xi. simpozij peradarski dani€¦ · luka jurinovi , fani krstulovi , darko majnari , milivoj...

ISSN 1848 3747

XI. SIMPOZIJPERADARSKI DANI 2015.

s me unarodnim sudjelovanjem

Hrvatska, Šibenik, 13. 16. svibnja 2015.

XI SYMPOSIUMPOULTRY DAYS 2015With International Participation

Croatia, Šibenik, May 13 16, 2015

ZBORNIK

PROCEEDINGS

Zagreb, 2015.

Izdava / PublisherHrvatski veterinarski institut / Croatian Veterinary Institute

Centar za peradarstvo / Poultry Centre

Urednica / EditorMirta Balenovi

Lerkorica i prevoditeljica / Language editorAntonija Redovnikovi

Oblikovanje Zbornika i priprema za tisak / Proceedings design and layoutBerislav Jadro

Dizajn naslovnice / Cover designMirta Balenovi

Fotografija / Photo bySuhozid, otok Vis, Hrvatska / Dry stone walls, island of Vis, Croatia

Anamarija Durbeši

Za tisak / Of printCRESCAT d.o.o., Zagreb

Naklada / Issue300 primjeraka / 300 copies

Radovi objavljeni u Zborniku recenzenti su pozitivno ocijenili.

Organizator / OrganizerHrvatski veterinarski institut

Centar za peradarstvoHeinzelova 55, Zagreb

Hrvatska

Croatian veterinary institutePoultry centreHeinzelova 55, ZagrebCroatia

Pod pokroviteljstvom / Under the Ausprices ofMinistarstvo poljoprivrede

Republike HrvatskeMinistry of AgricultureRepublic of Croatia

Ministarstvo znanosti, obrazovanja isporta

Republike Hrvatske

Ministry of Science, Education and SportRepublic of Croatia

Svjetska udruga za znanost o peradi The World’s Poultry Science Association

Svjetska udruga veterinara uperadarstvu World Veterinary Poultry Association

Glavni sponzor / General sponsor

KOKA d.d., Varaždin KOKA Inc., Varaždin

Predsjednik Simpozija / President of the SymposiumVladimir Savi

Tajnica Simpozija / Secretary General of the SymposiumRadmila Raguž uri

Organizacijski odbor / Organising committeeMirta Balenovi , Marija Berendika, Branko Bobeti , Jakov ori , Davor Jankovi ,

Luka Jurinovi , Fani Krstulovi , Darko Majnari , Milivoj Mikec,Radmila Raguž uri , Stjepan Sabljak

Znanstveni odbor / Scientific committeeTajana Amšel Zelenika, Željko Cvetni , Teufik Goleti , Željko Gottstein, Boris Habrun,

Zlatko Janje i ,Marica Loli , Kristina Matkovi , Mario Mitak, Jelka Pleadin,Estella Prukner Radov i , Vladimir Savi , Marijana Sokolovi ,

Borka Šimpraga, Marina Tišljar, Olga Zorman Rojs, ur ica Žutini

Radovi objavljeni u Zborniku “Peradarski dani 2015.” biti e referirani ubazi podataka CAB International

Full of papers published in Conference Proceedings of “Poultry days 2015” will be indexed inthe database CAB International

7

SADRŽAJ / CONTENTSUvodna predavanja / Introductory lecture

HRVATSKI VETERINARSKI INSTITUT - INSTITUT ZA BUDU NOST CROATIAN VETERINARY INSTITUTE - INSTITUTE FOR THE FUTURE Boris Habrun ................................................................................................................................................... 11

AKTUALNO U POJAVNOSTI BOLESTI PERADI U HRVATSKOJ I REGIJI TOPICAL ISSUES IN DISEASES OF POULTRY IN CROATIA AND THE REGION Vladimir Savi ................................................................................................................................................. 13

GLOBALNA KONKURENTNOST PERADARSKE PROIZVODNJE U EUROPSKOJ UNIJI TE STANJE I TRENDOVI PROIZVODNJE I TRŽIŠTA REPUBLIKE HTVATSKE U DRUGOJ GODINI LANSTVA U EUROPSKOJ UNIJI GLOBAL COMPETITIVENESS OF POULTRY PRODUCTION IN EUROPEAN UNION, AND PRODUCTION AND MARKET TRENDS IN THE REPUBLIC OF CROATIA IN THE SECOND YEAR OF EUROPEAN UNION MEMBERSHIP Branko Bobeti ................................................................................................................................................ 15

Usmena izlaganja / Lectures

PRA ENJE RAZINE PROTUTIJELA U JATIMA PERADI KAO OSNOVA PROCJENE PROCIJEPLJENOSTI I TERENSKE INFEKCIJE VIRUSIMA ZARAZNOG BRONHITISA I ZARAZNE BOLESTI BURZE MONITORING OF ANTIBODY LEVEL IN POULTRY FLOCKS AS A BASIS FOR ASSESSMENT OF VACCINATION RATE AND FIELD INFECTION WITH INFECTIOUS BRONCHITIS AND INFECTIOUS BURSAL DISEASE VIRUSES Tajana Amšel Zelenika, Vladimir Savi , Mirta Balenovi ............................................................................... 19

ŠTO TREBA ZNATI O RASVJETI U PERADARSKOJ PROIZVODNJI WHAT SHOULD WE KNOW ABOUT LIGHTING IN POULTRY PRODUCTIONMilivoj Mikec, Tihomir Zglavnik ....................................................................................................................... 25

ZNA AJ PATOGENIH PLIJESNI U PERADARSTVU SIGNIFICANCE OF PATHOGENIC MOULDS IN POULTRY PRODUCTION Marijana Sokolovi , Borka Šimpraga, Fani Krstulovi , Marija Berendika ....................................................... 32

POJAVNOST BAKTERIJE SALMONELLA INFANTIS U TOVNIH PILI A U HRVATSKOJ U RAZDOBLJU OD 2010. DO 2014. GODINE INCIDENCE OF SALMONELLA INFANTIS IN BROILERS IN CROATIA 2010-2014Luka Jurinovi , Borka Šimpraga, Fani Krstulovi , Marijana Sokolovi ........................................................... 39

INFEKCIJA BAKTERIJOM ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE U KONZUMNIH NESILICA - PRIKAZ SLU AJAINFECTION WITH ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE BACTERIUM IN LAYING HENS – CASE REPORTFani Krstulovi , Borka Šimpraga, Luka Jurinovi , Marina Tišljar, Milivoj Mikec, Marijana Sokolovi , Marija Berendika ........................................................................................................................................................ 44

8

STANJE I GOSPODARSKE PERSPEKTIVE UZGOJA ZAGORSKOG PURANA U VARAŽDINSKOJ ŽUPANIJI SITUATION AND ECONOMIC PERSPECTIVES OF ZAGORJE TURKEY REARING IN VARAŽDIN COUNTY Vladimir Kure i , Zlatko Janje i , Stjepan Mužic, Zoran Grgi , Dalibor Bedekovi ....................................... 49

BAKTERIJSKI UZRO NICI ZARAZNIH BOLESTI KOJE SE PRENOSE HRANOM U ISTARSKOJ ŽUPANIJI (2007-2014) BACTERIA THAT CAUSE FOODBORNE ILLNESS IN ISTRIAN COUNTY (2010-2014) Lorena Lazari Stefanovi , Jasmina Ku inar ................................................................................................. 54

USEFULNESS OF CLINICAL BLOOD ANALYSES IN DIAGNOSTICS OF SOME POULTRY DISEASES VRIJEDNOST KLINI KIH ANALIZA KRVI U DIJAGNOSTICI NEKIH BOLESTI PERADI Olga Zorman Rojs, Alenka Dov , Brigita Slavec, Marko Zadravec, Rahela Jurši -Cizerl, Liljana Štalcer, Janez Poje, Marija Nemec, Alenka Nemec Svete, Jožko Ra nik .................................................................. 61

IMMUNOMODULATORY ACTIVITY IN VITRO OF THE NEWCASTLE DISEASE VIRUS STRAIN ZG1999HDS IMUNOMODULATORNA IN VITRO AKTIVNOST SOJA ZG1999HDS VIRUSA NEWCASTLESKE BOLESTI Bratko Filipi , Lidija Gradišnik, Adriana Pereyra, Hrvoje Mazija .................................................................... 68

VITAMIN B6 ENHANCES THE INTERFERON INDUCING CAPABILITY OF THE PARAMYXOVIRUSEE OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS STRAIN ZG1999HDS AND SENDAI VIRUS STRAIN CANTELL VITAMIN B6 POJA AVA INDUKCIJU INTERFERONA PARAMYXOVIRUSIMA NEWCASTLESKE BOLESTI SOJ ZG1999HDS I VIRUSOM SENDAI SOJA CANTELLBratko Filipi , Adrana Pereyra, Hrvoje Mazija ................................................................................................ 77

SUPERIOR PRODUCTION RESULTS OF BROILERS FEED WITH IN WATER-SOLUBLE FORM OF TANNIN (CASTANEASATIVA MILL.) EXTRACT FORTIFIED BY CA-BUTYRATEDOBRI PROIZVODNI REZULTATI UZ HRANU ZA TOVNE PILI E S EKSTRAKTOM TANINA TOPIVIM U VODI (CASTANEA SATIVA MILL.) UZ DODATAK CA-BUTIRATA Maksimiljan Brus, Marko Volk ......................................................................................................................... 84

Poster prezentacije / Poster presentations

PATHOLOGY AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF SOME VIRUSES IDENTIFIED IN WILDLIFE BIRDS IN CROATIA: PRELIMINARY RESEARCH BOLESTI I FILOGENETSKA ANALIZA NEKIH VIRUSA IDENTIFICIRANIH U SLOBODNO ŽIVU IH PTICA U HRVATSKOJ: PO ETNO ISTRAŽIVANJE Marina Tišljar, Marina Bi in, Zdenko Bi in, Vladimir Savi , Borka Šimpraga, Tajana Amšel Zelenika ......... 93

ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY PATTERNS OF ENTEROCOCCUS CECORUM AND ENTEROCOCCUS HIRAEISOLATES FROM BROILERS ANTIMIKROBNA OSJETLJIVOST IZOLATA ENTEROCOCCUS CECORUM I ENTEROCOCCUS HIRAE IZ TOVNIH PILI AMajda Golob, Jasna Mi unovi , Jana Avberšek, Irena Zdovc ........................................................................ 102

UPORABA KOKCIDIOSTATIKA U PERADI USE OF COCCIDIOSTATICS IN POULTRY Marija Berendika, Marijana Sokolovi , Gabrijela Krivec ................................................................................. 107

9

PREGLED POJAVNOSTI MIKOTOKSINA U EU SURVEY OF INCIDENCE OF MYCOTOXINS IN EU Marijana Sokolovi , Borka Šimpraga, Marija Berendika ................................................................................ 114

FENOTIPSKA OBILJEŽJA KRIŽEVA KE KUKMASTE KOKOŠI PHENOTYPIC TRAITS OF KRIŽEVCI CRESTED HEN Marija Meštrovi , Zlatko Janje i , Dalibor Bedekovi , Gorgana Duvnjak ...................................................... 125

PREGLED MORFOLOŠKIH SVOJSTAVA AUTOPODIJA PILI A U TOVU KAO POKAZATELJA KVALITETE SMJEŠTAJA I DOBROBITI REVIEW OF BROILER AUTOPODIUM MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS AS AN INDICATOR OF ACCOMMODATION QUALITY AND WELFARE Kristina Matkovi , Danijel Maruši , Željko Pavi i , Nina Polji ak Milas, Mario Ostovi , Hrvoje Luci ........... 129

UTJECAJ ULTRAZVUKA VISOKOG INTENZITETA NA KVALITETU PILE EG MESA INFLUENCE OF HIGH POWER ULTRASOUND ON THE QUALITY OF CHICKEN MEAT Helga Medi , Tibor Jan i, Mladen Brn i , Filip Dujmi , Ksenija Markov, Duška uri .................................. 133

U INAK BOSILJKA (OCIMUM BASILICUM CV. GENOVESE) U HRANI ZA KONZUMNE NESILICE NA HUMORALNU I STANI NU IMUNOST EFFECT OF SWEET BASIL (OCIMUM BASILICUM CV. GENOVESE) IN LAYING HEN FEED ON HUMORAL AND CELLULAR IMMUNITYMirta Balenovi , Tajana Amšel Zelenika, Zlatko Janje i , Klaudija Carovi -Stanko, Maja Popovi , Dalibor Bedekovi , Vladimir Savi .............................................................................................................................. 137

OBRAZOVNE POTREBE PERADARSKIH PROIZVO A AEDUCATIONAL NEEDS OF POULTRY FARMERS

ur ica Žutini , Radmila Raguž- uri ........................................................................................................... 145

SMJEŠTAJ I DRŽANJE PTICA KAO ŽIVOTINJSKIH MODELA U POKUSIMAHOUSING AND HUSBANDRY OF BIRDS AS ANIMAL MODEL IN EXPERIMENTS Gordana Greguri Gra ner, Željko Pavi i , Marija Lipar, Jadranka Bubi Špoljar, Damjan Gra ner, Luka Jurinovi .......................................................................................................................................................... 151

Okrugli stol / Round table

UPORABA ENZIMSKIH PRIPRAVAKA U HRANIDBI PERADI USE OF ENZYME SUPPLEMENTS IN POULTRY DIETS Tihomir Zglavnik, Milivoj Mikec, Tajana Amšel Zelenika ................................................................................ 155

THE IMPORTANT FACTORS IN EVALUATION OF CORN NUTRIENTS VALUE FOR POULTRY VAŽNI IMBENICI U OCJENJIVANJU VRIJEDNOSTI KUKURUZNIH NUTRIJENATA ZA PERAD Mohammad Vadiei .......................................................................................................................................... 166

PERADARSKI DANI 2015. 11

HRVATSKI VETERINARSKI INSTITUT – INSTITUT ZA BUDU NOST

Boris Habrun

Hrvatski veterinarski institut, Zagreb, Hrvatska

Hrvatski veterinarski institut je javni institut u vlasništvu Republike Hrvatske temeljna djelatnost kojega je dijagnostika zaraznih i nametni kih bolesti životinja, kontrola hrane životinjskog podrijetla, hrane za životinje i veterinarsko medicinskih pripravaka. Uz središnjicu smještenu u Savskoj cesti 143, Hrvatski veterinarski institut ima pet podružnica: Veterinarski zavod Križevci, Veterinarski zavod Rijeka, Veterinarski zavod Split, Veterinarski zavod Vinkovci i Centar za peradarstvo. Od svog osnutka 1933. godine Hrvatski veterinarski institut je opstao u razli itim društvenim sustavima. U svojoj povijesti je 10 puta mijenjao naziv do 1995. godine, od kada se zove Hrvatski veterinarski institut. Dolaskom prof. dr. sc. Željka Cvetni a na mjesto ravnatelja Instituta u ožujku 2007. godine po inje razdoblje vrlo intenzivnih promjena u Institutu. U život je provedena reorganizacija Instituta, gdje je 17 laboratorija spojeno u 4 odjela. Donosi se odluka o rekonstrukciji laboratorija Instituta u postoje oj, tada oronuloj zgradi u Savskoj cesti 143. Tijekom proteklih 8 godina rekonstruirani su svi laboratoriji Instituta, administrativni prostori (ukupno oko 2500 m2 prostora). Sekcijska dvorana za velike životinje dislocirana je u prostore "Agroproteinke" u Sesvetskom Kraljevcu. Nabavljena je nova vrhunska oprema i novi namještaj u svim laboratorijima. Sve investicije napravljene su vlastitim sredstvima bez kredita i zajmova. Danas svi laboratoriji Instituta svojim ure enjem i opremom potpuno zadovoljavaju sve uvjete za kvalitetan laboratorijski rad. Tako er su i svi veterinarski zavodi rekonstruirani i opremljeni najsuvremenijom opremom. Iznimka je Centar za peradarstvo koji je smješten u podrumskim prostorijama Veterinarskog fakulteta Sveu ilišta u Zagrebu pa nije bilo mogu e provesti zna ajnije rekonstrukcije, ve je nabavljena nova oprema. Koncem studenog 2010. godine u Hrvatskom veterinarskom institut ima 252 djelatnika, od kojih 129 u središnjici. Za razliku od deficita znanstvenih kadrova prije desetak godina, danas u Institutu radi 53 doktora znanosti, od ega 8 znanstvenih suradnika, 10 viših znanstvenih suradnika i 20 znanstvenih savjetnika. Akreditirane su 202 metode, a u nekim podru jima Hrvatski veterinarski institut ima fleksibilno podru je akreditacije. Radi daljnjeg razvoja Hrvatskog veterinarskog instituta pokrenuta je inicijativa za dobivanje gra evinskog zemljišta u Velikog Gorici, k.o. Kurilovec, k. br. 688/1 površine oko 65.000 m2. Rije je o zemljištu u državnom vlasništvu pa je pismo namjere upu eno u Državni ured za upravljanje državnom imovinom. U tijeku je isho enje lokacijske dozvole. Ako bi Institut dobio to zemljište zapo elo bi se s pripremom sve potrebne dokumentacije za isho enje gra evinske dozvole. Ovo bi zemljište poslužilo za gradnju nove zgrade Hrvatskog veterinarskog instituta za što bi se tražila sredstva iz strukturnih fondova Europske Unije. Sadašnja zgrada Hrvatskog veterinarskog instituta iskorištena je u cijelosti, uklju uju ipotkrovlje i podrumske prostorije. Novom zgradom riješio bi se i problem Centra za peradarstvo.

CROATIAN VETERINARY INSTITUTE – INSTITUTE FOR THE FUTURE

Croatian Veterinary Institute is public institution in the Republic of Croatia ownership, its activity being primarily focused on the diagnosis of infectious and parasitic diseases in animals and control of food of animal origin, animal feed and veterinary medicine agents. Besides the Institute head office in Savska cesta 143, there are five Institute branch offices: Križevci Veterinary Institute, Rijeka Veterinary Institute, Split Veterinary Institute, Vinkovci Veterinary Institute and Poultry Centre. Since its foundation in 1933, Croatian Veterinary Institute has managed to maintain its activities through different social systems. In its history, its name was changed ten times until 1995, since when its name is Croatian Veterinary Institute. Since March 2007, when Prof. Željko Cvetni , PhD, was appointed head of the Institute, profound changes have been undertaken for Institute restructuring. Seventeen laboratories have been integrated into 4 departments. It was decided to reconstruct Institute laboratories in the then run-down building in Savska cesta 143. In the past 8 years, all Institute laboratories and administrative premises (around 2500 m2) have been reconstructed. Section room for big animals

izv. prof. dr. sc. Boris Habrun, dr. med. vet., ravnatelj Hrvatskog veterinarskog instituta, Savska cesta 143, 10000 Zagreb, Hrvatska; e-mail: [email protected]

HRVATSKI VETERINARSKI INSTITUT – INSTITUT ZA BUDU NOST 12

has been dislocated to Agroproteinka premises in Sesvetski Kraljevec. All laboratories have been provided with new sophisticated equipment and new furniture. All these investments have been covered from the Institute own resources, without any loans. Nowadays, all Institute laboratories meet strict conditions for quality laboratory work with their arrangement and instruments. All veterinary departments have also been reconstructed and provided with latest equipment. The only exception is Poultry Centre, which is located in the basement of the Faculty of Medicine, University of Zagreb; therefore, it was impossible to perform any major reconstruction activities and only new equipment was provided. At the end of November 2010, Croatian Veterinary Institute had 252 employees, 129 of them working at the head office. Contrary to the deficit of scientific researchers recorded some ten years ago, currently there are 53 PhD professionals, eight of them scientific associates, ten senior scientific associates and 20 scientific advisers, employed at the Institute. The Institute has acquired accreditation for 202 methods, along with a flexible accreditation range in some areas. Considering future development of the Croatian Veterinary Institute, an initiative has been launched to get a building lot in Velika Gorica, cad. commun. Kurilovec, cad. lot. no. 688/1, around 65,000 m2 area. It is a state-owned lot, thus a letter of intent was sent to the Agency for State Property Management. The location permit procedure is just under way. If the Institute gets this building lot, work on preparing necessary documentation for building permit would be started. A new building of the Croatian Veterinary Institute would be constructed on the lot, probably using European Union structural funds. The present Institute building has been completely utilized, including attic and basement. The new building would also solve the problem of the Poultry Centre premises.


AKTUALNO U POJAVNOSTI BOLESTI PERADI U HRVATSKOJ I REGIJI

Vladimir Savi

Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Zagreb, Hrvatska

Dvije najzna ajnije virusne bolesti peradi, visokopatogena influenca peradi (VPIP) i newcastleska bolest (NB) nisu zabi-lježene u Hrvatskoj ve cijeli niz godina, no ove dvije bolesti se redovito pojavljuju u zemljama u regiji. VPIP podtipa H5N1 koja je uzdrmala svjetsko peradarstvo i dalje uzrokuje probleme u zemljama središnje i isto ne Azije. Štoviše, na svoje nepredvidljivo širenje ovaj nas je virus podsjetio po etkom godine kada je na en u uginulom pelikanu u Bugarskoj. Vrlo srodan virus VPIP podtipa H5N8 se u proteklih nekoliko godina tako er ukorijenio na Dalekom istoku. Sli no virusu podtipa H5N1 i ovaj virus „pravi izlete“ sve do Europe. Tako je krajem prošle godine na en u peradi u Njema koj, Italiji, Nizozemskoj i Velikoj Britaniji, a po etkom ove godine i u peradi u Ma arskoj te u trenutku pisanja ovoga sažetka (ožujak 2015.) i u uginulom labudu u Švedskoj. Uz ova dva visokopatogena virusa podtipa H5, u sjevernoj Italiji je u ljeto 2013. došlo do zaražavanja peradi visokopatogenim virusom podtipa H7N7, no bolest je vrlo brzo iskorijenjena. Druga naj-zna ajnija virusna bolest peradi, newcastleska bolest, kontinuirano je prisutna u razli itim zemljama, a nama najbliže je zabilježena pojava u Rumunjskoj krajem prošle godine. U Hrvatskoj su u proteklom dvogodišnjem razdoblju od virusnih bolesti peradi i dalje najzna ajniji zarazni bronhitis i zarazna bolest burze (gumborska bolest). Me u terenskim virusima zaraznog bronhitisa dominiraju sojevi podtipa QX uz sporadi nu pojavu sojeva podtipa Italy 02 te naše lokalne varijante preliminarno nazvane HR2010. Zarazna bolest burze ve uobi ajeno pokazuje sezonski karakter vezano prvenstveno uz držanje pili a u malim, nekontroliranim uzgojima u toplije doba godine. S ovakvih uzgoja povremeno dolazi do prijenosa virusa na farmski držane pili e. Osim zaraznih bolesti peradi koje smo navikli susretati treba skrenuti pozornost i na pojavu erozija kutikule miši nog želuca uzrokovanih pti jim adenovirusom. Bolest se javlja u kokoši lakih i teških hibrida bilo koje dobi. Erozije je lako zamijeniti s promjenama nastalim uslijed razli itih štetnih tvari u hrani (mikotoksini, bakar, biogeni amini, gizerozin). Zaraza je proširena u svijetu, a dokazana je i u nekoliko susjednih zemalja. Uzro ni virus je mogu edokazati molekularnim tehnikama, me utim, zasad ga uobi ajenim laboratorijskim metodama nije mogu e razlikovati od tzv. virusa CELO, tako er pti jeg adenovirusa koji nije posebno patogen za kokoš. Stoga dijagnozu treba temeljiti na specifi nim patoanatomskim promjenama i pozitivnom nalazu ovoga virusa. Može se zaklju iti da je u Hrvatskoj u proteklom dvogodišnjem razdoblju vladala povoljna epizootiološka situacija s obzirom na zna ajnije zarazne bolesti peradi unato nepovoljnim globalnim i regionalnim epizootiološkim okolnostima.

TOPICAL ISSUES IN DISEASES OF POULTRY IN CROATIA AND THE REGION

The highly pathogenic avian influenza (HPAI) and Newcastle disease (ND) as the two most important viral diseases of poultry have not been reported in Croatia for years but they do occur regularly in the region. The HPAI of subtype H5N1 that shook the very foundations of world poultry industry continues causing problems in the Central and East Asia countries. The more so, at the beginning of 2015, this virus reminded us of its unpredictable spreading, when it was detected in a dead pelican in Bulgaria. In the last few years, a closely related HPAI of subtype H5N8 virus has also become enzootic in the Far East. Likewise subtype H5N1, this virus also "takes trips" as far as Europe, so that at the end of 2014, it was found in poultry in Germany, Italy, The Netherlands and Great Britain, then at the beginning of 2015 also in poultry in Hungary, and at the time of writing this abstract (March 2015) in a dead swan in Sweden. Besides these two highly pathogenic subtype H5 viruses, poultry infection with the highly pathogenic subtype H7N7 virus was reported in northern Italy in summer 2013, however, the disease was eradicated soon. Newcastle disease as the other most important viral disease of poultry has been continuously present in various countries; closest to us was its occurrence in Romania at the end

dr. sc. Vladimir Savi , dr. med. vet., predstojnik Centra za peradarstvo Hrvatskog veterinarskog instituta, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; e-mail: [email protected]

AKTUALNO U POJAVNOSTI BOLESTI PERADI U HRVATSKOJ I REGIJI 14

of 2014 In Croatia, infectious bronchitis and infectious bursal disease (Gumboro disease) were still of a major concern regarding viral diseases of poultry during the last two years. Subtype QX strains prevailed among infectious bronchitis viruses, with sporadic occurrence of subtype Italy 02 strains and our local variant preliminarily named HR2010. Infectious bursal disease usually shows seasonal pattern, primarily related to raising poultry in small, uncontrolled flocks during warm season. Then, the virus may occasionally be transmitted to poultry farms. In addition to infectious diseases that are usual in poultry in Croatia, attention should be paid to the occurrence of gizzard erosions caused by avian adenovirus. The disease involves light and heavy hybrid chickens of any age. These erosions may easily be mistaken for lesions caused by various feed contaminants (mycotoxins, copper, biogenic amines, gizzerosine, etc.). The infection has spread worldwide and has also been identified in some neighboring countries. The causative virus can be demonstrated by molecular techniques; however, for the time being it cannot be differentiated by standard laboratory methods from the so-called CELO virus, another avian adenovirus which is not particularly pathogenic for chicken. Therefore, diagnosis should be based on the specific gross lesions and positive virus finding. In conclusion, in spite of untoward global and regional epizootiological circumstances, Croatia had a favorable epizootiological situation considering major infectious diseases of poultry in the past two years.


GLOBALNA KONKURENTNOST PERADARSKE PROIZVODNJE U EUROPSKOJ UNIJI TE STANJE I TRENDOVI PROIZVODNJE I TRŽIŠTA REPUBLIKE HRVATSKE U DRUGOJ GODINI

LANSTVA U EUROPSKOJ UNIJI

Branko Bobeti

Gospodarsko interesno udruženje „Croatiasto ar“, Zagreb, Hrvatska

Globalni trendovi proizvodnje i potrošnje mesa U posljednjih 10 godina prosje na godišnja stopa rasta svih vrsta mesa u svijetu iznosila je 1,9%, a prosje na godišnja stopa rasta mesa peradi iznosila je 2,9%. Ukupna proiz-vodnja svih vrsta mesa u lanicama EU u 2014. godini iznosila je cca 43.9 milijuna tona, što je pove anje od 10%. Proizvodnja mesa peradi u 2014. godini dostigla je razinu od 1,3 milijuna tona, što je rast od 20% u odnosu na proiz-vodnju 2005. godine. Prema procjenama FAO oko 2020. godine na svjetskoj razini proizvodnja mesa peradi dosti i eproizvodnju svinjskog mesa i u idu im godinama e meso peradi imati najbrži rast od svih vrsta mesa.

Tržište mesa peradi i jaja u EU Izvoz lanica EU prema podacima iz 2013. godine iznosio je 1,3 milijuna tona mesa peradi, dok je uvoz iznosio 0,8 milijuna tona. Uvozi se najve im dijelom pile i i pure i file te proizvodi na bazi bijelog mesa peradi. Zbog ve e uvozne cijene bijelog mesa lanice EU vrijednosno su neto uvoznik, jer vrijednost uvoza nadmašuje vrijednost izvoza za 17%. Što se jaja i proizvoda od jaja ti e, lanice EU višestruko su neto izvoznik i po koli inama i po vrijednosti. Ukupan izvoz jaja i proizvoda od jaja iz EU u 2013. godini iznosio je 179.000 tona, a uvoz 22.000 tona.

Globalna konkurentnost mesa peradi i jaja iz EU U 2013. godini prosje na cijena koštanja utovljenog pileta bila je 1,01 eura/kg ž.v., cijena pile eg trupa grill obrade bez troškova klanja iznosila je 1,44 eura/kg, a cijena trupa s troškovima klanja 1,73 eura/kg. Prosje na neto prodajna cijena pile ih trupova grill obrade iznosila je 2,04 eura/kg. Konkurentnost globalnog tržišta analizira se kroz tržnu cijenu pile eg filea. Prosje na tržna cijena pile eg filea u EU bila je u 2013. godini 4,25 eura/kg, dok je prosje nadomicilna tržna cijena najve ih izvoznika pile eg filea na svjetska tržišta (SAD, Tajland, Brazil) iznosila cca 3 eura.

Uvozna cijena pile eg filea na tržište EU ve a je od pro-sje ne EU cijene zbog transportnih troškova te uvoznih pristojba. Prosje na proizvodna cijena koštanja konzumnih jaja vode ih EU proizvo a a u 2010. godini iznosila je 0,84 eura/kg. Na globalnom tržištu najve im dijelom trguje se jajima u prahu. Prosje na EU cijena koštanja jaja u prahu iznosila je 6,21 eura/kg, dok je prosje na cijena koštanja jaja u prahu najve ih svjetskih izvoznika (SAD, Argentina, Ukrajina i Indija) iznosila 4,41 eura. Proizvodnu cijenu koštanja mesa i jaja kod lanica EU zna-ajno optere uje obveza EU proizvo a a s naslova primjene

EU legislative (Nitratna direktiva, emisija NH3, kontrola salmonele, GMO, zabrana upotrebe mesno koštanog brašna, zabrana upotrebe stimulatora rasta te gusto a naseljenosti). U tovu pili a ovi troškovi ine blizu 5% ukupnih troškova proizvodnje, a u proizvodnji jaja ti troškovi imaju udio u ukupnim troškovima blizu 9%. Europska komisija ve neko-liko godina pregovara s WTO o daljnjoj liberalizaciji tržišta poljoprivredno prehrambenih proizvoda te e uvozne pri-stojbe se zasigurno smanjiti u idu im godinama. To e biti novi izazovi proizvodno tržišne konkurentnosti EU peradar-stva te se u tom smislu razra uju mogu i scenariji kao što su: smanjenje pristojba do 50% postoje e osnovne carine kao i promjene u te ajevima svjetskih valuta, što zajedno ima zna ajnog utjecaja na konkurentnost EU tržišta.

Trendovi peradarstva Hrvatske u drugoj godini lanstva u EU U zadnjih pet godina u klaonicama RH stagnira proizvodnja pile eg mesa, a od 2012. godine smanjila se proizvodnja pure eg mesa u odnosu na 2010. godinu. Zbog obveze primjene EU legislative kod konzumnih nesilica zna ajnijepada proizvodnja konzumnih jaja s obzirom na izostanak potrebnih investiranja u zamjenu opreme ili investiranja u alternativne na ine proizvodnje konzumnih jaja. Dodatni izazov hrvatskog peradarstva bio je ulazak u lanstvo EU

Branko Bobeti , dr. med. vet., Gospodarsko interesno udruženje "Croatiasto ar", Ivana Šibla 9, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: +385(0)1 6604990; faks: +385(0)1 6604998; e-mail: [email protected]

GLOBALNA KONKURENTNOST PERADARSKE PROIZVODNJE U EUROPSKOJ UNIJI TE STANJE I TRENDOVI PROIZVODNJE I TRŽIŠTA REPUBLIKE HRVATSKE U DRUGOJ GODINI LANSTVA U EUROPSKOJ UNIJI

16

sredinom 2013. godine. Unato smanjenju neto prodajnih cijena mesa peradi te konzumnih jaja nakon ulaska u lanstvo EU zna ajno eskalira uvoz svih vrsta mesa peradi, a

naro ito konzumnih kategorija te uvoz mesnih proizvoda od mesa peradi. Istodobno je zbog gubitka CEFTA tržišta smanjen izvoz kobasi arskih proizvoda na bazi mesa peradi, a zbog pada broja nesilica eskalira u 2014. godini uvoz konzumnih jaja u odnosu na 2012. godinu. U 2014. godini neznatno je pove an izvoz mesa peradi, a ukupna proizvodnja jednodnevne peradi bilježi rast u od-nosu na 2012. godinu. Opstojnost i daljnji razvoj peradarske proizvodnje RH iznimno je složen izazov. Naime, analiziraju i uvoz mesa, mesnih proizvoda te jaja vidljivo je da se uvoze proizvodi najve im dijelom iz lanica EU gdje su troškovi proizvodnje daleko najniži u odnosu na EU prosjeke.

S druge strane, prosje na kupovna mo domicilnog potro-ša a RH za gotovo 40% je niža od prosjeka EU pa samim time dio potroša a kupuje proizvode niže prodajne cijene bez obzira na iznimnu domicilnu konkurentnost kada je u pitanju kvaliteta i zdravstveni status doma ih proizvoda. Budu a tržišna konkurentnost u zna ajnoj mjeri ovisit e i o efikasnosti korištenja EU fondova koji bi u budu im investicijama trebali doprinijeti ne samo unapre enju tehno-loškog procesa, ve i smanjenju troškova proizvodnje, stva-ranju proizvoda ve e dodane vrijednosti, a samim time i ukupnom pove anju proizvodnje prema o ekivanim EU i globalnim trendovima u idu im godinama.

Izvor podataka: FAOStat, Eurostat, Godišnje izvješ eAVEC-a, DZS, HPA.

TRENDOVI PROIZVODNJE, UVOZA TE IZVOZA PERADARSTVA RH 2014./2012. GODINE

Opis 2014. 2012. Indeks 14/12.

Proizvodnja 1/d peradi - u 000 kom. 51.007 49.942 2 Proizv. mesa peradi u klaonicama RH - tona 58.543 61.337 -5 Uvoz mesa peradi - tona 22.000 16.360 34 Izvoz mesa peradi - tona 5.400 5.121 5 Uvoz mesnih proizvoda od mesa peradi - tona 8.880 5.869 51 Izvoz mesnih proizvoda od mesa peradi - tona 5.749 7.943 28 Uvoz konz. jaja - tona 2.830 846 235 Izvoz konz. jaja - tona 510 649 -21 Uvoz proizvoda od jaja - tona 270 285 -5 Izvoz proizvoda od jaja - tona 106 84 27 Broj nesilica - kom. 1.698.000 2.566.000 -34


17

Global Trends in Meat Production and Consumption In the last ten years, the mean annual growth rate for all kinds of meat was 1.9%, while for poultry meat it was 2.9%. In 2014, total all meat production in the European Union (EU) member countries was around 43.9 million tons, yielding a 10% increase. In the same year, the poultry meat production reached 1.3 million tons, yielding a 20% increase from 2005. According to FAO estimates, in the years to come, the poultry meat production will show fastest increase of all kinds of meat in the world and will reach the level of pork production by 2020.

EU Poultry and Egg Market Based on 2013 data, export from and import to EU countries amounted to 1.3 million tons and 0.8 million tons, res-

pectively. Imported are mostly chicken fillet and turkey fillet and white poultry meat products. According to value, EU member countries are net importers because of the higher import price of white meat, thus the import value exceeding the export value by 17%. Considering eggs and egg products, EU countries are several times net exporter by both quantities and value. In 2013, total EU export of eggs and egg products was 179,000 tons versus import of 22,000 tons.

Global EU Poultry Meat and Egg Production Competitiveness In 2013, the mean price of fattened chicken was 1.01 €/kg live weight, of grill processed chicken trunk without slaughter cost 1.44 €/kg, and of chicken trunk with slaughter

TRENDS IN CROATIAN POULTRY PRODUCTION, IMPORT AND EXPORT 2014 vs. 2012

Description 2014 2012 Index 14/12

Production of 1/d poultry - in 000 pcs 51,007 49,942 2 Prod. of poultry meat in slaughterhouses - tons 58,543 61,337 -5 Poultry meat import - tons 22,000 16,360 34 Poultry meat export - tons 5,400 5,121 5 Poultry meat product import- tons 8,880 5,869 51 Poultry meat product export - tons 5,749 7,943 28 Consumer egg import - tons 2,830 846 235 Consumer egg export - tons 510 649 -21 Egg product import - tons 270 285 -5 Egg product export - tona 106 84 27 Number of laying hens - pcs 1,698,000 2,566,000 -34

GLOBAL COMPETITIVENESS OF POULTRY PRODUCTION IN EUROPEAN UNION, AND PRODUCTIONAND MARKET TRENDS IN THE REPUBLIC OF CROATIA IN THE SECOND YEAR OF EUROPEAN UNIONMEMBERSHIP


18

cost 1.73 €/kg. The mean net selling price of grill processed chicken trunk was 2.04 €/kg. Global market competitiveness is analyzed by the chicken fillet market price. In 2013, the market price of chicken fillet in EU was 4.25 €/kg, whereas the mean domicile market price in the leading exporters of chicken fillet to the world markets (USA, Thailand and Brazil) was 3 €/kg. The price of chicken fillet imported to EU market exceeds the mean EU price because of transport cost and import dues. In 2010, the mean production price of consumer eggs in the leading EU manufacturers was 0.84 €/kg. The international market is predominantly dealing with powdered eggs. The mean EU price of powdered eggs was 6.21 €/kg versus 4.41 €/kg in the leading international exporters (USA, Argentina, Ukraine and India). In EU member countries, the production price of chicken meat and eggs is considerably burdened by the EU manufacturers' commitment to apply the EU legislative (Nitrate Directive, NH3 emission, salmonella control, GMO, ban on the use of meat-bone meal, ban on the use of growth stimulants, and population density). In chicken fattening, these costs account for nearly 5% of total production cost, whereas in egg production these costs account for nearly 9%. For years now, European Com-mission has been negotiating with the World Trade Orga-nization about further liberalization of the agricultural-alimentary product market and import dues will certainly be reduced in the years to come. This will pose new challenges upon the production and market competitiveness of EU poultry production, therefore a number of possible scenarios have been considered, such as reducing dues by up to 50% of the current basic customs duty and changes in the international official exchange rates, which taken together have a great impact on the EU market competitiveness.

