse mode (Ca2+ naar binnen)
Zonder digitalis: ENCX = -47 mV (forward mode)
Met digitalis: ENCX = -74 mV (reverse mode) -> versterkt hartwerking door sterkere/snellere hartslagen! (Ca2+ is nodig voor contractie)
· Regelen de intracellulaire pH (7,2-7,4)
· Buffersysteem bloed: CO2 + H2O <-> HCO3- + H+ via:
· Na+/H+-antiporter
· Na+HCO3-/Cl- antiporter
Ionenkanalen: bio-elektrische principes: zie formularium.
· Oplossen standaard-oefening:
1. Grafiek maken: kijken naar de 4 grafieken en die plotten op één grafiek.
2. Channel-conductantie meten: Vm = 0-grafiek pakken en dan omzetten naar gamma.
3. Ex’n aanduiden op de grafiek: ix = 0 pakken en dan omzetten naar Vm. Dan kijken welke van de twee/meer op de grafiek ligt -> voor die is het kanaal selectief.
· Open probabiliteit: formules kunnen omgevormd worden in elkaar!
· Oplossen oefeningen met open probabiliteit, macroscopische stroom en membraanpotentiaal in rust:
1. Rustpotentiaal berekenen: alles in elkaar invullen.
2. Grafiek maken met macroscopische stroom (I): I berekenen door in te vullen bij beiden, maar Vm = 0 pakken! -> eerste punt. Dan Vm zoeken waarbij I = 0 voor beiden.
3. Verticale lijnen trekken naar elkaars lijn -> twee punten verbinden -> dit is de totale stroom met beide ionen ingerekend. (Snijlijn met x-as = Em)
Ionenkanalen: technieken voor het meten van Em, I en i:
· Current-clamp: stroom vastleggen en dan de spanning meten, want als I = 0 dan kun je Em meten.
· Voltage-clamp spanning aanleggen en dan de stroom meten: soorten:
· Met scherpe elektroden: in cel aanbrengen. Nadelen:
· Beschadiging van cel
· Elektrisch lek
· Two-electrode voltage clamp: men meet de Vm van de cel en vergelijkt dit met een bepaalde potentiaal. Men stuurt stroom door de cel totdat Vm gelijk is aan deze potentiaal. Dan kan men meten hoeveel stroom erin gestuurd is. Werkt wel alleen bij zeer grote cellen.
· Patch-clamp:
· Technieken:
· On-cell: meet indirecte effecten van extracellulaire stoffen die binnenkomen via andere kanalen op het ionenkanaal dat op de pipet zit.
· Whole-cell: idem aan on-cell maar dan de effecten op de hele cel, niet alleen de ionenkanalen op de pipetzone.
· Inside-out: de membraan is naar de binnenkant van de pipet gericht en men meet de invloed van de intracellulaire vloeistof op één kanaal.
· Outside-out: de membraan is naar de buitenkant van de pipet gericht en men meet de invloed van de extracellulaire vloeistof op één kanaal.
· Voordelen:
· Toepasbaar op alle cellen.
· Single- én whole-cell metingen.
· Op basis van grootte.
· Op basis van lading: als het kanaal vanbinnen negatief geladen is kunnen alleen kationen passeren (+), als het kanaal vanbinnen positief is kunnen alleen anionen passeren (-).
· Op basis van binding: bepaalde ionen kunnen bvb binden in het kanaal en zo de doorgang voor andere ionen blokkeren. Bij lagere concentraties van dat ‘blok’-ion zullen de andere ionen dus wel doorkunnen.
Vb: K+-selectiviteit: In het kanaal is de wand begrensd door een dubbelgebonden O. De K+-ionen passen hier perfect in en binden ook perfect, terwijl andere ionen dit niet kunnen.
Ionenkanalen: gevolgen van openen:
· Openen van Na+/Ca2+-kanalen: Na+/Ca2+-influx -> Em stijgt (depolarisatie/excitatie).
