western blot
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5/9/2018 Western Blot - slidepdf.com
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Western Blot�Alejandra Lara Couto
�María Fernanda Ponce Hernández�
Alma Jessica Salazár Reyes�Sandra Pamela Reynoso Bistraín
�Amairani Villeda Rodríguez
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� También llamada
´inmunoblottingµ fue utilizada por pr imer a vez por Towbin en 1979, yconsiste en la especificidad de la
unión antígeno-anticuerpo queper mite la detección de una única proteína dentro de una
mezcla compleja de otr asproteínas.
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� Es una técnica mediante la cual
se separ an proteínas por electroforesis en gel de
poliacr ilamida y después se
tr ansfieren electrofor éticamente a un papel de nitrocelulosa o una membr ana similar donde son
detectadas con anticuerpos quereconocen los antígenos que hay
en ellas.
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� El fundamento de Western blot es una discr iminación de los antígenos del VIH
frente a los que se dir igen losanticuerpos presentes.
� Básicamente se basa en la separ aciónde las proteínas (antígenos) obtenidasdel VIH-1 procedentes del lisado del
cultivo del vir us y pur ificadas por centr ifugación.
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Se realiza una eletroelución que se basa
en la movilidad electrofor ética de lasproteínas for mando un sándwich entredos electrodos sumergidos en una
solu
ció
n condu
ctor a
, cua
nd
o sesumerge en esta solución se aplica uncampo eléctr ico y gr acias a este las
proteínas migr an del gel a la
membr ana y aquí quedan adher idas.
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� La eficacia de este proceso
depende de la capacidad de la proteína de migr ar al gel, su capacidad de adherencia, la
consistenc
ia d
el gel y sieste est
a completamente en contacto con
la membr ana o un ba jo volta je en
la
corr iente
del c
ampo el
éctr
ico.
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� par a revisar su eficacia se tiñela membr ana con un reactivo
llamado rojo Ponceau
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� en la membr ana se bloquean
sus sitios de unión par a reducir la unión inespecífica de las
proteínas, actualmente par a este bloqueo se crean
tampones desde leche hasta
proteína
s específica
spur ificadas
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� la desventa ja es que estos tampones debenser específicos dependiendo de la proteína
que se quiere localizar y de la enzima quese vaya a utilizar, este tampón se va a unir a todos los sitios de unión inespecífica de la membr ana eliminando todo el r uido de
fondo o bloquear los epitopos par a la uniónde los anticuerpos pr imar ios.
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� se debe de realizar un lavado par a eliminar el mayor r uido posible e incrementar la relación señal-r uido, se puede utilizar un
detergente llamado Tween-20 o el tampónque se vaya a utilizar diluido en detergente ,si este lavado es insuficiente habrá una gr an
cantidad de r uido pero si se hace unexceso de lavado se puede presentar una
sensibilidad.
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� Par a escoger el tipo de tampón
que se debe utilizar se emplea la técnica de ´relación señal-r uidoµque consiste en obtener un
pequ
eñ
os fr a
gm
entosd
e esta
membr ana y utilizar diferentestipos de tampones par a bloquear
cada
pedaz
od
em
emb
r a
na
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no existe una car acterística enespecifico par a cada unión
antígeno-anticuerpo por lo que sedebe utilizar la mayor var iedad detampones posibles par a observar con cual existen mayor relación
señal-r uido.
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� Par a saber que anticuerpo pr imar ioutilizar es importante saber que
antígeno se desea detectar y de losanticuerpos disponibles par a este
antígeno (existe una gr an var iedad de
anticuerpos que ya son comerciales).� Se pueden utilizar antígenos
monoclonales (estos son fáciles de
produ
cir y t
ienen gr
ana
finidad
por su
antígeno) o policlonales (sonespecíficos
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� Anticuerpos Policlonales
Anticuerpos Monoclonales
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� Par a la selección del antígeno
secundar io depende de la fuente dela que se haya obtenido el anticuerpopr imar io y del marca je que se desea obtener, par a obtener esto se utiliza
biotina, fluoroforos o enzimas
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� Par a utilizar fluoroforos se necesita unequipo especial par a observar la
fluorescencia� Par utilizar enzimas se necesitan algunos
pasos extr a y son más sensibles las que seutilizan son: la fosfatasa alcalina y la
peroxidasa de rábano que producen luz fluorescente o solo liber an luz.
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� Los sustr atos que se pueden utilizar dependen de la respuesta que se
desea obtener como fluorescencia oquimioluminicidad se utilizan junto con
la enzima y combinados se
tr ansfor man en productos coloreadosque actúan sobre la membr ana y el
mas utilizado es el naftol
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� Par a captur ar de los datosgener ados en un Western Blot se
utilizan cámar as CCD refr iger adaso las películas de autor adiogr afí ay su venta ja es la manipulación en
tiempo real de las imágenes
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