Trends in Poultry Production in Croatia in the Second Year of EU Membership In the last five years, the production of chicken meat has been stagnant in the slaughterhouses in Croatia, while the production of turkey meat has been on a decrease since 2012

as compared with 2010. The production of consumer eggs decreased significantly due to the compulsory implemen-tation of EU legislative in consumer laying hens, cons-idering the lack of necessary investments in equipment renewal or in alternative methods of consumer egg production. Croatia accession to the EU in mid-2013 posed an additional challenge to the Croatian poultry production. In spite of reduction of the net selling price of poultry meat and consumer eggs, the import of all kinds of poultry meat, consumer categories in particular, and of poultry meat products escalated significantly since the Croatia accessing EU membership. At the same time, the export of poultry meat sausage products was reduced due to the loss of CEFTA market, while the import of consumer eggs greatly increased in 2014 as compared with 2012 due to reduction in the number of laying hens. In 2014, the export of poultry meat slightly increased and a rise was recorded in total production of one-day poultry as compared with 2012. The viability and future development of poultry production in the Republic of Croatia appear to pose a very complex challenge. Namely, analysis of the meat, meat product and egg import reveals that generally, products are imported from EU member countries with by far lowest production costs relative to EU average. On the other hand, the average purchasing power of domicile consumers in Croatia is by nearly 40% lower than the EU average, so that these consumers buy cheaper products irrespective of the great domicile competitiveness in terms of quality and health status of domestic products. In the near future, market competitiveness will greatly depend on the efficiency of raising EU funds, which are expected to contribute not only to advances in technological processes but also to reduction in production costs, as well as to creating products with higher added value, and thus to the overall production expansion, according to the anticipated EU and global trends in the years to come.

Data source: FAOStat, Eurostat, AVEC Annual Report, DZS, HPA


PRA ENJE RAZINE PROTUTIJELA U JATIMA PERADI KAO OSNOVA PROCJENE PROCIJEPLJENOSTI I TERENSKE INFEKCIJE VIRUSIMA ZARAZNOG BRONHITISA I ZARAZNE BOLESTI BURZE

Tajana Amšel Zelenika, Vladimir Savi , Mirta Balenovi


Sažetak Serološko pra enje razine protutijela omogu uje procjenu imunog stanja peradi ili prisutnost bolesti. Kako bismo nalaz protutijela mogli pravilno tuma iti te na osnovi rezultata sagledati zdravstveno stanje jata potrebno je poznavati prosje nurazinu protutijela ovisno o dobi i kategoriji peradi, poznatu i kao prosje ni (baseline) titar. U ovom radu prikazali smo prosje nu razinu titra protutijela za zaraznu bolest burze i zarazni bronhitis u serumima teških i lakih hibrida kokoši nesilica prikupljanih u razdoblju od 11 godina i testiranih komercijalnim imunoenzimnim kompletima (ELISA) koje koristimo u našem laboratoriju. Prosje na razina protutijela prikazana je prema dobi i vrsti proizvodnje.

Klju ne rije i: zarazni bronhitis, zarazna bolest burze, prosje na razina protutijela (baseline titar)

Uvod

Peradarska industrija zna ajna je gospodarska grana. Pro-izvodnja jaja i mesa osigurava izvor bjelan evina živo-tinjskog podrijetla pristupa nog gotovo svim stanovnicima pa i onima niže platežne mo i, kako u razvijenim tako i u nerazvijenim zemljama svijeta. Proizvo a i peradi ulažu znatna sredstva i vrijeme za provedbu cijepljenja i bio-sigurnosti na farmama s ciljem sprje avanja mogu ih gospodarskih gubitaka nastalih kao posljedica bolesti. Cjepiva za perad široko se primjenjuju za sprje avanje bolesti peradi, tj. za izbjegavanje ili smanjenje pojave kli-ni ke manifestacije bolesti. Pitanja na koje proizvo a inaj eš e traže odgovor su po kojem programu cijepiti, je li taj program u inkovit i je li perad zašti ena od infekcije. Cijepljenje mora biti prilago eno imbenicima koji mogu utjecati na u inkovitost, a to su u prvom redu vrsta pro-izvodnje, epidemiološka situacija, dostupnost cjepiva, gusto-a naseljenosti peradi, poštivanje ostalih biosigurnosnih

mjera na farmi te u kona nici raspoloživost ljudi i sredstava. Pra enjem humoralnog odgovora može se pravodobno utjecati na optimalno vrijeme cijepljenja kao i izbor cjepiva, ali i dijagnosticirati eventualnu infekciju jata. Nalaz pro-tutijela može ukazivati na prisutnost pasivno ste ene imunosti (maj ina protutijela) te na aktivno ste enu imunost (posljedi no cijepljenju) ili na infekciju. Zarazni bronhitis

(ZB) i zarazna bolest burze (ZBB) dvije su bolesti koje se esto pojavljuju i uzrokuju zna ajne gospodarske štete u

proizvodnji peradi, kako u svijetu tako i u Hrvatskoj, a procjena razine protutijela se rutinski provodi imuno-enzimskim postupkom. Stoga emo u ovom radu dati naglasak na serološki nadzor upravo ovih dviju bolesti. Zarazni bronhitis je vrlo kontagiozna virusna zaraza koja se o ituje prvenstveno dišnim simptomima, reprodukcijskim poreme ajima i nefritisom. Proširena je u cijelom svijetu i uzrokuje zna ajne gospodarske štete zbog velikog uginu a, umanjene nosivosti i slabije kakvo e jaja. Bolest je teško dijagnosticirati s obzirom na estu subklini ku pojavu, ali i pojavu nespecifi nih simptoma (Cavanagh i Nagy, 2003.). Uzro nik bolesti je RNK virus iz porodice Coronaviridae,no poznato je više od 20 serotipova ZB koji uzrokuju bolest (Capua i sur., 1994.; Cavanagh i Davis, 1992.). Jedini u inkoviti na in kontrole zaraznog bronhitisa je cijepljenje. Važno je napomenuti da cjepna imunost ne traje dugo pa su nužna docjepljivanja, ali isto tako važan je odabir odgovaraju eg soja cjepiva. Zarazna bolest burze ili gumborska bolest je vrlo konta-giozna, limfocitoliti ka, imunosupresivna, akutna do sub-akutna virusna bolest pili a obilježena destrukcijom nezrelih B limfocita u Fabricijevoj burzi (Lukert i Saif, 2003.). Uz izravno uginu e štete nastaju i zbog imunosupresije, pojave tzv. „Gumboru pridruženih bolesti“ (kroni na dišna bolest,

dr. sc. Tajana Amšel Zelenika, dr. med. vet., Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; e-mail: [email protected]


20

kokcidioza, hepatitis s uklopinama, gangrenozni dermatitis, Marekova bolest pa i zarazni bronhitis). Nadalje, zbog imunosupresije izostaje i zadovoljavaju i imuni odziv na cijepljenja protiv drugih bolesti. Uzro nik bolesti je RNK virus iz porodice Birnaviridae roda Birnavirus (Murphy i sur., 1999.). Bolest se prvi put pojavila 1957. u SAD-u te se brzo proširila Europom, ali sve do sredine devedesetih godina smrtnost je bila rijetka i iznosila je kod podmlatka nesilica oko 20%, a u tovnih pili a je rijetko prelazila 3% (van den Berg i sur., 1996.). Me utim nakon pojave vrlo virulentnog soja virusa gubitci zbog uginu a bili su višestruko ve i i to do 30% u tovnih pili a pa sve do 60% u podmladaka nesilica (van den Berg i Meuelmans, 1991.). Godinama je u Hrvatskoj cijepljenje blagim atenuiranim cjepivima davalo zadovoljavaju e rezultate. No, pojavom vrlo virulentnog virusa ZBB dolazi do o itovanja klini kih simptoma bolesti unato postojanja zna ajne razine maj inih protutijela (Savi i sur., 1997.). Primjena intermedijarnih živih cjepiva postala je nužna u intenzivnoj peradarskoj proizvodnji. Danas tržište raspolaže cijelim nizom živih cjepiva pripremljenih od razli ito patogenih sojeva virusa ZBB. Me utim, zbog interferencije cjepnog soja i maj inih protutijela u pili a važno je odrediti to no vrijeme ci-jepljenja, tj. dan kada se titar maj inih protutijela u pili asnizi do razine koja dopušta da se cijepljenjem potakne odgovaraju i imuni odziv. Odabir cijepnog soja i programa suzbijanja ovisi i o patogenosti soja virusa ZBB, na inu držanja pili a i primijenjenoj tehnologiji (Kouwenhoven i van den Bos, 1992.). Za uspješnu kontrolu i preventivu bolesti neophodan je serološki nadzor razvoja imunosti u peradi, kao i pra enje epizootiološke situacije te utvr ivanje optimalnog programa imunoprofilakse koji e perad štititi od prodora infekcije tijekom cijelog proizvodnog razdoblja. Serološki monitoring naj eš e se provodi primjenom imu-nodifuzije u gelu, brze serumske aglutinacije ili inhibicije hemaglutinacije i imunoenzimskog testa (engl. enzyme-

linked immunosorbent assay, ELISA). Za serološki nadzor ZB i ZBB danas je naj eš a i najpouzdanija metoda ELISA. To je osjetljiva, specifi na i objektivna tehnika koja omogu ava obradu velikog broja uzoraka u kratko vrijeme, a istodobno daje podatke o razini protutijela za pojedinu bolest, kao i o ujedna enosti imunosti u jatu. No, kao i kod svih ostalih seroloških metoda, važno je znati pravilno tuma iti dobivene rezultate (Borne i Comte, 2004.). Cilj našega istraživanja bio je prikazati prosje nu razinu protutijela (engl. baseline titer) prema dobi i proizvodnoj kategoriji peradi za ZB i ZBB, kako bismo na osnovi dobivenih rezultata mogli procijeniti procijepljenost ili pojavu terenske infekcije ZB ili ZBB u jatu.

Materijali i metode

Pretraženo je ukupno 2878 seruma konzumnih nesilica i 8294 seruma rasplodnih nesilica pristiglih na odre ivanje razine protutijela za ZB i ZBB s raznih farma na podru ju Republike Hrvatske u razdoblju od 2003. do 2014. godine. Prema vrsti bolesti na koju su pretraživani, dobi i kategoriji peradi, serumi su svrstani u dobne skupine (tablica 1.). Serumi su pretraženi indirektnom imunoenzimnom probom (ELISA) na prisutnost protutijela za ZB i ZBB koriste ikomercijalne komplete x-OvO FlockscreenTM (x-OvO Limited, UK) prema uputi proizvo a a. Vrijednosti opti kih gusto a o itane su uz pomo ita a E max precision microplate reader (Molecular Devices, SAD) rabe i filtar od 550 nm. Dobivene vrijednosti obra ene su ra unalnim programom Softscreen 3.0 (x-OvO Limited, UK) koji omogu ava izra un titra protutijela pojedinog seruma.Osnovnu obradu podataka obavili smo postupcima deskriptivne statistike primjenom statisti kog ra unalnog programa Statistica 10 (StatSoft, Inc., 2011.). Srednja vrijednost i standardna devijacija je za svaku dobnu skupinu izra unata obradom pojedina nih titara protutijela, tj. nije se uzimala u obzir srednja vrijednost titara u pojedinom jatu.

Tablica 1. Prikaz broja pretraženih seruma prema vrsti bolesti na koju su pretraživani, dobi i kategoriji peradi Table 1. Number of tested sera according to disease type, poultry age group and category

Rasplodne nesilice / Breeding hens Konzumne nesilice / Laying hensBroj pretraženih seruma

/ Number of examined seraBroj pretraženih seruma

/ Number of examined seraDobna skupina

/ Age group Dob /Age ZB /IB ZBB /IBD ZB /IB ZBB /IBD

1 1-8 dana 46 2772 - 2184

2 6-17 tjedana 535 500 76 103

3 19-37 tjedana 2015 2109 326 -

4 41-69 tjedana 242 75 189 -

Ukupno 2838 5456 591 2287 ZB – zarazni bronhitis, ZBB – zarazna bolest burze IB - Infectious bronchitis; IBD - Infectious bursal disease


21

Rezultati

Slikama 1., 2., 3. i 4. prikazane su srednje vrijednosti titra protutijela (aritmeti ke sredine), standardne pogreške i standardne devijacije za ZB i ZBB u serumima rasplodnih i konzumnih nesilica prema dobnim skupinama, grafi kim prikazom Box & Whisker Plot.

Pojašnjenje grafi kog prikaza: srednja vrijednost (aritmeti ka sredina)

standardna pogreška srednje vrijednosti raspon rezultata unutar jedne standardne devijacije

Slika 1. Srednja vrijednost, standardna pogreška i standardna devijacija titra protutijela za zarazni bronhitis u rasplodnih nesilica prikazane prema dobnim skupinama

Figure 1. Mean, standard error and standad deviation of infectious bronchitis antibody titer in breeding hens according to agegroups

Slika 2. Srednja vrijednost, standardna pogreška i standardna devijacija titra protutijela za zarazni bronhitis u konzumnih nesilica prikazane prema dobnim skupinama

Figure 2. Mean, standard error and standad deviation of infectious bronchitis antibody titer in laying hens according to age groups


22

Slika 3. Srednja vrijednost, standardna pogreška i standardna devijacija titra protutijela za zaraznu bolest burze u rasplodnih nesilica prikazane prema dobnim skupinama.

Figure 3. Mean, standard error and standad deviation of infectious bursal disease antibody titer in breeding hens according toage groups.

Slika 4. Srednja vrijednost, standardna pogreška i standardna devijacija titra protutijela za zaraznu bolest burze u konzumnih nesilica prikazane prema dobnim skupinama.

Figure 4. Mean, standard error and standad deviation of infectious bursal disease antibody titer in laying hens according to agegroups.

Diskusija

Pitanje na koje peradari o ekuju odgovor prilikom slanja uzoraka na analizu imunog stanja jata je koja srednja vrijednost titra protutijela štiti njihovo jato od pojave bolesti, tj. može li se iz dobivenih nalaza procijeniti uspješnost cijepljenja, potreba za docjepljivanjem ili dijagnosticirati infekcija terenskim virusom. To je vrlo kompleksno pitanje

na koje nije jednostavno dati odgovor. Naime, kako bismo pravilno tuma ili dobivene rezultate potrebno je poznavati o ekivani titar protutijela za odre enu bolest prije i nakon cijepljenja, pravilno tuma iti vrijednosti koeficijenta vari-jabilnosti (KV) te napokon uzimaju i u obzir dob, kategoriju peradi i primijenjeni na in cijepljenja protuma iti nalaz ELISA protutijela. Visina o ekivanog titra ovisi o itavom nizu imbenika (dob, kategorija, na in držanja, na in


23

primjene cjepiva, vrsta dijagnosti kog ELISA kompleta koji se u laboratoriju koristi itd.). U našem istraživanju koristili smo serume pristigle na kontrolu imunosti kroz 11 godina, pretražili ih ELISA testom te grupirali prema kategoriji i dobi peradi kako bismo dobili prosje ni titar (engl. baseline titer) koji e nam pomo i u procjeni o ekivanog titra protutijela u cijepljenim jatima. Slike 1., 2., 3. i 4. prikazuju prosje ne vrijednosti titra protutijela prema dobnim sku-pinama, kategoriji peradi i bolesti te najviše i najniže odstupanje titara unutar jedne standardne devijacije koje smatramo prihvatljivim. Rezultati pretraživanja seruma na protutijela za ZB u dobnoj skupini 1 govore o titru naslije enih maj inih protutijela. Tijekom istraživanja nije bilo pretraživanih seruma na pri-sutnost maj inih protutijela za ZB u podmlatka konzumnih nesilica (slika 2.). Broj pretraženih seruma u dobnoj skupini 2 konzumnih nesilica je vrlo mali (svega 76 seruma), zbog ega ovu srednju vrijednost titra protutijela ne možemo

smatrati pouzdanom pa je za o ekivanu vrijednost prag-mati nije uzeti srednju vrijednost titra koji je na en u rasplodnim jatima. Srednje vrijednosti titara protutijela u pretraženim serumima rasplodnih nesilica dobnih skupina 2, 3 i 4 ukazuju na to da je vrijednost o ekivanih titara izme u5000 i 6000. Nešto ve a odstupanja od prosje ne vrijednosti možemo na i u dobnoj skupini 2, dakle, u dobi peradi od 6-17 tjedana, što je o ekivano s obzirom na to da se perad u ovom razdoblju dvokratno cijepi pa je i raspršenost rezultata ovisna o vremenu nakon cijepljenja, tj. vremenu potrebnom za razvoj imunosti. Prosje ne vrijednosti titra protutijela za ZB u rasplodnih i konzumnih nesilica dobnih skupina 3 i 4 rezultat su provedenog cijepljenja tijekom odgoja kao i cijepljenja inaktiviranim cjepivom te e se koristiti kao vrijednosti o ekivanog titra u toj dobi. Svako odstupanje od najniže ili najviše vrijednosti titra unutar jedne standardne devijacije (vrijednosti prikazane slikama 1. i 2.) govori bilo o nedostatnoj specifi noj imunosti ili o mogu em prodoru terenske infekcije. Cijepna imunost kod zaraznog bronhitisa ne traje dugo i ne postoji križna zaštita pa su nužna docjepljivanja tijekom nesivosti. Za sprje avanje pojave ZB potrebna je redovita serološka kontrola i prilago avanje programa cijepljenja svakom pojedinom jatu. Na osnovi svih prikupljenih po-dataka mogu e je izraditi program imunoprofilakse koji pruža sigurnu zaštitu životinja od prodora infekcije (Jack-wood i sur., 2005.). Vrlo virulentni virus ZBB je sredinom devedesetih godina uzrokovao goleme gospodarske štete. Gubitci koje su pe-radari pretrpjeli bili su povod za temeljitu izmjenu programa imunoprofilakse primjenom živih cjepiva pripravljenih od razli ito patogenih sojeva. Sukladno velikom gospodarskom zna enju ove bolesti u Hrvatskoj pretražen je i ve i broj seruma na prisutnost ELISA protutijela za ZBB kako u rasplodnih tako i u konzumnih nesilica. injenica da po-tomstvo naslje uje maj ina protutijela koja mogu inter-ferirati s cjepnim sojem te tako smanjiti u inak cjepljenja ili pak da se razina maj inih protutijela može prenijeti u nižem titru i omogu iti prodor infekcije iziskivala je temeljit

pristup i individualnu izradu programa imunoprofilakse (van den Berg i Meulemans, 1991.). Stoga je u intenzivnoj peradarskoj proizvodnji postalo uobi ajeno odre ivanje razine maj inih protutijela kod netom izleženih pili a. Na osnovi razine titra maj inih protutijela, na ina držanja i primijenjene tehnologije izra uju se programi imunopro-filakse za svako pojedino jato. Devedesetih godina zapo elaje upotreba tzv. formule Deventer koja je razvijena za procjenu optimalnog vremena cijepljenja, a uzima u obzir vrijeme poluraspada maj inih protutijela, dob, genetiku i ujedna enost razine titra protutijela u pojedinom jatu (de Wit 1998.). Prosje ni titar protutijela u prvoj dobnoj skupini od 5769 za rasplodni podmladak i 4796 za podmladak konzumnih nesilica posljedica je pasivno ste enog imuniteta koji se s majke prenosi na potomstvo. Me utim, velik raspon titra protutijela (od 2144 do 9394, slike 3. i 4.) posljedica je itavog niza imbenika koji utje u na razinu maj inih protutijela, a to su prvenstveno kategorija peradi, imuno stanje mati nog jata iz kojeg potje u pili i, dobi u kojoj je uzorkovana krv za pretraživanje itd. esto smo svjedoci vrlo neujedna enog titra protutijela za ZBB u pojedinom jatu, što može biti posljedica podrijetla pili a iz više razli itih jata ili pak rasplodna jata nisu cijepljena inaktiviranim cjepivom i sl. Istraživanja koja su provedena upotrebom ELISA testova (komercijalni kompleti proizvo-a a IDEXX) sugeriraju da se cijepljenje primjenjuje u dobi

kada se titar u 75% jata spusti na razinu 500. S obzirom na to da jedan dio jata može zadržati relativno visoku razinu maj inih protutijela (25% jata ima ve u razinu protutijela od one koja omogu uje kvalitetan odgovor na cjepivo) uobi-ajeno je dvokratno cijepiti pili e (de Wit, 1998.). Danas se

u nas protiv ZBB perad naj eš e cijepi dvokratno inter-medijarnim sojem cjepiva, a vrijeme cijepljenja je najuput-nije odrediti za svako pojedino jato. Rezultati pretraživanja u konzumnih nesilica (slika 4.) svrstani su u samo dvije dobne skupine. Dobnu skupinu 1 iji rezultat ukazuje na o ekivanititar maj inih protutijela i dobnu skupinu 2 u kojoj je relativno visoka razina protutijela (prosje ni titar 8651) rezultat dvokratnog cjepljenja intermedijarnim sojem cjepiva i pokazuje titar koji je dostatan za zaštitu pili a tijekom razdoblja prijem ljivosti (slika 4.). S obzirom na to da odrasle spolno zrele konzumne nesilice ne obolijevaju od ZBB (Fabricijeva burza fiziološki involuira u dobi od 12-20 tjedana), a jaja se ne koriste za valenje, daljnje pra enjetitara protutijela za ZBB nije bilo potrebno. U rasplodnih jata bitno je poznavati o ekivani titar tijekom cijelog proizvodnog procesa. Kvalitetno provedeno cijep-ljenje i dostatna imunost jamstvo su proizvodnje pili a s visokom razinom maj inih protutijela koja e ih štititi u prvim danima života. Prosje na vrijednost titra protutijela u rasplodnih jata kre e se od 7956 u dobnoj skupini 2, 5794 u dobnoj skupini 3 te oko 4677 u dobnoj skupini 4. Ovisno o dobnoj skupini možemo o ekivati i blago odstupanje od srednje vrijednosti, no ono mora biti unutar raspona jedne standardne devijacije (prikazan slikama 3. i 4.). Svi titri izvan tog raspona ukazuju ili na slab imuni odziv (nepra-vilna primjena cjepiva, neodgovaraju a dob cijepljenja itd.) ili pak prodor infekcije u jato ako se radi o višim titrima.


24

S obzirom na velik broj pretraženih seruma prikupljanih kroz razdoblje od 11 godina smatramo da dobivene vri-jednosti mogu poslužiti kao vrijednosti o ekivanih titara protutijela za ZB i ZBB u pojedinim jatima ovisno o dobi, kategoriji peradi i vrsti protutijela. Uz o ekivanu srednju vrijednost titra protutijela važno je znati tuma iti i vrijednost KV. KV prikazuje se za svako pojedino jato, a govori nam koliko variraju vrijednosti titara u pojedinom jatu. Niži KV ukazuje na ujedna eniju distribuciju i kvalitetno provedeno cijepljenje. Me utim, KV ve i od 60% može ukazivati na to da se u jatu nalaze jedinke koje nisu ili su u vrlo niskom titru stvorile imuni odziv na cjepivo ili da postoje i ptice s vrlo visokim titrom protutijela kao odgovor na cijepljenje, ali i na mogu u infekciju. Za tuma enje rezultata svakako je bitan i broj pretraženih seruma. Smatra se da je pretraživanje 18 seruma po jatu minimalan broj za objektivnu procjenu rezultata (de Wit, 1998.). Sagledavši sve navedene parametre, ali uzimaju i u obzir i spoznaju o pojavnosti bolesti na odre enom epizooti-ološkom podru ju, u ve ini slu ajeva je mogu e temeljem seroloških rezultata dobivenih uporabom imunoenzimnog testa procijeniti uspješnost provedenog cijepljenja ili prisutnost terenske infekcije jata konzumnih i rasplodnih nesilica virusima ZB i ZBB.

Literatura

BORNE, P. M., S. COMTE (2004): Vaccines and vaccination in poultry production. Ceva Sante Animale, 137 p.

CAPUA, I., R. E. GOUGH, M. MANCINI, C. CASACCIA, C. WEISS (1994): A 'novel' infectious bronchitis strain infecting broiler chickens in Italy. J Vet Med Series B, 41, 83-89.

CAVANAGH, D., P. J. DAVIS (1992): Sequence analysis of strain of avian infectious bronchitis coronavirus isolated during the 1960s in the U.K. Arch Virol. 130. 471-476.

CAVANAGH, D., S. NAGI (2003): Infectious bronchitis. In: Diseases of Poultry, 11. izd. Y. M. Saif, H.J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, ur. Iowa State University Press, Ames, IA, 101-119.

de WIT, J. J. (1998): Gumboro disease: estimation of optimal time of vaccination by the Deventer formula. Polish Vet. J. 3:19-22.

JACKWOOD, M. W., D. A. HILT LEE, W. CH., H. M. KWON, S. A. CALLISON, K. M. MOORE, H. MOSCOSO, H. SELLERS, S. THAYER (2005): Data from 11 years of molecular typing infectious bronchitis virus field isolates. Avian Dis. 49, 614-618.

KOUWENHOVEN, B., J. Van den BOS (1992): Control of very virulent infectious bursal disease (Gumboro disease) in the Netherlands with so called „hot“ vaccines. Proc 19th World Poultry Congress, Amsetrdam, 465-468.

LUKERT, P. D., M. SAIF (2003): Infectious bursal disease. In: Diseases of Poultry, 11. izd. Y. M. Saif, H.J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, ur. Iowa State University Press, Ames, IA, 161-179.

MURPHY, F. A., E. P. J. GIBBS, M. C. HORZINEK, M. J. STUDDERT (1999): Birnaviridae. In: Veterinary Viro-logy, 3. izd. Murphy, F.A., M.J. Studdert, ur. Academic Press. San Diego-London-Boston-New York-Sydney-Tokio-Toronto, 405-409.

SAVI , V., Z. BI IN, S. AJAVEC, M. STAN I , .GJUR EVI , G. SAVI (1997): Epidemic of infectious bursal disease in Croatia durin the period 1995-1996. Field and experimentaly observation. Vet. Arhiv, 67, 243-251.

Van den BERG, T. P., G. MEULEMANS (1991): Acute infectious bursal disease in poultry: protection affored by maternally derived antibodies and interference with live vaccinatione. Avian path. 20, 409 – 421.

Van den BERG, T. P., M. GONZE, D. MORALES, G. MEULEMANS (1996): Acute infectious bursal disese in poultry: imunological and molecular basis of antigenicity of a highly virulent strain. Avian Pathol. 25, 751-768.

MONITORING OF ANTIBODY TITER IN POULTRY FLOCKS FOR ASSESSMENT OF THE RATE OF VACCINATION AND FIELD INFECTION WITH INFECTIOUS BRONCHITIS AND INFECTIOUS BURSAL DISEASE VIRUSES

Summary

Serologic monitoring of antibody titer enables assessment of poultry immunity or presence of disease. Determination of the age and category specific baseline antibody titer is a precondition for correct interpretation of antibody titer result and assessment of the poultry flock health state. This paper presents baseline antibody titers for infectious bursal disease and infectious bronchitis determined in sera of laying hen, collected over 11-year period and tested by the commercial immunoenzymatic assays (ELISA) used in our laboratory. The mean antibody titers are presented according to animal age groups and type of production.

Key words: infectious bronchitis, infectious bursal disease, baseline antibody titer


ŠTO TREBA ZNATI O RASVJETI U PERADARSKOJ PROIZVODNJI

Milivoj Mikec, Tihomir Zglavnik


Sažetak

Današnja peradarska praksa primjenjuje razli ite izvore i boje svjetla u provedbi programa rasvjete kao važnog dijela tehnologije proizvodnje, što zbunjuje proizvo a e. Tu konfuziju još više produbljuju i proizvo a i opreme, jer nude razli itarasvjetna tijela i uvjeravaju peradare da su ona najbolja. Uglavnom je prevaga u odabiru cijena koštanja i rok trajanja rasvjetnih tijela, dok se manje uvažavaju svojstva svjetla što ga rasvjetno tijelo proizvodi i koje peradi više odgovara za ostvarenje bolje proizvodnosti i zdravlja. Zapravo, donedavno ni znanost nije imala pravi odgovor kako djeluje boja svjetla i njen intenzitet na neurohormonsku, fiziološku i imunu aktivnost peradi. Rasvjeta u peradarstvu jedan je od važnijih tehnoloških imbenika u proizvodnji mesa i jaja. Primjenom pravilnog ritma osvjetljenja te primjenom odgovaraju e boje i intenziteta svjetla u peradi poti emo hormonsku aktivnost i anaboli ke procese, što se o ituje kao dobar prirast ili dobra nesivost. Zapravo, odre enim tehnološkim postupcima (primjerice, programom rasvjete i hranjenja) u peradi stvaramo osje aj godišnjeg doba kada se poja ava ili smanjuje njena fiziološka aktivnost, što naravno zavisi o proizvodnoj kategoriji peradi. Dakle, radi se o utjecaju i kontroli neurohormonske aktivnosti životinje pomo u okolišnih imbenika. Stoga je neobi no važno poznavanje utjecaja svjetla i njegovih svojstava na perad, a boja, ritam, trajanje i intenzitet svjetla u tome imaju važnu ulogu. Odabir rasvjetnih tijela poznatih karakteristika od velikog je zna enja za bolji proizvodni uspjeh, a pozornost mora biti usmjerena i na uštedu elektri ne energije te cijenu rasvjetnih tijela, mada to ne smije biti glavni argument u odlu ivanju.

Klju ne rije i: perad, rasvjeta, boja i intenzitet svjetla, proizvodnost, zdravlje

Uvod

U suvremenim peradarskim nastambama jedini izvor svjetla za perad je umjetna rasvjeta pa trajanje, intenzitet i spektar svjetla postaju zna ajan okolišni imbenik koji bitno utje e na reprodukciju, prirast i zdravlje peradi. Uloga svjetla u biološkoj aktivnosti ptica dugo je poznata, poglavito na proizvodnju jaja. U inak svjetla na organizam definiran je trima kriterijima (Andrews i Zimmerman, 1990.): 1. izmjenama svjetla i mraka ili fotoperiodom, 2. intenzitetom svjetla i 3. bojom svjetla. U ptica iz suptropskih podru ja iznenadno pove anje dana poti e gonade na proizvodnju jaja, dok skra enje smanjuje seksualnu aktivnost i prekida nesivost (Benoit, 1964.; Woodard i sur., 1969.). Uz to, pticama je potreban i odre eni intenzitet svjetla u razdoblju fotostimulacije, jer bez obzira na boju svjetla, ako je intenzitet slab može se

zna ajno umanjiti fotostimulacija (North i sur., 1990.). Percepcija intenziteta svjetla zavisna je o dijelu spektra svjetlosti i tipu rasvjetnog tijela (Huber-Eicher i sur., 2013.). Slab intenzitet svjetla umanjuje uzimanje hrane u peradi bez obzira na spektar svjetlosti, isti u Rozenboim i sur. (1998.), dok Charles (1984.) tvrdi da intenzitet svjetla ne utje e na uzimanje hrane u nesilica. Boshouwers i Nicaise (1987.) su smanjenjem intenziteta svjetla od 120 na 1 lux reducirali potrošnju energije u organizmu kokoši za 18%. Ovaj fenomen je posljedica slabije aktivnosti pe-radi, što se vrlo dobro koristi u uzgojnom razdoblju. Oko peradi sli no je ljudskom oku i vidi u uskom svjetlosnom spektru od 380 do 750 nm. Uz retinske ptice imaju i izvanretinske fotoreceptore smještene u nekoliko dijelova mozga koji su uklju eni u prijenos svjetlosne stimulacije. Fotostimulacija uklju uje svjetlost razli itih valnih duljina u pili a (Harrison i sur., 1970.), purana (Scott i Payne, 1937.) i pataka (Benoit, 1964.), odnosno razli ite boje svjetlosti. Rasvjetna tijela koja se još i danas koriste u peradarskoj proizvodnji

dr. sc. Milivoj Mikec, dr. med. vet., Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; e-mail: [email protected]

ŠTO TREBA ZNATI O RASVJETI U PERADARSKOJ PROIZVODNJI 26

emitiraju širi spektar svjetla (klasi na žarulja, fluores-centne cijevi), za razliku od sve više ugra ivanih LED lampa koje emitiraju monokromatsko svjetlo (Rozenboim i sur., 1998.), što je poželjno jer poticajno djeluje na fizio-lošku aktivnost i proizvodnost peradi.

Svjetlost

Svjetlost je elektromagnetsko zra enje vidljivo oku koje se sastoji od estica energetskih paketi a fotona. Cjelokupni raspon zra enja u svemiru nazivamo elektromagnetski spektar i on se sastoji od: - gama zra enja,- rendgenskog zra enja,- ultraljubi astog zra enja, - vidljivog zra enja (svjetlost), - infracrvenog zra enja,- mikrovalnog zra enja i - radio valova.

Navedena zra enja razlikuju se jedino po frekvenciji, od-nosno broju titraja u nekom vremenskom intervalu i valnoj duljini. Svjetlost je kretanje elektri nog naboja u elektro-magnetskom polju. Atomi odašilju svjetlost kada su neki od njegovih elektrona pobu eni energijom izvana. To zra-enje izražavamo valnom duljinom, a svjetlost manje

energije ima manju frekvenciju i ve u valnu duljinu, dok ona s više energije ima ve u frekvenciju i manju valnu duljinu. Brzina svjetlosti u vakuumu, kao i ostalih zra enja,iznosi oko 300 000 km/s. Oko reagira samo na vidljivu svjetlost i odli no raspoznaje male raspone valnih duljina, a koji su zapravo boje. Danas vrlo jasno znamo da svjetlost ima veliku ulogu u razvoju, funkciji i kontroli reproduktivnog sustava u pe-radi, na njihovo ponašanje i imuni status. Najbolji primjer za to je u prirodi. U prolje e s porastom dužine dana aktivira se razvitak i funkcija reproduktivnog sustava, a zimi sa skra enjem dnevne svjetlosti prestaje nesivost.

Razlika u fotorecepciji izme u ovjeka i peradi

Oko je ustroj koji elektromagnetske valove (svjetlost) pre-ko kemijskih procesa i elektri nog podražaja putem vidnog živca prenosi u vidna središta mozga. Fotosenzitivno tkivo oka nalazi se u mrežnici i sastoji od dva tipa fotorecep-torskih (vidnih) stanica. Štapi aste stanice odgovorne su za vid kod slabog svjetla (no ni vid), imaju slabu rezoluciju i mogu proslijediti samo bijelu i crnu boju. Stožaste stanice omogu avaju vid kod dnevnog svjetla i stvaraju sliku jake rezolucije uz dobro vi enje boja. Tri su vrste stožastih stanica i jedna skupina reagira na svjetlosne valove od 400-490 nm (plava osjetljivost), druga na one od 490-580 nm (zelena osjetljivost) i tre a na svjetlosne valove od 580-700 nm (crvena osjetljivost). Svjetlosna stimulacija jedan je od klju nih utjecaja okoline za pokretanje i sinkronizaciju mnogih fizioloških procesa u organizmu. Za razliku od ovjeka koji ima najve u osjetljivost na svjetlost od 555

nm, kod peradi je to 417 nm (Yoshizawa, 1992.; Hart i sur., 1999.), što je vidljivo iz tablice 1. Ova tablica ukazuje na to da perad ima više vidnih stanica (fotoreceptora) za odre enu boju svjetlosti (npr. plavu), a osjetljivija je i na intenzitet svjetla (Lewis i Morris, 2000.). Nadalje, perad percipira dio ultravioletnog zra enja, ali valja re i da to nisu boje svjetlosti, no sasvim sigurno utje e na ukupnu vidnu percepciju (Nuboer, 1993.). Spekt-ralna osjetljivost je razli ita kod ptica i ovjeka, poglavito u crvenom i plavom spektru (Nuboer i sur., 1992.) pa pro-izlazi da intenzitet percepcije kod razli itih izvora svjetlo-sti nije isti kod ovjeka i peradi, što se najbolje vidi u tablici 2. Kod projektiranja rasvjete za peradnjake ne smijemo ko-ristiti našu percepciju svjetla, nego pri mjerenju treba koristiti fotometre koji imaju percepciju svjetlosti peradi (Delabbio, 2014.). Nisam siguran da se mogu složiti s tom konstatacijom, jer bez obzira na to što koristimo fotometre prilago ene ljudskom oku biološka potreba peradi za svjet-lom kao poticajnim fiziološkim imbenikom je za-dovoljena na percepcijskoj razini ljudskog oka, ali i odre ena na temelju proizvodnih i fizioloških aktivnosti u peradi. ovjek uz pomo svjetlosti dobiva informacije iz okoline i to nazivamo mrežni nom stimulacijom. No, životinje, poglavito perad, imaju i dodatne senzore koje nazivamo ekstraretinski fotoreceptori (Lewis i Morris,

Valna duljina Boja 380-435 nm Ljubi asta 435-500 nm Plava 500-565 nm Zelena565-600 nm Žuta600-630 nm Naran asta630-780 nm Crvena

Slika 1. Percepcija svjetlosnog spektra peradi i ovjeka(Prescott i Wathes, 1999.)

Figure 1. Perception of light spectrum in poultry andhumans (Prescott and Wathes, 1999)


2000.; Menaker i Underwood, 1976.). Ti ekstraretinski fotoreceptori su epifiza ili kako se još naziva tre e oko i duboki moždani fotoreceptori smješteni na bazi mozga. Sli no kao i o i tako i ekstraretinski fotoreceptori stimu-liraju mozak na fiziološku aktivnost koja utje e na pona-šanje životinja. Ova vrsta stimulacije ne može se pred-vidjeti u izradi programa rasvjete, ali nedvojbeno ima utjecaja na proizvodnost i zdravlje peradi. Izmjenu dana i no i ili dužinu dana ptice percipiraju uz pomo ekstrare-

tinskih fotoreceptora, a ne kroz oko. To odgovara sezon-skim promjenama u prirodi. Dakle, o na ruta bitna je za osjet vida u mozgu, dok nije od vitalnog zna enja za kontrolu reproduktivnog sustava. To potvr uje i istraži-vanje koje su proveli japanski istraživa i. Oni su uspore-

uju i proizvodne performanse slijepe i vidne kokoši ustvrdili da je slijepa kokoš snijela više jaja od vidne i za to potrošila manje hrane.