· Ionenconcentratie:
· Openen van Ca2+-kanalen: intracellulaire concentratie stijgt -> cellulaire respons (spiercontractie, …)
· Gelijktijdig openen van K+ en Cl- kanalen: efflux van KCl -> daling celvolume.
Ionenkanalen: schakelsignalen:
· Achtergrond-/lekkanalen: zijn permanent open. Vb: Em = EK in rust, of Na+-influx in epithelia voor reabsorptie in de nier.
· Temperatuurgeschakelde kanalen: reageren op hitte en zetten het thermisch signaal om in een elektrisch signaal. Vb: TRP-kanalen: geactiveerd door hitte of liganden die hitte/koude nabootsen zoals menthol en capsaïcine.
· Mechanogevoelige kanalen: zetten fysisch signaal om in elektrisch signaal.
Vb: transductiekanaal in slakkenhuis van het oor.
Vb: piezo-proteïnen die een porie vormen zodra er fysisch contact is (vrij nieuw).
· Spanningsgeschakelde kanalen: zie volgend stuk.
Ionenkanalen: spanningsgeschakelde kanalen:
1. Kanaal is gesloten.
2. Er gebeurt een depolarisatie (+ en – wisselen om over membraan) -> spanningsgevoelige alpha-helices verplaatsen.
3. Ionen stromen door kanaal na opening van kanaal.
4. Ball-and-chain-model: kanaal sluit zich af.
5. Repolarisatie (+ en – wisselen nog eens om).
· Vb: giant squid axon: K+-kanalen laten K+ naar buiten stromen. Door deze depolarisatie zullen + en – omslaan, wat de spanningsgeschakelde Na+-kanalen opent.
· Intermezzo: actiepotentiaal:
· Regels bij ionenkanalen:
· Depolarisatie (Vm stijgt).
· Repolarisatie (Vm daalt).
Ziekten:
· Multiple Sclerose (MS): afbraak myelineschede -> daling van Rm -> daling van lengteconstante -> lage snelheid.
· Fugu-verlamming: tetrodotoxine in de vis fugu blokkeert spanningsgeschakelde Na+-kanalen -> blokkade van actiepotentialen in neuronen en hart -> verschillende symptomen:
· Gevoelloosheid -> verlamming.
· Bereiken van drempel voor actiepotentiaal:
· Artificiële stroominjectie.
· Natuurlijke kabelmodel door depolarisatie:
· Activatie van depolariserende stromen (conductanties van Na+ en Ca2+ gaan omhoog) door bvb thermoreceptoren.
· Inhibitie van repolariserende stromen (conductantie van K+ gaat omlaag)
Opmerking: repolarisatie krijg je door het omgekeerde van hierboven te doen.
· Geleiding van actiepotentiaal: receptorcel -> afferent neuron -> interneuron -> efferent neuron -> effectorcel.
· Verloop van synaptische transmissie:
1. Aanmaak en opslag van NT.
2. Vrijzetting van NT via Ca2+ zodra actiepotentiaal aankomt in presynaps:
a. Import van NT
b. Beweging naar exocytosezone en ‘docking’.
c. Ca2+ triggert exocytose door binding van het synaptotagminedeel van het SNARE-complex.
Colocalisatie: er moet veel Ca2+ aanwezig zijn zodat het dicht genoeg bij de vesikel kan komen voor de exocytose > snelle exocytose.
d. Endocytose voor hergebruik van vesikel (heeft even een clathrinemantel)
3. Verwijdering NT uit synaptische spleet -> binding van NT aan postsynaptische receptoren.
4. Post-synaptische respons.
5. Heropname NT door bepaalde symporters: Na+/NT-symporter.
! Acetylcholine is een uitzondering: wordt eerst gesplitst in acetaat en choline en door acetylcholinesterase en wordt dan heropgenomen via een Na+/choline-symporter.
Blokkers van Na+/NT-symporters -> verlengde NT-signalen in hersenen:
· Cocaïne: Na+/dopamine-symporter
· Prozac: Na+/serotonine-symporter
· ATP
· NO
Aanmaak van acetylcholine (in cytosol): choline acetyltransferase zet acetyl CoA en choline om in acetylcholine met bijproduct CoA-SH.
Opslag van NT: in presynaptische vesikels door H+/NT-antiporter. H+ wordt terug aangevuld in de vesikel door een V-type ATPase (idem aan die in mitochondria).
· Invloed van tetanus- en botuline-toxines: op een vesikel zitten SNARE’s (SNAP receptoren -> SNAP’s zijn een onderdeel van het SNARE-complex), die binden met de SNARE’s aan de binnenkant van de membraan om te ‘docken’. Toxines als botuline splitsen deze SNAP’s met als gevolg verlamming van de spieren.
Toepassingen:
· Werking neuromusculaire junctie:
3. Door de depolarisatie openen de spanningsgeschakelde Na+-kanalen.
4. Door de sterkere depolarisatie opent de Ca2+-release channel/ryanodinereceptor in het sarcoplasmatisch reticulum.
5. De spiercel zorgt dankzij Ca2+ voor samentrekking.
Blokkade van de nAch-receptor zorgt voor spierverlamming (vb: curare).
· Exciterende <-> inhiberende NT’s (voornaamste):
· Exciterend (depolarisatie): acetylcholine, glutamaat (conductantie Na+/Ca2+ stijgt).
· Inhiberend (repolarisatie): GABA (conductantie Cl- stijgt).
Actiepotentiaal voor GABA: ECl = EK maar gCl = 3x of 7x gK.
! Barbituraten en benzodiazepines activeren de GABA-receptor.
Er wordt een summatie gemaakt van de exciterende en inhiberende NT’s, wat uiteindelijk bepaald of de actiepotentiaal bereikt wordt.
Glucosewerking: de pancreas:
· Endocriene pancreas (van eilandjes van Langerhans naar bloedbaan): insuline en glucagon.
Werking glucose en insuline-vrijzetting: zie eerder.
HOOFDSTUK 3: MEMBRAANRECEPTOREN
· Via bloedbaan (endocrien: hormonen: op lange afstand).
· Lokaal via diffusie (auto- en paracrien: signaalmoleculen: op korte afstand).
· Lokaal via membraangebonden proteïnen.
Vrijzetting gebeurt ofwel door exocytose of door diffusie. Transport in het bloed gebeurt ofwel vrij of via een carrier. Effecten van receptoractivering gebeuren ofwel snel (gealterd proteïne) of traag (via genexpressie).
! Steroïde-hormonen werken in op intracellulaire receptoren.
Ionotrope receptoren <-> metabotrope receptoren:
· Ionotroop: ligand-gestuurd ionenkanaal:
· Binding is meestal specifiek (afhankelijk van residu’s in receptor en ligand).
· Formule: zie formularium.
· Kd = dissociatieconstante.
Receptoren: G-proteïnen gekoppelde receptoren (GPCR’s):
· Drie onderdelen van werking: hormoon, receptor, trimerisch G-proteïne.
· Receptor bestaat uit 7 transmembranaire gebieden.
· Werking van GPCR:
2. Confromationele verandering -> interactie met G-proteïne.
3. Het GDP op het G-proteïne dissocieert door een conformatieverandering.
4. GTP bindt aan het G-proteïne -> Gα dissocieert van receptor.
5. Hormoon dissocieert en Gα) bindt met effector en activeert het.
6. Hydrolyse van GTP tot GDP -> dissociatie Gα van effector -> reassociatie met Gβγ.
· Doelwitten van sommige Gα-soorten:
· Ionenkanalen:
· CFTR = Cl- kanaal: Secretie van Cl- in epithelia. Mucoviscidose: taai slijm door defect in CFTR-gen. 1/32 mensen is heterozygoot voor een mutatie in dit gen.