Tablica 1. Osje aj boja svjetlosti ovjeka i peradi (Philips Lighting B.V., The Netherlands) Table 1. Sense of light color in humans and poultry

Valna duljina Boja svjetla Percepcija (lux)

ovjek Perad 340-360 UV 0 1,2 360-380 UV 0 10,7 380-400 Ljubi asta 0 12,4 400-420 Ljubi asta 0,1 11,7 420-440 Ljubi asta 1,0 23,6 440-460 Plava 3,0 39,8 460-480 Plava 7,1 52,4 480-500 Plava 16,4 53,1 500-520 Zelena 38,1 45,6 520-540 Zelena 60,2 59,0 540-560 Zelena 67,8 66,9 560-580 Žuta 63,5 66,0 580-600 Žuta 49,5 44,1 600-620 Naran asta 32,3 37,9 620-640 Naran asta 16,7 42,7 640-660 Crvena 6,6 20,7 660-680 Crvena 2,0 10,9 680-700 Crvena 0,5 5,8 700-730 Crvena 0,1 2,3

Tablica 2. Percepcija intenziteta svjetla u ljudi (lux) i doma e peradi (gallilux) (Philips Lighting B.V., The Netherlands) Table 2. Perception of light intensity in humans (lux) and poultry (gallilux)

Izvor svjetla Percepcija intenziteta

ovjek (lux) Perad (gallilux) Klasi na žarulja 5,6 8,1 Topla bijela fluorescentna cijev 120,8 147,2 Hladna bijela fluorescentna cijev 120,8 159,1 Natrijeva visokotla na lampa 254,4 277,3 Plava fluorescentna cijev 37,8 196,8 Crvena fluorescentna cijev 2,2 6,7 Ljetni sun ani dan 100 000 163 560


Utjecaj svjetlosti na proizvodnost i zdravlje peradi

Svjetlosne informacije izravno utje u na razinu serotonina i melatonina koji pak poti u ostale endokrine funkcije (lokomotorna aktivnost, temperatura tijela, vrijeme mi-gracije u divljih ptica). Uz to, utjecaj svjetla bilo izravni ili neizravni, dakle, preko ekstraretinskih ili retinskih foto-receptora, poti e lu enje gonadotropina, a on poti ehipofizu na proizvodnju FSH (folikulostimuliraju ihormon) koji djeluje na razvoj ovarija i ovidukta i LH (luteiniziraju i hormon) koji poti e ovulaciju i osloba anje žumanjka s jajnika u jajovod. Porast koncentracije LH u krvi doga a se jednom u dnevnom ciklusu svjetlost-tama, a što je i granica za proizvodnju jaja kokoši u jednom danu. Svjetlosne informacije primljene u hipofizi više su odgo-vorne za ovulaciju negoli za njenu inicijaciju i kontrolu. Epifiza proizvodi melatonin, hormon koji omogu uje živo-tinji odre ivanje dužine dana i no i u dnevnom ciklusu, a uz to to utje e na imunost i aktivnost kokoši. Vrijeme nesivosti prema tom dnevnom ciklusu odre eno je više du-žinom no i negoli dužinom dana (Lewis i Morris, 2000.).

Slika 2. Prijenos svjetlosnog signala na hipotalamus (Lewis, 1988.)

Figure 2. Light signal transmission to hypothalamus (Lewis, 1988)

Postoje zna ajne prednosti koje daje pravilna rasvjeta u peradnjacima. Dugoro no gledaju i, primjena neodgova-raju e svjetlosti ima za posljedicu slabiju nesivost i rast, a kratkoro no poja anu agresiju u kokoši. Retinska recepcija utje e na ponašanje i rast, a fotoseksualni odgovor vezan je uz hipotalami nu recepciju (Lewis i Morris, 2000.). Plavo svjetlo smanjuje stres u ptica (Lewis i Morris, 2000.; Firouzi i sur., 2014.), stimuliraju e djeluje na njihov imuni status (Xie i sur., 2008.; Firouzi i sur., 2014.) i djeluje smiruju e na perad (Lewis i Morris, 2000.; Rodenboog, 2001.; Firouzi i sur., 2014.). Crveno svjetlo stimulira

proizvodnju jaja, dok plavo i zeleno nema neki poseban u inak (El Halawani, 2009.; Huber-Eicher i sur., 2013.). Plavo i zeleno svjetlo bolji u inak ima na rast tovnih pili a(Rosenboin i sur., 2004.). U prvom i drugom ciklusu nesivosti utjecaj boje svjetla vrlo je zna ajan s najve im brojem jaja u skupini s crvenim svjetlom, ali valja re i da su jaja kokoši izloženih plavom i zelenom svjetlu bila ve a(Pyrzak i sur.,1987.). Crvena boja valne duljine 630 nm superiorna je za nesivost u odnosu na ostale nijanse crvene boje (El Halawani, 2009.; Huber-Eicher i sur., 2013.). Nadalje, dobar u inak plavog svjetla na prirast pili a i purana u tovu istražen je i potvr en u više eksperimenata, kao i njegov relaksiraju i u inak na perad (Levenick i Leighton, 1988.). El Halawani (2013.) istražio je djelo-vanje više boja svjetlosti tijekom dnevnog ciklusa i utvrdio da je programirana LED rasvjeta koja tijekom dana emitira crvenu i plavu svjetlost najbolja za proizvodne perfor-manse jata. Intenzitet ili svjetlina svjetla koja je zasebna komponenta boje podjednako je važna za nesivost (Rosenboim i sur., 1998.). Fairchild (2007.) zaklju uje nakon pokusa s nesilicama da intenzitet svjetla nije važan imbenik za nesivost, jer kokoši nesu kod 5 isto kao i kod

20 luxa. No, novije istraživanje (El Halawani, 2009.) pokazalo je da crveno LED svjetlo valne duljine 630 nm s intenzitetom svjetla 30 luxa ima najbolji u inak na nesivost. U tijeku istraživanja koje je trajalo 27 tjedana nesivosti u jatu od 10 000 nesilica ostvario je zna ajno ve ibroj jaja u odnosu na druge kokoši koje su osvjetljavane iz drugih izvora svjetla. Zanimljivo istraživanje napravili su Borille i sur. (2013.) u kojem su usporedili nesivost, potrošnju hrane i težinu jaja kod nesilica (112 dana) izloženih razli itim bojama LED rasvjete i klasi nih žarulja sa žarnom niti. Rezultate prikazujemo u tablici 3.

Tablica 3. Proizvodni rezultati nesilica kod razli itog izvora i boje svjetlosti

Table 3. Laying hen productivity at different light sources and light colors

Izvor svjetla Prosje nanesivost u %

Prosje na potrošnjahrane u

gramima/dnevno

Prosje natežina jaja u

gramima

LED plavo 89,14 114 62,23

LED žuto 89,21 117 61,55

LED zeleno 86,84 113 62,40

LED crveno 92,18 115 63,07

LED bijelo 91,95 116 63,64

Klasi nažarulja 91,58 115 63,80

O ito je iz tablice 3. da su kokoši pri LED bijelom i crvenom svjetlu kao i one kod klasi nih žarulja imale


gotovo iste proizvodne rezultate. Perad je vrlo osjetljiva na male razlike u valnim duljinama kao i na njihov intenzitet osvijetljenosti. To se veoma dobro vidi u starijim istraži-vanjima u tovnih pili a, pri emu su korištene svjetlosti razli itih valnih duljina s razli itim intenzitetom svjetla (Foss i sur., 1972.; Wabeck i Skoglund, 1974.; Johnson i sur., 1982.). Utvr en je bolji porast tjelesne mase u pili akoji su bili izloženi svjetlu s nižim valnim duljinama koje se približavaju ili jesu u plavom spektru svjetla. Istodobno je primije eno da su ti pili i bili mirniji i imali bolju konverziju hrane. Novije i detaljnije istraživanje s mono-kromatskim LED svjetlom i obi nim klasi nim žaruljama u tovnih pili a obavili su Rosenboim i sur. (1999.). Najbolje tjelesne mase ostvarili su pili i izloženi svjetlosti valne duljine 480 i 560 nm. U pokusu s tovnim puranima Levenick i Leighton (1988.) ustvrdili su da primjena razli itog intenziteta svjetla (od 5 do 85 luxa) nije imala utjecaja na porast purana i da on ovisi o primijenjenoj valnoj duljini odnosno boji svjetla. Prate i porast tjelesne mase u pili a izloženih zelenom, naran astom, žutom i crvenom svjetlu Smith i Phillips (1959.) zamijetili su najbolji porast u pili a izloženih zelenom svjetlu. Delabbio (2014.) navodi da su pili i (20 000) izloženi LED rasvjeti ostvarili 3% ve u tjelesnu masu i za 3 g bolju konverziju od pili a pod rasvjetom s klasi nim žaruljama (tablica 4.).

Tablica 4. Proizvodni rezultati pili a u tovu kod razli itih izvora svjetlosti

Table 4. Broiler productivity at different light sources

Izvor svjetla Dani tova Prosje na

tjelesna masa u kg

Konverzija u kg

Klasi na žarulja 49 2,57 1,94 LED rasvjeta 49 2,66 1,91

Dakle, moglo bi se zaklju iti da je u tovu pili a najbolje koristiti svjetlo od plavog ka zelenom spektru (od 480 do 560 nm), a intenzitet svjetla nema nekog utjecaja na rast tovne peradi. Za nesilice je optimalno koristiti crveno svjetlo (od 630 nm) uz intenzitet svjetla od 30 luxa. Nadalje, kao što navode Lewis i Morris (2000.), utjecaj boje svjetlosti bolje se manifestira ako se koriste rasvjetna tijela s emisijom monokromatske svjetlosti, a ne ona sa širokim spektrom boja.

Rasvjeta u peradnjacima

Ve duže vrijeme istražuju se razli ite vrste rasvjetnih tijela, zapravo kvaliteta svjetla koju ona emitiraju ( isto aboje svjetla i intenzitet osvijetljenosti) i njegov utjecaj na ponašanje, proizvodnost i zdravstveno stanje u peradi. Uporaba puno njih je pogrešna, jer one nemaju odgovara-ju u temperaturu boje (boja svjetlosti koju isijava rasvjetno tijelo izražava se stupnjevima Kelvina) i intenzitet koji bi na pravi na in aktivirali neurohormonski sustav kokoši. Neobi no je važno obratiti pozornost na temperaturu boje koju rasvjetna tijela imaju, jer nam ona govori koji spektar boje svjetlosti se emitira iz njih.

2500-2700 K jako toplo svjetlo prema crvenom 3000-3500 K toplo svjetlo prema žutom 4000-4500 K od toplog prema hladnom svjetlu 5000-5500 K ljetno popodne 6000-6500 K bijelo hladno svjetlo 7000-9000 K hladno od bijelog prema plavom svjetlu

No, nije dovoljno obratiti pozornost samo na temperaturu boje, nego i na valnu duljinu koja preciznije govori o boji svjetlosti pa se i istraživanja obnašaju koriste i svjetlo s odre enom valnom duljinom. Zapravo iz gornjeg prikaza vidi se da temperatura boje govori više o toplini i hladno isvjetla (asocijacija na toplinu ili hladno u) i samo ugrubo iskazuje boju svjetla. Nadalje, neki istraživa i su mišljenja da bi trebalo koristiti rasvjetna tijela koja bi emitirala svjetlost na temelju pti je, a ne ljudske percepcije svjet-losti, jer okolina kako je vidi ptica bitno se razlikuje od one kako je vidi ovjek (Delabbio, 2014.). Veoma je važno za provedbu optimalnog svjetlosnog programa koji tip rasvjetnih tijela valja postavljati u peradarske nastambe za pojedine proizvodne kategorije peradi. Posljednje spoznaje do kojih se došlo na temelju istraživanja proizvodnosti, ponašanja i zdravlja ptica dosta su jasno odredile koju boju svjetla za pojedine proizvodne kategorije treba koristiti, koji intenzitet svjetla i kakav tip rasvjetnih tijela. Budu ida se rasvjetna tijela sa širim spektrom boja nisu pokazala dobrima, valja se preorijentirati na ona koja emitiraju monokromatsko svjetlo (ciljanu boju svjetla, jednu ili programiranu). U puno istraživanja u kojima su kao izvori svjetla korištene klasi ne žarulje, fluorescentno svjetlo, halogena rasvjetna tijela, LED svjetlo i neka druga najbolje

Tablica 5. Utrošak energije i hrane kod razli itih sustava rasvjete Table 5. Energy and food utilization in different lighting systems

Sustav rasvjete Energija W po objektu Hrana kg po danu Klasi na žarulja 1300

(100 žarulja od 13 W po objektu) 1725

(115g dnevno x 15000) LED rasvjeta 1080

(0,216 W po kavezu x 5000 kaveza) 1605

(107g dnevno x 15000) Ušteda u % 17 7


djelovanje na performanse, ponašanje i zdravlje peradi imala su LED (engl. light emitting diodes) rasvjetna tijela. Tako, uspore uju i potrošnju energije i utrošak hrane u jednom proizvodnom ciklusu konzumnih nesilica (15 000) osvjetljavanih konvencionalno (klasi ne žarulje sa žarnom niti) i onih pod LED rasvjetom, Rozenboim i sur. (1998.) dobivaju 7% uštedu u hrani i 17% uštedu energije rasvjete u objektu s LED rasvjetom (tablica 5.). Ove injenice i prije navedene spoznaje koje se odnose na proizvodnost, ponašanje i zdravlje peradi kod razli itih izvora svjetla nedvojbeno ukazuju na nužnost ugradnje LED rasvjete u naše peradarske nastambe. Naravno, pritom valja postavljati LED lampe s bojom i intenzitetom svjet-losti koja najviše odgovara proizvodnoj kategoriji peradi. Ne treba zanemariti ni injenicu da su LED lampe eko-nomi nije, jer uz to što troše manje energije imaju i puno duži rok iskorištavanja (do 70 000 sati) od dosad korištenih rasvjetnih tijela (do 1000 sati).

Literatura

ANDREWS, D. K., N. G. ZIMMERMAN (1990): A comparison of energy efficient house lighting source and photoperiods. Poult. Sci. 69, 1471-1479.

BENOIT, J. (1964): The role of the eye and of the hypothalamus in the photostimulation of gonads in the duck. Ann. N. Y. Acad. Sci. 117, 204-215.

BORILLE, R., R. G. GARCIA, A. F. B. ROYER, M. R. SANTANA, S. COLET, I. A. NAAS, F. R. CALDARA, I. C. L. ALMEIDA PAZ, E. S. ROSA, V. A. R. CASTILHO (2013): The use of light-emitting diodes in commercial layer production. Rev. Bras. Cienc. Aric., vol. 15, 2013.

BOSHOUWERS, F. M., E. NICAISE (1987): Physical activity and energy expenditure of laying hens affected by light intensity. Br. Poult. Sci. 28, 155-163.

CHARLES, D. R. (1984): A model of egg production. Br. Poult. Sci. 25, 309-321.

DELABBIO, J. (2014): The science of poultry lighting. Once Innovations Inc. http://www.onceinnovations.com/wp/wp-content/uploads/2014/10/Once_WhitePapers_Energy-Savings-in-Poultry-Farming.pdf

EL HALAWANI, M. F. (2009): Light intensity requirement for breeder hen turkeys. Gobbles, 66 (4),6-7.

EL HALAWANI M. F. (2013): Light spectrum requirement for maximizing breeder hen turkey egg production. Gobbles, 70 (4), 6-8.

FIROUZI, S., H. H. NAZARPAK, H. HABIBI, S. S. JALALI, Y. NABIZADEH, F. REZAEE, R. ARDALI, M. MARZBAN (2014): Effects of color light on performance, immune response and hematological indices of broilers. J. World Poult. Res. 4(2), 52-55.

FAIRCHILD, B. (2007): Lighting programs for backyard egg production. The poultry site, September 2007. The University of Georgia.

FOOS, D. C., L. B. CAREW, E. L. ARNOLD (1972): Physiological development of cockerels as influenced by selected wavelengths of environmental light. Poult. Sci. 51, 1922-1927.

HARRISON, P. C., J. D. LATHSAW, J. M. CASEY, J. McGINNIS (1970): Influence of decreased length of different

spectral photoperiods on testis development of domestic fowl. J. Reprod. Fertil. 22, 269-275.

HART, N. S., J. C. PARTRIDGE, I. C. CUTHILL (1999): Visual pigments, cone oil droplets, ocular media and predicted spectral sensitivity in the domestic turkey. Vision Res. 39, 3321-3328.

HUBER-EICHER, B., A. SUTER, P. SPRING-STAHLI (2013): Effects of colored light-emitting diode illumination on behavior and performance of laying hens. Poult. Sci. 92, 869-873.

JOHNSON, A. L., D. C. FOSS, L. B. CAREW (1982): Effect of selected light treatments on pineal weight and lipid content in the cockerel. Poult. Sci. 61, 128-134.

LEVENICK, C. K., A. T. LEIGHTON (1988): Effects of photoperiod and filtered light on growth, reproduction and behaviour of turkey. Poult. Sci. 67, 1505-1513.

LEWIS, P. D., T. R. MORRIS (2000): Poultry and coloured light. World Poult. Sci. J. 56 (3), 189-207.

LEWIS, P. (1988): How light affects the reproductive system. World Poultry, October,1988.

MENAKER, M., H. UNDERWOOD (1976): Extraretinal photoreception in birds. Photophysiology 23, 299-306.

NORTH, M. O., D. D. BELL (1990): Lighting management. Pages 407-451 in Chicken production manual. Chapman and Hall, NY.

NUBOER, J. F. W. (1993): Visual ecology in poultry houses. In: Fourth European Symposium on Poultry Welfare, UFAV, Potters Bar, pp. 39-44.

NUBOER, J. F. W., M. A. J. COEMANS, J. J. VOS (1992): Arti-ficial lighting in poultry houses. Br. Poult. Sci. 33, 135-140.

PHILIPS LIGHTING (1988): Correspondence course lighting application. Vision 3,4. Light and radiation.

PRESCOTT, N. B., C. M. WATHES (1999): Spectral sensitivity of the domestic fowl. Br. Poult. Sci. 40, 332-339.

PYRZAK, R., G. SNAPIR, G. GOODMAN, M. PEREK (1987): The effect of light wavelength on the production and quality of eggs of the domestic hen. Theriogenology, 28, 947-960.

RODENBOOG, H. (2001): Sodium, green, blue, cool or warm-white light. World Poult. 17, 22-23.

ROZENBOIM, I., E. SILBERMAN, G. GVARAHU (1998): New monochromatic light source for laying hens. Poult. Sci. 77, 1695-1698.

ROZENBOIM, I., I. BIRAN, Z. UNI, B. ROBINSON, O. HALEVY (1999): The effect of monochromatic light on broiler growth and development. Poult. Sci. 78, 135-138.

ROZENBOIM, I., I. BIRAN, Y. CHAISEA, S. YAHAV, A. ROSENSTRAUCH, D. SKLAN, O. HALEVY (2004): The effect of green and blue monochromatic light combination on broiler growth and development. Poult. Sci. 83, 842-845.

SCOTT, R. P., L. F. PAYNE (1937): Light in relation to the experimental modification of the breeding season of turkeys. Poult. Sci. 16, 90-96.

SMITH, L. T., R. E. PHILLIPS (1959): Influence of colored neon light on feed consumption in poultry. Poult. Sci. 38, 1248.

WABECK, C. J., W. C. SKOGLUND (1974): Influence of radiant energy from fluorescent light sources on growth, mortality and feed conversion of broilers. Poult Sci. 53, 2055-2059.

WOODARD, A. E., J. A. MOORE, W. O. WILSON (1969): Effect of wave length of light on growth and reproduction in Japanese quail. Poult. Sci. 48, 118-123.


XIE, D., Z. W. WANG,Y. L. DONG, J. CAO, J. F. WANG, J. L. CHEN, Y. X. CHEN (2008): Effects of monochromatic light on immune response of broilers. Poult. Sci. 87, 1535-1539.

YOSHIZAWA, T. (1992): The road to colour vision: structure, evolution and function of chicken and gecko visual pigments. Photochem. Photobiol. 56, 859-867.

WHAT SHOULD WE KNOW ABOUT LIGHTING IN POULTRY PRODUCTION

Summary

Different light sources and colors are currently used in poultry housings implementing the lighting program as an important part of production technology, which leads to confusion in poultry farmers. This is additionally increased by equipment manufacturers offering various lighting fixtures and assuring poultry farmers that theirs are superior to others. The price andlife of lighting fixtures generally determine the choice, while the characteristics of the light emitted by the respective lighting fixture and which type is more appropriate to achieve better poultry productivity and health are less decisive. In fact, until recently, neither science could specify how the color and intensity of light influence the neurohormonal, physiologic and immune activities of poultry. In poultry farming, lighting is one of the most important technologic factors for meat and egg production. Hormonal activity and anabolic processes in poultry are stimulated by use of regular lighting cycles and applying appropriate light color and intensity, which then manifests as good weight gain or good layer productivity. Using particular technologic procedures (e.g., lighting and feeding program) produces the sense of various seasons associated with enhanced or reduced physiologic activity in poultry, which, of course, depends on the poultry production category. Accordingly, it implies influence upon and control of the animal neurohormonal activity viaenvironmental factors. Therefore, it is of utmost importance to be familiar with the effects of light and its properties on poultry, whereby the color, rhythm, duration and intensity of light have a prominent role. The choice of lighting fixtures of known characteristics is highly relevant for better productivity, while paying due attention to electric power saving and cost of lighting fixtures, although it should not be the main argument on making this decision.

Key words: poultry, lighting, light color and intensity, productivity, health

PERADARSKI DANI 2015.32

ZNA AJ PATOGENIH PLIJESNI U PERADARSTVU

Marijana Sokolovi , Borka Šimpraga, Fani Krstulovi , Marija Berendika


SAŽETAK Bolesti uzrokovane patogenim plijesnima rje e se pojavljuju od bakterijskih i virusnih infekcija, ali mogu uzrokovati zna ajne gubitke u peradarstvu bilo zbog infekcija samim plijesnima (mikoze) ili kao posljedica toksi nog djelovanja sekundarnih metabolita – mikotoksina (mikotoksikoze). Naj eš i uzro nici bolesti u peradi su ubikvitarne plijesni rodova Aspergillus, Penicillium i Fusarium te rje e rodova Microsporum i Trichophyton. Ponekad i pojedine vrste kvasaca (Candida i Cryptococcus) mogu uzrokovati bolesti u ptica. Simptomi su esto nespecifi ni, ali primjenom ciljanih metoda dijagnostike mogu a je brza i to na dijagnoza. U inkovite preventivne i kontrolne mjere jedini su pravi pristup u sprje avanju ovih infekcija i toksikoza. U radu e biti opisani naj eš i uzro nici mikoza i mikotoksikoza u peradi, njihova dijagnostika te pregled mjera kojima se može umanjiti njihov nepovoljan u inak za zdravlje i proizvodnost peradi.

Klju ne rije i: patogene plijesni, mikoze, mikotoksikoze, mikotoksini, perad

Uvod

Kvasci, makroskopske filamentozne gljive i višestani nefilamentozne plijesni su zbog specifi nog na ina ishrane, neposjedovanja klorofila, karakteristi ne strukure i sastava stani ne stijenke svrstani u zasebno kraljevstvo Gljiva (Fungi). Prema dostupnim podacima iz literature procjenjuje se da postoji oko milijun i pol razli itih vrsta gljiva od kojih je svega mali broj (oko 5%) detaljno opisan. Kvasci su jednostani ni organizmi koji se razmnožavaju pupanjem, važni su u biotehnologiji, ali i kao potencijalni oportunisti ki uzro nici infekcija u imuno kompromitiranih ljudi i živo-tinja. Za razliku od makroskopskih filamentoznih gljiva koje proizvode micelij ispod zemlje i vidljiva (ne)jestiva plodišta ili sporofore (stru ak i klobuk), višestani ne filamentozne plijesni naj eš e su prisutne u tlu, zraku, biljkama i mrtvoj organskoj tvari, a svega manji broj može uzrokovati bolesti u ljudi i životinja. Plijesni su gra ene od dugih filamenata (hyphae) koji tijekom rasta tvore mrežu nazvanu micelij. Probavni enzimi koji se izlu uju s vrhova hifa služe za raz-gradnju organske tvari u manje molekule koje im služe za ishranu. Neke hife tvore zra ni micelij i stvaraju spore (strukture sa zaštitnim omota em) koje služe za razmnožavanje i širenje (Hawksworth, 2001.). Iako rje e od bakterijskih i virusnih infekcija patogene pli-jesni mogu uzrokovati zna ajne gubitke u peradarstvu bilo zbog infekcija tkiva samim plijesnima (mikoze) koje infi-

ciraju organizam putem sluznica, kože i respiracijskog su-stava ili kao posljedica toksi nog djelovanja sekundarnih metabolita – mikotoksina (mikotoksikoze) nakon ulaska mikotoksina u organizam (naj eš e hranom, putem kože ili respiracijskim putem). Mikotoksikoze za razliku od mikoza nisu zarazne.

MIKOTOKSIKOZE. Mikotoksini su sekundarni metabo-liti plijesni esto prisutni u žitaricama i hrani. Identificano je više od 400 mikotoksina, molekula male molekularne mase razli ite kemijske strukture, koji mogu uzrokovati niz raz-li itih simptoma od imunosupresije, slabijeg uzimanja hrane, slabijeg prirasta i drugih proizvodnih rezultata, a u nekim slu ajevima mogu uzrokovati i smrt. U peradi su opisana otrovanja mikotoksinima koje naj eš e proizvode plijesni rodova Aspergillus, Penicillium, Fusarium, odnosno otro-vanja aflatoksinima, fuzarijskim toksinima (T-2/HT-2 tok-sin, deoksinivalenol, diacetoksiscirpenol, fumonizini), ohra-toksinom, zearalenonom te rje e drugim mikotoksinima. Pojedina plijesan može proizvoditi više razli itih miko-toksina, a pojedine mikotoksine može proizvoditi više patogenih pijesni. Navedeni toksini, ovisno o dozi, trajanju izloženosti te dobi i zdravstvenom stanju životinje mogu djelovati akutno i kroni no te imati hepatotoksi an,nefrotoksi an, neurotoksi an i genotoksi an u inak (tablica 1.) (Leeson, 1995.; Bennet i Klich, 2003.; Hoerr, 2008; Sokolovic i sur., 2008.).

dr. sc. Marijana Sokolovi , dr. med. vet, Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Henizelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; Tel.: +385(0)12441-394; Faks: +385(0)12441-396; e-mail: [email protected]

ZNA AJ PATOGENIH PLIJESNI U PERADARSTVU 33

Tablica 1. Najzna ajniji mikotoksini, plijesni koje ih proizvode i simptomi koje uzrokuju u peradi

Mikotoksin Plijesni koje ih proizvode U inci u peradi Aflatoksin A. flavus

A. parasiticu A. nomius A. tamarii A. pseudotamarii A. bombycis A. ochraceoroseus

Smanjeni unos hrane i slabiji prirast, anoreksija, depresija, ataksija,imunosupresija, pove ana smrtnost, hepatotoksi nost, karcinogenost,teratogenost, atrofija i hepatomegalija jetre i bubrega, slabija pigmentiranostkože, neurološki simptomi, smanjena proizvodnja i težina jaja.

Ohratoksin A. ochraceus A. carbonariusP. verrucosum P. palitans

Smanjeni prirast, karcinogenost, teratogenost, ošte enje jetre i bubrega,pove ana smrtnost, slabija pigmentiranost kože, slabija proizvodnja jaja, jajaslabije kvalitete (manja jaja, mrlje na ljuski).

Zearalenon F. roseum F. graminearum F. culmorum F. equiseti F. crookwellense

Smanjeni prirast i proizvodnja jaja, poreme aji u reprodukcijskom sustavu.

Fumonizin F. moniliforme F. verticillioides F. proliferatum F. nygamai F. anthophilum F. dlamini F. napiforme Alternaria spp.

Smanjeni unos hrane, slabiji prirast i proizvodnost, imunosupresivnost,pove ana smrtnost.

T-2/HT-2 toksin F. sporotrichioides F. graminearum Fusarium spp.StachybotrysTrichotheciumTrichoderma Myrothecium

Odbijanje hrane, slabiji unos hrane i prirast, imunosupresija, smanjenaproizvodnja jaja, lezije na sluznici usta i probavnog sustava, nakostriješenostperja, neurološki simptomi.

Diacetoksiscirpenol Deoksinivalenol

Table 1. The most important mycotoxins, moulds that produce them and symptoms in poultry

Mycotoxin Producing mould Effects in poultry Aflatoxin A. flavus

A. parasiticu A. nomius A. tamarii A. pseudotamarii A. bombycis A. ochraceoroseus

Reduced feed intake and weight gain, anorexia, depression, ataxia,immunosupression, increased mortality, hepatotoxicity, carcinogenicity,teratogeny, atrophy and hepatomegaly of liver and kidney, reduced skinpigmentation, neural symptoms, reduced production, quality and egg weight.

Ochratoxin A. ochraceus A. carbonariusP. verrucosum P. palitans

Reduced weight gain, carcinogenicity, teratogeny, lesions of liver and kidney,increased mortality, reduced skin pigmentation, reduced production, size andquality of eggs (shell sports).


Mycotoxin Producing mould Effects in poultry Zearalenone F. roseum

F. graminearum F. culmorum F. equiseti F. crookwellense

Reduced weight gain and egg production, impaired reproductive system.

Fumonisin F. moniliforme F. verticillioides F. proliferatum F. nygamai F. anthophilum F. dlamini F. napiforme Alternaria spp.

Reduced feed intake and weight gain and productivity, immunosupression,increased mortality.

T-2/HT-2 toxin F. sporotrichioides F. graminearum Fusarium spp.,StachybotrysTrichotheciumTrichoderma Myrothecium

Feed refusal, reduced feed intake and weight gain, immunosupression, loweregg production, oral lesions, lesions in the mucosa of the digestive system,ruffled feathers and neural disturbances.

Diacetoxyscirpenol Deoxynivalenol

Kontaminacija mikotoksinima nastaje u polju i/ili tijekom transporta i pohrane žitarica u odgovaraju im uvjetima okoliša (visoka vlaga, temperatura, ošte enje zrna i drugo). S obzirom na toksi nost i u estalost za aflatoksine, deo-ksinivalenol, zearalenon, fumonizine i ohratoksin A u zemljama Europske Unije vrijede pravilnici i preporuke o najve im dopuštenim koli inama u hrani i hrani za životinje. Navedeno je važno osobito zbog este istodobne prisutnosti više mikotoksina (75%-100% ispitanih uzoraka hrane i hrane za životinje) te pritom i niske doze više razli itih mikotoksina mogu nepovoljno utjecati na zdravlje životinja. Dijagnostika mikotoksikoza postavlja se na temelju pojave simptoma kao što su: smanjeni unos hrane, odbijanje hrane, slabiji prirast, nakostriješenost perja, neurološke smetnje, poreme aji u proizvodnji i kvaliteti jaja. To na dijagnoza mogu a je tek kombinacijom anamneze, klini ke i pato-anatomske pretrage. Nalaz mikotoksina u hrani (primjenom imunoenzimskih testova i kromatografskim metodama), na-ro ito u nedozvoljenim koli inama, dobar je indikator poten-cijalne kontaminacije i olakšava dijagnostiku mikotoksikoza (Streit i sur., 2012.; EFSA, 2014.; Sokolovi i sur., 2015.). Kako specifi nog lije enja nema, u praksi se esto pri-mjenjuju razli iti postupci dekontaminacije hrane: fizikalne mjere (ljuštenje, separacija, sortiranje, ispiranje, hidroter-mi ka obrada i drugo), kemijska detoksikacija (uporaba sredstava kao što su: kalcij hidroksid, amonij hidroksid, monomietilamin, natrij bisulfit, klor, vodikov peroksid, askorbinska, klorovodi na i benzojeva kiselina, bakar sulfat i drugo) te biološka detoksikacija (primjena mikroorga-nizma, enzima i pripravaka proizvedenih od stani ne stijenke kvasca Saccharomyces cervisiae). Uz navedeno, u hranu se esto dodaju i razli ite mineralne gline (bentonit,

zeolit, aluminosilikat) koje s više ili manje uspjeha adsor-biraju neželjene toksine u hrani za životinje (Grbeša i sur., 2014.). Ipak, preventivne mjere jedina su mogu nostsprje avanja neželjenog u inka mikotoksina, a uklju uju primjenu dobre proizvo a ke prakse, redovitu kontrolu i uporabu kvalitetnih nekontaminiranih žitarica i gotove hrane, primjenu odgovaraju ih higijenskih mjera kao i svih ostalih mjera koje osiguravaju pravilan rast i razvoj zdravih životinja.

MIKOZE. Osnovni preduvjeti za nastanak infekcija pato-genim plijesnima u uzgoju peradi su toplina, slabo provjetra-vanje peradnjaka, prisutnost vlage u okolišu (vlažna stelja) te neodgovaraju i higijenski uvjeti. Nadalje, neodgovaraju aprehrana, prisutnost drugih bolesti i pretjerana uporaba antimikrobnih pripravaka koji oslabljuju imunitet ptica predisponiraju i su imbenici za nastanak mikoza. Infekcije su naj eš e sporadi ne, iako ponekad može istodobno obo-ljeti i velik broj životinja. Na pojavnost i širenje infekcija plijesnima utje u vremenske prilike te je uo ena sezonska varijacija pojavnosti infekcija (naj eš e su u prolje e i jesen) (Young i sur., 1998.; De Lucca, 2007.; Charlton i sur., 2008.; Khosravi i sur. 2008.; Soliman i sur., 2009.). Plijesni mogu imati akutan i kroni an u inak na zdravlje peradi. Akutna pojava bolesti nastaje pri inhalaciji velike koli ine spora. Pritom naj eš e dolazi do visokog pobola i smrtnosti u mladih životinja i to naj eš e unutar 24-48 sati od nastanka infekcije. Kroni ni oblik se javlja sporadi no,est je u odraslih životinja, a obilježava ga imunosupresija,

nespecifi ni znakovi bolesti i zna ajni ekonomski gubici. Od infekcija patogenim plijesnima u peradarstvu su najzna-ajnije aspergiloza i kandidijaza, dok povremeno može do i


i do drugih gljivi nih infekcija uzrokovanih plijesnima iz rodova Microsporum i Penicillium. Dodatno zna enje ima potencijalna opasnost širenja rezistencije plijesni na antifun-galne lijekove koja se sve eš e pojavljuje u izoliranih vrsta. Do navedenog dolazi zbog izlaganja životinja i/ili ljudi antifungalnim lijekovima i zbog stjecanja rezistencije putem okoliša (izlaganje plijesni azolnim fungicidima koji se koriste u poljoprivredi) (Charlton i sur., 2008.; Howard i sur., 2009.; Verwej i sur., 2009.).

Aspergiloza. Plijesni roda Aspergillus ubikvitarni su orga-nizmi i naj eš i su uzro nici mikoza u peradi i drugih ptica. Bolest redovito uzorkuju plijesni Aspergillus fumigatus, A. flavus, A terreus i A. niger. Do obolijevanja dolazi kon-taminiranom hranom ili fecesom u specifi nim uvjetima okoliša (toplina, vlaga i strujanje zraka) i inhalacijom spora. Respiracijska infekcija naj eš i je oblik bolesti, koji se vrlo asto javlja u pura (Gründer i sur., 2005.; Silvanose i sur.,

2006.; Balajee, 2009.; Beernaert i sur., 2010.; Dhama i sur., 2013.). Mlade životinje su u pravilu osjetljivije, a infekcije su akutne s visokim pobolom i smrtnoš u ( ak i do 90% jata). Tako je u pojavi aspergiloze uzrokovane kontaminiranim fecesom uginula tre ina jata pura (Dyar i sur., 1984.; Charlton i sur., 2008.). U istraživanju Richarda i suradnika (1983), deset-minutno izlaganje puri a aerosolu konidija A.fumigatus uzrokovalo je nalaz 5x105 CFU/g kolonija u tkivu plu a i smrtnost od 50% unutar nekoliko dana od izlaganja. Prema nekim autorima, prisutnost velikih koli ina željeza smatra se predisponiraju im imbenikom nastanka ove bo-lesti (Kapetanov i sur., 2011.). U starijih životinja asper-giloza je eš e kroni nog karaktera s atipi nim simptomima kao što su otežano disanje (dispneja), disanje otvorenim ustima (zbog opstrukcije diših puteva), letargija, dehidracija i nastanak neuroloških smetnji (ataksija, konvulzije, pareza i šepanje). Tako er se može javiti vodenasti proljev, gubitak na težini i ošte enje o iju. Kod subakutnog oblika koji se razvije unutar deset dana od infekcije (u ptica do dva tjedna starosti) simptomi su blaži, a uo ena je anemija, dok se patoanatomski mogu na i to kaste žute lezije u plu ima i zra nim vre icama, rast zelene plijesni u šupljinama i krvnim žilama, gnoj u bronhiolama te granulomi u drugim organima. Kroni ni oblik obilježavaju plu ni granulomi, di-latacija ventrikula i ascites, što se o ituje insuficijencijom plu a, neurološkim simptomima (tupost i letargija) te ponekad i kožnim oblikom (nekroti ni granulomatozni dermatitis) (Okoye i sur., 1989.; Akan i sur., 2002.; Throne Steinlage i sur., 2003.; Atasever i sur., 2004.; Cortes i sur., 2005.; Zafra i sur., 2008.; Cacciuttolo i sur., 2009.). Dijagnoza se postavlja na temelju anamneze, klini kih znakova, biokemijskih, seroloških i patoanatomskih pretraga te izdvajanjem uzro nika i to iz više organa životinje istodobno (Jones i Orosz, 2000.; Franca i sur., 2012.). Problem predstavljaju nespecifi ni znakovi bolesti, jer ovise o tome koji je organ zahva en. Zbog otežane dijagnostike i relativno slabog u inka terapije prognoza nije povoljna. U novije vrijeme sve je ve i broj izvještaja o otporonosti

(rezistentnosti) mikroorganizama na antimikrobne priprav-ke, što dodatno umanjuje uspjeh terapije. Ve ina plijesni iz roda Aspergilus osjetljiva je na vorikonazol u niskim kon-centracijama, otporna na itrakonazol, dok se otpornost na amfotericin B u niskim koncentracijama pove ava tijekom terapije (Silvanose i sur., 2006.; Walsh i sur., 2008.; Snelders i sur., 2009.; Ziolkowska i sur., 2014.). Stoga je preventiva najbolja preporuka za sprje avanje nastanka aspergiloze i uklju uje primjenu dobre proizvo a ke prakse s naglaskom na higijenu nastambe i hrane, odgovaraju uventilaciju i uklanjanje potencijalnih stresora u uzgoju životinja.