· HCN = kationenkanaal.
Regelt paccemakeractiviteit van het hart door adrenaline (dankzij cAMP dat HCN activeert).
· PKA (Proteïne Kinase A): is een serine/threonine kinase op een ankerproteïne dat enzymen activeert -> vorming van bepaalde stof via genexpressie. Epinephrine versterkt dit door meer adenylylcyclase te activeren.
Cholera: werking: toxine stopt GTPase-activiteit van Gαs -> Gαs continu actief -> concentratie cAMP in darm stijgt -> Cl- kanalen (CFTR) openen meer -> diarree door te veel water in darm (slechte reabsorptie in darmwand).
· Gαq: fosfolipase C-activatie.
Fosfolipase C splitst een fosfoglyceride op een specifieke plek (zie eerder).
IP3 activeert de IP3-receptor (STIM1) op de membraan van het ER waardoor er Ca2+ vrijkomt uit het ER. Het SOC (Store-Operated Ca2+-Channel/Orai1) in de celmembraan (gekoppeld aan het ER) opent zodra de concentratie van Ca2+ in het ER laag is.
Rustfase: Ca2+ in ER is hoog en Ca2+ i gebonden aan STIM1, die voorkomt in monomeren. Orai1 is gesloten.
Actiefase: Ca2+ in ER is laag en STIM1, die voorkomt in clusters, is Ca2+-vrij. Orai1 is geopend.
· GαT: cGMP fosfodiesterase-activatie.
Nachtblindheid/nyctalopia: geen nachtzicht door verlies van staafjes.
· Kegeltjes: lagere lichtgevoeligheid en rood-groen-blauw-zicht.
· Werking van Rhodopsine in staafjes:
Uit opsine (een GPCR) en retinol (van vitamine A) kan rhodopsine gesynthetiseerd worden. Rhodopsine samen met GαT vormt tranducine.
Precieze werking:
1. Licht valt in op opsine -> opsine wordt geactiveerd.
2. Het GαT ernaast verliest zijn GDP en krijgt een GTP -> conformatieverandering tot transducine.
3. Het tranducine activeert PDE.
4. PDE zet cGMP om in GMP.
5. Door een laag cytosolisch cGMP is het Na+/Ca2+-ionenkanaal op het plasmamembraan gesloten -> repolarisatie staafje -> spanningsgeactiveerde Ca2+-kanalen zijn gesloten -> weinig exocytose van glutamaat -> repolarisatie van bipolaire cel -> niet geadapteerd aan donker.
! Als er een hoog cytosolisch cGMP was zouden deze kanalen wel open gaan -> depolarisatie staafje -> spanningsgeactiveerde Ca2+-kanalen zijn open -> exocytose van glutamaat -> depolarisatie van bipolaire cel -> geadapteerd aan donker.
! Bij weinig licht zijn de staafjes iets minder actief (1x fosforylatie door ATP voa rhodopsinekinase), bij veel licht zijn de staafjes weinig actief (3x fosforylatie door ATP), bij heel veel licht stoppen ze met werken (door arrestine bovenop fosforylatie).
· Ook: Gαo: vasorelaxatie met PLC en NO
· De rol van endotheelcellen bij contractie en relaxatie: is dat ze EDRF (Endothelium Derived Relaxation Factor) afgeven -> relaxeert de spier na contractie. Na een experiment waarbij ze EDRF en NO spectrofotometrisch vergeleken kwamen ze tot de conclusie dat EDRF gewoon NO is. De NO-receptor heet ook guanylaatcyclase.
· Angina Pectoris: pijn in borst door zuurstoftekort in hart -> kransslagaders zijn te nauw -> hart moet harder pompen. Oplossing: nitroglycerine: relaxeert de hartvaten.
· Werking:
1. Acetylcholine bindt aan een GPCR en via Gαo wordt fosfolipase geactiveerd.
2. Uit PIP2 ontstaat IP3, dat Ca2+ vrijzet.
3. Ca2+ activeert NO-synthase waardoor er NO ontstaat uit ene bepaalde reactie.
4. NO bindt aan de guanylaatcyclase van spiercelllen waardoor GTP wordt omgezet in cGMP (met PPi als bijproduct)
5. cGMP activeert proteïne kinase G, wat zorgt voor relaxatie van de spiercel -> vasorelaxatie.
6. cGMP wordt terug omgezet naar GMP door PDE5 (sidenafil is een PDE5-inhibitor -> geen vasorelaxatie meer).
Vb: via viagra (Pfizer). Opmerking: werkt ook in planten. Opmerking: bij de splitsing tot IP3 komt er ook een transcriptiefactor vrij die gaat zorgen voor transcriptie in de kern.
· Gβγ: heeft als doelwit het GIRK K+-kanaal:
In het hart word na binding van acetylcholine aan een GPCR Gβγ verplaatst naar een K+-kanaal om het daar te activeren -> hyperpolarisatie -> vertraging van hartritme.
! De effecten van acetylcholine kunnen dus ionotroop zijn (neuromusculaire junctie: Na+) of metabotroop (hartspier: K+).
Receptoren: cytokinereceptoren:
· Hoogtestage
· Lagedruktent
· ! Te hoog hematokriet (> 50) -> bloed wordt stroperig -> hartstilstand, …
· Celreactie op hypoxie: HIF (Hypoxia Induced Factor) -> vb: stimuleert genexpressie van EPO-gen -> EPO -> betere zuurstofopname.
· EPO:
· Stimuleert erythropoïese in beenmerg: de progenitorcel met vele EPO-receptoren deelt. Hoe meer de cellen delen hoe minder het EPO-receptor-gen tot expressie komt en hoe meer het hemoglobine-gen tot expressie komt.
· Is een cytokine (bestaat uit 160 AZ, 4 alpha-helices).
· Cytokinereceptor: werking:
1. JAK (Just Another Kinase = tyrosinekinase) bindt aan de intracellulaire kant van de cytokinereceptor.
2. Door binding van EPO (tussen de twee binding-sites -> elke binding-site interageert met 2 alph-helices) zullen de bindingsites dimeriseren.
3. JAK wordt gefosforyleerd en wordt zo actief.
4. Het actieve JAK helpt mee bij fosforylatie van de cytokinereceptor -> receptor is actief.
5. Signaalmoleculen binden aan de fosfaten van de cytokinereceptor via hun SH2-domein. Ze hebben ook een dNA-bindingsdomein. Samen: STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription proteins).
6. STAT neemt een fosfaat over en dimeriseert dan met een ander gefosforyleerd STAT.
7. Het dimeer bindt aan het DNA en start de transcriptie.
! Bij gebrek aan STAT5 krijgt men anemie.
8. SHP1 bindt aan de fosfaten van JAK en van de cytokinereceptor en deactiveert het zo, of SOCS’ (Supressor Of Cytokine Signalling) binden aan deze fosfaten en blokken zo het signaal, maar rekruteren tegelijkertijd ook ubiquitine (een proteasoom) -> afbraak.
! Er was een olympisch sporter met hematokriet > 60 omdat er bij hem geen binding was van SHP1 -> vertraagde deactivatie EPO-signaal -> verhoogde erythropoïese.
! EPO-receptoren kunnen ook viraal geactiveerd worden door een viraal proteïne van het SFFV-virus -> erythroleukemie.
Receptoren: receptor tyrosine kinasen (RTK’s):
· Liganden voor RTK’s:
· Werking:
1. Twee liganden binden aan de zijkanten van de twee binding-sites.
2. De binding-sites dimeriseren en de intracellulaire tyrosine kinases (die op de receptor zelf zitten!) worden om de beurt gefosforyleerd.