Kandidijaza (monilijaza ili trush) je gljivi na bolest pro-bavnog sustava peradi uzrokovana kvascem Candida albicans, koja se kao oportunisti ka infekcija javlja u mla ih i imunokompromitiranih ptica (zbog stresa, loših higijenskih uvjeta i/ili prisutnosti drugih infekcija). Vrste roda Candidanormalni su stanovnici mikroflore probavnog sustava ljudi, životinja i ptica. Prema istraživanjau Wyatta i Hamiltona (1975.) ovi kvasci su izdvojeni iz 32,3% pretraženih voljki ptica. Candida albicans naj eš i je uzro nik bolesti, ali su u bolesnih i zdravih ptica izdvojene i druge vrste: C. brumptii,C. catenulata, C. famata, C. guilliermondii, C. ravautii, C. parapsilosis, C. rugosa, C. salmonicola i C. tropicalis. Kako je uzro nik komenzal, do infekcije naj eš e dolazi oralnim putem bilo zbog promjene u endogenoj mikroflori životinje ili infekcije putem kontaminiranog fecesa, hrane i/ili vode. Bolest je uo ena u peradi i drugih ptica i pojavljuje se sporadi no, ali može uzrokovati zna ajne ekonomske gu-bitke. Pobol i smrtnost uglavnom su niski, iako su opisani i slu ajevi u pili a i pura u kojih je smrtnost iznosila 20%-40%. U slu ajevima kada je obolio velik broj životinja redoviti uzrok bila je niska higijena ili pojava drugih infekcija (Mayeda, 1961.; Wyat i Hamilton, 1975.; Moretti i sur., 2000.; Charlton i sur., 2008.). Klini ki znakovi bolesti redovito su nespecifi ni: smanjeno uzimanje hrane, slabiji prirast, pove ana že , proljev, depre-sija i ravnodušnost. U nekim slu ajevima mogu se uo iti dermatitis i nakostriješenost perja. U slu ajevima kada je kandidijaza sekundarna infekcija simptomi druge bolesti bolje su izraženi te time otežavaju dijagnostiku bolesti. Kao što je ve spomenuto, mlade životinje (do etiri tjedna starosti) su osjetljivije i smrtnost u te dobne kategorije je viša (Charlton i sur., 2008.). Dijagnoza se postavlja na temelju anamneze, patoanatom-skog nalaza (npr. nalaz bijelih žarišnih ili difuznih bijelo-sivih naslaga (plakova) u sluznici usta, jednjaka, voljke, predželudca i crijeva; površinske nekroze i upala sluznice i nekroza jetre). Kona na dijagnoza postavlja se izolacijom uzro nika mikrobiološkim metodama, mikroskopskom iden-tifikacijom (nalaz karakteristi nih hifa i spora) te primjenom potvrdnih asimilacijskih testova i molekularnih metoda (Ramani sur., 1998.; Kemoi i sur., 2013.). Lije enje se u peradi provodi primjenom bakrenog suflata i antimikotika, ali najzna ajnija je primjena preventivnih mjera budu i da je uzro nik esto otporan na ve inu sred-


stava za dezinfekciju. Stoga je nužno primijeniti mjere dobre proizvo a ke prakse uklju uju i redovito održavanje hi-gijene u peradnjaku, kontrolu hrane i vode za pi e te uklanjanje ostalih potencijalnih stresora (smanjiti uporabu antibiotika) koji pogoduju nastanaku ove bolesti.

Mikrosporoza (dermatofitoza, dermatomikoza ili favus) je kontagiozna gljivi na infekcija uzrokovana filamentoznim keratinofilnim plijesnima Microsoprum, plijesnima koje naj eš e uzrokuju lezije na koži i prenose se izravnim kontaktom na druge životinje i ljude. Uzro nik bolesti je Microsporum gallinae, rje e Microsporum gypseum iTrihcophyton simii. Ove gljivice su normalno prisutne u tlu i uzrokuju sporadi ne infekcije u ekstenzivno držane peradi. U oboljelih životinja nastaju upalne promjene u obliku bijelih krasta ( esto u obliku prstena) na keratiniziranim dijelovima kože (podru je vrata, kresta, podbradnjaci i distalni dijelovi nogu) te gubitak perja. Širenju bolesti pogoduju loši higijenski uvjeti (vlaga, alkalni pH i prisutnost kisika). Dijagnoza se postavlja na temelju karakteristi nih promjena na koži, patoanatomskim nalazom te mikroskop-skim i kulturalnim dokazivanjem karakteristi nog micelija i spora. U terapiji se naj eš e primjenjuju razli iti antimiko-tici i preventivne higijenske mjere (Gründer i sur., 2005.; Charlton i sur., 2008.; Murata i sur., 2013.; Yamaguchi i sur., 2014.).

Penicilioza je mikoza uzrokovana plijesnima iz roda Penicillium i to naj eš e u ko-infekciji s plijesnima iz roda Aspergillus. Penicillium vrste su vrlo rasprostranjene u okolišu (zrak, tlo, vegetacija) i esto kontaminiraju hranu. Uz to što proizvode ve spomenute mikotoksine mogu u iznimnim slu ajevima uzrokovati infekciju u imunokompro-mitiranih životinja. Do bolesti uglavnom dolazi inhalacijom spora, a simptomi su nespecifi ni: slabiji prirast, proljev, promjene u kvaliteti perja i pove ana iznenadna smrtnost te nalaz invazivnih, hijalih, septiranih micelija u plu ima, zra nim vre icama, jetri i drugim organima. U nekih ptica opisane su i sekundarne infekcije i pojava deformacije kljuna. Toksikogenost plijesni (proizvodnja ohratoksina A, citrinina, rubratoksina ili penicilinske kiseline) dodatna je opasnost od ovih patogenih plijesni. Dijagnoza se postavlja na temelju anamneze, patoanatomskog nalaza, histološke pretrage, a indirektno nalazom patogenih plijesni u hrani i stelji. Kao i kod mikrosporoze, u terapiji se koriste anti-mikotici i preventivne higijenske mjere. Važnost navedenih infekcija je i u opasnosti obolijevanja ljudi bilo putem hrane ili inhalacijom (Aho i sur., 1990.; Bengoa i sur., 1994.; Mans, 2007.; Lanteri u sur., 2011.; Brandão i Beaufrère, 2013.).

Iako je poznato da su i u naizgled zdravih ptica u perju redovito prisutne rzali ite plijesni (npr. Chrysosporium,Trichophyton, Arthroderma, Scopulariopsis, Sepedonium i druge), opasnost za zdravlje životinja je u potencijalnom širenju patogenih organizama i sporadi nim pojavama dru-gih mikoza kao što su kriptokokoza, daktilarioza i triho-

sporonoza. Navedene mikoze opisane su u malom broju slu ajeva i esto su povezane s lošim higijenskim uvjetima te drugim virusnim i bakterijskim uzro nicima bolesti u peradi i drugih ptica. eš e se pojavljuju u ukrasnih ptica te prema dostupnim podacima iz literature nemaju ve e zna-enje u uzgoju i proizvodnji peradi (Londero i sur., 1969.;

Padhye, 1968.; Jansson i sur., 2008; Stoute i sur., 2009.; Shepherd i Fairchild, 2010.; Qaher-Mandeel i sur., 2011.; Wyss i sur., 2015.).

Zaklju ak

Usprkos rje oj u estalosti mikoza i mikotoksikoza, ubikvi-tarna i esta u estalost plijesni kao i prisutnost mikotoksina u hrani i okolišu ukazuje na njihov potencijalni nepovoljni u inak na zdravlje i proizvodnost peradi te rizik nastanka zoonoza. Zbog nepostojanja u inkovite terapije sprje avanjemikoza i mikotoksikoza mogu e je prvenstveno primjenom preventivnih mjera i postupaka dobre proizvo a ke prakse uklju uju i visoke higijenske uvjete u nastambi za uzgoj životinja, uporabu kvalitetne i zdravstveno ispravne hrane za životinje te redovitu kontrolu zdravlja životinja. Zbog velike u estalosti mikotoksina u žitaricama i hrani za životinje esto se iz ekonomskih razloga koriste razli iti postupci

dekontaminacije hrane (fizikalne, kemijske i biološke) te se primjenjuju razli ite mineralne gline. Iako navedeni postupci mogu povoljno utjecati na ja anje otpornosti životinja na patogene plijesni i njihove metabolite, jedino uporaba kvalitetne hrane može sa sigurnoš u isklju iti mogu nostpojave bolesti i ekonomskih šteta u peradarstvu.

Literatura

AHO, R., B. WESTERLING, L. AJELLO, A. A. PADHYE, R. A. SAMSON (1990): Avian penicilliosis caused by Penicilliumgriseofulvum in a captive toucanet. J. Med. Vet. Mycol. 28(5):349-354.

AKAN, M., R. HAZIRO LU, Z. ILHAN, B. SAREYYÜPO LU, R. TUNCA (2002): A case of aspergillosis in a broiler breeder flock. Avian Dis. 46(2):497-501.

ATASEVER, A., K. S. GUMUSSOY (2004): Pathological, clinical and mycological findings in experimental aspergillosis infections of starlings. J. Vet. Med. A. Physiol. Pathol. Clin. Med. 51(1):19-22.

BALAJEE, S. A. (2009): Aspergillus terreus complex. Med. Mycol. 47(Suppl. 1):S42-S46.

BEERNAERT, L. A., F. PASMANS, L. VAN WAEYEN-BERGHE, F. HAESEBROUCK, A. MARTEL (2010): Aspergillus infections in birds: a review. Avian Pathol. 39(5):325-331.

BENGOA, A., V. BRIONES, M. B. LÓPEZ, M. J. PAYÁ (1994): Beak infection by Penicillium cyclopium in a macaw (Ara ararauna). Avian Dis. 38(4):922-927.

BENNETT, J., W. M. KLICH (2003): Mycotoxins. Clin. Microbiol. Rev. 16(3):497-516.

BRANDÃO, J. H. BEAUFRÈRE (2013): Clinical update and treatment of selected infectious gastrointestinal diseases in avian species. J. Exotic Pet Med. 22:101-117.


CACCIUTTOLO, E., G. ROSSI, S. NARDONI, R. LEGROT-TAGLIE, P. MANI (2009): Anatomopathological aspects of avian aspergillosis. Vet. Res. Commun. 33(6):521-527.

CHARLTON, B. R., R. P. CHIN, H. J. BARNES (2008): Fungal Infections. U: SAIF, Y. M. Diseases of Poultry. 12th ed. Blackwell Publishing, Ames, Iowa. pp. 989-1008.

CORTES, P. L., H. L. SHIVAPRASAD, M. KIUPEL, G. SENTÍES-CUÉ (2005): Omphalitis associated with Aspergillus fumigatus in poults. Avian Dis. 49(2):304-308.

DE LUCCA, A. J. (2007): Harmful fungi in both agriculture and medicine. Rev. Iberoam. Micol. 24(1):3-13.

DHAMA, K., S. CHAKRABORTY, A. K. VERMA, R. TIWARI, R. BARATHIDASAN, A. KUMAR, S. D. SINGH (2013): Fungal/mycotic diseases of poultry – diagnosis, treatment and control: a review. Pak. J. Biol. Sci. 16(23):1626-1640.

DYAR, P. M., O. J. FLETCHER, R. K. PAGE (1984): Asper-gillosis in turkeys associated with use of contminated litter. Avian Dis 28:250-255.

EFSA, European Food Safety Authority (2014): Scientific opinion on the risks for human and animal health related to the presence of modified forms of certain mycotoxins in food and feed. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 12(12)3916:1-107.

FRANÇA, M., C. CRAY, H. L. SHIVAPRASAD (2012): Sero-logic testing for aspergillosis in commercial broiler chickens and turkeys. Avian Dis. 56(1):160-164.

GRBEŠA, D., M. DUVNJAK, K. KLJAK (2014): Ublažavanje pojave mikotoksina u krmi i njihovih u inaka na životinje. Krmiva. 56(1):15-32.

GRÜNDER, S., P. MAYSER, T. REDMANN, E. F. KALETA (2005): Mycological examinations on the fungal flora of the chicken comb. Mycoses. 48(2): 114–119.

HAWKSWORTH, D. L. (2001): The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited. Mycol. Res. 105(12):1422-1432.

HOERR, F. J. (2008): Mycotoxicoses. U: SAIF, Y. M. Diseases of Poultry. 12th ed. Blackwell Publishin, Ames, Iowa. Pp. 1197-1229.

HOWARD, S. J., D. CERAR, M. J. ANDERSON, A. ALBARRAG, M. C. FISHER, A. C. PASQUALOTTO, M. LAVERDIERE, M. C. ARENDRUP, D. S. PERLIN, D. W. DENNING (2009): Frequency and evolution of azole resistance in Aspergillus fumigatus associated with treatment failure. Emerg. Infect. Dis. 15(7):1068–1076.

JANSSON, D. S., C. BRÖJER, R. MATTSSON, R. FEINSTEIN, T. MÖRNER, C. HÅRD, A. F. SEGERSTAD (2008): Mycotic proventriculitis in gray partridges (Perdix perdix) on two game bird farms. J. Zoo Wildl Med. 39(3):428-437.

JONES, M. P., S. E. OROSZ (2000): The diagnosis of aspergillosis in birds. Semin. Avian Exotic Pet Med. 9(2):52-58.

KAPETANOV, M. C., D. V. POTKONJAK, D. S. MILANOV, I. M. STOJANOV, M. Z. BALOS, B. Z. PRUNIC (2011): Investigation of dissemination of aspergillosis in poultry and possible control measures. Zbornik Matice Srpske za Prirodne Nauke. 120:267-276.

KEMOI, E. K., P. OKEMO, C. C. BII (2013): Isolation of Candida species in domestic chicken (Gallus gallus) droppings in Kabigeriet village, Nakuru County, Kenya. European. Sci. J. 9(36):309-318.

KHOSRAVI, A. R., H. SHOKRI, T. ZIGLARI, A. R. NAEINI, Z. MOUSAVI, H. HASHEMI (2008): Outbreak of severe

disseminated aspergillosis in a flock of ostrich (Struthio camelus). Mycoses. 51(6):557-559.

LANGERI, G. A. SFACTERIA, D. MACRI, S. REALE, F. MARINO (2011): Pencillosis in an African grey parrot (Psittacus erithaceus). J. Zoo. Wildl. Med. 42(2):309-312.

LEESON, S., G. DIAZ, J. D. SUMMERS (1995): Poultry Metabolic Disorders and Mycotoxins. Ontario, Canada, University Books.

LONDERO, A. T., C. D. RAMOS, O. FISCHMAN (1969): Four epizooties of Trichophyton gallinae infection on chickens in Brazil. Mykosen. 12(1):31-38.

MANDEEL, Q., S. NARDONI, F. MANCIANTI (2011): Keratinophilic fungi on feathers of common clinically healthy birds in Bahrain. Mycoses. 54(1):71-77.

MANS, C. (2007): What is your diagnosis? J. Avian Med. Surg. 21:235-238.

MAYEDA, B. (1961): Candidiasis in turkeys and chickens in the Sacramento Valley of California. Avian Dis. 5(3):232-243.

MORETTI, A., D. PIERGILI FIORETTI, L. BONCIO, P. PASQUALI, E. DEL ROSSI (2000): Isolation of Candida rugosa from turkeys. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 47(6):433-439.

MURATA, M., H. TAKAHASHI, S. TAKAHASHI, Y. TAKAHASHI, H. CHIBANA, Y. MURATA, K. SUGI-YAMA, T. KANESHIMA, S. YAMAGUCHI, H. MIYA-SATO, M. MURAKAMI, R. KANO, A. HASEGAWA, H. UEZATO, A. HOSOKAWA, A. SANO (2013): Isolation of Microsporum gallinae from a fighting cock (Gallus gallus domesticus) in Japan. Med. Mycol. 51(2):144-149

OKOYE, J. O., H. C. GUGNANI, C. N. OKEKE (1989): Pulmonary infections due to Aspergillus flavus in turkey poults and goslings. Mycoses. 32(7):336-339.

PADHYE, A. A. (1968): Trichophyton terrestre from poultry farm soil in India. Mykosen. 11(10):725-726.

RAMANI, R., S. GROMADZKI, D. H. PINCUS, I. F. SALKIN, V. CHATURVEDI (1998): Efficacy of API 20C and ID 32C systems for identification of common and rare clinical yeast isolates. J. Clin. Microbiol. 36: 3396-3398.

RICHARD, J. L., J. R. THURSTON (1983): Rapid hematogenous dissemination of Aspergillus fumigatus and A. flavus spores in turkey poults following aerosol exposure. Avian Dis. 27(4):1025-1033.

SHEPHERD, E. M., B. D. FAIRCHILD (2010): Footpad dermatitis in poultry. Poult. Sci. 89(10):2043-2051.

SILVANOSE, C. D, T. A BAILEY, A. DI SOMMA (2006): Susceptibility of fungi isolated from the respiratory tract of falcons to amphotericin B, itraconazole and voriconazole. Vet. Rec. 159(9):282-284.

SNELDERS, E., R. A. HUIS IN ’T VELD, A. J. RIJS, G. H. KEMA, W. J. MELCHERS, AND P. E. VERWEIJ (2009): Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Appl. Environ. Microbiol. 75(12):4053-4057.

SOKOLOVI , M., B. ŠIMPRAGA, M. BERENDIKA (2015): Pregled pojavnosti mikotoksina u EU. XI. Simpozij "Peradarski dani 2015." s me unarodnim sudjelovanjem. Šibenik, Hrvatska, 13.-16.05.2015. Zbornik radova.

SOKOLOVI , M., V. GARAJ-VRHOVAC, B. ŠIMPRAGA (2008): T-2 toxin: incidence and toxicity in poultry. Arh. Hig. Rada Toksikol. 59(1):43-52.


SOLIMAN, E. S., M. A. A. SOBEIH, Z. H. AHMAD, M. M. HUSSEIN, H. ABDEL-LATIFF, A. A. MONEIM (2009): Seasonal epidemiological surveillance on bacterial and fungal pathogens in broiler farms in Egypt. Int. J. Poult. Sci. 8(8):720-727.

STOUTE, S. T., A. A. BICKFORD, R. L. WALKER, B. R. CHARLTON (2009): Mycotic pododermatitis and mycotic pneumonia in commercial turkey poults in northern California. J. Vet. Diagn. Invest. 21(4):554-557.

STREIT, E., G. SCHATZMAYR, P. TASSIS, E. TZIKA, D. MARIN, I. TARANU, C. TABUC, A. NICOLAU, I. APRODU, O. PUEL, I. P. OSWALD (2012): Current situation of mycotoxin contamination and co-occurrence in animal feed – focus on Europe. Toxins (Basel). 4(10):788-809.

THRONE STEINLAGE, S. J. T., J. E. SANDER, T. P. BROWN, C. M. LOBSINGER, S. G. THAYER, A. MARTINEZ (2003): Disseminated mycosis in layer cockerels and pullets. Avian Dis. 47(1):229-233.

VERWEIJ, P. E., E. SNELDERS, G. H. KEMA, E. MELLADO, AND W. J. MELCHERS (2009): Azole resistance in Aspergillus fumigatus: a side-effect of environmental fungicide use? Lancet Infect. Dis. 9(12):789–795.

WALSH, T. J., E. J. ANAISSIE, D. W. DENNING, R. HERBRECHT, D. P. KONTOYIANNIS, K. A. MARR, V. A. MORRISON, B. H. SEGAL, W. J. STEINBACH, D. A. STEVENS, J. A. VAN BURIK, J. R. WINGARD, T. F. PATTERSON (2008): Treatment of aspergillosis: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 46(3):327-360.

WYATT, R. D., P. B. HAMILTON (1975): Candida species and crop mycosis in broiler chickens. Poult Sci. 54(5):1663-1666.

WYSS, F., V. SCHUMACHER, C. WENKER, S. HOBY, S. GOBELI, A. ARNAUD, M. ENGELS, M. FRIESS, C. E. LANGE, M. H. STOFFEL, N. ROBERT (2015). Pododermatitis in captive and free-ranging Greater Flamingos (Phoenicopterus roseus). Vet Pathol, 0300985814568359, first published on January 23, 2015.

YAMAGUCHI, S., A. SANO, M. HIRUMA, M. MURATA, T. KANESHIMA, Y. MURATA, H. TAKAHASHI, S. TAKA-HASHI, Y. TAKAHASHI, H. CHIBANA, H. TOUYAMA, N. T. HA, Y. NAKAZATO, Y. UEHARA, M. HIRAKAWA, Y. IMURA, Y. TERASHIMA, Y. KAWAMOTO, K. TAKA-HASHI, K. SUGIYAMA, M. HIRUMA, M. MURAKAMI, A. HOSOKAWA, H. UEZATO (2014): Isolation of dermatophytes and related species from domestic fowl (Gallus gallus domesticus). Mycopathologia. 178(1-2):135-143.

YOUNG, E. A., T. E. CORNISH, S. E. LITTLE (1998): Concomitant mycotic and verminous pneumonia in a Blue Jay from Georgia. J. Wildl. Dis. 34(3): 625-628.

ZAFRA, R., J. PÉREZ, R. A. PÉREZ-ECIJA, C. BORGE, R. BUSTAMANTE, A. CARBONERO, C. TARRADAS (2008): Concurrent aspergillosis and ascites with high mortality in a farm of growing broiler chickens. Avian Dis. 52(4):711-713.

ZIO KOWSKA, G., S. TOKARZEWSKI, A. NOWAKIEWICZ (2014): Drug resistance of Aspergillus fumigatus strains isolated from flocks of domestic geese in Poland. Poult Sci. 93(5):1106-1112.

SIGNIFICANCE OF PATHOGENIC MOULDS IN POULTRY PRODUCTION

Summary

Diseases caused by fungal pathogens are less common than bacterial and viral infections. However, they can be a cause of significant losses in poultry production due to infections with pathogenic moulds (mycosis) or as a result of toxic effects of secondary metabolites, mycotoxins (mycotoxicosis). The main pathogens include ubiquitous moulds like Aspergillus, Penicillium and Fusarium, while in rare cases pathogenic are also Microsporum and Trichophyton species. Certain yeasts (Candida and Cryptococcus) have also been documented as a cause of infections in birds. Symptoms are often unspecific, but application of focused diagnostics enables fast and accurate diagnosis. Successful preventive and control measures are the only adequate approach in avoiding these infections and toxicosis. This paper will give a short overview of the most common causes of mycosis and mycotoxicosis in poultry, diagnostics and measures for avoiding their potential undesired effects on poultry health and production.

Key words: pathogenic moulds, mycosis, mycotoxicosis, mycotoxins


POJAVNOST BAKTERIJE SALMONELLA INFANTIS U TOVNIH PILI A U HRVATSKOJ U RAZDOBLJU OD 2010. DO 2014. GODINE

Luka Jurinovi , Borka Šimpraga, Fani Krstulovi , Marijana Sokolovi


Sažetak

U radu je opisana pojavnost bakterije Salmonella Infantis u uzorcima navlaka za obu u i fecesu tovnih pili a. U razdoblju od 2010. do 2014. godine u Laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo Hrvatskog veterinarskog Instituta ukupno je pretraženo 18799 uzoraka. Ukupno je izdvojeno 357 bakterija iz roda Salmonella, od ega 81 serovara Infantis. U istraživanom razdoblju zabilježen je zamjetan rast izdvojenih salmonela, naro ito serovara Infantis. U razdoblju od 2010. do 2013. godine serovar Infantis bio je drugi naj eš e izdvojeni serovar, dok je 2014. bio naj eš i. Ovakav trend vidljiv je i u Europskoj Uniji, kao i u mnogim državama svijeta. Mnogi autori kao mogu i razlog ovako velikog porasta u estalosti serovara Infantis vide u novootvorenoj niši koja je nastala kao rezulat uspješne kontrole serovarova Enteritidis i Thyphimurium.

Klju ne rije i: Salmonella Infantis, pojavnost, tovni pili i

Uvod

U 2013. godini u zemljama Europske Unije (EU) zabi-lježeno je 82.694 slu ajeva infekcije salmonelama u ljudi, što iznosi 20,4 slu ajeva na 100.000 stanovnika. U usporedbi s 2012. godinom došlo je do pada broja slu ajeva salmoneloze u ljudi za 7,9%. U razdoblju od 2008. do 2013. godine broj izbijanja smanjio se s 1888 na 1168. Iako broj slu ajeva salmoneloze u ljudi posljednjih nekoliko godina pokazuje zna ajan trend opadanja, bakterije roda Salmonella su prema izvješ u Europske agencije za sigurnost hrane i Europskog centra za prevenciju i kontrolu bolesti naj eš iuzro nik trovanja ljudi hranom i to ak u 22,5% izbijanja bolesti u ljudi (EFSA i ECDC, 2015.). Kao i prijašnjih godina prevladavala su dva naj eš a serovara S. Enteritidis iS. Typhimurium s 39,5% odnosno 20,2% svih serovarova potvr enih slu ajeva salmoneloze u ljudi. Postotak infekcije uzrokovane serovarom S. Enteritidis smanjio se za 14,1% u odnosu na 2012. godinu, isto kao i postotak S. Typhimurium uklju uju i njenu monofaznu varijantu 1,4[5],12:i:- za 11,1%. Istodobno se za 26,5% pove ao broj slu ajevauzrokovanih infekcijom S. Infantis, etvrtim naj eš imserovarom salmonela. Naj eš i izvori infekcije bili su jaja, proizvodi od jaja, meso i proizvodi od mesa svinja i peradi. Posljednjih godina zabilježeno je zna ajno pove anje u e-

stalosti serovara S. Infantis u ve ini zemalja EU (EFSA i ECDC, 2015.), SAD-u (CDC, 2012.), Australiji (Ross i Heuzenroeder, 2008.; Samiullah i sur., 2013.), Japanu (Shahada i sur., 2009.; Noda i sur., 2010.), Izraelu (Gal-Mor i sur., 2010.; Aviv i sur., 2012.), Iranu (Rahmani i sur., 2013.) i Brazilu (Fonseca i sur., 2006.). U izvješ u Jonesa i sur. (2008.) spominje se 0,3% smrtnosti od salmoneloze uzrokovane bakterijom Salmonella Infantis u Velikoj Brita-niji u razdoblju od 1996. do 2006. godine. Od zemalja lanica EU Ma arska posljednjih nekoliko godina bilježi

najzna ajnije pove anje obolijevanja u ljudi uzrokovanog infekcijom spomenutim serovarom S. Infantis (Nógrády i sur., 2007.) i tako er zna ajno pove anje istog serovara u tovnih pili a (Nógrády i sur., 2008.). U Njema koj je S.Infantis tre i naj eš i serovar salmonela posljednjih godina u ljudi, a najvažniji izvori infekcije su meso tovnih pili a i svinja (Miller i sur., 2010.; Miller i sur., 2013.) Salmonella Infantis, višestruko neosjetljiva na razli iteantimikrobne lijekove uklju uju i cefalosporine, izdvajana je iz uzoraka krvi i stolice djece hospitalizirane zbog jakog gastroenteritisa (Fonseca i sur., 2006.). Zna ajno je napo-menuti da su spomenuti autori u svom istraživanju uo ili ustrajnost infekcije u bolnici kroz duže razdoblje te ovaj podatak isti u kao vrlo zna ajan javnozdravstveni problem zbog dugotrajne mogu nosti infekcije ljudi.

dr. sc. Luka Jurinovi , dipl. ing biol., Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel. +385(0)12440211; faks. +385(0)12440394; e-mail: [email protected]


40

U Hrvatskoj su u Nacionalni program kontrole salmoneloze u pili a vrste Gallus gallus uzgajanih za proizvodnju mesa (tovni pili i) ugra ene i provode se Uredba br. 2160/2003. Europskog parlamenta i Vije a od 17. studenog 2003. godine o kontroli salmonela i drugih odre enih zoonoza uzrokovanih hranom, Uredba Komisije (EU) br. 2007/2012. od 8. ožujka 2012. o cilju Unije za smanjenje u estalosti bakterija Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium u jatima tovnih pili a, kako je predvi eno u Uredbi (EZ) BR. 2160/2003. Europskog parlamenta i Vije a te Uredba Komisije (EZ) br. 1177/2006. od 1. kolovoza 2006. o provedbi Uredbe (EZ) br. 2160/2003. Europskog parlamenta i Vije a glede zahtjeva za korištenje posebnih metoda kontrole u okviru nacionalnih programa kontrole salmonela. Zbog velikih ekonomskih šteta prouzro enih salmonelnim infekcijama i utjecaja na zdravlje ljudi neophodno je u sve faze cjelokupne peradarske proizvodnje, poglavito primarne, uvesti mjere prevencije, otkrivanja i kontrole infekcija sal-monelama (Carrique-Mas i Davies, 2008.; Van Immerseel i sur., 2009.; Vandeplas i sur., 2010.). Navedene mjere moraju obuhva ati stroge higijenske i biosigurnosne mjere (teme-ljito iš enje i raskužba, kontrolu insekata, glodavaca i ektoparazita), dekontaminaciju vode i hrane, primjenu ma-snih kiselina i aditiva u hrani za perad te primjenu cjepiva, prebiotika i probiotika (Hafez, 2008.; van Immersel, 2009.). Cilj ove studije bio je kroz rezultate pretraživanja uzoraka fecesa i navlaka za obu u prikazati u estalost S. Infantis u jatima tovnih pili a u razdoblju od 2010. do 2014. godine u Hrvatskoj.

Materijali i metode

U Laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo u okviru godišnje Naredbe i Nacionalnog programa kontrole salmoneloze u pili a pretraživane su navlake za obu u i feces na prisutstvo bakterija iz roda Salmonella. Uzorci su skupljani u farmskim i obiteljskim objektima za tov pili a. Izdvajanje salmonela iz navlaka za obu u i fecesa obavljeno je prema uputama standardne metode HRN EN ISO 6579: 2003/A1:2008. Od svakog uzorka fecesa/navlaka za obu uodvagano je 25 g i nacijepljeno u 225 mL puferirane peptonske vode (BPW, Buffered Peptone Water,bioMérieux, Francuska) te inkubirano pri 37 ºC ± 1 ºC kroz 18±2 sata. Ako je koli ina fecesa bila manja od 25 g nakon vaganja prilago ena je koli ina peptonske vode tako da je omjer fecesa/navlaka i peptonske vode bio 1:9. Nakon prednamnažanja u puferiranoj peptonskoj vodi uzorci fecesa/navlaka precijepljeni su na modificiranu polumeku podlogu Rappaport Vassiliadis (MSRV, Modifed Semi-solid Rappaport Vassiliadis, Bio Rad, Francuska; Noack, Austri-ja) na na in da se sadržaj nacijepljene peptonske vode inokulirao na podlogu na tri mjesta (3 kapi) u ukupnoj koli ini od 0,1 mL. Tako nacijepljene hranjive podloge inkubirane su pri 41,5 ºC ± 1 ºC kroz 24±3 sata. U slu ajunegativnog nalaza na podlozi MSRV, nakon inkubacije od 24±3 sata (odsutnost zone migracije) inkubacija je produ-žena kroz sljede a 24±3 sata. Pri uo enom rastu bakterija s podloge MSRV u podru ju prisutnosti zone migracije

sakupio se rast pomo u mikrobiološke ušice volumena 10 L izbjegavaju i mjesto inokulacije (bakterijski rast na kraju

zone migracije) i istodobno precijepio na selektivne hranjive podloge ksiloza-lizin deoksikolatni agar (XLD, Xylose Lysine Desoxycholate, bioMérieux, Francuska) i kromogenu podlogu za otkrivanje i izolaciju salmonela (SMID2, Salmonella Detection and Isolation Medium, bioMérieux, Francuska), te su plo e inkubirane pri 37º C ± 1 ºC kroz 24±2 sata. Nakon inkubacije sumnjive kolonije (najmanje etiri do pet) porasle na selektivnim hranjivim podlogama

precijepljene su na trostruki še erni agar sa željezom (TSI, Triple Sugar Iron agar, bioMérieux, Francuska) i inkubirane pri 37 ºC ± 1 ºC kroz 24±3 sata. Za biokemijsku karak-terizaciju salmonela rabljeni su nizovi API za enterobak-terije ID 32E (bioMérieux, Francuska). Serološka tipizacija izolata Salmonella spp. u Laboratoriju za bakteriologiju provodi se akreditiranom metodom u skladu s Uputama za serotipizaciju salmonela (EN ISO 6579 – 3, ISO/TC 34/SC 9) i Internacionalne metode ISO/TR 6579 - 3:2014. Prije serološke tipizacije biokemijskom karakterizacijom potvr-eno je da izolat pripada rodu Salmonella. Za tipizaciju su

korišteni polivalentni i monovalentni O i H antiserumi (Bio Rad, Francuska; Statens Serum Institut, Danska). Aglu-tinacijom na predmetnom stakalcu odre ivana je pripadnost izolata salmonele odre enom serovaru. Serovar je odre ivan prema antigenim formulama (Grimonth i Weill, 2007.). Prije aglutinacije s O antiserumima potrebno je isklju iti spontanu aglutinaciju s kapi fiziološke otopine na predmetnom sta-kalcu u koju se lagano umiješa dio kolonije s agara da se dobije homogena suspenzija. Nakon pokretanja predmetnice 30-60 sekundi pogledati suspenziju s pove alom i tamnom pozadinom. Ako su se u suspenziji zamijetile manje ili ve enakupine bakterijskih stanica zna ilo je da izolat spontano aglutinira te se dalje nije aglutiniralo. Dokazivanje O anti-gena izvodilo se s poli i monovalentnim O antiserumima. Kultura za aglutinaciju bila je uzgojena na hranjivom i TSI agaru. Na istu predmetnicu kapnuta je 1 kap antiseruma (25

L), ezom je nanesena kultura s agara u kap antiseruma i lagano miješana dok nije dobivena homogena suspenzija. Potom je laganim pokretima predmetnice suspenzija mije-šana najviše 1 minutu (od 5 do 60 sekundi) te je pretražena golim okom ili pove alom na možebitnu aglutinaciju. Aglu-tinacijom s polivalentnim O antiserumima sužena je pripad-nost izolata pojedinim serološkim skupinama (monovalentni O antiserumi sadržani u polivalentnim O antiserumima ovise o proizvo a u). Nakon dokazane aglutinacije s polivalent-nim O antiserumom prešlo se na aglutinaciju s monovalent-nim O antiserumima kako bi se odredila skupina kojoj pripada soj. Kada se soju odredila serološka skupna prešlo se na odre ivanje flagelarnih H antigena kako bi se utvrdio to an serovar Salmonella spp. Salmonele obi no imaju dvije faze H antigena (faza 1 i faza 2). Flagelarni antigeni se teško dokazuju u kulturi izrasloj na TSI agaru, osobito ako je agar dulje pohranjen u hladnjaku i suh. U tom slu aju može se nakon nacjepljivanja na TSI agar dodati 1 mL sterilne fiziološke otopine koja se lagano spušta niz stijenke epruvete nasuprot kosine agara tako da dno kosine bude pokriveno fiziološkom otopinom, što omogu uje bolji razvoj


41

flagela. Kultura koja se pretražuje može se nacijepiti na Sven Gard polumeki agar i inkubirati 24±3 sata. Kultura se nacjepljuje lagano na sredini Petrijeve plo e i nakon inku-bacije trebala bi propuzati cijelom plo om. Takva kultura prikladna je za odre ivanje H antigena koji su odre ivani poli- i monovalentnim H antiserumima. Aglutinacijom s polivalentnim H antiserumima suženo je dokazivanje prve H faze soja (monovalentni H antiserumi sadržani u poliva-lentnim H antiserumima ovise o proizvo a u). Postupak izvo enja je isti kao i kod odre ivanja O antiseruma. Velik broj serovarova Salmonella spp. je dvofazan, što zna i da flagele imaju dvije faze: fazu 1 (specifi nu) i fazu 2 (grupnu ili nespecifi nu). Uzgojena kultura salmonela može imati obje ili samo jednu od faza. Obje faze moraju biti iden-tificirane kako bismo to no utvrdili serovar Salmonella spp.Ako se kod serovara s dvije faze dobije pozitivna reakcija s jednom fazom, a dugom ne, mora se primijeniti metoda fazne inverzije. Na elo ove metode je da se u polumeki agar koji dozvoljava puzanje salmonela po površini doda antiserum one faze koja je uspješno aglutinirana. Time se razvoj te faze blokira, a soj koji se testira može puzati samo ako razvije drugu fazu flagela. U Petrijevu plo u promjera 4-5 cm ulije se 1-2 kapi antiseruma za fazu koja je uspješno aglutinirana, npr. ako se kod S. Infantis uspješno aglutinira izolat s H:r antiserumom, onda se kap tog antiseruma kapne u Petrijevu plo u. Na ukapani serum doda se odgovaraju iagar te se agar i antiserum u Petrijevoj plo i lagano pomiješa

i ostavi da se stvrdne. Nakon toga se u sredini Petrijeve plo e nacijepi pretraživana kultura i inkubira na 34 do 38 ºC kroz 18 sati. Važno je da nakon 18 sati izolat od sredine gdje je nacijepljen propuzi cijelom Petrijevom plo om. Potom se dio koji je propuzio uzme ezom i aglutinira s odre enimantiserumom (u slu aju S. Infantis s H:5 antiserumom).

Rezultati

U razdoblju od 2010. do 2014. godine u Laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo Hrvatskoga veteri-narskog instituta ukupno je pretraženo 18 799 uzoraka navlaka za obu u i fecesa tovnih pili a na prisutnost bak-terija roda Salmonella. Ukupno je izdvojeno 357 bakterija roda Salmonella. Od tog broja 81 (22.69%) su bili izolati serovara Infantis. Biokemijskom karakterizacijom pomo unizova API za enterobakterije ID 32E potvr ena je njihova pripadnost rodu Salmonella. Serološkom tipizacijom s poli- i monovalentnim antiserumima izolatima je odre ena anti-gena formula i to 6,7,14:r:5. Salmonella Infantis spada u serološku skupnu „C1“ salmonela. Brojnost pretraženih uzoraka kao i brojnost izoliranih bakterija iz roda Salmonella dan je u tablici 1. Vidljivo je da se tijekom istraživanog razdoblja pove ava u estalost serovara Infantis kako u ukupnom uzorku te je u 2014. godini upravo serovar Infantis bio naj eš i po pojavnosti.

Tablica 1. Nalaz bakterija roda Salmonella u uzorcima fecesa/navlaka za obu u uzorkovanih u objektima za tov pili a u periodu od 2010. do 2014. godine

Table 1. Bacteria of the genus Salmonella isolated in the samples of feces/overshoes collected in broiler housing 2010-2014

Godina / Year

Ukupan broj pretraženih uzoraka / Number of samples

Ukupan broj izdvojenih bakterija roda Salmonella /

Number of Salmonella spp.

Ukupan broj izdvojenih bakterija Salmonella Infantis /

Number of Salmonella Infantis 2010. 3259 70 14 2011. 3626 48 8 2012. 3958 58 9 2013. 4062 73 16 2014. 3894 108 34

Slika 1. U estalost (%) bakterija roda Salmenella (crveno) te Salmonella Infantis (plavo) u uzorcima pretraženim u Centru za peradarstvo Figure 1. Incidence (%) of the genus Salmenella (red) and Salmonella Infantis (blue) bacteria in the samples examined at Poultry Centre


42

Iz prikazane tablice 1. i slike 1. može se vidjeti da je udio izdvojenog serovara S. Infantis apsolutno i u postocima u odnosu na broj pretraženih uzoraka i ukupan broj salmonela bio najve i u 2014. godini. U razdoblju od 2010. do 2013. godine spomenuti serovar je po u estalosti bio na drugom mjestu. Istodobno u promatranom razdoblju salmonele Ente-ritidis i Typhimurium koje su ugra ene u Nacionalni pro-gram pokazuju trend porasta, osobito u 2014. godini kada je u Laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo iz-dvojeno 22 izolata S. Enteritidis i 5 izolata S. Typhimurium. U 2014. godini ukupan broj salmonela izdvojenih iz navlaka za obu u i fecesa tovnih pili a bio je ukupno najve i i to 108 izolata odnosno 2.77% od ukupnog broja pretraženih uzoraka.