3. De receptor wordt dan ook geactiveerd door fosforylaties intracellulair.
4. (Door multidocking proteins kunnen er meerdere interactiesites/fosfaten beschikbaar gemaakt worden. Vb: IRS/Insuline Receptor Substraat.)
· Activatie van Ras-MAP:
· Facetoog van fruitvlieg: bestaat uit ommatidia, die op hun beurt bestaan uit 8 lichtgevoelige cellen, R1-R8. Er is een mutante vlieg (sevenless) die het R7-gen mist. Als oplossing heeft deze een sevenless-gen die codeert voor een RTK.
· Werking: De Boss (Bride Of Sevenless) van de R8 interageert met de sevenless van de toekomstige R7. Door ras, sos (Son Of Sevenless = GEF/Guanine nucleotide-Exchange Factor) en GRB2 (Growth hormone Receptor Binding protein 2) wordt de R7-precursor geïnduceerd en ontstaan R7.
Precieze werking:
1. Standaard activatie van RTK (zie 1-3 hierboven)
2. Koppeling van fosfaat van RTK aan GRB2 aan Sos aan inactief Ras.
3. Binding van deze stoffen zorgt voor dissociatie van GDP en associatie van GTP -> conformatieverandering -> actief Ras.
4. Sos komt los van Ras.
5. Actief Ras rekruteert, bindt en activeert Raf.
6. Hydrolysatie van GTP -> Ras dissocieert van Raf.
7. Raf activeert MEK (MAP/Erk Kinase).
8. MEK activeert MAP Kinase.
9. MAP Kinase dimeriseert en gaat naar nucleus.
10. MAP Kinase dimeer activeert verschillende transcriptiefactoren -> activeert R7-cel.
! Door een mutatie in het Ras (RasD) kan Ras permanent geactiveerd worden -> ongecontroleerde proliferatie -> kanker. RTK-gen is hierbij het proto-oncogen.
· Activatie van PLC: De PLCγ-vorm wordt via RTK’s geactiveerd. (De PLCβ-vorm via GPCR.)
· Activatie van PI-3-kinase:
· Gebeurt via insulinereceptor na binding van insuline, en allerlei tussenstoffen. De laatste tussenstof staat in voor de fosforylatie van PI-3 tot PIP2 door ATP.
· Gevolgen: het vervolg van de glucose-insulinewerking:
1. Een inactief PKB bindt met zijn PH (Pleckstrin Homology motief) aan een fosfaat van PIP2. Een beetje verder gebeurt hetzelfde met een PDK (PI-Dependant Kinase), maar deze bezit twee fosfaten.
2. De fosfaten springen over naar de PKB en activeert het.
3. Het actief PKB zorgt dan voor transcriptie: exocytose van GLUT4-bevattende vesikels -> glycogeensynthase en glucose-opname en opslag.
4. (Het MAP-Kinase zorgt ondertussen voor proteïnensynthese -> celgroei en celdifferentiatie.)
Receptoren: Notch-receptoren:
· Activatie: activatie van de notch-receptoren leidt tot het migreren van een deel van de receptor naar de kern om transcriptiefactoren te activeren. Deze transcriptiefactoren zetten een proces in de gang waardoor er nog meer notch-receptoren tot expressie komen en minder delta-receptoren (de bindingspartner van de notch-receptoren). Ook zorgen de transcriptiefactoren voor de ontwikkeling van verschillende celtypes uit de cellen die rond de oorspronkelijke cel liggen. Hierdoor ontstaan de grenzen van de weefsels in onze organen.
· Alzheimer: een deel van de notch-receptor, namelijk het bètasecretase van het APP, staat in voor de vorming van het amyloid proteïne (Aβ42). Als er een mutatie ontstaat in het APP-gen dan ontstaat er meer bètasecretase -> meer amyloid proteïnen -> vorming van amyloidplaque in de hersenen -> Alzheimer.