Rasprava i zaklju ci

Infekcije bakterijama roda Salmonella predstavljaju zna-ajan ekonomski i gospodarski problem kako zbog velikih

šteta u intenzivnoj proizvodnji tovnih pili a tako i u stva-ranju zna ajnih izvora infekcije za ljude putem mesa i proizvoda od mesa. Temeljem rezultata ove studije može se vidjeti da je u 2013. i u 2014. godini došlo do pove anja broja izdvojenih salmonela, što je u skladu s izvješ emEFSA-e i ECDC-a (2015.) za salmonele u tovnih pili a za 2013.godinu (za 2014. godinu još nema izvješ a EFSA-e i ECDC-a). Isto tako zna ajno pove anje u estalosti serovara S. Infantis nije zabilježeno samo u zemljama EU, ve i u mnogim državama svijeta (EFSA i ECDC, 2015.; CDC, 2012.; Ross i Heuzemroeder, 2008.; Noda i sur., 2010.; Gal-Mor i sur., 2010.; Rahmani i sur., 2013.; Fonseca i sur., 2006.; Jones i sur., 2008.). Brojni autori u svojim istraži-vanjima pokušavaju prona i odgovor na trenutno tako visoku u estalost serovara S. Infantis pa neki od njih navode kao mogu i razlog vakcinaciju protiv S. Enteritidis i Typhimurium (Miller i sur., 2010.). Uspješnom kontrolom serovarova S. Enteritidis i S. Typhimurium putem vakci-nacije otvorena je ekološka niša za ulazak drugih sero-varova. Jednako tako poznato je da je nakon uspješne eradikacije bakterije S. Gallinarum došlo do zna ajnog porasta S. Enteritidis i pretpostavke da je upravo nestanak S.Gallinarum otvorio nišu za epidemijsku raširenost S.Enteritidis (Rabsch i sur., 2000.). Jedno od objašnjenja tako velike u estalosti S. Infantis dali su Cleaveland i sur. (2007.) koji definiraju pojavu novog patogenog mikroorganizma, uzro nika zarazne bolesti kao onoga koji se javi u novom doma inu ili ija u estalost zna ajno poraste kao rezultat dugotrajnih promjena u njegovoj epidemiologiji. Zna ajni porast serovara S. Infantis u tovnih pili a uo en u Laboratoriju za bakteriologiju Centra za peradarstvo prati trend porasta ovog serovara u mnogim zemljama svijeta. Jednako tako, ukupni porast broja izdvojenih salmonela u tovnih pili a posljednje dvije godine zabilježen u Labora-toriju za bakterilologiju Centra za peradarstvo zahtijeva strože mjere kontrole, otkrivanja i prevencije salmonelnih infekcija u tovnih pili a.

Literatura

AVIV, GALI, K. TSYBA, N. STECK, M. SALMON-DIVON, A.CORNELIUS, G. RAHAV, G. A. GRASSL, O. GAL-MOR (2013): A unique magaplasmid contributes to stress tolerance and pathogenicity of an emergent Salmonella enterica serovar Infantis strain. Environ Microbiol. 16(4), 977-94.

CARRIQUE-MAS, J. J., R. H. DAVIES (2008): Salmonella enteritidis in commercial layer flock in Europe: legistative background on farm sampling and main challenges. Braz J Poult Sci. 10, 1-9.

CDC (2012): Number and incidence of Salmonella infections by serotype 2011. [http://www.cdc.gov/foodnet/data/trends/ /tables/Table5.html (25.02.2015.)].

CLEAVELAND, S., D. T. HAYDON, L. TAYLOR (2007): Overviews of pathogen emergence: which pathogens emerge, when and why? Curr Top Microbiol Immunol. 315, 85-111.

EFSA i ECDC (2015): The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-Borne Outbreaks in 2013. EFSA J 13(1), 3991.

EN ISO 6579 – 3. Working Group ISO/TC 34/SC 9 (Work Programmes for EU Reference Laboratories for 2011) Guide for Serotyping Salmonella ISO/TC 34Sc 9.

FONSECA, E. L., O. L. MYKYTCZUK, M. D. ASENI, E. M. F. REISM L. R. FERRAZ, F. L. PAULA, L. K. NG, D. P. RODRIGUES (2006): Clonality and antimicrobial resistance gene profiles of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Infantis isolates from four public hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol. 44 (8), 2767-2772.

GAL-MOR, O., L. VALINSKY, M. WEINBERGER, S. GUY, J. JAFFE, Y. I. SCHORR, et al. (2010): Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Infantis, Israel. Emerg Infect Dis. 16, 1754-1757.

GRIMONTH, P. A. D., F.-X. WEILL (2007): Antigenic formulae of the Salomonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institute Pasteur. [http://www.pasteur.fr/ip/portal/action/WebdriveActionEvent/oid/01s-000036-089 (01.04.2011)].

HAFEZ, H. M. (2008): European perspective on the control and eradication of some poultry diseases. 1st Mediterranean Summit of WPSA, Porto Carras, Chalkidiki, Greece, May 7-10, 2008, Proceedings, str. 62-72.

HRN EN ISO 6579:2003. Mikrobiologija hrane i sto ne hrane – Horizontalna metoda za otkrivanje Salmonella spp.

HRN EN ISO 6579: 2003/A1:2008. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal methods for the detection of Salmonella spp. Amendment 1: Annex D: Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage.

JONES, K. E., N. G. PATEL, M. A. LEVY, A. STOREYGARD, D. BALK, J. L. GITTLEMAN, P. DASZAK (2008): Global trends in emerging infectious diseases. Nature. 451, 990-993.

MILLER, T., R. PRAGER, W. RABSCH, K. FEHLHABER, M. VOSS (2010): Epidemiological relationship between Salmonella Infantis isolates of human and broiler origin. Lohman Information. 45(2), 28.

MILLER, T., P. G. BRAUN, K. FEHLHABER, R. PRAGER, Y. PFEIFER,W. RABSCH (2013): Typing of Salmonella enterica serovar Infantis isolates from 51 outbreaks in Germany between 1974 and 2009 by a novel phage-typing scheme. Epidemiol Infect. 142(1), 75-83.


43

NODA, T., K. MURAKAMI, Y. ISHIGURO, T. ASAI (2010): Chicken meat is an infection source of Salmonella serovar Infantis for humans in Japan. Foodborne Pathog Dis. 7(6), 727-735.

NÓGRÁDY N., A. TÓTH, A. KOSTYÁK, J. PÁSZTI, B. J. NAGY(2007): Emergence of multidrug-resistant clones of Salmonella Infantis in broiler chickens and humans in Hungary. Antimicrob Chemother. 60(3), 645-648.

NÓGRÁDY, N., G. KARDOS, A. BISTYAK, I. TURCSANYI, J. MESZAROS, ZS. GALANTAI, A. JUHASZ, P. SAMU, J. E. KASZANYITZKY, J. PASZTI, I. KISS (2008): Prevalence and characterisation of Salmonella Infantis isolates originating from different points of the broiler chicken-human food chain in Hungary. Int J Food Microbiol. 127(1-2), 162-167.

RABSCH, W., B. M. HARGIS, R. M. TSOLIS, R. A. KINGSLEY, K-H. HINZ, H. TSCHAPE, A. J. BAUMLER (2000): Competitive exclusion of Salmonella enteritidis by Salmonella gallinarum in poultry. Emerg Infect Dis. 6 (5), 443-448.

RAHMANI, M., S. M. PEIGHAMBARI, C. A. SVENDSEN, L. M. CAVACO, Y. AGRESØ, R. S. HENDRIKSEN (2013): Molecular clonality and antimicrobial resistance in Salmonella enterica serovars Enteritidis and Infantis from broilers in three northern regions of Iran. BMC Vet Res. 9, 66.

ROSS, I. L., M. W HEUZENROEDER (2008): A comparison of three molecular typing methods for the discrimination of Salmonella enterica serovar Infantis. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 375-384.

SAMIULLAH, S. (2013): Salmonella Infantis, a potential human pathogen has an association with table eggs. Int J Poult Sci. 12(3), 185-191.

SHAHADA, F., H. SUGIYAMA, T. CHUMA, M. SUEYOSHI, K. OKAMOTO (2009): Genetic analysis of multi-drug resistance and the clonal dissemination of beta-lactam resistance in Salmonella Infantis isolated from broilers. Vet Microbiol. 140, 136-141.

Uredba (EZ-a) br. 2160/2003 Europskog parlamenta i Vije a od 17. studenog 2003. godine o kontroli salmonele i drugih odre enih zoonoza uzrokovanih hranom.

Uredba Komisija (EU) br. 2007/2012 od 8. ožujka 2012. o cilju Unije za smanjenje prevalencije bakterija Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium u jatima tovnih pili a, kako predvi a Uredba (EZ) br. 2160/2003 Europskog parlamenta i Vije a.

Uredba Komisije (EZ) br. 1177/2006 od 1. kolovoza 2006. o provedbi Uredbe (EZ) br. 2160/2003. Europskog parlamenta i Vije a glede zahtjeva za korištenje posebnih metoda kontrole u okviru nacionalnih programa kontrole salmonele u peradi.

VANDEPLAS, S., R. DUBOIS DAUPHIN, Y. BECKERS, P. THONART, A. THÉVIS (2010): Salmonella in chicken: current and developing strategies to reduce contamination at farm level. J Food Protect. 73, 774-785.

VAN IMMERSEEL, F., L. de ZUTTER, K. HOUF, F. PASMANS, F. HAESEBROUCK, R. DUCATELL (2009): Strategies to control Salmonella in the broiler production chain. World Poult Sci J. 65(03), 367-392.

INCIDENCE OF SALMONELLA INFANTIS IN BROILERS IN CROATIA 2010-2014

Summary The incidence of Salmonella Infantis in the samples of boot swabs and broiler feces is reported. During the 2010-2014 period, 18799 samples were examined at the Laboratory of Bacteriology, Poultry Centre, Croatian Veterinary Institute. A total of 357 bacteria of the genus Salmonella were isolated, 81 of these serovar Infantis. During the study period, considerable growth of the isolated salmonella species was observed, serovar Infantis in particular. Serovar Infantis was the second most common serovar isolated in the 2010-2013 period and the leading serovar in 2014. A similar trend has also been recorded in the European Union as well as in many other countries worldwide. Many authors consider this high increase in the incidence of the serovar Infantis be due to the newly opened niche resulting from the successful control of the serovars Enteritidis and Typhimurium.

Key words: Salmonella Infantis, incidence, broilers


INFEKCIJA BAKTERIJOM ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE U KONZUMNIH NESILICA – PRIKAZ SLU AJA

Fani Krstulovi , Borka Šimpraga, Luka Jurinovi , Marina Tišljar, Milivoj Mikec, Marijana Sokolovi , Marija Berendika


Sažetak

U radu se opisuje slu aj infekcije bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae u konzumnih nesilica hibridne linije Tetra SL, dobi 60 tjedana. Klini ki znaci bolesti u jatu o itovali su se smanjenom nesivosti i pove anim uginu em, što je trajalo desetak dana. Patoanatomske promjene bile su kaheksija, izražena cijanoza sluznica, kože glave i vrata, znakovi sepse, hiperemi ni tumor slezene, pove enje i punokrvnost jetre te u jednom slu aju nekroza jetre i upala jajnika i jajovoda. Bakteriološkom pretragom je iz sve etiri pretražene jetre, tri slezene i dva ovarija izdvojena vrsta Erysipelothrix rhusiopathiae. Izdvojena bakterija identificirana je biokemijskom karakterizacijom pomo u API nizova Rapid ID 32 STREP. Testovi tvorbe katalaze i oksidaze kao i test na pokretljivost bili su negativni. U razmazima napravljenim iz iste bakterijske kulture i obojanim prema Gramu na eni su savijeni i nitasti gram-pozitivni štapi i. Prema rezultatima testa osjetljivosti vrsta Erysipelothrix rhusiopathiaepokazala je osjetljivost prema deset, a neosjetljivost prema tri antimikrobna lijeka.

Klju ne rije i: Erysipelotrix rusiopathiae, konzumne nesilice, infekcija

Uvod

Vrbanac je bolest od koje mogu oboljeti mnogobrojne vrste sisavaca, ptica i ovjek (Wang i sur., 2010.; Erikson, 2013.). Vrbanac peradi (Erysipelas avium) je akutna septikemijska, iznenadna i eksplozivna zaraza pojedinih životinja u jatu. Bakterija Erysipelothrix rhusiopathiae dokazana je u brojnih vrsta ptica kao što su emui, fazani, jarebice, prepelice, kanarinci, papige, zlatni orlovi i mnoge druge, ali i u doma eperadi kao što su purani, kokoši, pili i, patke i guske (Bricker i Saif, 2003.; Mazaheri i sur., 2005.; Eriksson i sur., 2009.; Fossum i sur. 2009.; Eriksson i sur., 2010.; Kurian i sur., 2012.; Schmitt i sur., 2014.). Od ptica su na infekciju najosjetljiviji purani, naj eš e obolijevaju, a pojava bolesti u puranskoj proizvodnji uzrokuje velike gospodarske i eko-nomske štete kako zbog uginu a tako i zbog slabije plodnosti mužjaka i smanjene nesivosti ženki (Wang i sur., 2010.). Vrbanac je zoonoza i ubraja se u profesionalne zarazne bolesti. Njegova pojava u ljudi povezana je s prirodom posla pa su tako najve em riziku od infekcije izloženi veterinari, ljudi koji rade u klaonicama, tvornicama ribe, peradarskim farmama, ribolovci, kožari, kuhari, njegovatelji životinja te

osobe koje dolaze u kontakt sa životinjama ili tlom (Brooke i Riley, 1999.; Wang i sur., 2010.). U ljudi se vrbanac pojavljuje u tri oblika (klini ke manife-stacije) i to kao lokalizirani kožni oblik – erizipeloid, gene-ralizirani kožni oblik i septikemijski oblik s endokarditisom kao komplikacijom. Ulazna vrata infekcije su ošte ena koža i sluznica (Bricker i Seif, 2003.). Erizipeloid opisan kao lokalizirani celulitis naj eš i je oblik infekcije u ljudi, a manifestira se promjenama na koži ruku i prstiju (Brooke i Riley, 1999.). O ituje se dobro ograni enim romboidnim ote enjem ljubi aste boje i nerijetko prisutnom jakom boli poput peckanja, pulziranja i svrbeža. Ponekad je prisutna groznica, dolazi do upale limfnih vorova te upale zglobova u zahva enom podru ju (Brooke i Riley, 1999.; Wang i sur., 2010.). Tijekom bolesti ne dolazi do gnojenja i nastanka edema, što je zna ajno za razlikovanje erizipeloida od streptokoknih i stafilokoknih infekcija. Bolest je samo-ogra-ni avaju a i obi no pro e za 3 do 4 tjedna bez lije enja(Wang i sur., 2010.). Drugi oblik je rijedak i prouzro en je progresijom i širenjem prvotnih promjena na koži na druga mjesta na tijelu pa može nastati generalizirani kožni oblik bolesti s izrazito jakim bolovima u zglobovima (Stacke-brandt i sur., 2006.). Promjene su sli ne onima kod loka-

mr. Fani Krstulovi , dr. med. Vet., Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; Tel. +385 (0) 1 2440212, e-mail: [email protected]

INFEKCIJA BAKTERIJOM ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE U KONZUMNIH NESILICA – PRIKAZ SLU AJA 45

liziranog oblika, ali mogu nastati gnojni mjehuri uz pojavu groznice i u estale bolove u zglobovima. Bolest traje dulje nego kod lokaliziranog oblika i može se ponovno vratiti. Tre i, septikemijski oblik vrlo je ozbiljna manifestacija infekcije. Rijetko se razvije iz lokaliziranog oblika, a esta mu je komplikacija verukozni endokarditis (Brooke i Riley, 1999.; Wang i sur., 2010.). Uz navedene bolesti infekcija bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae u ljudi može uzro-kovati kroni ni artritis, infekciju mozga, nekrozu pal ane kosti te intrakranijske apscese. U jatima konzumnih nesilica izbijanje infekcije bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae ponekad može prouzro iti vi-soku smrtnost i pad nesivosti (Mazaheri i sur., 2005.; Stokholm i sur., 2010.; Schmitt i sur., 2014.). Klini komslikom prevladavaju nespecifi ni simptomi poput depresije, proljeva, blijedih krijesti, nakostriješenog perja, znakova eksikoze pa diferencijalno dijagnosti ki valja isklju iti pti jugripu i newcastlesku bolest (Schmitt i sur., 2014.). Infekcija može uzrokovati jedno ili obostrano ote enje periorbitalne regije popra eno suzenjem, stvaranjem krasta na o ima te ote enjem sinusa i konjunktiva (Schmitt i sur., 2014.). Izbi-janje bolesti u purana nastupi naglo s uginu em jedne ili nekoliko ptica u jatu. Trajanje inkubacije ne može se sa sigurnoš u utvrditi, ali se procjenjuje da traje oko 3 do 5 dana. U oboljelih životinja pojavljuje se cijanoza kože, ote-enje nosnog privjeska, ožarice na podbradnjaku, nevoljkost,

nesigurno kretanje, klonulost, proljev i na kraju uginu e(Wang i sur., 2010.). Na miši ima prsa i nogu mogu se na ibrojne hemoragije i petehijska krvarenja. U istraživanjima virulencije nakon izaziva ke infekcije Specific Pathogen-Free (SPF) konzumnih nesilica dobi 17, 27 i 37 tjedana najviša smrtnost utvr ena je u nesilica dobi 37 tjedana i to ve osam dana nakon infekcije. U pokusnoj skupini nesilica dobi 27 tjedana zabilježeno je 40% do 60% uginu a, dok u nesilica dobi 17 tjedana uginu a nije bilo (Mazaheri i sur., 2005.). Uo eni klini ki simptomi bili su depresija, crven kasta krijesta te vlažna i uprljana ne isnica. Od patološko-anatomskih promjena na enih na uginulim životinjama zabi-lježene su petehije na želu anom masnom tkivu, hemoragije na perikardu, ulceracije na želucu, pove ane jetra i slezena te kataralni enteritis. Bakterija Erysipelothrix rhusiopathiaeizdvojena je iz krvi iz srca, jetre, slezene, plu a i mozga. Fossum i sur. (2009.) su istražuju i uzroke uginu a kon-zumnih nesilica u razli itim uvjetima držanja utvrdili izbi-janje infekcije vrstom Erysipelothrix rhusiopathiae u 10 od 129 jata nesilica držanih u nastambi na stelji i u 6 od 23 jata slobodno držanih nesilica na otvorenom. Po u estalosti uzroka uginu a odmah poslije kolibaciloze bili su vrbanac i pastereloza. Sli ne rezultate u svojim istraživanjima opisuju Stokholm i sur. (2010.). Autori isti u da se slobodnim na inom držanja na otvorenom ili u nastambi zna ajnopove ava rizik od infekcije bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae. Schmitt i sur. (2014.) opisuju izbijanje bolesti u slobodno držanih konzumnih nesilica s visokim postotkom uginu a od 7% i velikim padom nesivosti od 45%. U literaturi se na temelju istraživanja navodi da su pili i i pile e meso potencijalni rezervoari infekcije bakterijom

Erysipelothrix rhusiopathiae za ljude (Nakazawa i sur., 1998.a; Nakazawa i sur., 1998.b).Bakterija Erysipelothrix rhusiopathiae jedna je od tri vrste unutar roda Erysipelothrix, preostale dvije su Erysipelothrix tonsillarum i Erysipelothrix inopinata. Danas je poznato 28 serotipova unutar roda. Serotipovi 1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 19, 21 i N pripadaju Erysipelothrix rhusiopathiae, dok Erysipelothrix tonsillarum uklju uje serotipove 3, 7, 10, 14, 20, 22, 23, 24, 25 i 26 (Opriessing i sur., 2012.). Vrsta Erysipelothrix inopinata još nije serološki karakterizirana (Verbarg i sur., 2004.).Bakterija Erysipelothrix rhusiopathiae je fakultativno anae-roban nesporuliraju i, ravan ili lagano zakrivljen gram-pozi-tivan štapi veli ine 0,2-0,4x0,8-2,5 m s estom tvorbom dugih, nitastih oblika veli ine 60 m ili dužih (Brooke i Riley, 1999.; Stackebrandt, 2009.). Uzgaja se na hranjivim podlogama s dodatkom krvi ili krvnog seruma u mi-kroaerofilnim ili aerobnim uvjetima pri temperaturi od 30 do 37 °C, no može rasti i na temperaturi od 5 do 42 ºC (Stackebrandt, 2009.). Na krvnom agaru raste u obliku malih, poput rose prozirnih kolonija s uskom zonom -hemolize. Ne tvori katalazu, oksidazu i ureazu, proizvodi koagulazu. Ne stvara indol ni sumporovodik niti reducira nitrate. Fermentira še ere i to glukozu, laktozu, fruktozu, maltozu, a ponekad i saharozu tvore i plin. Otporna je na visoke i niske temperature, na isušenje, dimljenje, salamu-renje, a ostaje živa u zamrznutom ili ohla enom mesu, trulome mesu, osušenoj krvi i ribljem brašnu (Opriessnig i Wood, 2012.).Sojevi Erysipelothrix rhusiopathiae zna ajno se razlikuju u posjedovanju imbenika virulencije, ali korelacija izme userotipova i virulencije nije utvr ena (Wang, 2010.). Bak-terija posjeduje polisaharidnu kapsulu koja joj omogu ava otpornost na fagocitozu (Shimoji i sur., 1994.; Shimoji, 2000.). Tako er može preživjeti unutar mišjih polimorfo-nuklearnih leukocita i makrofaga (Shimoji i sur., 1996.; Shimoji, 2000.). Enzim neuraminidaza olakšava prianjanje na epitelne stanice nositelja i ulazak u stanice (Wang i sur., 2005.). Hijaluronidaza olakšava širenje bakterije u tkivima doma ina, no njena uloga kao imbenika virulencije u patogenezi infekcije nije zna ajna (Shimoji i sur., 2002.). Vrsta Erysipelothrix rhusiopathiae posjeduje mnogo anti-oksidativnih imbenika te nekoliko površinskih proteina koji tako er utje u na njenu virulenciju (Ogawa i sur., 2011.). U ovom radu opisuje se slu aj infekcije bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae u farmi konzumnih nesilica hibridne linije Tetra SL, dobi 60 tjedana.

Materijali i metode

Tijekom zimskih mjeseci u farmi konzumnih nesilica hi-bridne linije Tetra SL, dobi 60 tjedana u jednoj nastambi od 28.000 ptica došlo je do pada nesivosti i pove ane smrtnosti. Uginu e se pove alo s 0,2% na 0,6%, a nesivost se smanjila za 3,4%. Nesilice su držane u oboga enim kavezima, hra-njene komercijalnom, izbalansiranom hranom i napajane vo-dom iz gradskog vodovoda. Cijepljene su protiv Marekove


bolesti, zaraznog bronhitisa, newcastleske bolesti, zarazne bolesti burze, sindroma pada nesivosti i protiv bakterija Salmonella ser. Enteritidis i ser. Typhimurium. Nakon de-setak dana zdravstveno stanje u jatu se normaliziralo

Patološkoanatomska pretraga

etiri lešine konzumnih nesilica razu ivane su u Labora-toriju za patologiju Centra za perdarstvo Hrvatskoga vete-rinarskog instituta u Zagrebu u sklopu rutinske patološko-morfološke pretrage i na zahtjev vlasnika farme. Uzorci etiri jetre, etiri slezene, dva ovarija i dva crijeva uzeti su za

bakteriološku pretragu.

Bakteriološka pretraga

Uzorci organa ( etiri jetre, tri slezene, dva ovarija i dva crijeva) sterilnom mikrobiološkom ušicom nacijepljeni su na vrste hranjive podloge i to na Columbia agar (bio Merieux,

Francuska), Columbia agar s dodatkom 5% defibrinirane ov je krvi i na Mac Conkey agar (bio Merieux, Francuska). Agari su inkubirani u aerobnim uvjetima pri 37 ºC tijekom 24 do 48 sati. Nakon inkubacije od sumnjivih kolonija na krvnom agaru napravljeni su razmasci i obojani prema Gramu. Na plo ama Mac Conkey agara nije uo en bakterij-ski rast. Tako er je napravljeno ispitivanje na oksidazu, katalazu i pokretljivost te rast na trostrukom še eru (Triple Sugar Iron, bio Merieux, Francuska) te biokemijska ka-rakterizacija pomo u API nizova Rapid ID 32 STREP. Ispitivanje na oksidazu napravljeno je tako da su odabrane pojedina ne kolonije preba ene na filtar papir na koji je prethodno stavljena kap oksidaza reagensa (Oxidase reagent, bio Merieux, Francuska). Kao pozitivna kontrola korišten je referentni soj Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, a kao negativna kontrola referentni soj Escherichia coli ATCC25922. Za ispitivanje na katalazu svaka odabrana kolonija uzeta je pomo u mikrobiološke ušice i stavljena u kapljicu vodikovog peroksida na isto predmetno stakalce. Kao pozitivna kontrola korišten je referentni soj Staphylococcus aureus ATCC 25923, a kao negativna kontrola referentni soj Enterococcus faecalis ATCC 23186. Za test pokretljivosti nekoliko kolonija iste bakterijske kulture suspendirano je u 1 mL F.O. na predmetnom stakalcu i pregledano pod mikroskopom. Izdvojenoj bakteriji odre ena je osjetljivost prema antimikrobnim lijkovima disk-difuzijskom metodom na vrstoj podlozi Mueller-Hinton agaru (Mueller-Hinton agar 2, bio Merieux, Francuska) s dodatkom 5% do 10% ov je krvi prema preporukama CLSI (2012.) prema kojima su o itavani rezultati. Kao kontrola korišteni su referentni sojevi spomenuti kod testova katalaze i oksidaze. Korišteni su sljede i diskovi: ampicin (AMP) 10 μg, amoksi-cilin/klavulanska kiselina (AMC) 20 μg + 10 μg, Penicilin G 10 IU, tetraciklin (TE) 30 μg, oksitetraciklin (OT) 30 μg, trimetoprim/sulfametoksazol (SXT) 1,25 μg + 23,75 μg, enofloksacin (ENO) 5 μg, ciprofloksacin (CIP) 5 μg, norfloksacin (NOR) 10 μg, cefalotin (CF) 30 μg, cefoperazon (CFP) 30 μg, klindamicin (CM) 2 μg, kloramfenikol (C) 30 μg.

Rezultati

Patološkoanatomska pretraga

Patološkoanatomskom pretragom etiri lešine kokoši nesi-lica hibrida lakih pasmina dobi 60 tjedana utvr ena je izrazita kaheksija i cijanoza vidljivih sluznica, kože i miši jaglave, vrata, trupa i udova. U svih je lešina prevladavala slika hepatomegalije (izrazito pove ana i punokrvna jetra) popra ena u jednom slu aju nekrozom jetre. Tako er je utvr ena splenomegalija te upala jajnika i jajovoda u svih pretraženih lešina kokoši.

Bakteriološka pretraga

Bakteriološkom pretragom je iz sve etiri pretražene jetre, tri slezene i dva ovarija izdvojena bakterija Erysipelothrix rhusiopathiae. Iz oba pretražena crijeva izdvojena je bakterija Escherichia coli. U razmazima u injenim iz bakterijske kulture na eni su gram-pozitivni, savijeni i nitasti štapi i razli itih dužina. ista bakterijska kultura porasla iz jetara, slezena i ovarija na krvnom agaru, a biokemijski je pomo u API nizova Rapid ID 32 STREP identificirana kao Erysipelothrix rhusiopathiae. Test na tvorbu katalaze, oksidaze i pokretljivosti bio je negativan.

ista bakerijska kultura nacijepljena je na trostruki še er. Nakon inkubacije od 24 sata na mjestu uboda pojavila se tanka crna linija. Od trinaest antimikrobnih lijekova na koje je testirana osjetljivost vrsta Erysipelothrix rhusiopathiae pokazala je osjetljivost prema njih 10 i to prema ampicilinu, amoksicilinu s klavulanskom kiselinom, penicilinu, tetraci-klinu, oksitetraciklinu, trimetoprim-sulfametoksazolu, enro-floksacinu, ciprofloksacinu, norfloksacinu, cefalotinu, cefo-perazonu, klindamicinu i kloramfenikolu. Neosjetljivost je pokazala prema tetraciklinu, cefalotinu i oksitetraciklinu.

Rasprava i zaklju ci

Patološkoanatomski nalaz ukazivao je na sepsu u svih pretraženih kokoši nesilica. Uspore uju i patološkomorfo-lošku sliku purana i kokoši nesilica spontano zaraženih bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae u kokoši nesilica zahva en je daleko manji broj organa promjenama tipi nim za vrbanac nego u purana. Tako Bricker i Saif (2003.) isti uodsutnost patoloških promjena ina e tipi nih u purana u endokardu, zglobovima i koži zaraženih kokoši. Mutalib i sur. (1993.) naglašavaju punokrvnost svih organa, krvarenja u miši ju trupa i unutarnjim organima, hepato-megaliju i splenomegaliju te pove anje bubrega sa sporadi -nim nalazom nekroze. Eriksson (2013.) proglašava isti nalaz u kokoši nesilica tipi nim za uvijek prisutnu sepsu uz po-pratno esto vidljivu nekrozu pove ane jetre i ve spome-nutu splenomegaliju i punokrvnost svih organa. Ista autorica spominje diskoloraciju i regresiju jajnika (s posljedi nom smanjenom stopom nesivosti u oboljelih kokoši). Gotovo isti patološkoanatomski nalaz (s izuzetkom nalaza upalnih promjena tercijarnih folikula jajnika i upale jajovoda bez nalaza tipi nih za regresiju organa) utvr en je u opisanom


slu aju. S obzirom na podatke Stokholm i sur. (2010.) i zdravstveno stanje predmetnih kokoši (sepsa kao posljedica infekcije bakterijom Erysipelothrix rhusiopathiae) iznena-uju i je nalaz upalnih (umjesto regresivnih) promjena u

jajnicima još o uvanih tercijarnih folikula kokoši nesilica dobi 60 tjedana.Iako je vrbanac eš i i gospodarski zna ajniji u purana, u brojnim literaturnim podatcima opisani su slu ajevi njego-vog izbijanja u konzumnih nesilica (Mazaheri i sur., 2005.; Fossum i sur., 2008.; Stokholm i sur., 2010.; Eriksson i sur., 2010.; Kurian i sur., 2013.; Schmitt i sur., 2014.). U opisanom prikazu slu aja temeljem klini kih znakova bo-lesti (podatci diobiveni od vlasnika farme) te patološko-anatomske pretrage iz organa ( etiri jetre, tri slezene, dva ovarija i dva crijeva) uginulih kokoši napravljena je bakte-riološka pretraga. Iz svih jetara, slezena i ovarija izdvojena je bakterija Erysipelothrix rhusiopathiae. Spomenuta vrsta dokazana je na temelju biokemijske karakterizacije pomo uAPI nizova, mikroskopske pretrage, testa na katalazu, okidazu, pokretljivost te specifi an rast na TSI agaru. Takva potvrda vrste Erysipelothrix rhusiopathiae u skladu je s bakteriološkom pretragom i potvrdnim testovima opisanim u lancima drugih autora (Mazaheri i sur., 2005.; Schmitt i

sur., 2014.). Konzumne nesilice iz opisanog slu aja držane su u oboga enim kavezima i bolest se pojavila u zimskim mjesecima. U dostupnoj literaturi samo jedan autor opisuje iznena uju e velik postotak serološki pozitivnih nesilica držanih u kavezima, što je u suglasju sa slu ajem opisanim u ovom radu (Kurian i sur., 2012.). Velik broj autora opisao je slu ajeve i zaklju io da je ve a izloženost i mogu nost infekcije vrstom Erysipelothrix rhusiopathiae u uvjetima slobodnog držanja i držanja u nastambi na stelji nego u komercijalnim oboga enim kavezima (Erikson i sur., 2010.; Eriksson i sur., 2013.; Schmitt i sur., 2014.). U literaturi brojni autori tako er navode da su na infekciju osjetljive nesilice u starijoj dobi, što potvr uje i prikaz slu aja u ovom radu (Mazaheri i sur., 2005.; Stocholm i sur., 2010.; Eriksson i sur., 2010.). Prema rezultatima testa osjetljivosti napravljenog disk difuzijskom metodom bakterija Erysipelo-thrix rhusiopathiae pokazala je osjetljivost prema deset anti-biotika i to prema ampicilinu, amoksicilinu s klavulanskom kiselinom, penicilinu, trimetoprim-sulfametoksazolu, enro-floksacinu, ciprofloksacinu, norfloksacinu, cefoperazonu, klindamicinu i kloramfenikolu, a neosjetljivost prema tetra-ciklinu, oksitetraciklinu i cefalotinu, što je uglavnom u suglasju s podatcima iz literature (Eriksson i sur., 2010.; Wang i sur., 2010.). Eriksson i sur. (2010.) su testom dilucije odre ivali minimalne inhibitorske koncentacije MIK-ova i utvrdili vrlo niske MIK-ove za penicilin i oksitetraciklin koji u testu disk difuzije nije pokazao u in-kovitost za bakteriju Erysipelothrix rhusiopathiae. Brojni autori navode penicilin kao lijek izbora, ali i oksitetraciklin, tilozin, fluorokinolone i cefalosporine (Eriksson i sur., 2009.; Eriksson i sur., 2013.; Wang i sur., 2010.). Vrsta Erysipelothrix rhusiopathiae osjetljiva je na ve inu raskužnih sredstava u postupku iš enja i raskužbe pa je uvo enje strogih higijenskih i sanitarnih mjera u peradarskoj proizvodnji važna preventiva izbijanja infekcije (Bricker i Saif, 2003.; Wang i sur., 2010.).

Literatura

BRICKER, J. M., Y. M. SAIF, (2003): Erysipelas. U: Diseases of Poultry, 11th ed. Ur. Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R.Glis-son, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne. Iowa State Press, 812-826.

BROOKE, C. J., T. V. RILEY (1999). Erysipelothrix rhusiopathiae: bacteriology, epidemiology and clinical mani-festations of an occupational pathogen. J. Med. Microbiol. 48,789-799.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2012: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty-Second Informational Supplement. M100-S22, Vol. 32 No. 3; Replaces M100-S21, Vol. 31 No.1.

ERIKSSON, H., D. S. JANSSON, K. E. JOHANSON, V. BÄVERUD, J. CHIRICO, A. ASPÁN (2009): Characte-rization of Erysipelothrix rhusiopathiae isolates from poultry, pigs, emus. The poultry red mite and other animals. Vet. Microbiol. 137, 98-104.

ERIKSSON, H., S. BRÄNNSTRÖM, H. SKARIN, J. CHIRICO (2010): Characterization of Erysipelothrix rhusiopathiae isolates from laying hens and poultry red mites (Dermanyssus gallinae) from an outbreak of erysipelas. Avian. Pathol. 39 (6), 505-509.

ERIKSSON, H., A. K. NYMAN, C. FELLSTRÖM, P. WAL-LGREN (2013): Erysipelas in laying hens is associated with housing system. Vet. Rec. 173, 18.

ERIKSSON, H. (2013): Erysipelothrix rhusiopathiae in laying hens. Doctoral Thesis. Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Clinical Sciences, Uppsala, 2013. Sweden.

FOSSUM, O., D. S. JANSSON, P. ENGELSEN ETTERLIN, I. VÅGSHOLM, (2009): Causes of mortality in laying hens in different housing systems in 2001 to 2004. Acta Vet. Scand. 51,3.

KURIAN, A., E. J. NEUMANN, W. F. HALL, D. MARKS (2012). Serological survey of exposure to Erysipelothrix rhusiopathiae in poultry in New Zealand. New Zeal. Vet. J. 60, 106-109.

MAZAHERI, A., M. LIERZ, H. M. HAFEZ (2005): Investigations on the pathogenicity of Erysipelothrix rhusiopathiae in laying hens. Avian Dis. 49, 574-576.

MUTALIB, A. A., J. M. KING , P. M. McDONOUGH (1993): Erysipelas in caged laying chickens and suspected erysipeloid in animal caretakers. J. Vet. Diagn. Invest. 5, 198-201.

NAKAZAWA, H., H. HAYASHIDANI, J. HIGASHI, K. KA-NEKO, T. TAKAHASHI, M. OGAWA (1998a): Occurrence of Erysipelothrix spp. in chicken meat parts from a processing plant. J. Food Protect. 61, 1207-1209.

NAKAZAWA, H., H. HAYASHIDANI, J. HIGASHI, T. KA-NEKO, T. TAKAHASHI, M. OGAWA (1998b): Occurrence of Erysipelothrix spp. in broiler chickens at an abattoir. J. Food Protect. 61, 907-909.

OGAWA, Y., T. OOKA, F. SHI, Y. OGURA, K. NAKAYAMA, T. HAYASHI, Y. SHIMOJI (2011): The genome of Erysipelothrix rhusiopathiae, the causative agent of swine erysipelas, reveals new insights into the evolution of Firmicutes and its intracellular adaptations. J. Bacteriol. 193, 2959-2971.

OPRIESSNIG, T., H. G. SHEN, J. S. BENDER, J. R. BOEHM, P. G. HALBUR (2012): Erysipelothrix rhusiopathiae isolates recovered from fish, a harbour seal (Phoca vitulina) and the marine environment are capable of inducing characteristic


cutaneous lesions in pigs. J. Comp. Pathol. doi:/10.1016/ /j.jcpa.2012.08.004

OPRIESSNIG, T., R. L. WOOD (2012): Erysipelas. In: Zimmer-man, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J. Stevenson, G.W. (eds), Diseases of Swine, Tenth edition. Ames, Iowa: John Wiley & Sons, str. 750-759.

SHIMOJI, Y., Y. YOKOMIZO, T. SEKIZAKI, Y. MORI, M. KUBO (1994): Presence of a capsule in Erysipelothrix rhusiopathiae and its relationship to virulence for mice. Infect. Immun. 62, 2806-2810.

SHIMOJI, Y., Y. YOKOMIZO, Y. MORI (1996): Intracellular survival and replication of Erysipelothrix rhusiopathiae within murine macrophages: failure of induction of the oxidative burst of macrophages. Infect. Immun. 64(5), 1789-1793.

SHIMOJI, Y. (2000): Pathogenicity of Erysipelothrix rhusio-pathiae: virulence factors and protective immunity. Microb. Infect. 2(8), 965-972.

SHIMOJI, Y., H. ASATO, T. SEKIZAKI, Y. MORI, Y. YAMAMOTO (2002): Hyaluronidase is not essential for the lethality of Erysipelothrix rhusiopathiae infection in mice. J. Vet. Med. Sci. 64, 173-176.

SCHMITT, F., B. SCHADE, B. BÖHM, Y. SHIMOJI, C. PFAHLER (2014): Erysipelas in a free-range layer flock with conjunctival oedema as an unusual clinic sign. Berl.. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 127(5-6), 183-187.

STACKEBRANDT, E., A. C. REBOLI, W. E. FARRAR (2006): The genus Erysipelothrix. In: Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H. Stackebrandt, E. (eds), The Prokaryotes. Volume 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria,Third edition. New York: Springer Science, Business Media, LLC, str. 492-510.

STACKEBRANDT, E. (2009): Genus I. Erysipelothrix Rosenbach 1909, 367AL. In: de Vos, P., G. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, L. Ludwig, F. A. Rainey, K.-H. Schleifer, W. B Whitman, 58.

STOKHOLM, N. M., A. PERMIN, M. BISGAARD, J. P. CHRISTENSEN (2010): Causes of mortality in commercial organic layers in Denmark. Avian Dis. 54, 1241-1250.

VERBARG, S., H. RHEIMS, S. EMUS, A. FRÜHLING, R. M. KROPPENSTEDT, E. STACKEBRANDT, P. SCHUMANN (2004): Erysipelothrix inopinata sp. nov., isolated in the course of sterile filtration of vegetable peptone broth, and description of Erysipelotrichaceae fam. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54, 221-225.

WANG, Q., B. J. CHANG, T. V. RILEY (2010): Erysipelothrix rhusiopathiae. Vet. Microbiol. 140, 405-417.

YOSHIHIRIO S., Y. YOKOMIZO, S. TSUTOMU, M. YASUYUKI, K. MASANORI (1994): Presence of a capsule in Erysipelothrix rhusiopathiae and its relationship to virulence for mice. Infect. Immun. 62, 2806-2810.

INFECTION WITH ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE BACTERIUM IN LAYING HENS – CASE REPORT

Summary

A case of Erysipelothrix rhusiopathiae infection in laying hens, hybrid line Tetra SL, aged 60 weeks, is reported. Clinical signs of the disease manifested in the flock as reduced laying performance and increased mortality persisting for about ten days. The pathoanatomical alterations included cachexia, pronounced cyanosis of mucous membranes, head and neck skin, signs of sepsis, hyperemic spleen tumor, liver enlargement and perfusion, and in one case liver necrosis and inflammation of the ovaries and oviducts. On bacteriological analysis, Erysipelothrix rhusiopathiae was isolated from all four livers, three spleens and two ovaries. The bacterium was identified by biochemical characterization using the API Rapid ID 32 STREP set. Tests for catalase and oxidase production as well as the motility test were negative. Curved and thread-like gram-positive rods were detected in the smears prepared from pure bacterial culture and stained according to Gram. The antimicrobial susceptibility test showed the Erysipelothrix rhusiopathiae species to be susceptible to ten and resistant to three antimicrobials.

Key words: Erysipelothrix rhusiopathiae, laying hens, infection


STANJE I GOSPODARSKE PERSPEKTIVE UZGOJA ZAGORSKOG PURANA U VARAŽDINSKOJ ŽUPANIJI

Vladimir Kure i 1, Zlatko Janje i 2, Stjepan Mužic2, Zoran Grgi 2, Dalibor Bedekovi 2

1 Vladimira Nazora 71, Petrijanec, Hrvatska 2 Agronomski fakultet, Sveu ilište u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Puran se na širem podru ju Hrvatskog zagorja uzgaja od 16. stolje a. Nakon otkri a Novog svijeta vjerojatno je iz Srednje Amerike brodovima stigao u Europu, najvjerojatnije u Španjolsku, zatim u Englesku pa u Njema ku i Italiju, odakle se proširio i u naše krajeve. S vremenom se udoma io, nije se križao s drugim pasminama pa je specifi an uzgoj u malim jatima koja su ve i dio života provela na otvorenom u prirodi skupljaju i hranu uvjetovao razvoj specifi nih morfoloških i fizioloških svojstava. Utjecao je na kvalitetu mesa, po emu je zagorski puran poznat te se smatra specijalnom pasminom u gospodarskom smislu, a u uz to ima i veliko zna enje kao vrijedan element biološke raznolikosti Hrvatske. U prošlosti se ova izvorna pasmina peradi slabo izu avala, tek nešto prije drugog svjetskog rata, iako je tada predstavljala zna ajan izvozni proizvod tradicionalnog uzgoja u zemlje zapadne Europe. Od drugog svjetskog rata do sredine devedesetih godina prošloga stolje a zagorski puran gotovo je izumro i nestao. Svojom inicijativom i stru noš u, koncem devedesetih godina prošloga i po etkom ovoga stolje a spasili su ga pojedini entuzijasti i stru njaci Agronomskog fakulteta u Zagrebu. Od tada se zagorski puran ozbiljnije istražuje, podupire i promovira, iako mu broj jedinki još uvijek varira na godišnjoj razini. U svakom je slu aju spašen, ak je u nekim inicijativama povremeno bio i ozbiljna robna marka kojoj, na kraju se pokazalo, treba stabilnost i kontinuitet uzgoja. Ovaj rad prikazuje stanje i gospodarske perspektive zagorskog purana u Varaždinskoj županiji.

Klju ne rije i: zagorski puran, biološka raznolikost, tradicionalni uzgoj, Varaždinska županija

Uvod

Moderna peradarska proizvodnja u zatvorenim objektima sa strogo kontroliranim mikroklimatskim uvjetima i s visoko selekcioniranim hibridnim linijama purana dosegla je fantasti ne proizvodne rezultate te predstavlja bazu za prehrambenu industriju i prakti ki svakodnevnu prehranu velikog broja ljudi. Me utim, paralelno sa specijaliziranom industrijskom proizvodnjom peradi sve se više javlja svijest i potreba za proizvodima dobivenim ekstenzivnom proizvodnjom, „u prirodi“, od autohtonih odnosno izvornih pasmina peradi, ije su vrijednosti i zna enje nemjerljivi i dragocjeni iz puno aspekata. Jedna od takvih pasmina peradi je i zagorski puran koji se nekoliko stotina godina uzgaja na podru ju Hrvatskog zagorja, bez miješanja s drugim pasminama, u malim jatima koja ve inu života

provode u prirodi na otvorenom, što je stvorilo specifi na morfološka i fiziološka svojstva te utjecalo na kvalitetu mesa (Janje i i Mužic, 2007.). O toj „zagorskoj“ ptici malo se istraživalo, tek nešto u prvoj polovici 20. st., da bi ga ugroženog, prorije enog i gotovo zaboravljenog „iz pepela“ podigli entuzijasti pojedinci, a naro ito stru njaci Agronomskog fakulteta u Zagrebu koncem devedesetih godina prošloga i po etkom ovoga novog stolje a. Zagorski puran je „preživio“ i opstao, ali i dalje proživljava oscilacije u svom broju i korištenju. Cilj rada bio je utvrditi broj ano stanje zagorskih purana koji se uzgajaju na podru ju Varaždinske županije, broj uzgajiva a, ostale podatke važne za organizaciju uzgoja te ekonomsku isplativost proizvodnje zagorskog purana na obiteljskim gospodarstvima.

prof. dr. sc. Zlatko Janje i , Sveu ilište u Zagrebu, Agronomski fakultet, Zavod za hranidbu životinja, Svetošimunska 25, 10000 Zagreb, Republika Hrvatska; tel.: +385 (0) 1 239 3951, faks: +385 (0) 1 239 3932, e-mail: [email protected]

STANJE I GOSPODARSKE PERSPEKTIVE UZGOJA ZAGORSKOG PURANA U VARAŽDINSKOJ ŽUPANIJI 50

Materijal i metode

Podaci su dobiveni iz vlastitog istraživanja, iz godišnjih izvještaja Hrvatske poljoprivredne agencije (HPA) te iz podataka udruga i zadruga koje se bave uzgojem zagor-skog purana na podru ju Varaždinske županije. Izvršen je obilazak uzgajiva a zagorskih purana na podru ju Varaž-dinske županije, pri emu su metodom ankete prikupljeni podaci o broj anom stanju purana, broju uzgajiva a, veli-ini obiteljskih gospodarstava, kao i mnogi drugi podaci

vezani uz sadašnjost i budu nost uzgoja. U vezi s ekonom-skom isplativosti korištene su metode kalkulacije varija-bilnih troškova (Grgi , 1998.).

Rezultati istraživanja i rasprava

U tablici 1. prikazan je broj uzgajiva a iji su purani u se-lekcijskom obuhvatu umati eni i prstenovani u Varaždin-skoj županiji od 2001. do 2013. godine (HPA, 2014.). Radi se u pravilu o obiteljskim gospodarstvima s po 9-10 klju-nova, dakle s dva mati na jata, s jednim puranom i etiri do pet purica u svakom jatu. Interes za selekcijski obuhvat od strane uzgajiva a znatno varira ovisno o razini organi-ziranosti kroz udruge ili zadruge i o iznosu poticaja koji su od samog po etka varirali u varijantama: 140/110 kn, 90/90 kn, 150/110 kn, 150 kn po puranu i purici (u ovom slu aju 750 kn po jatu) službeno, ali u stvarnosti puno ma-nje uz zakašnjelo i neizvjesno pla anje od strane države, obveze upisivanja u upisnik i sli ne administrativne pro-cedure itd.Tablica 2. daje prikaz ukupnog i prosje nog broja jaja i puri a po puri u Varaždinskoj županiji od 2009. do 2013. godine (HPA, 2014.). Iako je broj nasa enih jaja bio go-

tovo identi an 2009. i 2013. godine broj odgojenih puri a u 2013. godini bio je ve i u prosjeku za 4 komada. Dobiveni se rezultati najvjerojatnije mogu pripisati boljoj izobrazbi samih uzgajiva a te primjeni dobivenih spoznaja u prijmu jednodnevnih puri a te uzgoju u toploj fazi.

Tablica 1. Broj uzgajiva a i broj umati enih zagorskih pu-rana u Varaždinskoj županiji od 2001. do 2013., HPA 2014.

Table 1. Number of growers and number of registered Zagorje Turkey in Varaždin County, 2001-2013 (HPA 2014)

GodinaYear

Broj uzgajiva aNumber of growers

Broj purana Number of turkeys

2001. 51 490 2002. 102 985 2003. 65 543 2004. 62 503 2005. 51 486 2006. 49 466 2007. 45 343 2008. 75 760 2009. 103 904 2010. 96 989 2011. 101 905 2012. 74 654 2013. 59 528

Tablica 2. Ukupan i prosje an broj jaja i puri a po puri, HPA 2014.

GodinaSnesena

jaja Nasa ena

jaja Izvaljano

puri aOdgojeno

puri a

2009.Ukupno 13903 12757 9543 8423

Prosje no po puri 18,39 16,87 12,62 11,15

2010.Ukupno 13457 12522 10022 8674

Prosje no po puri 16,72 15,56 12,45 10,78

2011.Ukupno 13559 13451 12767 12041

Prosje no po puri 17,84 17,70 16,80 15,75

2012.Ukupno 9514 8945 8567 8404

Prosje no po puri 18,90 18,43 17,58 17,37

2013.Ukupno 9007 8707 8163 7889

Prosje no po puri 17,25 16,68 15,64 15,11


Table 2. Total number of eggs and poults per female turkey (HPA 2014)

Year Laid eggs Hatching eggs Hatched poults Alive poults

2009Total 13903 12757 9543 8423

Mean per female turkey 18.39 16.87 12.62 11.15

2010Total 13457 12522 10022 8674


2011Total 13559 13451 12767 12041


2012Total 9514 8945 8567 8404


2013Total 9007 8707 8163 7889


Anketom je obuhva eno 50 gospodarstava, ve inom onih koji su u selekcijskom obuhvatu, ali i dijelom onih koji nisu. Status gospodarstva je uglavnom OPG, a prosje na dob uzgajiva a na anketiranim gospodarstvima iznosi 50 godina. Velik broj uzgajiva a je prošla dodatnu izobrazbu o uzgoju zagorskih purana putem koje su puno nau ili i u pozitivnom smislu promijenili pristup uzgoju. Iz provedene je ankete vidljivo da se zagorski puran uzgaja na cijelom podru ju Varaždinske županije: od Varaždina na sjeveru do Breznice i Mirkovca na jugu, od Bednje na zapadu do Ludbrega i Hrženice na istoku, u stotinjak sela kod dvjestotinjak uzgajiva a od kojih je oko 150 prošlo kroz selekcijski obuhvat. Oko 50 uzgajiva a s jednim jatom nije ulazilo u obuhvat koji purane uzgajaju isklju ivo za sebe i svoju obitelj. Radi se esto o rubnim dijelovima županije sa starijim nositeljima gospodarstva. Broj mati nih jata u do-ma instvu kre e se u rasponu od 1 do 4. Zbrojeno, radi se dakle o ukupno 288 rasplodnih purana i 992 pure od kojih se godišnje uzgoji oko 13.000 kljunova. Od ukupnog broja ras-plodnih zagorskih purana i pura bron anom je soju pripadalo 52%, sivom soju 27%, crnom soju 13%, a svijetlom soju 12% životinja. Purice u prosjeku zapo inju s nesenjem jaja polovicom ožujka. Vrlo mali broj uzgajiva a stimulira raniju nesivost i produljenje sezone nesenja produljenjem svjetlosnog dana. Prosje ni broj snesenih jaja po puri u proljetnoj sezoni ne-senja ve i je od podataka HPA i iznosi preko 20 jaja. Broj nasa enih jaja po puri iznosi 15-19 (prosje no 17). Ve ina uzgajiva a inkubira jaja prirodno, dok samo 5 uzgajiva ainkubira u inkubatoru za sebe i iz usluge. Prosje an broj izvaljenih puri a odgovara podacima HPA. Prosje nasmrtnost iznosi 8%. Oko 60% uzgajiva a preventivno cijepi purane tijekom uzgoja protiv pojave zaraznih bolesti. U posljednje vrijeme provodi se stroga sanitacija objekta kako bi se sprije ila pojava i širenje bolesti. Velika ve ina uzga-jiva a u slu aju ve ih zdravstvenih problema konzultira se sa stru njacima. Površina zatvorenog objekta u kojem bo-rave purani kre e se od 20 do 40 m2. Površina ispusta za

napasivanje purana tijekom tzv. hladne faze uzgoja varira od 0,5 ha do 1,5 ha. Više od 90% uzgajiva a u po etku purane hrane kompletnim krmnim smjesama, a kasnije kombinaci-jom krmne smjese, kukuruza, je ma, sojine sa me, mine-ralnog dodatka i hrane iz prirode (djetelina, sto ni kelj i sl.). Za prodaju su svi uzgojeni purani osim mati nog jata i osobnih potreba. Klanje purana je u preko 90% samostalno, „ilegalno“; tek 10-ak % purana klano je legalno uz vete-rinarski nadzor i to purani kod uzgajiva a organiziranih u dvije zadruge, od kojih je jedna prestala s radom, a druga posluje reducirano. Na in prodaje purana je uglavnom dogo-vorom osobno i narudžbom, dok je organizirana prodaja u malom postotku putem zadruga. Jednodnevni se purani prodaju po cijeni od oko 25 kn, sedmodnevni puri i 30-35 kn, dok o iš ena purica od 2,5-3 kg postiže cijenu od 60 kn/kg, a o iš eni puran od oko 4 kg cijenu od 55 kn/kg. Gledaju i ukupne rezultate provedene ankete vidljivo je da su uzgoj i proizvodnja zagorskog purana na podru juVaraždinske županije unato oscilacijama ustaljeni te da su razlozi oscilacija pa i povremenih stagnacija nedvojbeno i ti što i ova proizvodnja prati trenutno ekonomsko stanje u društvu (pad kupovne mo i). Velika ve ina uzgajiva a za-zire od papirologije i striktnih ( esto kompliciranih i nepo-trebnih) propisa (obnova certifikata svake godine, papiro-logija, upisnik, premije za mati no jato koje kasne i oscili-raju, obveza da se mati no jato drži do 31. prosinca nakon ega ga je teško prodati itd.). Unato tome proizvodnja se

ustalila, uzgajiva i su obazovaniji i spremni u iti, a svoju proizvodnju smatraju dobrim dodatnim prihodom, iako pove anje proizvodnje – eka neko „bolje vrijeme“. U tablici 3. je prikazan izra un i usporedba prihoda i troškova proizvodnje na razini 2 i 4 mati na jata. Bruto dohodak je kod dva jata iznosio 9.770,00 kn, a kod etiri jata 22.440,00 kn te su svi ekonomski pokazatelji vrlo dobri u obje ispitivane veli ine jata, pri emu se u ve em jatu ostvaruju bolji rezultati. To je vidljivo kroz ve e vrijednosti ekonomi nosti i rentabilnosti, što u kona nici rezultira i nižom cijenom.


Tablica 3. Izra un i usporedba prihoda i troškova proizvodnje kod 2 i 4 mati na jata

2 jata (8 pura x 14 puri a)112 purana

4 jata (16 pura x 14 puri a)224 purana

UKUPNI PRIHOD 24.950,00 kn 49.900,00 kn Uzgojeni purani 112 x 4 kg x 50 kn= 22.400,00 kn 224 x 4 kg x 50 kn = 44.800,00 kn Izlu eni purani 50 kg x 30 kn = 1500,00 kn 100 kg x 30 kn = 3000,00 kn Jaja 60 x 5 kn = 300,00 kn 120 x 5 kn = 600,00 kn Poticaji 750,00 kn 1.500,00 kn UKUPNI RASHOD 15.180,00 kn 27.460,00 kn Vlastita sto na hrana 20 kn x 112 = 2.240,00 kn 20 kn x 224 = 4.480,00 kn Kupljena sto na hrana 45 kn x 112 = 5.040,00 kn 45 kn x 224 = 10.080,00 kn Stelja 25 m3 x 4 kn = 100,00 kn 50 m3 x 4 kn = 200,00 kn Lijekovi i preventiva 600,00 kn 1200,00 kn Energija 500,00 kn 1000,00 kn Rad 240 h x 20 kn = 4.800,00 kn 360 h x 20 kn = 7.200,00 kn Ostalo 500,00 kn 500,00 kn Usluga klanja 12,5 kn / kljun = 1.400,00 kn 12,5 kn / kljun = 2.800,00 kn BRUTO DOHODAK (prihodi - rashodi) 9.770,00 kn 22.440,00 kn EKONOMI NOST (uk. prihodi / uk. troškovi) 1,64 1,82 RENTABILNOST (% = dobitak / uk. troškovi) 64,36 % 81,72 % CIJENA KOŠTANJA 135,0 kn/puran 122,6 kn/puran

Table 3. Calculation and comparison of income and production costs at 2 and 4 breeding flock

2 flock (8 female turkeys x 14 poults) 112 turkeys

4 flock (16 female turkeys x 14 poults) 224 turkeys

TOTAL INCOME 24,950.00 kn 49,900.00 kn Grown turkeys 112 x 4 kg x 50 kn = 22,400.00 kn 224 x 4 kg x 50 kn = 44,800.00 kn Secreted turkeys 50 kg x 30 kn = 1500.00 kn 100 kg x 30 kn = 3000.00 kn Eggs 60 x 5 kn = 300.00 kn 120 x 5 kn = 600.00 kn Government incentives 750.00 kn 1,500.00 kn PRODUCTION COSTS 15,180.00 kn 27,460.00 kn Own animal feed 20 kn x 112 = 2,240.00 kn 20 kn x 224 = 4,480.00 kn Bought animal feed 45 kn x 112 = 5,040.00 kn 45 kn x 224 = 10,080.00 kn Bedding 25 m3 x 4 kn = 100.00 kn 50 m3 x 4 kn = 200.00 kn Veterinary costs 600.00 kn 1200.00 kn Energy 500.00 kn 1000.00 kn Labour 240 h x 20 kn = 4,800.00 kn 360 h x 20 kn = 7,200.00 kn Other 500.00 kn 500.00 kn Service of slaughter 12,5 kn / head = 1,400.00 kn 12,5 kn / head = 2,800.00 kn GROSS INCOME (income - costs) 9,770.00 kn 22,440.00 kn ECONOMY (tot. income/tot. costs) 1.64 1.82 RENTABILITY (% = gain/total costs) 64.36% 81.72% PRICE 135.0 kn/turkey 122.6 kn/turkey


Zaklju ak

Na temelju podataka dobivenih iz vlastitog istraživanja te podataka HPA možemo zaklju iti da je u usporedbi s vremenom kada se zagorski puran tek po eo istraživati i kada je bio ugrožen njegov opstanak danas zagorski puran na podru ju Varaždinske županije nije ugrožen, štoviše, uz o ekivane oscilacije stabiliziran je njegov broj i uzgoj. Uzgoj zagorskih purana je dobar dodatni prihod, jer je proizvodnja zagorskog purana isplativa, uz prednost uzgoja ve eg jata, jer proizvodnost, ekonomi nost i rentabilnost

rastu s pove anjem broja purana u uzgoju, dok istodobno cijena pada.

Literatura

GRGI , Z. (1998): Analiza poslovanja poljoprivrednog po-duze a, Sveu ilište u Zagrebu, Agronomski fakultet, interna skripta.

HPA (2014): Godišnje izvješ e.JANJE I , Z, S. MUŽIC (2007): Phenotypic traits in Zagorje

turkey. Agriculture. 13:205-208.

SITUATION AND ECONOMIC PERSPECTIVES OF ZAGORJE TURKEY REARING IN VARAŽDIN COUNTY

Summary

Turkey has been raised as poultry across most of the Croatian region known as Hrvatsko Zagorje since the 16th century when, after the discovery of the New World, it was brought on ships, most probably from Central America, to Europe: first to Spain, then England, Germany and Italy. Since then, it has been domesticated and has not been cross-bred with other breeds and has been specifically bred in small, free range flocks where they can naturally peck for food. This has conditioned the development of certain morphological and physiological properties and influenced the quality of meat for which Zagorje Turkey is widely renowned and considered a special breed, not only economically but also as a valuable element of Croatian biodiversity. In the past, original breeds of domestic poultry have been insufficiently researched, i.e. there were only a few attempts prior to the outbreak of World War 2, despite the fact that it represented a significant part oftraditional product exports to Western Europe. From the end of World War 2 to the mid 1990s, the Zagorje Turkey almost became extinct and practically disappeared, and it took the initiative and expertise of various enthusiasts and experts from the Faculty of Agriculture of the University of Zagreb from the end 1990s and early 2000s onwards to save it. Since then, the Zagorje Turkey has been seriously researched, supported and promoted, and even though the numbers of individual turkeys saved have varied, the breed has been saved for the future. There have been occasional initiatives in which it was treated as a brand requiring stability and continuity of breeding. This paper aims to establish the situation and economic prospects of Zagorje Turkey in the County of Varaždin.

Key words: Zagorje Turkey, special breeds, biological diversity, traditional farming, Varaždin County


BAKTERIJSKI UZRO NICI ZARAZNIH BOLESTI KOJE SE PRENOSE HRANOM U ISTARSKOJ ŽUPANIJI (2010.-2014.)

Lorena Lazari -Stefanovi , Jasmina Ku inar

Zavod za javno zdravstvo Istarske županije, Pula, Hrvatska

Sažetak

Naj eš i bakterijski uzro nici bolesti koje se prenose hranom su bakterije roda Salmonella i Campylobacter. Ove se bakterije šire kontaminiranom hranom i predstavljaju važan uzrok zoonoza diljem svijeta. U cilju sprje avanja širenja ovih uzro nika potrebne su este i brojne intervencije. Jedna od njih je serotipizacija Salmonella spp. radi definiranja izvora zaraze. Statisti ki podaci rezultata tipizacije pokazuju razli ite distribucije serotipova Salmonella spp., ali je u velikoj ve ini zemalja S. enteritidis naj eš i serotip. Tijekom petogodišnjeg razdoblja (2010.-2014.) u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija Zavoda za javno zdravstvo Istarske županije (ZZJZIŽ) izolirane su bakterije roda Salmonella, Campylobacter, enterohemoragi ni sojevi Escherichia (E.) coli (EPEC) i sojevi roda Yersinia kao naj eš iuzro nici zaraznih bolesti koje se prenose hranom. Najve i udio me u bakterijskim uzro nicima imaju bakterije roda Salmonella. Posljednjih godina udio bakterija roda Campylobacter sve je ve i i u estalost je gotovo izjedna ena s pojavnosti salmonela. Iako se u terapiji crijevnih zaraznih bolesti antimikrobni lijekovi iznimno rijetko preporu uju, svi izolirani sojevi u našem laboratoriju testiraju se na osjetljivost na antimikrobne lijekove radi pra enja rezistencije u Republici Hrvatskoj. Navedena testiranja pokazala su porast rezistencije sojeva roda Salmonella na ampicilin, ampicilin s klavulanskom kiselinom i nalidiksi nu kiselinu, u usporedbi s rezultatima dobivenim pra enjem osjetljivosti u cijeloj državi.

Klju ne rije i: Salmonella, Campylobacter, trovanje hranom, alimentarna toksikoinfekcija

Uvod

Zarazne bolesti koje se prenose hranom nazivamo još i alimentarnim toksikoinfekcijama ili trovanje hranom. Mnogi su patogeni mikroorganizmi sposobni izazvati trovanje hranom u ljudi. Naj eš e su to bakterije roda Salmonella, Campylobacter, Shigella, bakterije Escherichia (E.) coliO157:H7 i Staphylococcus (S.) aureus te grupa Calicivirusa, poznatih kao Norwalk ili Norwalku-sli ni virusi. Izvori zaraze mogu biti ljudi i životinje, a zoonoze se naj eš eprenose nedovoljno termi ki obra enom kontaminiranom hranom (npr. jaja i meso). Prema izvješ ima EFSA-e (engl. European Food Safety Authority) i ECDC-a (engl. European Centre for Disease Prevention and Control) o trendovima i izvorima zoonoza, uzro nika i pojavi bolesti uzrokovanih hranom, kampilo-bakterioza je ve dugi niz godina naj eš a zoonoza, nakon koje slijede salmoneloza, jersinizioza, VTEC infekcije

(infekcije verocitotoksigenim sojevima E. coli), listerioza i druge zoonoze, pri emu se hrana (osobito hrana animalnog podrijetla) smatra jednim od glavnih izvora zaraze. Tako je tijekom 2013. godine dokazana u estalost patogenih sojeva bakterije Campylobacter u 31,4% uzoraka svježeg mesa peradi, a u slu ajevima pojave bolesti u ljudi u 2013. godini (64,8 oboljelih na 100.000 ljudi) izvor zaraze bili su meso peradi, proizvodi od mesa peradi, mlijeko, a rje e ostale vrste hrane. Istodobno, za salmonele je zabilježena u estalost obolijevanja u ljudi od 20,4 slu aja na 100.000 ljudi. Naj eš e izolirani serotipovi bili su S. Enteritidis i S.Typhimurium. U hrani, salmonela je naj eš e izdvojena iz mesa peradi i svinja, rje e iz mesa drugih vrsta životinja i jaja, iako se jaja i proizvodi od jaja i dalje smatraju glavnim uzrokom obolijevanja u ljudi (44,9% slu ajeva obolijevanja u ljudi). Nadalje, VTEC infekcije u ljudi dokazane su u 1,59 slu ajeva na 100.000 ljudi, a izvor zaraze su naj eš e pro-izvodi animalnog podrijetla (meso i mlijeko) te u manjem broju povr e, sokovi i sirevi. Uz navedeno, velik broj

mr. sc. Lorena Lazari -Stefanovi , dr. med. spec. medicinske mikrobiologije s parazitologijom. Služba za mikrobiologiju, Zavod za javno zdravstvo Istarske županije; Nazorova 23, Pula; tel: 052/529 000; fax: 052/529-089; e-mail: [email protected]

BAKTERIJSKI UZRO NICI ZARAZNIH BOLESTI KOJE SE PRENOSE HRANOM U ISTARSKOJ ŽUPANIJI (2010.-2014.) 55

izoliranih sojeva patogenih bakterija pokazuje rezistenciju na ve inu antimikrobnih lijekova umanjuju i time uspješ-nost lije enja infekcija u ljudi. Kako se upotreba antimikrobnih lijekova u farmski držanih životinja povezuje s nastankom rezistencije u sojeva koji uzrokuju infekcije u ljudi, važno je istodobno pratiti ne samo u estalost sojeva i njihove karakteristike, ve i njihovu osjetljivost na antimikrobne lijekove (ECDC, 2013.; EFSA, 2014.). Klini ke manifestacije ovih zaraznih bolesti u ljudi mogu se podijeliti na intestinalne i izvanintestinalne. Naj eš a inte-stinalna manifestacija je gastroenteritis obilježen povišenom tjelesnom temperaturom, abdominalnim bolovima, prolje-vom koji zapo inje 6-48 sati od konzumirannja kontami-nirane hrane, mu ninom i povra anjem. Izvanintestinalne klini ke slike karakteriziraju sepsa, infekcija rana, infekcija mokra nog trakta i meningitis. Uz navedeno, mogu e su i neinfektivne posljedice poput sindroma iritabilnog kolona, hemoliti ko-uremi nog sindroma, reaktivnog artritisa i Guillain-Barréova sindroma (Kuzman, 2012.). Dokazivanje uzroka svakog gastroenteritisa u klini koj prak-si zapo inje mikrobiološkom dijagnostikom, tj. dokaziva-njem bakterija, virusa i/ili parazita u uzorku stolice ili brisu rektuma. U Istarskoj županiji mikrobiološka analiza stolice kako kod bolni kih (Op a bolnica Pula) tako i izvan-bolni kih pacijenata obavlja se u Laboratoriju za bak-teriološku dijagnostiku crijevnih zaraznih bolesti, pri Službi za mikrobiologiju Zavoda za javno zdravstvo Istarske županije. Naj eš e izolirani uzro nici trovanja hranom u Istarskoj županiji su bakterijski uzro nici Salmonella spp. i Campylobacter spp., što odgovara trendovima u svijetu. Radi brzog prepoznavanja epidemija i svih pacijenata koji su oboljeli, kreiranja kvalitetne ankete te radi brzog do-kazivanja izvora (uzroka) infekcije sve izolirane sojeve bakterija roda Salmonella neophodno je serotipizirati. Cilj ovoga rada je dati pregled u estalosti i zna ajke izdvojenih patogenih mikroorganizama koji se prenose hranom u ljudi na podru ju Istarske županije s osvrtom na antimikrobnu rezistenciju izdvojenih bakterija.

Materijal i metode

Uzorci stolica bolni kih i izvanbolni kih pacijenata te osoba pod zdravstvenim nadzorom koji dolaze u Laboratorij za bakteriološku dijagnostiku crijevnih zaraznih bolesti istoga se dana mikrobiološki analiziraju prema zahtjevu klini ara ili epidemiologa koji je pacijenta pregledao. Anketiranjem oboljelih u ve ini slu ajeva nije bilo mogu e otkriti izvor zaraze, a samo u manjem broju slu ajeva dokazano je trovanje hranom.Bakteriološka analiza stolice podrazumijeva standardne po-stupke predoboga ivanja i oboga ivanja pomo u odre enih

hranjivih bujona i podloga i izolaciju sojeva te njihovu daljnju biokemijsku, mikroskopsku ili serološku tipizaciju. Isto se postiže nacjepljivanjem uzorka stolice na dife-rencijalne i selektivne podloge radi dokazivanja bakterija roda Salmonella, Shigella, Campylobacter, EPEC sojeva (enterohemoragi na E. coli), VTEC sojeva i bakterija roda Yersinia.Primjerice, za dokaz Salmonella spp. i Shigella spp. koriste se SS (Salmonella-Shigella agar) i XLD (xylose lysine deoxycholate agar) kruti agar te teku i Selenit-T bujon. Sumnjive kolonije nacijepe se na KIA (Kligler Iron Agar), a identifikacija podrazumijeva odre ivanje biokemijskih karakteristika izraslih kolonija te serotipizaciju sojeva Salmonella ili Shigella.Za dokazivanje bakterija roda Campylobacter koristi se Karmali agar koji se inkubira u mikroaerofilnim uvjetima pri 42 ºC kroz 48 sati. Sumnjive kolonije se mikroskopiraju, a definitivna identifikacija se provodi dokazivanjem bio-kemijskih osobina soja. Postupak izolacije patogenih sojeva bakterije E. coli provodi se pomo u rutinskog agara za enterobakterije s laktozom (koji ne razlikuje patogene od nepatogenih sojeva bakterije E. coli). Identifikacija se provodi dokazivanjem biokemijskih osobina soja, a svaka se bakterija E. coli serotipizira odgovaraju im antiserumima. Za izolaciju bakterije Yersinia enterocolitica koristi se CIN agar (Cefsulodin Irgasan, Novobiocin agar), identifikacija se provodi dokazivanjem biokemijskih karakteristika i sero-tipizacijom. Ako klini ar ili epidemiolog sumnja na druge infekcije uzrokovane bakterijama roda Clostridium, stolica se pretražuje postupkom selekcije spora i inokuliranja uzorka na selektivne podloge za Clostridium perfringens iClostridium difficile te inkubacijom u anerobnim uvjetima. Hospitaliziranim pacijentima se istodobno u ini i testiranje stolice na toxin Cl. difficile, što ima puno ve e dijagnosti kozna enje. Po potrebi se pretrage mogu proširiti na ostale uzro nike crijevnih zaraznih bolesti kao što su Bacillus cereus i Vibrio spp. (Isenberg, 1995.; Blom i sur., 1999.; Grimont i Weill, 2007.; OIE, 2014.; EFSA, 2014.; EUCAST, 2015.). Svim sojevima bakterija roda Salmonella, Campylobacter iEPEC sojevima ispituje se osjetljivost na antimikrobne lije-kove standardnim postupkom disk difuzije prema EUCAST-u (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) kako bi se pratila osjetljivost (rezistencija) sojeva bakterija izoliranih na podru ju Istarske županije na odabrane antimikrobne lijekove (EUCAST, 2015.). U razdoblju od 2010. do 2014. godine u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija Zavoda za javno zdravstvo Istarske županije (ZZJZIŽ) obra eno je ukupno 179718 uzoraka, a broj bakterioloških pretraga po godinama prikazan je u tablici 1.


Tablica 1. Broj bakterioloških pretraga iz uzoraka stolice dostavljenih u Laboratorij za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014. godine

Table 1. Bacteriologic analyses performed on stool samples at the Laboratory of Bacteriologic Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian County Public Health Institute (2010-2014)

Godina / Year Pacijenti / N of patients Osobe pod zdravstvenim nadzorom / N of persons under health surveillance Ukupno / Total

2010. 4604 29687 34291 2011. 4897 30308 35205 2012. 4717 31263 35980 2013. 4166 32986 37152 2014. 4019 33071 37090

Rezultati i rasprava

Rezultati bakterioloških analiza tijekom petogodišnjeg razdoblja (2010.-2014.) U petogodišnjem razdoblju postoji lagani trend porasta broja pretraga u korist osoba pod zdravstvenim nadzorom (tablica 1.). Bakteriološkom analizom uzoraka stolice naj eš e su izolirane bakterije roda Salmonella iCampylobacter te toksin Cl. difficile. Na slici 1. prikazan je ukupni broj izoliranih sojeva pojedinih bakterija kroz petogodišnje razdoblje, a na slici 2. udio pojedinih vrsta bakterija u istom razdoblju. Iz prikazanih rezultata vidljivo je da se broj izoliranih bakterija roda Salmonella znatno smanjio u posljednje tri godine, dok je broj izolata bakterija roda Campylobacter ostao približno isti, ime je došlo do promjene udjela ovih uzro nika crijevnih zaraznih bolesti. Godine 2010. od svih izoliranih uzro nika zaraznih bolesti koje se prenose hranom udio bakterija roda

Salmonella bio je 75,21%, a Campylobacter 22,73%. Godine 2014. udio ovih dviju vrsta se gotovo izjedna io (Salmonella spp. 44,10%, a Campylobacter spp. 42,86%). Prema izvještaju ECDC-a za 2012. godinu potvr eno je da je broj slu ajeva kampilobakterioza u ljudi u Europskoj Uniji (EU) smanjen u odnosu na 2011. godinu, ali je kampilobakterioza u ljudi i dalje najzastupljenija zoonoza s 214.268 prijavljenih slu ajeva. Isti izvještaj objavljuje i pad pojave salmoneloza u ljudi za 4,7% u odnosu na 2011. godinu. Statisti ki zna ajno smanjenje salmoneloza u EU primije eno je u razdoblju od 2008.-2012. godine (ECDC, 2013.; EFSA, 2013.; 2014.). Za razliku od ECDC-a, ameri ki CDC (engl. Centre for Disease Prevention and Control) u svom godišnjem izvještaju za 2011. objavljuje da su salmonele naj eš ibakterijski uzro nik trovanja hranom, a kampilobakteri drugi po redu uzro nik ovih zoonoza koje su završile hospitalizacijom (CDC, 2011.; ECDC, 2013.).

Slika 1. Broj izoliranih bakterija po vrstama u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014.

Figure 1. Number of isolates by species in the Laboratory for Bacteriological Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian County Public Health Institute (2010-2014).


Slika 2. Udio pojedinih vrsta bakterija izoliranih u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014.

Figure 2. Rates of isolates by species in the Laboratory for Bacteriological Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian CountyPublic Health Institute (2010-2014).

Slika 3. Serotipovi vrste Salmonella species subsp. enterica u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014.

Figure 3. Salmonella species subsp. enterica serotypes isolated in the Laboratory for Bacteriological Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian County Public Health Institute (2010-2014).


Izolirani sojevi vrste Salmonella enterica subsp. enterica rutinski se serotipiziraju pomo u antiseruma za dokaz serotipova. Slika 3. prikazuje naj eš e izolirane serotipove vrste Salmonella u Laboratoriju za bakteriološku di-jagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014. Iz prikazanih rezultata jasno je vidljivo da je naj eš e izolirani serotip S. Enteritidis, kao i u ostalim zemljama EU. Serotip S. Typhimurium je drugi po u e-stalosti u EU, a u Istarskoj županiji je tako er bio drugi po u estalosti do 2012. godine, nakon ega se vrlo rijetko izo-lira. Monofazna varijanta S. ser. Typhimurium O:4,[5]:i:- je u porastu kako u EU tako i kod nas. Iako je u godišnjem

epidemiološkom izvještaju ECDC-a za 2011. godinu prijavljeno 157% više oboljelih od ovoga serotipa u odnosu na 2010. godinu, ovaj veliki skok u postotku pojavio se zbog dviju velikih epidemija u Francuskoj (ECDC, 2013.). Od ostalih uzro nika analiziraih tijekom navedenog petogodišnjeg razdoblja pri identifikaciji sojeva Campylobacter spp. izolirane su samo dvije vrste: C. jejuni i C. coli. Istodobno, Yersinia enterocolitica izolirana je u samo dva uzorka, a EPEC sojevi u 18 ispitanih uzoraka, od ega su naj eš e zastupljene bile bakterije E. coli O111,

O103 i O55.

Tablica 2. Salmonella spp. – rezistencija na antibiotike u razdoblju 2010.-2013. godine (zbirni prikaz izolata u 40 centara u RH) Table 2. Salmonella spp. – susceptibility testing results 2010-2013 (results from 40 centers in Croatia)

Antibiotik / Antibiotic 2010. 2011. 2012. 2013.

Ampicilin / Ampicillin 10% 10% 10% 10%

Amp+klav. kiselina / Amoxicillin +clav. acid 0% 1% 1% 1%

Nalidiksi na kiselina / Nalidixic acid 2% 2% 2% 2%

Sulfo+trimetoprim / Co-trimoxazole 2% 3% 2% 3%

Ciprofloksacin / Ciprofloxacin 0% 0% 0% 0%

Ceftazidim / Ceftazidime 0% 0% 0% 0%

Ceftriakson / Ceftriaxone 0% 0% 0% 0%

Tablica 3. Broj sojeva Camylobacter spp. izoliranih u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014.