HOOFDSTUK 4: PROTEINE-TARGETING EN VESICULAIR TRANSPORT
Verschillen in protein targeting tussen de secretorische weg en de niet-secretorische weg:
· Secretorisch:
· Vereist een ER-signaalsequentie.
· Polypeptide komt vrij in cytosol.
· Targeting dmv organel-specifieke sequentie.
· Er zitten ribosomen op het ER -> bewijs voor co-translationele translocatie.
· Labeling-experimenten: secretorische proteïnen waren beschermd tegen proteasen -> bewijs dat ze met gemak in het cytosol en buiten de cel kunnen ‘overleven’.
· Zonder N-terminale ER-signaalsequentie kon de translatie niet via het membraan van het ER worden verdergezet.
Herkenning en verwijdering van de signaalsequentie:
1. De signaalsequentie wordt aangemaakt tijdens de translatie.
2. SRP (Signal-Recognition Particle) bindt aan het ribosoom -> translocatie naar ER.
3. Het SRP bindt via de SRP-receptor aan een translocon van het ER. De SRP en SRP-receptor zijn GTPases, het translocon is een polypeptidekanaal.
4. Door hydrolyse van de GTP’s in SRP en de SRP-receptor gaat het translocon open.
5. De translatie gaat verder en een signaalpeptidase knipt de signaalsequentie eraf.
6. De translatie gaat verder tot het secretorische proteïne gevouwen is.
Productie van membraanproteïnen van ER/Golgi(/extracellulair): single-pass proteïnen (zie slides):
! Het STA (Stop-Transfer Ankersequentie) stopt met het vormen van de proteïne aan de ene zijde en gaat dan verder aan de andere zijde. Het bestaat uit 22 (hydrofobe) AZ en vormt een alpha-helix.
! De ribosomen zitten altijd cytosolair. ! De positieve polypeptideladingen bepalen de cytosolaire zijde.
· Type I:
· SA-II-sequentie (Signal Anchor sequence)
· SA-III-sequentie.
· Type IV:
· Zonder ER-signaalsequentie.
· Of eerst NH3+ in lumen.
· Dan translocatie door SA-III.
Productie van membraanproteïnen van ER/Golgi(/extracellulair): vetanker-proteïnen (zie slides):
· GPI-anker:
1. GPI-anker wordt aangemaakt aan de cytosolische zijde van het ER-membraan.
2. Een type I-membraanproteïne dat al in het membraan zit wordt gesplitst door een transamidase en dan overgebracht naar het GPI-anker.
Modificatie en kwaliteitscontrole van proteïnen in het ER:
· Modificatie:
1. Glycosylatie: Een suikerboom van 14 suikers wordt vastgemaakt aan asparagine van het proteïne. Er is een kerngedeelte wat nooit verandert en een variabel gedeelte wat wel kan veranderen naargelang het nodig is. Als er bvb een foutje is gebeurt dan zal in een bepaalde stap de omgekeerde reactie gebeuren en een glucose terug op de suikerboom worden gezet.
2. Vorming van disulfide-bruggen: is een oxidatiereactie (ER is een geschikt oxiderend milieu) waarbij de bruggen worden gemaakt door een geoxideerd PDI (Protein Disulfide Isomerase) dat 2 H+-ionen zal opnemen en dus gereduceerd wordt. PDI kan ook foute disulfidebruggen juist omleggen. ! Dit is ook een vouwreactie.
3. Vouwing: door vouwenzymes (PDI, PPI) en moleculaire chaperones (BiP/Binding Protein, calnexine en careticuline = lectines: binden aan suikers):
· PPI (Peptidyl-prolyl isomerase): tijdens de vouwing gebeurt er een draaiing rond peptidyl-prolyl isomerases, die vrij traag gebeurt. PPI versnelt dit.