Table 3. Camylobacter spp. isolated in Laboratory for Bacteriological Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian County Public Health Institute (2010-2014)

Godina / Year C. coli C. jejuni Ukupno/Total

2010. 3 52 55

2011. 5 66 71

2012. 3 56 59

2013. 1 35 36

2014. 6 63 69

Rezultati pra enja osjetljivosti izoliranih bakterijskih sojeva na antimikrobne pripravke tijekom petogodišnjeg razdoblja (2010.-2014.)

Svim izdvojenim sojevima bakterija roda Salmonellaetijekom petogodišnjeg razdoblja ispitana je osjetljivost na antimikrobne lijekove standardnim postupkom disk difuzije prema preporukama EUCAST-a (slika 4.). Testiranje se provodi radi pra enja rezistencije u okruženju te kao dio nadzora koji provodi Akademija medicinskih znanosti Hrvatske na podru ju cijele države.

Iako Akademija medicinskih znanosti još nije objavila rezultate za 2014. godinu jasno je vidljiva pove ana rezi-stencija istarskih sojeva na antimikrobne lijekove (ampicilin, ampicilin s klavulanskom kiselinom, nalidiksi na kiselina) u odnosu na rezultate dobivene u drugim dijelovima RH. Zna ajno je porasla rezistencija istarskih sojeva bakterija roda Salmonella na ampicilin od 2010. (17%) do 2014. (83%) godine. Rezistencija na ampicilin s klavulanskom kiselinom 2010. godine iznosila je 10%, a 2014. godine 61%. Rezistencija na nalidiksi nu kiselinu je u istom razdoblju porasla s 1% na 7%.


Slika 4. Rezultati osjetljivosti na antibiotike izoliranih Salmonella spp. u Laboratoriju za bakteriološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ u razdoblju 2010.-2014.

Figure 4. Results of susceptibility testing for Salmonella spp. in the Laboratory for Bacteriological Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian County Public Health Institute (2010-2014).

Ovi antimikrobni lijekovi pokazuju pove anu rezistenciju u odnosu na hrvatski prosjek, dok osjetljivost na ostale antimikrobne lijekove prati hrvatski trend u ovom raz-doblju (AMZH Izvješ e 2010.-2013.).

Zaklju ci

U razdoblju od 2010. do 2014. u Laboratoriju za bakte-riološku dijagnostiku crijevnih infekcija ZZJZIŽ naj eš iizolirani uzro nici bolesti koje se prenose hranom bile su bakterije roda Salmonella i Campylobacter, što prati trendove u Europi i svijetu. Sve je manji udio bakterija roda Salmonella kao uzro nika ovih bolesti, što tako erprati europski trend. Od 2007. godine u Europi se bilježi

opadanje broja salmoneloza, što se pripisuje novim pro-gramima nadzora hrane i boljoj veterinarskoj kontroli, osobito u peradarstvu. Rezultati dobiveni serotipizacijom bakterija roda Salmo-nella pokazuju distribuciju serotipova u Istri sa serotipom S. Enteritidis na prvom mjestu, kao i u ostatku svijeta. Test osjetljivosti ispitanih bakterija roda Salmonellaepokazuje zna ajno ve u rezistenciju sojeva izdvojenih u Istri na ampicilin i ampicilin s klavulanskom kiselinom u odnosu na hrvatski prosjek.Campylobacter jejuni je naj eš e izolirana bakterija roda Campylobacter. U razdoblju od 2010. do 2014. u Istri je došlo po porasta udjela ove bakterije kao uzro nika bolesti


koje se prenose hranom, što tako er prati trend u zemljama EU. Budu i da je hrana animalnog podrijetla (naro itopodrijetlom od peradi) est uzrok obolijevanja u ljudi i s obzirom na u estalost navedenih bolesti u ljudi te porasta rezistencije izdvojenih sojeva važno je redovito pratiti trendove pojava u estalosti uzro nika i zoonoza te provesti daljnja istraživanja njihovih karakteristika i primjenu od-govaraju ih mjera zaštite od zaraznih bolesti kako u proizvodnji hrane tako i u doma instvima.

Literatura

AMZH (2010.-2013.): Osjetljivost i rezistencija bakterija na antibiotike u Republici Hrvatskoj u 2013. g. Dostupno na: http://iskra.bfm.hr/hrv/Resistance.aspx?id=66 [22.02.2015].

BLOM, M., A. MEYER, P. GERNER-SMIDT, K. GAARSLEV, F. ESPERSEN (1999): Evaluation of Statens Serum Insitute Enteric Medium for detection of enteric pathogens. J Clin Microbiol. 37(7):2312-2316.

CDC (2011): CDC 2011 Estimates of foodborne illness in the US. Dostupno na: http://www.cdc.gov/foodborneburden/ /2011-foodborne-estimates.html#annual [24.02.2015].

ECDC (2013): Annual epidemiological report 2013. Dostupno na: http://www.ecdc.europa.eu/en/publications/_layouts/ /forms/Publication_DispForm.aspx?List=4f55ad51-4aed-4d32-b960-af70113dbb90&ID=989 [20.02.2015].

EFSA (2012): The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2012. Dostupno na: http://www.ecdc.europa. eu/en/publications/Publications/EU-summary-report-zoonoses-food-borne-outbreaks-2012.pdf [23.02.2015].

EFSA (2014): The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks 2013. European Food Safety Authority. European Centre for Disease Prevention and Control. EFSA J. 2015;13(1):3991.

EUCAST, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (2015): Clinical breakpoints – bacteria (ver. 5.0, 2015-01-26). Dostupno na: http://www.eucast.org/ /clinical_breakpoints/ [23.02.2015].

GRIMONT, A. D., F. X. WEILL (2007): Antigenic formulae of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Institute Pasteur. 9. izd.

ISENBERG, H. D. (1995): Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Press, Washington D.C., USA.

KUZMAN, I. (2012): Infektologija. Medicinska naklada, Zagreb. OIE, World Organisation for Animal Health (2014): Manual of

Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2014. Dostupno na: http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/ [23.02.2015].

BACTERIA THAT CAUSE FOODBORNE ILLNESS IN ISTRIAN COUNTY (2010-2014)

Summary The most common bacterial causes of foodborne illness are Salmonella spp. and Campylobacter spp. Those bacteria usually spread through contaminated food and represent the most common cause of zoonoses worldwide. Interventions are needed to control those bacteria and subtyping Salmonella by serotyping is useful for targeting such interventions. Different countries have different distribution of Salmonella species, but almost everywhere S. Enteritidis is the leading serotype. From 2010 to 2014, the most common isolates of foodborne illness at the Laboratory for Bacteriological Diagnosis of Intestinal Infections, Istrian County Public Health Institute were Salmonella spp., Campylobacter spp., EPEC and Yersinia enterocolitica. Although Campylobacter spp. rates showed a significant increase, the rates of Salmonella spp. were still higher in this five-year period. Antibiotic susceptibility testing was performed for all these isolates, according to the national monitoring program. Susceptibility testing showed greater resistance to ampicillin, ampicillin with clavulanate and nalidixic acid as compared with the national data for the same period.

Key words: Salmonella spp., Campylobacter spp., foodborne illness


USEFULNESS OF CLINICAL BLOOD ANALYSES IN DIAGNOSTICS OF SOME POULTRY DISEASES

Olga Zorman Rojs1, Alenka Dov 1, Brigita Slavec1, Marko Zadravec1, Rahela Jurši -Cizerl2,Liljana Štalcer2, Janez Poje3, Marija Nemec1, Alenka Nemec Svete1 and Jožko Ra nik1

1University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Ljubljana, Slovenia 2Perutnina Ptuj Veterinary Clinic, Veterinarstvo d.o.o., Ptuj, Slovenia 3VETAM. JATA d.o.o., Domžale, Slovenia

Summary

Clinical biochemistry tests, hematology and blood gas analyses are useful tools to support the diagnosis of diseases or dysfunctions, which can occur in poultry. In our study, biochemical and blood gas parameters for different poultry species were measured by portable or conventional biochemical and blood gas analyzers. As blood components may be influenced by age and different pathological factors, blood samples from birds of different age and clinical status were examined. More than 200 blood samples were collected; most of them were taken from broilers of different ages (Ross breed), 40 samples were derived from meat type turkeys (Converter), and 20 samples were obtained from commercial layers (Lohmann brown, Lohmann white). Whole blood ionized calcium concentration and serum levels of total calcium, phosphorus, sodium, potassium, chloride and enzymes (aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and creatine kinase) were determined. Values from clinically healthy birds were compared with those obtained from animals with severe leg problems, parasite infestation or bacterial infection.

Key words: blood chemistry values, poultry, diagnosis

Introduction

Diseases present with a wide variety of symptoms, thus physical examination is not sufficient to provide an accurate diagnosis. In comparison to veterinary diagnostic procedures in other domestic animals, hematology and biochemistry tests are rarely performed in the diagnosis of poultry diseases. More often, detection of antibodies, bacteriology and virology support the clinical signs and pathomorpho-logical examinations (Collett, 2013). In the present study, biochemical and blood gas parameters in different poultry species were measured by portable or conventional biochemical and blood gas analyzers. As blood components may be influenced by species and age, blood samples from birds of different age were examined. Values from clinically healthy birds were compared with those obtained from animals with severe leg problems, parasite infestation or bacterial infection. Besides high quality instruments, which are limited to clinical laboratories with skilled personnel, a portable clinical analyzer was used in the study.

Materials and Methods

Healthy birds Broilers: Hematological and biochemical analyses of healthy birds were conducted by sampling healthy commercial broilers (Ross, 308) from four flocks. Birds originated from different broiler breeders. They were fed with commercial available feed based on corn and soybean. Birds were placed on deep litter. From 1 to 20 days of age bro-starter and from the 21st day onwards bro-finisher was used. Room temperature and hours of lightning varied with the age of chickens in accordance with standard manage-ment procedures for Ross 308 broilers. Blood samples were taken from wing vein. Blood samples from flock 1 were collected on 14, 24 and 35 days of age. On each selected day, 20 samples were taken. Serum levels of total calcium (Ca), phosphorus (aP), sodium (Na), potassium (K), chloride (Cl), aspartate amino-transferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were

prof. Olga Zorman Rojs, PhD, University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Institute of Poultry Health and Protection, Ljubljana, Slovenia; Phone:+386-1-4779-242; Fax: +386 1 4779 339, e-mail:[email protected]

USEFULNESS OF CLINICAL BLOOD ANALYSES IN DIAGNOSTICS OF SOME POULTRY DISEASES 62

determined on a conventional biochemical analyzer (Cobas Mira, Roche). In blood samples, evaluation of hematologic profile viz. hemoglobin (Hb), total red blood cell count (RBC), mean corpuscular volume (MCV) and hematocrit (Ht) was performed on a ZF6 Coulter Counter (Coulter Electronics, Ltd.) Blood samples from flocks 2 and 3 were taken from 10 birds per flock at the age of 11 days and serum levels of Ca and aP were measured on a conventional biochemical analyzer (Cobas Mira, Roche). Samples from flock 4 were collected from 7 broilers at the age of 28 days by wing-vein puncture using preheparinized syringes. Samples were immediately proceeded to blood gas analyzer (RapidPoint 500, Siemens AG) to determine oxygen tension (oxygen partial pressure, pO2), carbon dioxide tension (pCO2), glucose, lactose and electrolyte status. Turkeys. For determination of blood components in turkeys, samples were collected in two commercial meat-type flocks (Converter) at the age of 9 weeks. Prehepa-rinized syringes were used and whole blood samples were tested without delay using a portable i-STAT1® (Abaxis Inc.) chemistry analyzer. Each blood sample was introduced into cartridge and inserted into the analyzer. The following parameters were tested: Na, K, ionized Ca (iCa), pH, pO2,carbon dioxide partial pressure (pCO2) and glucose. Layers. Samples for determination of blood components were collected from seven Lohmann white birds aged 55 weeks, which were kept at our Institute for Diagnostic Proposal. Biochemical measurement was performed immediately after blood collection using a VetScan VS2®

(Abaxis, Inc.) chemistry analyzer. The following parameters were tested: K, Na, aP, albumin, globulins, glucose, creatine kinase (CK) and AST.

Clinical cases

Broilers – lameness. Four commercial broiler flocks with severe leg problems were investigated. Clinical signs of rickets started in all flocks at the age of 9 to 11 days. At necropsy, rubbery bones were found in the majority of examined birds. In order to determine whether rickets was due to deficiencies or imbalances of calcium, phosphorus or vitamin D3 deficiencies, 10 to 29 blood samples were taken from severely affected birds from each flock. To define the levels of Ca and aP, conventional biochemical analyzer (Cobas Mira, Roche) was used. The values were compared with those obtained in healthy broilers of the same age. Besides blood analyses, chemical analyses of bone ash were performed in 6 to 10 broilers per flock and bacteriological examinations were done. Broilers – respiratory disorders. High mortality with mild respiratory and neurological signs occurred in 34-day-old

broiler flock. A sudden increase and sharp reduction of mortality happened within 24 hours. Clinically, fine tremor of the head and marked depression were noticed, followed by coma. Blood samples were taken from five moribund birds using preheparinized syringes and whole blood samples were examined immediately on a RapidPoint 500 blood gas analyzer (Siemens). Oxygen partial pressure (pO2), carbon dioxide tension (pCO2), pH, glucose, lactose, and Na, K, Cl and Ca ion were determined. Further histologic examinations revealed severe granulomatous pneumonia and Escherichia (E.) coli was isolated. Layers – parasitism. In the flock of commercial layers (Lohmann brown), discoloration of eggshell and egg yolk was observed and parasitological examination of fecal samples confirmed Ascaridia (A.) galli infestation. We compared the values of serum electrolytes, proteins, glucose, CK and AST of eight layers (Lohmann brown) proven to be infected with A. galli by pathological and parasitological investigation with those obtained in negative birds. Biochemical measurements were done by a portable VetScan VS2® chemistry analyzer (Abaxis Inc.). The following parameters were tested: K, Na, P, albumin, globulins, glucose, CK and AST.

Results and Discussion

Hematologic values could support clinical pathological diagnosis of some poultry viral diseases (e.g., avian chicken anemia, infectious bursal disease, hemorrhagic enteritis of turkeys, etc.), parasitism, bacterial septicemia and nutritional deficiencies (Swayne, 2013). Hematologic studies in birds have been carried out by several authors (Talebi et al., 2005; Pavlak et al., 2005; Strakova et al., 2010), but limited information is available on the normal blood profiles of broilers of different age. In Table 1, the relation of age to hematologic values in commercial healthy broilers (Ross, 308) is presented. The values obtained fell within the relatively narrow ranges. However, total RBC and hemoglobin slightly increased with broiler age, while hematocrit values did not differ. Calcium, phosphorus, sodium, potassium, chloride levels and AST and ALT are diagnostic values for several diseases such as lameness, gout, kidney disease, chronic diarrhea and dehydration or liver disease (Harris, 2009; Silva et al., 2007; Abdi-Hachesoo et al., 2011). Table 2 shows means and standard deviations of electrolyte and serum biochemical values obtained in healthy broilers of different ages. The measurements of serum electrolytes showed that the highest values of serum Na and Cl were found at 35 days of age. In contrast, the values of serum K declined with chicken age. Serum Ca increased gradually with age; the highest mean value was determined in birds aged 35 days, when the lowest aP was recorded.


Table 1. Hematologic values of healthy broilers (Ross, 308) at different ages

Parameter Broilers 14 days (n=20)

Broilers 24 days (n=20)


Total RBC (106/L) ±SD (range)

2.367±0.21(1.99-2.92)

2.424±0.39(1.45-2.82)

2.482±0.19(2.1-2.72)

Hemoglobin (g/dL) ±SD (range)

13.325±1.15(10.8-15.2)

14.158±2.38(8.1-16.1)

14.085±1.03(12.0-15.4)

MCV (fl) ±SD (range)

144±4.75(136-154)

136.85±3.25(130-142)

134.8±4.32(125-141)

Ht (%) ±SD (range)

32.78±3,39(26.7-42.5)

32.152±5,58(19.2-37.4)

32.695±2.42(27-36.2)

Table 2. Serum electrolyte and biochemical values of healthy broilers (Ross 308) at different ages

Parameter Broilers 14 days (n=20)



K (mmol/L) ±SD (range)

6.357±0.805.36-7.91

5.01±0.624-6.15

4.90±0.616.35-3.89

Na (mmol/L) ±SD (range)

147.05±3.56143-159

151.7±2.32145-156

157.05±4.09153-172

Cl (mmol/L) ±SD (range)

117.85±1.95114-121

117.75±2.57112- 121

118.4±4.29110-129

aP (mmol/L) ± SD (range)

2.45±0.172.16-2.78

2.67±0.322.14-3.5

2.12±0.201.83-2.5

Ca (mmol/L) ± SD (range)

2.39±0.281.61-2.87

2.52±0.192.18-2.87

2.67±0.262.25-3.14

AST (U/L) ±SD (range)

232.15±29.29193-323

212.7±43.42172-376

229.2±24.26193-271

ALT (U/L) ±SD (range)

6.2±1.933-13

2.95±1.091-5

3.15±0.992-5

Handheld clinical analyzers are frequently used in human and veterinary clinics, but very rare in the diagnosis of poultry diseases. Portable analyzers could provide rapid and relatively low cost blood analyses in the field at the time the flock was being checked (Martin et al., 2010). Evaluation of selected blood parameters and gas values from clinically ill birds requires knowledge of normal values. Although there is some information available on blood profiles in layers and broiler breeders (Steinmetz et al., 2007; Martin et al., 2011), no such values are available for meat-type turkeys. In Table 3, blood chemistry values from 40 healthy turkeys at 9 weeks of age are shown.

Clinical cases The main characteristic of rickets is inadequate bone mineralization. For appropriate corrective treatment, it is of utmost importance to determine whether rickets is due to deficiencies of Ca, P, or vitamin D3, or to an excess of Ca (Leeson et al., 1995; Edwards, 2000). In Figure 1, values of serum Ca and aP in broilers with severe leg problems are

shown in comparison with healthy birds of the same age and breed. In Table 4, bone ash content, Ca and P concentrations in bone ash of broilers with clinical signs of rickets are presented.

Table 3. Blood gases, glucose and electrolyte parameters for meat-type turkeys obtained from venous blood samples using portable clinical analyzer

Parametern=20 Mean ± SD Range

pH (T) 7.38±0.03 7.27-7.43 pCO2 (T) (mm Hg) 46.32±4.94 39-59.8 pO2 (T) (mm Hg) 51.46±6.04 37-58 Na (mmol/L) 149.14±1.74 145-152 K (mmol/L) 4.41±0.22 3.9-4.7 iCa (mmol/L) 1.45±0.07 1.33-1.54 Glu (mmol/L) 14.37±0.56 13.42-15.45


Figure 1. Serum Ca and aP values in broilers with severe leg problems in comparison to healthy broilers of the same age

Flocks 1, 2, 3 and 4: severe leg problems were observed at the age of 9-11 days; flocks 5 and 6: control birds of the same age (healthybroilers)

Table 4. Bone ash content and concentrations of P and Ca in broilers with lameness and control birds (age 11 days)

Flock(n=10)

Bone ash %

P%

Ca%

1 29.7 4.7 10.1 2 29.9 4.2 9.3 3* 40.0 6.4 14.4 4 31.8 4.7 11.7 5/control 49.3 7.2 14.5 6/control 52.8 8.7 16.7 *E. coli was confirmed by bacteriological testing

In all four cases of lameness in broilers aged 9-11 days, biochemical analyses showed that birds were hypophospha-temic and hypercalcemic. It is known that Ca deficient birds are usually hypocalcemic and hyperphosphatemic, whereas D3 deficiency results in hypocalcemia and hypophospha-temia (Leeson et al., 1995). Our investigations suggested excess Ca, which induced aP deficiency. Abnormal minera-lization of leg bones was also confirmed by measuring ash content (Onyango et al., 2003). Around 50% of bone ash was found in control birds versus nearly 20% less bone ash confirmed in birds with severe leg problems. In one flock (flock 3), E. coli was isolated from the proximal part of femurs. In that flock, a higher bone ash percent was found, although the values of serum Ca and aP were comparable in all four flocks.A sudden mortality increase within a broiler flock might be related to environmental conditions or may be due to severe infections. Besides classical diagnostic approaches, in one of

such cases we performed blood analyses of severely affected birds. The levels of pO2, pCO2, glucose and lactose and electrolyte status were determined by use of a gas analyzer. The results were compared to the values obtained in healthy broilers of similar age (Table 4). Although results showed some differences in all parameters measured, the main differences were found in oxygen status and glucose concentration. Differences in venous blood pO2 and pCO2 were most probably related to severe respiratory symptoms. However, for more accurate results, arterial blood samples should be used. Blood glucose concentrations in chickens from affected flock varied from 2.9 to 11.1 mmol/L, mean 8.44 mmol/L. In healthy birds, the mean blood glucose concentration was 15.03 mmol/L, range 13.3-16.3 mmol/L. The primary cause of hypoglycemia in birds is septicemia (Harris, 2009); in broilers, however, very low levels of glucose could be related to the spiking mortality syndrome (Burns et al., 2002).


Table 5. Venous blood values of partial pressure O2 and CO2, glucose, lactose and electrolyte status of broilers with severe respiratory disorders

Parameter Affected broilers (34 days) (n=5)

Healthy broilers (28 days) (n=7)

pH(T) ± SD range

7.43±0.017.71-7.74

7.35±0.047.3-7.4

pCO2 (T) (mm Hg) ± SD range

34.9±2.0531.7-38.7

51.43±4.7545.5-59.3

pO2 (T) (mmHg) ± SD range

49.78±4.6745.2-56.5

60.41±6.3953.1-73.1

Na (mmol/L) ± SD range

142.46±1.19140.8-143.7

150.44±4.34142.4-153.8

K (mmol/L) ± SD range

6.15±0.565.25-6.24

5.03±0.454.44-5.62

Ca++ (mmol/L) ± SD range

1.13±0.101.0-1.26

1.43±0.031.40-1.49

Cl (mmol/L) ± SD range

110.2±1.64108-112

114.57±3.45109-120

AnGap (mmol/L) ± SD range

16.9±1.9714.6-19.3

14.01±1.9710.8-17.1

Glucose (mmol/L) ± SD range

8.44±3.282.9-11.1

15.03±0.9113.3-16.3

Lactose (mmol/L) ± SD range

6.05±1.304.32-7.97

5.40±0.864.43-6.81

Table 6. Blood chemistry data from hens with Ascaridia galli infestation and healthy birds determined with portable clinical analyzer

Parameter Lohmann brown – Ascaridia galli(n=8)

Lohmann white – healthy birds (n=7)

K (mmol/L) (range)

4.58(3.5-5.7)

4.40(4-4.8)

Na (mmol/L) (range)

148.25(144-154)

143.42(138-148)

aP (mmol/L) (range)

1.82(1.45-2.05)

1.43(1.18-1.84)

Albumin (g/L) (range)

23.87(20-27)

27.7(26-29)

Globulins (g/L) (range)

31.4(27-40)

25.85(22-29)

Glucose (mmol/L) (range)

12.42(11.9-13.0)

11.40(10.6-12.3)

CK (U/L) (range)

1155(669-3292)

755.71(378-1025)

AST (U/L) (range)

169.12(140-215)

149.71(114-174)


Although it is believed that modern rearing of poultry has significantly reduced the frequency of parasite infestation, severe parasitism still may be seen in floor-reared layers. A. galli infection is associated with a decrease in body weight gain and egg production, which correlates with the worm load (Swayne, 2013; Danicke et al., 2009). The infection led to changes in the levels of glucose, cholesterol, total protein, albumin, magnesium and potassium in experimentally infected broilers (Ayub Ali et al., 2011). In Table 5, values of serum electrolytes, proteins, glucose, CK and AST of layers infected with A. galli are shown. The values were obtained by using a handheld clinical analyzer. Although some changes were observed in all compared values, the main differences were observed in AST and CK values. AST elevations are frequently associated with liver disease or muscle damage in birds, but the interpretation of results should be correlated with CK. If CK is normal, it can be concluded that the liver is the source of elevated AST. If CK is elevated, muscle should be considered as the possible source of elevated AST (Harris, 2009). In our case, both AST and CK were increased. Surprisingly, glucose level was not decreased in birds with severe A. galli infestation.

Conclusions

Many poultry diseases are presented with similar clinical signs and several laboratory investigations are needed to establish the disease etiology. Clinical biochemistry tests, hematology and blood gas analyses could support the diagnosis of diseases or dysfunctions, but the interpretation of results is often very difficult. For appropriate or correct interpretation, 'normal values' are needed, which are corre-lated with the species, breed, age of birds and environmental conditions.

References

ABDI-HACHESOO, B., A. TALEBI, S. ASRI-REZAEI (2011): Comparative study on blood profiles of indigenous and Ross-308 broiler breeders. Global Vet. 7 (3), 238-241.

AYUB ALI, M., L. INAOTOMBI DEVI, W. M. LYNGDOH, etal. (2011): Comparative biochemical profile of Ascaridia galliinfected broiler chickens on administration of pineapple and neem leaves and piperazine. Int J Poult Sci. 10 (7), 542-546.

BURNS, K. E., J. RUIZ, K. OPENGART, C. L. HOFACRE, T. P. BROWN, G. N. ROWLAND (2002): Hypoglycemia spiking mortality syndrome in broilers with rickets and a subsequent investigation of feed restriction as a contributing factor. Avian Dis. 46, 735-739.

COLLETT, S. R. (2013): Principles of disease prevention, diagnosis and control introduction. In: Diseases of Poultry 13th

edn. (D.E. Swayne, ed.), John Wiley & Sons Inc. Publication, 4-40.

DANICKE, S., E. MOORS, A. BEINEKE, M. GAULY (2009): Ascaridia galli infection of pullets and intestinal viscosity: consequences for nutrient retention and gut morphology. Br Poult Sci. 50 (4), 512-520.

EDWARDS, Jr., H. M. (2000): Nutrition and skeletal problems in poultry. Poult Sci. 79, 1018-1023.

HARRIS, D. J. (2009): Clinical tests. In: Handbook of Avian Medicine 2nd edn. (T N. Tully, G. M. Dorrestein, A. K. Jones, J. E. Cooper, Eds.), Elsevier B.V., 77-84.

LEESON, S., G. J. DIAZ, J. D. SUMMERS (1995): Poultry metabolic disorders and mycotoxins. University Books, Guelph Ontario, Canada.

MARTIN, M.P., M. WINELAND, O. J. FLETCHER, H. J. BARNES (2011): Selected blood chemistry values in mobility-impaired broiler breeder hens with suspected calcium tetany using the i-STAT handheld clinical analyzer. Avian Dis. 55 (3), 340-345.

MARTIN, M.P., M. WINELAND, H. J. BARNES (2010): Selected blood chemistry and gas reference ranges for broiler breeders using the i-STAT handheld clinical analyzer. Avian Dis. 54 (3), 1016-1020.

ONYANGO, E. M., P. Y. HESTER, R. STROSHINE, O. ADEOLA (2003): Bone densitometry as an indicator of percentage tibia ash in broiler chicks fed varying dietary calcium and phosphorus levels. Poult Sci. 82, 1787-1791.

PAVLAK, M., K. VLAHOVI , J. JER I , A. DOV , Ž. ŽUPAN I (2005): Age, sexual and seasonal differences of haematological values and antibody status to Chlamydophilasp. in feral and racing pigeons (Columba livia forma domestica) from an urban environment (Zagreb, Croatia). Eur J Wildlife Res. 51 (4), 271-276.

SILVA, P. R. L., O. C. FREITAS NETO, A. C. LAURENTIZ, O. M. JUNQUEIRA, J. J. FAGLIARI (2007): Blood serum components and serum protein test of Hybro-PG broilers of different ages. Braz J Poult Sci. 9 (4), 229-232.

STRAKOVÁ, E., P. SUCHÝ, R. KÁBELOVÁ, F. VITULA, I. HERZIG (2010): Values of selected haematological indicators in six species of feathered game. Acta Vet Brno. 79, 3-8.

STEINMETZ, H.W., R. VOGT, S. KÄSTNER, B. RIOND, J. M. HATT (2007): Evaluation of the i-STAT portable clinical analyzer in chickens (Gallus gallus). J Vet Diagn Investig. 19 (4), 382-8.

SWAYNE, D.E. (2013): Diseases of Poultry. 13th edn. John Wiley & Sons Inc. Publication.

TALEBI, A., S. ASRI-REZAEI, R. ROZEH-CHAI, R. SAHRAEI (2005): Comparative studies on haematological values of broiler strains (Ross, Cobb, Arbor-acres and Arian). Int J Poult Sci. 4 (8), 573-579.

VRIJEDNOST KLINI KIH ANALIZA KRVI U DIJAGNOSTICI NEKIH BOLESTI PERADI

Sažetak Klini ke biokemijske pretrage, hematološke pretrage i analiza plinova u krvi korisne su u dijagnosticiranju bolesti ili disfunkcija koje se mogu pojaviti kod peradi. U ovom istraživanju parametri plinova u krvi u razli itih vrsta peradi mjereni su prenosivim ili konvencionalnim biokemijskim analizatorima i analizatorima plinova u krvi. Kako na krvne sastavnice


mogu utjecati dob i razni patološki imbenici, ispitani su uzorci krvi uzeti od ptica razli ite dobi i klini kog statusa. Prikupljeno je više od 200 uzoraka krvi, od kojih je ve ina uzeta od brojlera razli ite dobi (pasmina Ross), 40 uzoraka uzeto je od tovnih purana (Converter), a 20 uzoraka uzeto je od konzumnih nesilica (sme a Lohmann, bijela Lohmann). Odre ivala se koncentracija ioniziranog kalcija u punoj krvi te serumske razine ukupnog kalcija, fosfora, natrija, kalija, klorida i enzima (aspartat aminotransferaza, alanin aminotransferaza, kreatin kinaza). Vrijednosti dobivene kod klini kizdravih ptica uspore ene su s onima zabilježenim u životinja s teškim problemima s nogama, infestacijom parazitima ili bakterijskom infekcijom.

Klju ne rije i: vrijednosti kemijskih krvnih pretraga, perad, dijagnostika


IMMUNOMODULATORY ACTIVITY IN VITRO OF THE NEWCASTLE DISEASE VIRUS STRAIN ZG1999HDS

Bratko Filipi 1, Lidija Gradišnik2, Adriana Pereyra3, Hrvoje Mazija4

1Institute for Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia 2Medical Faculty, University of Maribor, Maribor, Slovenia 3MEDEX d.o.o., Ljubljana, Slovenia 4Croatian Institute of Experimental and Translation Oncology, Zagreb, Croatia

Summary

As an attractive therapeutic strategy, immunotherapy has attracted attention as a promising treatment option for a number of disorders. In this study, the immunomodulatory effects of low titers (10 HA/mL) of NDV strains ZG1999HDS or La Sota on TLT (human macrophage cell line) + PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) were analyzed. During activation, the levels of NO, H2O2, lysozyme and induced antibacterial activity against gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae and Streptococcus mutans) and gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and Acinetobacter baumannii), and the IL-1 , IL-2, IL-4, GM-CSF, TNF- , IFN- and IFN- cytokine secretion during immunomodulation were evaluated. At first, the macrophage activation by the NO 'burst', H2O2 and lysozyme level increased. After binding to the macrophages (TLT macrophage cell line) and interaction with the PBMC, a decrease in GM-CSF and an increase in TNF- and IFN- was found. Concomitantly, a decrease in proinflammatory cytokines (IFN- ) and variable increase in IL-1 , IL-2 and IL-4 was recorded. In the induction of antibacterial response against gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, MRSA,Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae and Streptococcus mutans), the effect was by1/3 higher with NDV strain ZG1999HDS than with strain La Sota. It was not so clear in case of antibacterial response against gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and Acinetobacter baumannii).

Key words: Newcastle disease virus (strain ZG1999HDS), Newcastle disease virus (strain La Sota), immunomodulation, TLT (human macrophage cell line) + PBMC, cytokines, lysozyme, antibacterial activity, gram-positive bacteria, gram-negative bacteria

Introduction

The substances that are capable of interacting with the immune system to up-regulate or down-regulate specific aspects of the host response are known as immuno-modulators (Stanilova et al., 2005; Utoh-Nedos et al., 2009). They are also known as biologic response modifiers or immunoregulators functioning as drug leading pre-dominantly to a nonspecific stimulation of the body immune defense mechanisms (Tzianabos, 2000; Ooi and Liu, 2000). To enhance the immune system, immuno-stimulatory agents such as chemicals, proteins and viruses are used (Kobayashi et al., 2008.). Among viruses, Newcastle disease virus (NDV) was found to have pleiotropic immunomodulatory properties in addition to

good cell-binding and selective proliferation in replicating cells. At the same time, this virus has the ability to introduce T-cell co-stimulatory activity and induce cytokines such as IFN-a, IFN-b and TNF-a that affect T-cell recruitment and activation (Schirrmacher et al., 1998; Schirrmacher et al., 2000). Cellular cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was enhanced significantly after co-incubation of NDV with effector cells (Zorn et al., 1994). Through the study, natural killer (NK) cells were found to be the predominant mediator of lysis. Enhancement of cytotoxicity also correlated with the induction of TNF- and reduced synthesis of IFN- in PBMC by NDV. The NDV strain ZG1999HDS was recently isolated, patented and genetically characterized (Mazija et al., 2011a; Mazija et al., 2011b.; Nedeljkovi ,

Bratko Filipi , PhD, Institute for Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Zaloška 4, 1105 Ljubljana, Slovenia;tel.: +3861 5437463; fax. +3861 5437401; e-mail: [email protected]

IMMUNOMODULATORY ACTIVITY IN VITRO OF THE NEWCASTLE DISEASE VIRUS STRAIN ZG1999HDS 69

2011). It was deposited in the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (2013) and the sequence in GeneBank (2014). Strain ZG1999HDS was isolated only from lung tissue of broiler chickens suffering from respiratory disease and was not present in brain tissue (Bi in and Mazija, 2010). It belongs to genotype II of class II NDV, being closely related to NDV strains LaSota and Hitcher (Nedeljkovi , 2011), but in spite of its lentogenic properties it caused death in 74.6% of chickens because of the virus tropism for the respiratory system. In the same group are strains LaSota, Ulster and Queensland. The cytolytic characteristics of strain ZG1999HDS were investigated in vitro on tumor cell cultures and in vivo on mice, and compared to the strain LaSota (Mazija et al., 2011). Strain ZG1999HDS is a relatively strong inducer of human type I IFN, more precisely HuIFN- N3, in PBMC from human buffy coats. One hundred HA of the NDV strain ZG1999HDS can induce 483±45pg/mL of the HuIFN- N3. The RP-HPLC profile of the HuIFN- N3 shows subtypes 1, 2, A and 2b. The relative ratio between 1 and 2 is important for biological activity of the NDV strain ZG1999HDS induced HuIFN- N3(Antonelli, 2008). The presented experiments were aimed to analyze the immunomodulatory activity in vitro of the NDV strain ZG1999HDS in comparison to NDV strain LaSota.

Material and methods

Viruses The NDV strain ZG1999HDS was obtained from Professor Eemeritus Hrvoje Mazija (Croatian Institute of Experimental and Translation Oncology, Zagreb, Croatia). The NDV strain LaSota was obtained from commercial sources. Both viruses were multiplied in SPF (Specific Pathogen Free) chicken embryos and concentrated by lyophilization. The EID50 determined in SPF chicken embryos was 2.0x107 for strain ZG1999HDS and 2.5x107 for strain LaSota.

Tissue culture medium and cells Eagle's medium with high content of glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and antibiotics (penicillin, streptomycin and

gentamicin) and trypsin solution were prepared at the Institute for Microbiology and Immunology, Laboratory for Interferon Research (Institution). Fetal bovine serum (FBS) was from Euroclone (Pero, Italy). Human macrophage cell line TLT was obtained from Lidija Gradišnik (Institute of Physiology, Medical Faculty, University of Maribor).

Isolation of peripheral blood mononuclear cells from human buffy coats Buffy coats were combined and centrifuged at 1700 RPM for 20 min at 4 °C. The supernatant containing plasma and part of the leukocytes were resuspended in the PBS containing 1% of glucose. To the sediment containing erythrocytes, lymphocytes, macrophages and granulocytes, 9 parts of the 0.83% ammonium chloride was added. The erythrocyte lysis was performed at 4 °C and took 15-20 min. After this, the cell suspension was centrifuged at 2500 RPM for 20 min at 4 °C. The supernatant was removed and the white cell sediment was resuspended in the PBS containing 1% of glucose. The supernatants and sediments were again combined and white cells were sedimented by centrifugation at 2500 RPM for 20 min at 4 °C. The percentage of living or dead cells was determined by trypan blue staining.

Bacterial species Bacterial species selected for the study were obtained from the Microbe Collection at the Institute for Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Slovenia. The following gram-negative bacteria were used: Escherichia (E.) coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and Acinetobacter baumannii. The gram-positive bacteria were Staphylococcus aureus, MRSA, Micrococcus luteus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiaeand Streptococcus mutans.

Cell treatment In the 10.0 mL flat bottom glass vials with rubber stoppers, human macrophages (TLT cell line) were cultivated in the modified Eagle's medium with 10% of FBS. After reaching the confluence, the supernatant was discharged and 2.0 mL

Figure 1. Activation of TLT + PMBC using 10 HAU/mL of NDV strain ZG1999HDS or LaSota


of PBMC suspension (106 cells/mL) was added. After two hours, 2.5 mL of modified Eagle's medium + 2.0% of FBS was added. To exert the immunomodulation and the antimicrobial activity, 0.5 mL of 10.0 HAU/mL and 1.0 HAU/mL of NDV strains ZG1999HDS and LaSota were added and vials were stored at 37 oC for 24 and 48 hours (Figure 1). All treatments were performed in triplicate and repeated two to three times. After the indicated time (24 or 48 hours at 37 oC), the vials were centrifuged at 1700 RPM/20 minutes and clear supernatants were collected, filtered through 0.2 m filters and stored before analysis at -20 oC.

Hydrogen peroxide (H2O2) determination The quantity ( M/mL) of H2O2 produced from cultivated cells (TLT+PBMC) after the treatment or in untreated control was determined according to the method developed by Orsi et al. (2000). Briefly, to the freshly sedimented cells (TLT+PBMC) 500.0 L of the phenol red solution (50 mL) containing 140.0 mM NaCl, 10.0 mM K2HPO4, 5.5 mM dextrose and 8.5 U/mL of horseradish peroxidase were added. After four hours of incubation at 37 oC, 100.0 L of 1.0 M NaOH was added and the solution was dissolved 10 times with 4.5 mL of saline. Optical density (OD) of the solution was measured at 620.0 nm. As the control, 10.0 mM of H2O2 was used.