· BiP: bindt aan ongevouwen polypeptideketens en zorgt ervoor dat ze niet terugglijden in het translocon.
· Lectines: binden aan suikerboom met 1 glucose en voorkomen zo aggregatie.
· Kwaliteitscontrole: proteïnen die te lang in het ER blijven gaan via het translocon terug naar het cytoplasma om daar vernietigd te worden. Ubiquitine bindt aan het proteïne en rekruteert daardoor een proteasoom om het proteïne te vernietigen.
! Prionen: een bepaald eiwit PrPc kan slecht worden gevouwen tot PrPSc door verkeerde genexpressie. Ze noemen deze deeltjes ook prionen en ze kunnen aggregeren waardoor scrapie, BSE/Gekkekoeien-ziekte, Creutzfeld-Jacob en Kuru kan ontstaan (allemaal dezelfde ziekte maar verschillende oorsprongen). Ook kan er Fatal Familial Insomnia ontstaan door acumulatie in de thalamus -> deze mensen slapen telkens minder en minder tot ze op een dag niet meer kunnen slapen.
Proteïnentransport van ER naar Golgi:
· Anterograad en retrograad transport, cisternale progressie:
· Anterograad: van ER naar cis-golgi-netwerk via COPII-vesikels.
· Cisternale progressie: van cis-golgi naar trans-golgi.
· Retrograad: terug van trans-golgi-netwerk naar ER.
! Vanaf trans-golgi-netwerk naar exocytose: late secretorische weg. Daarvoor: vroege secretorische weg.
· Werking van vesikeltransport:
1. Vesicle budding: binding van Sar1 aan sec12 van de vesikel, waarbij GTP omgezet wordt in GDP. De hydrofobe staart van Sar1 interageert met het membraan van de vesikel. Dan wordt er een COP-coat (Coat Protein) gevormd rondom de gebonden Sar1’s.
2. Afwerpen van de coat: GTPase-activiteit van Sar1 wordt versterkt waardoor de hydrofobe N-terminus zich ‘intrekt’ -> coat en Sar1’s worden afgeworpen.
3. Fusie van de vesikel: vb: neurosecretorische vesikels:
a. Docking: het Rab van de vesikel bindt met de Rab-effector (een GEF) van de membraan.
b. Vorming van SNARE-complexes door VAMP, Syntaxin en SNAP-25 (bestaat uit 4 alpha-helices die een coiled-coil vormen).
c. Versmelting met membraan via Ca2+ of op een constitutieve manier.
d. Recyclage van SNARE’s waarbij ATP wordt gehydrolyseerd.
· Soorten vesikels:
· ER -> golgi: COPII (anterograad: selectiviteit van cargo bepaalt waar het bindt) en COPI (retrograad: recyclage van v-SNARE’s en bepaalde proteïnen via KDEL-receptor).
· Trans-golgi-netwerk of PM(?) -> endosoom: Clathrine en AP(?): dynamine splitst het vesikel met chlatrine-coat en AP-complexen af van de membranen.
M6P wordt aangemaakt in het cis-golgi door N-acetylglucosamine transferase (N-AGT) en fosfodiesterase en stuurt enzymes naar lysosomen waarbij de M6P-receptor de clathrine en AP bindt, maar intracellulair het lysosomaal enzyme
Mutaties in N-AGT zorgen gestoorde afbraak in lysosomen -> Lysosomal Storage Disease/I-cell disease.
! LDL (Low Density Lipoprotein = slechte cholesterol): bindt aan LDL-receptoren op het plasmamembraan en activeert hiermee de endocytose van een clathrine-vesikel -> LDL wordt afgevoerd naar een lysosoom en daar afgebroken. Bij mutaties in de LDL-receptor kan men hypercholesterolemie krijgen (veel cholesterol in bloedbaan).
· Trans-golgi-netwerk -> extracellulair: vesikels zonder mantelproteïnen.
HOOFDSTUK 5: BEWEGING