Lysozyme determination The amount of lysozyme in the cell (TLT+PMBC) supernatant was determined according to Nash et al. (2006). In brief, 1000 CFU of Streptococcus pyogenes in 200.0 Lof 10.0 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) and 200.0

L of sample or 1.0 , 10.0 and 100.0 g/mL of lysozyme were added to the 1.6 mL of MH-broth (pH 6.5) and incubated overnight at 37 oC. On the next day, the OD was measured at 595 nm. The amount of lysozyme ( M/mL) was calculated in comparison to the bacterial OD after 24 hours.

Nitrite (NO) assay The concentration of stable nitrite, an end product of the nitric oxide present in the supernatant of treated or untreated human macrophages (TLT+PMBC), was measured using the method based on the Griess reaction (More and Pai, 2011). 50 L of the supernatant was incubated with an equal volume of Griess reagent (1% of sulfanilamide in 2.5% H3PO4 and 0.1% of naphthyl-ethylene-diamine-dihydro-chloride in distilled water). Both solutions were mixed at a ratio of 1:1 at room temperature for 30 minutes. The absorbance at 550 nm was then measured in a microtiter plate reader. The standard curve for nitrite was prepared using 10-100 M sodium nitrite in distilled water.

HuIFN- N3 monoclonal ELISA The quantity of induced HuIFN- N3 (pg/mL) was de-termined by Human IFN ELISA kit Platinum ELISA

(eBioscience, Vienna, Austria). In the assay, the inter-national HuIFN- N3 standard was used (Human IFN-Platinum ELISA (BMS 216/BMS 216 TEN), Affymetrix, eBioscience, USA). The assay was performed according to the manufacturer’s instructions, with the final reading by the ELISA reader at 620 nm and calculating the pg-s of HuIFN-

N3/mL.

HuIFN- N3 RP-HPLC analysis The HuIFN- N3 subtype composition was analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Different HuIFN- samples (natural and recombinant, approximately one million antiviral units/mL) of 20 to 40 L were applied to the Phenomenex, Aeris PEPTIDE column 3.6 m XB-C18, 250 x 4.6 mm and eluted with the linear gradient of solvent A = water + 0.1% of TFA and solvent C = acetonitrile + 0.1% TFA for 20 minutes at a flow rate of 0.8 mL/min and pressure of 139-140 bar. The course of RP-HPLC chromatography of different IFN samples is shown in Table 1. The column temperature was 40 °C. The absorbance was monitored at 214 and 280 nm. HuIFN- alpha interferon species in different IFN compositions were separated according to their relative hydrophobicity using RP-HPLC (Punainen et al.,1999).

Table 1. The course of RP-HPLC chromatography of different IFN samples

Step Time (min) Solvent A (%) Solvent C (%) 0 0 91 9 1 3 80 20 2 6 50 50 3 12 50 50 4 15 91 9 5 20 91 9

HuIFN- Mini ELISA Development Kit (Peprotech) The amount of HuIFN- (pg/mL) in the cell (TLT+PBMC) supernatant was performed according to the manufacturer's instructions: bind the capture antibodies (1.0 g/mL) to the Nunc Maxisorp plates and add 300.0 L of the block buffer. Standard/Sample: Dilute standard (HuIFN- ) from 300.0 pg/mL to zero in diluent. Immediately add 100.0 L of standard or sample to each well in triplicate and incubate the plates for six hours at 37 oC. Detection: After washing the plates, dilute the detection antibodies in diluent to a concentration of 1.0 g/mL and add 100.0 L/well and incubate at room temperature for two hours. Avidin-HRP Conjugate: After washing the plates, dilute 5.5

L of Avidin-HRP Conjugate 1:2000 in diluent for total volume of 11.0 mL. Add 100 L/well. Incubate plates for one hour at room temperature.


ABTS Liquid Substrate: Wash and aspirate the plates two times. To the empty plates add 100.0 L of substrate solution to each well and monitor the color development. Then, add 10.0 L of 1.0% SDS to each well and measure the plate with the ELISA reader at 405 nm with the wavelength correction at 650 nm. The reliable standard curves are obtained when either OD readings should not exceed 0.2 units for the zero standard concentration, or 1.2 units for the highest standard.

GM-CSF Mini ELISA Development Kit (Peprotech) The amount of GM-CSF (pg/mL) in the cell (TLT+PBMC) supernatant was performed in the same way as in the case of HuIFN- , with the use of GM-CSF specific capture and detection antibodies as well as specific avidin-HRP conjugate.

TNF- Mini ELISA Development Kit (Peprotech) The amount of TNF- (pg/mL) in the cell (TLT+PBMC) supernatant was performed in the same way as in the case of HuIFN- , with the use of TNF- specific capture and de-tection antibodies as well as specific avidin-HRP conjugate.

IL-1 Mini ELISA Development Kit (Peprotech) The amount of IL-1 (pg/mL) in the cell (TLT+PBMC) supernatant was performed in the same way as in the case of HuIFN- , with the use of IL-1 specific capture and de-tection antibodies as well as specific avidin-HRP conjugate.

IL-2 Mini ELISA Development Kit (Peprotech) The amount of IL-2 (pg/mL) in the cell (TLT+PBMC) supernatant was performed in the same way as in the case of HuIFN- , with the use of IL-2 specific capture and detection antibodies as well as specific avidin-HRP conjugate.

IL-4 Mini ELISA Development Kit (Peprotech) The amount of IL-4 (pg/mL) in the cell (TLT+PBMC) supernatant was performed in the same way as in the case of

HuIFN- , with the use of IL-4 specific capture and detection antibodies as well as specific avidin-HRP conjugate.

Antimicrobial activity The antimicrobial (gram-positive and gram-negative bacteria) screening was carried out by the agar diffusion method (Lino and Deogracious, 2006; Orsi et al. 2000). Suspension of microorganisms (McFarland 0.5) was swabbed over the surface of the MH agar plate using a sterile cotton swab. Wells of 6.0 mm diameter were bored in the medium with the help of a sterile cork-borer of 6.0 mm in diameter. Seventy L of different samples were filled in the wells with a micropipette. On a separate plate, 70 L of control antibiotics at a concentration of 10% was added. The plates were left for some time till the extracts diffused into the medium, with the lid closed, and incubated at 37 oC for 72 hours. The zone of the inhibition was measured in millimeters using a scale.


Determination of NO, H2O2 and lysozyme In case of NO, the releasing enhancement was found (7.12

M/mL) when NDV strain ZG1999HDS was used. The levels of H2O2 and lysozyme were increased with the use of the same virus (1.82 M and 0.748 g). Lysozyme is an indicator of the antimicrobial activity induction. The results are presented in Figure 2 and Table 2.

Activity of GM-CSF and TNF-GM-CSF, as a proliferator of different tumor cells in vitroand in vivo, was inhibited by either NDV strain ZG1999HDS or LaSota. The opponent, TNF- was increased, when the NDV strain ZG1999HDS was used. In case of NDV strain LaSota, the level of TNF- was decreased. Data on GM-CSF and TNF- analysis are shown in Table 3 and Figure 3.

Figure 2. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on NO, H2O2 and lysozyme levels released from activated TLT+PBMC


Table 2. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on NO, H2O2 and lysozyme levels

VirusNO (μM/mL) H2O2 (μM/mL) Lysozyme (μg/mL)

Control NO Control H2O2 Control Lysozyme NDV ZG1999HDS 3±0.66 7± 1,12 1±0.17 1±0.082 0.14±0.05 0.74±0.08 NDV LaSota 3±0.66 5±0.86 1±0.17 2±0.065 0.14±0.05 0.34±0.05

Table 3. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on GM-CSF and TNF- levels

VirusGM-CSF (pg/mL) TNF- (pg/mL)

Control NO Control H2O2

NDV ZG1999HDS 74±4.21 63±4.10 140±22 179±34 NDV LaSota 74±4.21 66±4.25 140±22 122±18

Figure 3. Effect of NDV strain ZG1999HDS or strain LaSota on GM-CSF and TNF- levels released from activated TLT+PBMC

Activity of IFN- and IFN-

When the levels of two IFNs were studied, the following data were obtained: increase in IFN- and decrease in proinflammatory IFN- . A higher increase of HuIFN- and greater decrease of HuIFN- was found with NDV strain

ZG1999HDS. Data on the levels of IFN- and IFN- are shown in Table 4 and Figure 4. The RP-HPLC profile of NDV strain ZG1999HDS induced interferons showed a greater decrease of 2, A and 1 and total absence of 2b together with an increase of HuIFN- in comparison to the strain LaSota induced interferons (Figure 5).

Figure 4. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on HuIFN- and HuIFN- levels released from activated TLT+PBMC


Table 4. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on HuIFN- and HuIFN- levels

VirusHuIFN- (pg/mL) HuIFN- (pg/mL)

Control NO Control H2O2

NDV ZG1999HDS 62±3.10 120±9.88 25±1.39 19±1.22 NDV LaSota 62±3.10 105±7.35 25±1.39 23±1.98

Figure 5. The RP-HPLC profiles of NDV strain ZG1999HDS or LaSota induced interferons: (A) with NDV induced Russian HuIFN- N3; (B) with NDV strain ZG1999HDS induced HuIFN- N3 and HuIFN- ; (C) with NDV strain LaSota induced HuIFN- N3 and HuIFN-

Table 5. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on IL-1 , IL-2 and IL-4 levels

VirusIL-1 (pg/mL) IL-2 (pg/mL) IL-4 (pg/mL)

Control NO Control H2O2 Control Lysozyme NDV ZG1999HDS 59±6.33 68±2.11 77±4.17 108±8.42 86±9.13 164±6.11 NDV La Sota 59±6.33 62±1.86 77±4.17 79±6.15 86±9.13 110±5.14

Figure 6. Effect of NDV strain ZG1999HDS or LaSota on IL-1 , IL-2 and IL-4 levels released from activated TLT+PBMC


Activity of IL-1 , IL-2 and IL-4 The level of IL-1 as a cytokine inducing the programmed cell death (apoptosis) of mostly different tumor cells was increased, similar to IL-2 and IL-4 when NDV strain ZG1999HDS was used (Table 5 and Figure 6).

Antibacterial activity Concomitantly with the immunomodulation, the induced antibacterial activity against different gram-positive and gram-negative bacteria was studied. The induced anti-bacterial activity was compared with the NDV strain LaSota. In general, it can be concluded that the NDV strain ZG1999HDS induced higher antibacterial activity against gram-positive bacteria than against gram-negative bacteria. It seems that such activity could be connected to the lysozyme content. (Table 6, Figure 7 and Figure 8). The results of the experiments comparing the immune-modulatory activity of very low amount, 10 HAU/mL of NDV strain ZG1999HDS or LaSota, showed in general the superiority of the NDV strain ZG1999HDS. At first, the

macrophage activation by the NO 'burst', H2O2 and lysozyme level increased. After binding to the macrophages (TLT macrophage cell line) and interaction with the PBMC, a decrease in GM-CSF and increase in TNF- and IFN-was found. Concomitantly, a decrease in proinflammatory cytokines (IFN- ) and a variable increase in IL-1 , IL-2 and IL-4 was recorded. In the induction of antibacterial response, strain ZG1999HDS induced higher response compared to strain LaSota against all gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae and Streptococcus mutans), and in case of Staphylococcus aureus, MRSA and Streptococcus mutans it was even higher compared to the antibiotics used. Against gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudo-monas aeruginosa, Proteus mirabilis and Acinetobacter baumannii) this effect was not so clear. (Figure 7 and Figure 8). One of the possible explanations lies in the level of lysozyme induced by NDV strain ZG1999HDS in comparison to strain LaSota. Although NDV causes direct oncolysis effects on tumor cells, NDV has the ability to

Table 6. Antibacterial activity induced by NDV strain ZG1999HDS or LaSota against various gram-positive and gram-negative bacteria

Gram-positive bacteria NDV (strain ZG1999HDS) (mm)

NDV (strain LaSota) (mm) Penicillin (mm) Streptomycin (mm) Gentamicin (mm)

Staphylococcus aureus 9±1.6 4±0.5 8±1.3 6±0.3 8±1.3 MRSA 14±2.5 6±0.3 4±0.5 3±0.3 13±2.5 Streptococcus pyogenes 7±1.4 4±0.5 12±2.5 14±2.5 18±3.2 Streptococcus agalactiae 7±1.4 3±0.3 8±1.3 16±2.5 14±2.5 Streptococcus mutans 19±2.5 13±2.5 6±0.3 12±2.5 14±2.5 Gram-negative bacteria Escherichia coli 7±1.3 5±0.5 8±1.3 14±2.5 18±2.5 Pseudomonas aeruginosa 4±0.5 3±0.3 4±0.3 7±1.3 8±1.3 Proteus mirabilis 5±0.5 6±0.5 5±0.5 9±1.3 8±1.3 Acinetobacter baumannii 5±0.5 6±0.5 3±0.3 18±2.5 16±2.5

Figure 7. Induction of antibacterial activity against different gram-positive bacteria with NDV strain ZG1999HDS or LaSota


modulate the human immune system. Zorn et al. (1994) showed that cellular cytotoxicity of PBMC was enhanced significantly after co-incubation of NDV with effector cells. Throughout the study, NK cells were found to be the predominant mediator of lysis. Indeed, NDV was found to stimulate the host immunity to produce NO and cytokines, such as IFN- , IFN- , TNF- and IL-1, which in turn leads to the activation of NK cells, macrophages and sensitized T cells (Avki et al., 2004). Therefore, activated NK cells are important contributors to the innate defense against viral infections and through stimulation of cytokine secretion, such as IL-2, IFN- and TNF- , further influencing and activating other immune cell functions connected with cytolysis effects against tumor cells.

Conclusions

Immunotherapy has attracted attention of many scientists because it holds promise to be an attractive therapeutic strategy to treat different disorders. In this study, the immunomodulatory effects of low titers of NDV strain ZG1999HDS in comparison to strain LaSota on a mixture of TLT (human macrophage cell line) with PBMC were analyzed. At first, the macrophage activation by the NO 'burst' increased H2O2 and lysozyme levels. After binding to the macrophages (TLT) and interaction with PBMC, a decrease of GM-CSF and increase of TNF- and IFN-was found. Concomitantly, the decrease of proinflam-matory cytokines (IFN- ) and a variable increase of IL-1 ,IL-2 and IL-4 was detected. In the induction of anti-bacterial response against gram-positive bacteria (Staphy-lococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes, Strepto-coccus agalactiae and Streptococcus mutans), it was by 1/3 higher when induced with NDV strain ZG1999HDS compared to antibiotics. Against gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and Acinetobacter baumannii) this effect was not so clear.

Conflict of Interest

All the authors have declared that there is no conflict of interest.

Acknowledgment

The research was partially supported by Mr. Ivan ermak (Croatia) and by grant from the Slovenian Research Agency: ARRS-NRU/P3-0083-0381.

References

ANONYMOUS (2014): The sequence data were deposited in the GeneBank under the accession No: NDV_ZG1999HDS.sqn NDV_Zagreb_1999\ Consensus KJ670427.

AVKI, S., H. TURUTOGLU, A. SIMSEK, A. UNSAL (2004): Clinical and immunological effects of Newcastle disease virus vaccine on bovine papillomatosis. Vet Immunol Immunopathol. 98, 9-16.

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) (2013): Virus NDV (strain ZG1999HDS) was deposited at Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Paris, France. Accession No: CNCM I-4811.

KOBAYASHI, S., R. SATO, T. AOKI, O. INAMANI, C. HANKANGA, Y. YAMADA, N. TOMIZAWA, J. YASUDA, J. SASAKI (2008): Effect of bovine lactoferrin on functions of activated feline peripheral blood mononuclear cells during chronic feline immunodeficiency virus isolation. J Vet Med Sci. 70, 429-435.

LINO, A., O. DEOGRACIOUS (2006): The in-vitro antibacterial activity of Annona negalensis, Securidacca longipendiculataand Steganotaenia araliacea – Ugandan medicinal plants. Afr Health Sci. 6, 31-35.

MAZIJA, H. (2011a): Pneumotropic lentogenic strain of Newcastle disease virus ZG1999HDS isolated in Croatia. Republic of Croatia, State Intellectual Property Office, Patent application P20100579A. (in Croatian)

MAZIJA, H., Ž. GOTTSTEIN, S. IVANKOVI , D. OVI(2011b): Lentogenic cytolytic strain of the Newcastle disease

Figure 8. Induction of antibacterial activity against different gram-negative bacteria with NDV strain ZG1999HDS or LaSota


virus isolated in Croatia. In: Balenovi M (Ed) IXSymposium Poultry Days with International Participation, Proceedings, Šibenik, Croatia, 48-58 (in Croatian)

MORE, P., K. PAI (2011): Immunomodulatory effects of Tinospora cordifolia (Guduchi) on macrophage activation.Biol Med. 3 (Special Issue), 134-140.

NASH, A., S.N.T. BALLARD, T.E. WEAVWER, T.H. AKINBI (2006): The peptidoglycan degrading property of lysozyme is not required for bactericidal activity in vivo. J Immunol. 177, 519-526.

NEDELJKOVI , G. (2011): Genomic characterization and phylogenetic analysis of Newcastle disease virus isolate ZG1999HDS from the outbreak in 1999 in Croatia. Master's of Science, Master's Programme in Infection Biology, Uppsala University, Sweden.

OOI, V. E., F. LIU (2000): Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Curr Med Chem. 7, 715-729.

ORSI, R. O., S. R. C. FUNARI, A. SOARES, S. A. CALVI, S. L. OLIVERI, J. M. SFORCIN (2000): Immunomodulatory action of propolis on macrophage activation. J Venom Anim Toxins. 6, 205-219.

PUNAINEN, S., U.R. VERIPAVEL, H. T L , J. PARKKINEN (1999): Alpha interferon manufacturing process using

immunoadsorption and virus removal filtration. Patent No WO 99/64440.

SCHIRRMACHER, V., T. AHLERT, T. PROBSTLE, H. H. STEINER, C. HEROLD-MENDE, R.GERHARDS, E. HAGMULLER, H. H. STEINER (1998): Immunization with virus-modified tumour cells. Semin Oncol. 25, 677-696.

SCHIRRMACHER, V., L. BAI, V. UMANSKY, L. YU, Y. XING, Z. QIAN (2000): Newcastle disease virus activates macrophages for anti-tumour activity. Int J. 16, 363-373.

STANILOVA, S. A., Z. G. DOBREVA, E. S. SLAVOV, L D. MITEVA (2005): C3 binding glycoprotein from Cuscutaeuropea induced different cytokine profiles from human PBMC compared to other plant and bacterial immunomodulators. Int Immunopharmacol. 5, 723-734.

TZIANABOS, A. O. (2000): Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural aspects and biologic function. Clin Microbiol Rev. 13, 523-533.

UTOH-NEDOS, A. U, P. A. AKAH, T. C. OKOYE, C. O. OKOLI (2009): Evaluation of the toxic effects of dihydroartemisinin on the vital organs of Wistar albino rats.Am J Pharmacol Toxicol. 4,169-173.

ZORN, U. I. DALLMAN, J. GROSSE, H. KIRCHNER, H. POLIWODA, J. ATZPODIEN (1994): Induction of cytokines and cytotoxicity against tumour cells by Newcastle disease virus. Cancer Biother. 9, 225-235.

IMUNOMODULATORNA IN VITRO AKTIVNOST SOJA ZG1999HDS VIRUSA NEWCASTLESKE BOLESTI

Sažetak Imunoterapiji kao privla noj strategiji u lije enju niza bolesti poklanja se sve ve a pozornost, jnudi mogu nost lije enja brojnih bolesti. Ovim istraživanjem uspore eni su imunomodulacijski u inci niskog titra (10 HA/mL) virusa newcastleske bolesti (VNB) soja ZG1999HDS i soja LaSota na TLT (stani na linija humanih makrofaga) + PBMC (periferne stanice krvi s jednom jezgrom). Tijekom aktivacije odre ene su razine NO, H2O2, lizozima i inducirana antibakterijska aktivnost prema gram-pozitivnim bakterijama (Staphylococcus aureus, MRSA, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae and Streptococcus mutans) and gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis i Acinetobacter baumannii), kao i lu enje citokina IL-1 , IL-2, IL-4, GM-CSF, TNF- , IFN- i IFN- tijekom imunomodulacije. Najprije je pove ana aktivnost makrofaga djelovanjem „poplave“ NO, te razine H2O2 i lizozima. Nakon vezanja na makrofage (stani na linija makrofaga TLT) i interakcije s PBMC zabilježeno je sniženje GM-CSF i porast TNF-

i IFN- . Istodobno je došlo do smanjenja koli ine proupalnih citokina (IFN- ) i raznolikog porasta IL-1 , IL-2 i IL-4. Stupanj poticanja antibakterijskog odziva prema gram-pozitivnim bakterijama (Staphylococcus aureus, MRSA,Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae i Streptococcus mutans) bio je za tre inu ve i djelovanjem soja VNB ZG1999HDS negoli sojem LaSota. Prema gram-negativnim bakterijama (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis i Acinetobacter baumannii) ovaj u inak nije o itovan.

Klju ne rije i: virus newcastleske bolesti (soj ZG1999HDS), virus newcastleske bolesti (soj LaSota), imunomodulacija, TLT (stani na linija humanih makrofaga) + PBMC, citokini, lizozim, antibakterijska aktivnost, gram-pozitivne bakterije, gram-negativne bakterije


VITAMIN B6 ENHANCES THE INTERFERON INDUCING CAPABILITY OF THE PARAMYXOVIRUSEE OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS STRAIN ZG1999HDS AND SENDAI VIRUS STRAIN CANTELL

Bratko Filipi 1, Adriana Pereyra2, Hrvoje Mazija3

1Institute for Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia 2MEDEX d.o.o., Ljubljana, Slovenia. 3Croatian Institute of Experimental and Translation Oncology, Zagreb, Croatia

Summary

The Newcastle disease virus (NDV) strain ZG1999HDS was isolated from lung tissue of a broiler chicken from the flock suffering respiratory disease, and was not present in the brain tissue. It proved to be lentogenic never the less causing 76% of mortality because of its pneumotropism. It belongs to genotype II of class II NDV and possesses significantly higher cytolytic abilities for tumor cell cultures in vitro and in vivo for mice compared to the NDV strain LaSota. The Sendai virus (SV) (strain Cantell) is murine paramyxovirus type I, and is broadly used as inducer of the HuIFN- N3 in the buffy coat. The experiments were designed to compare the HuIFN- N3 inducing ability of the two virus strains Cantell in vitro and the possible enhancing effect of vitamin B6 on it. The NDV strain ZG1999HDS yielded the interferon inducing capability similar to SV (483±57 pg/mL versus 584±46 pg/mL). The HuIFN- N3 inducing capability of NDV (strain ZG1999HDS) could be enhanced with vitamin B6 to 3286±34 pg/mL; in case of SV (strain Cantell), vitamin B6 enhanced its interferon inducing capacity to 4557±34 pg/mL. Nevertheless, its induction capacity of HuIFN- N3 differed from SV strain Cantell because of the absence of the HuIFN- N3 subtype 14 and a lower level of the HuIFN- N3 subtype 1.

Key words: Newcastle disease virus (strain ZG1999HDS), Sendai virus (strain Cantell), interferon induction, vitamin B6, enhancement

Introduction

Interferons (IFNs) are multifunctional glycoproteins/proteins made and released by host cells in response to the presence of different pathogens such as viruses, bacteria, parasites or tumor cells. They allow communication between cells to trigger protective defenses of the immune system that eradicate pathogens or tumors. There are two major categories of IFNs, designated as Types I and II. Type I includes IFNs- , and , while Type II includes IFN- only (Bekisz et al., 2004; Kalliolias and Ivashkiv, 2010). Human IFN- consists of a family of approximately 22 structurally related proteins that are products of 14 different gens. Three of them are glycosylated, with the approximate molecular weight of 17500-27000. Each of them is composed of 165-166 amino acids. The human IFN- coding chromosome is

9. The IFN- induction in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from human buffy coats was performed with different Newcastle disease viruses (NDV) (Wheelock, 1966) or Sendai virus (SV) (strain Cantell) (Johnston, 1981). The hemagglutinin-neuraminidase (HN) membrane glyco-protein of NDV virus is responsible for HuIFN- induction in human PBM cells. With regard to HuIFN- N3 induction in human PBMC by NDV, it has been previously suggested that it is a complex process involving the HN protein, uncleaved F protein precursor and a component of the M protein (Wertz et al., 1994; Zeng et al., 2002a). Because NDV determinants can indirectly activate early immune cells through diffuse secretion of cytokines, they can also promote antigen-specific antitumor immune responses. Expression of viral HN and F glycoprotein on tumors following NDV infection leads to up-regulation of T cell

Bratko Filipi , PhD, Institute for Microbiology and Immunology, Medical Faculty, University of Ljubljana, Zaloška 4, 1105 Ljubljana, Slovenia;tel.: +3861 5437463; fax. +3861 5437401; e-mail: [email protected]


78

activation markers; expression of HN on antigen-presenting cells has been shown to augment cytotoxic T lymphocyte responses against infected tumor (Washburn et al., 2003; Zeng et al., 2002b). Among various NDV strains that can induce HuIFN- , the NDV (strain ZG1999HDS) was recently isolated, patented and genetically characterized (Mazija, 2011; Nedeljkovi , 2011). It was deposited in the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM I-4811) (2013) and in GeneBank (2014). The virus was isolated from broiler chicken suffering from heavy respiratory disease causing death of 77.9% of the chicken during a period of 28 days. Its isolation was performed only from lung tissue but it was not present in the brain or other organs (e.g., liver, spleen, intestines). NDV (strain ZG1999HDS) proved to be lentogenic causing death only because of its tropism for respiratory system and immunogenic for chicken (Bi in and Mazija, 2010; Mazija et al., 2011). The phylogenetic analysis shows that it belongs to genotype II of class II NDV and is closely related to NDV strains LaSota and Hitcher B1 (Nedeljkovi , 2011). Sendai virus (strain Cantell) is a hemagglutinating (HA) virus also known as murine parainfluenza virus. Type 1 is generally used for interferon induction (Johnston, 1981). It was also found that the addition of vitamin B3 and vitamin C to the IFN induction medium increased the HuIFN- N3 productivity by 20%-30% (Di Paola, 1993). The presented experiments were aimed to determine the HuIFN- N3 inducing capability of the NDV (strain ZG1999HSD) and the possibility of its enhancement with vitamin B6 in comparison to the SV (strain Cantell) on human PBMC isolated from human buffy coats.

Material and Methods

Viruses The NDV (strain ZG1999HDS) virus was obtained from Professor Emeritus Hrvoje Mazija (Croatian Institute of Experimental and Translation Oncology, Zagreb, Croatia). The SV (strain Cantell) was kindly provided by Eugen Šooš, PhD (Kloštar Ivani , Croatia). Both viruses were multiplied in SPF (specific pathogen free) chicken embryos and concentrated by lyophilization. The EID50 determined in SPF chicken embryos was 2.0x107 for NDV (strain ZG1999HDS) and 1.0x107 for SV (strain Cantell).

Isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from human buffy coats The buffy coats obtained from the Blood Transfusion Center in Ljubljana (Slovenia) were combined and centrifuged at 1700 RPM for 20 min at 4 °C. The supernatant containing plasma and part of the leukocytes were resuspended in the PBS containing 1% of glucose. To the sediment containing erythrocytes, lymphocytes, macrophages and granulocytes, 9 parts of the 0.83% ammonium chloride were added. Erythrocyte lysis was performed at 4 °C and took 15-20

min. After this time, the cell suspension was centrifuged at 2500 RPM for 20 min at 4 °C. The supernatant was removed and the white cell sediment was resuspended in the PBS containing 1% of glucose. Both supernatants were combined and white cells were sedimented by centrifugation at 2500 RPM for 20 min at 4 °C. The percentage of living or dead cells was determined by trypan blue staining. The isolated PBMC cells were resuspended in the HuIFN- induction medium at a concentration of 2x107 cells/mL + 5% of Human Serum Albumin (HSA).

Determination of the virus hemagglutinating (HA) activity Hen's blood from Poultry Department of the Veterinary Faculty, University of Ljubljana (Slovenia) with added anticoagulant (sodium citrate) was centrifuged at 2400 RPM for 15 min. The sediment containing erythrocytes was resuspended in the PBS containing 1% glucose and sedimented again at 2400 RPM for 15 min. From the second sediment, 1 mL of erythrocytes was taken and resuspended in 99 mL of PBS containing 1% glucose. So, the 1% solution of hen's erythrocytes was obtained. The virus HA activity was determined as described elsewhere (Atabekov, 1981; Bekisz et al., 2004).

Induction of HuIFN- N3 with NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell)HuIFN- N3 induction was performed in the induction medium prepared according to Jarekrans and Olovsson (2001). To the 5 cm Petri dishes containing 3 mL of PBMS (2x107 cells/mL) cell suspension in the HuIFN- induction medium, 3.2, 6.4, 9.6 and 100 HA/mL of the NDV strain ZG1999 HDS was added. In the case of Sendai virus, 6.4, 9.6, 12.8 and 100 HA/mL was added. The Petri dishes were incubated for 18 hours at 37 °C at 5% CO2 atmosphere. All experiments were performed in triplicate in three to four separate experiments. In the separate experiments, before viral induction with NDV strain ZG1999HDS or Sendai virus, priming with 100 IU/mL of HuIFN- N3 was performed for two hours at 36 °C.

HuIFN- N3 induction enhancement experiments To 100 HA/mL of the NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell), 0.40 L of the suspension of vitamin B6 in PBS was added. In the combined experiment, vitamin B6 was added to 100 IU/mL of HuIFN- N3 primed 100 HA/mL NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell). All experiments were performed in triplicate in three separate experiments.

UV- inhibition of HuIFN- N3 induction with NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell) The human PBMC cells were cultured in 3 cm plastic Petri dishes at a concentration of 2x108 cells/mL in a total volume of 2.0 mL with the vaccine strain NDV ZG1999HDS or SV


79

(strain Cantell) or UV-treated NDV (strain ZG1999HDS) or UV-treated SV (strain Cantell). The UV illumination of the viruses took 10 and 30 min with 15 W UV lamp from a distance of 25 cm with occasional rotating of Petri dishes containing the viral sample. After UV illumination, the HuIFN- N3 (pg/mL) inducing capacity of the virus samples and their HA activity (HA units) were measured (Iwata etal., 1990).

Vitamin B6 Vitamin B6 was obtained from Sigma-Aldrich (representative in Slovenia).

HuIFN- N3 monoclonal ELISA The quantity of induced HuIFN- N3 (pg/mg) was determined by Human IFN ELISA kit Platinum ELISA from eBioscience (Vienna, Austria). In the assay, the international HuIFN- N3 standard was used (Human IFN- Platinum ELISA (BMS216/BMS 216 TEN), Affymetrix, eBioscience, Santa Clara, CA, USA). The assay was performed according to the manufacturer’s instructions, with the final reading by the ELISA reader at 620 nm and calculating of the pg-s of HuIFN- N3/mL.

HuIFN- N3 RP-HPLC analysis The HuIFN- N3 subtype composition was analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Different HuIFN- samples (natural and recombinant) (approximately 1 million antiviral units/mL) of 20-40 L were applied to the Phenomenex, Aeris PEPTIDE column 3.6 m XB-C18, 250x4.6 mm and eluted with the linear gradient of Solvent A = water + 0.1% of TFA and Solvent C = Acetonitrile + 0.1% TFA for 20 minutes with a flow rate of 0.8 mL/min and pressure of 139-140 bar. The course of RP-HPLC chromatography of different IFN samples is shown in Table 1. The temperature of the column was 40 °C. The absorbance was monitored at 214 and 280 nm. HuIFN- alpha interferon species in different IFN compositions were separated according to their relative hydrophobicity using RP-HPLC (Punainen et al., 1999).

Table 1. The course of RP-HPLC chromatography of different interferon samples

Step Time (min) Solvent A (%) Solvent C (%)

0 0 91 9

1 3 80 20

2 6 50 50

3 12 50 50

4 15 91 9

5 20 91 9

Data analysis All biological experiments were performed in triplicate in three to four separate experiments. Data are presented as means ± standard deviation.


Induction capability of HuIFN- N3 with NDV (strain ZG1999HDS) versus SV (strain Cantell) The results of the HuIFN- N3 induction experiments in the human PBMC with the NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell) are shown on Figure 1. In case of NDV (strain ZG1999HDS) induction of the HuIFN- N3, relatively high amounts (429±53 pg/mL) were obtained with the use of only 3.2 HA units/mL of the virus. The highest amount of HuIFN- N3 was obtained in single induction experiment when 100 HA/mL was used. In that case, 483±45 pg/mL of HuIFN- 3 was obtained. The obtained IFN amounts were comparable with the HuIFN- 3 inducing capacity to the SV (strain Cantell), where the highest amount in single experiment was obtained with 100 HA/mL, resulting in 584±52 pg/mL of HuIFN- N3. Quite comparable data were obtained with the avirulent NDV (strain Ulster) on human PMBC where about 450±32 pg/mL of HuIFN- 3 was obtained with 25 HA units/mL of the virus (Židovec and Mažuran, 1999).

The UV-inhibition of HuIFN- N3 induction capacity of the NDV (strain ZG1999HDS) versus SV (strain Cantell) The influence of UV treatment of NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell) virus on its capacity to induce HuIFN- N3 deserves discussion. The intensive UV treatment for 30 min practically destroyed the virus potency to induce HuIFN- N3. In contrary, its HA activity remained relatively unaffected after UV treatment. The results of these experiments are presented in Table 2. The UV-inhibition of the HuIFN- N3 induction capacity of the NDV (strain ZG1999HDS) and SV (strain Cantell) is the indirect proof of its HuIFN- N3 induction potential in vitro on PBMC.

HuIFN- N3 enhancement induction experiments The results of the HuIFN- N3 induction enhancement are shown in Table 3. The most 'fascinating' are data on the priming experiments using 100 IU/mL of HuIFN- N3 for two hours at 37 °C prior to adding 100 HA/mL of the NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell) and separately vitamin B6. The priming almost completely destroyed the induction enhancement of the B6 alone with 100 HA/mL either NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell). The mechanism of such destruction is completely unknown.


80

Table 2. UV-inhibition of HuIFN- N3 induction capacity of NDV (strain ZG1999HDS) versus SV (strain Cantell)

NDV (strain ZG1999HDS) SV (strain Cantell) Time of UV illumination HuIFN- N3 HA/mL HuIFN- N3 HA/mL

pg/mL % of inhibition HA/mL % of inhibition pg/mL % of inhibition HA/mL % of inhibition0 min 483±45 0 100 0 584±52 0 100 0 10 min 371±27 23 91 9 473±42 19 89 11 30 min 53±4 89 85 15 123±15 79 84 16

Table 3. HuIFN- N3 enhancement induction experiments

Induction with NDV1) (strain ZG1999HDS) With NDV (strain

ZG1999HDS) induced HuIFN- N3

With SV2) (strain Cantell) induced HuIFN- N3 Induction with SV (strain Cantell)

pg/mL pg/mL NDV (strain ZG1999HDS) 100HA/mL 3) 483±57 584±46 SV (strain Cantell) 100HA/mL NDV (strain ZG1999HDS) 100HA/mL + B6 3286±348 4557±348 SV (strain Cantell) 100HA/mL + B6

(HuIFN- N3 100IU/107PBMC) 4) NDV (strain ZG1999HDS) 100HA/mL 2695±243 3447±273 (HuIFN- N3 100IU/107PBMC) +

SV (strain Cantell) 100HA/mL (HuIFN- N3 100IU/107 PBMC) + NDV (strain ZG1999HDS) 100HA/mL + B6 342±14 496±78 (HuIFN- N3 100IU/107PBMC) +

SV (strain Cantell) 100HA/mL + B6 1) NDV = Newcastle disease virus 2) SV = Sendai virus 3) HA/mL = hemagglutination units/mL 4) (HuIFN- N3 100IU/107PBMC) = priming with 100IU/107 PBMC of HuIFN- N3.

RP-HPLC analyses of NDV (strain ZG1999HDS) versus SV (strain Cantell) induced interferon (HuIFN- N3) HuIFN- N3 interferon subtypes in different samples (natu-ral and recombinant) are separated according to their relative hydrophobicity using RP-HPLC (Salunkhe et al., 2009; Testa et al., 1997). The separation of different HuIFN-subtypes in the samples was achieved by increasing acetonitrile concentration. The least hydrophobic interferon subtypes were eluted as early peaks and the most hydrophobic interferon subtypes were eluted as later peaks. For standards, different human recombinant interferon were used: HuIFN- A, HuIFN- 2a and HuIF- 2b. Their chromatograms at 214 and 280 nm and the chromatograms at 280 nm of the Russian HuIFN- N3 (NDV induced) and HuIFN- N3 of the Institute of Immunology, Zagreb (Croatia) (Sendai virus (strain Cantell) induced were used as standard. The position of different HuIFN- N3 subtypes was determined according to the 214 nm chromatogram at WO 99/64440 (Punainen et al., 1999) and US Patent 6,309,862 (Iwata et al., 1990). The protein profile (280 nm) was compared to the HuIFN- N3 profile of different subtypes at 214 nm.

The NDV (strain ZG1999HDS) The components of the NDV (strain ZG1999HDS) induced HuIFN- N3, shown in Figure 2, are the subtypes 1, 2, A

and 2b. The most important are the subtypes 1 and 2 as the main biologically active components of the virus induced HuIF- N3, or more precisely, its relative ratio in the HuIFN- N3 preparation (Antonelli, 2008). To quantify different HuIFN- N3 subtypes 2, and 1 increase (values of mAU relative units), a remains unchanged, while 2bdecreases (value of mAU relative units; B and C in Figure 2). Different types of HuIFN- N3 inductors differ in induction capacity of the quantity of the IFN natural subtypes 1, 2, A and 2b. It seems that the highest increase of HuIFN- N3 subtypes 1 and 2 (value of mAU relative units) was obtained with the vitamin B6 addition to 100 HA/mL of NDV (strain ZG1999HDS).

The SV (strain Cantell) The predominant components of the SV (strain Cantell) induced HuIFN- N3, shown in Figure 3, are natural IFN subtypes 1, 2, A, b and 14. Similarly as in the case of the NDV (strain ZG1999HDS) induced HuIFN- N3 preparation, most important are subtypes 1, 2 and 14 as active components of the HuIFN- N3. The most important is the relative ratio between 1 and 2 (values of mAU relative units (Antonelli, 2008)). The quantification of different subtypes shows 2 and 1 increase (values of mAU relative units), while A, 2b and 14 remain


81

unchanged (B and C in Figure 3). Various types of HuIFN-N3 inductors differ in the induction capacity of the IFN

subtypes 1, 2, A, 2b and 14. The highest increase of

HuIFN- N3 subtypes 1 and 2 (value of mAU relative units) was obtained with vitamin B6 addition to 100 HA/mL of SV (strain Cantell).

Figure 1. HuIFN- N3 induction in PBMC by NDV (strain ZG1999HDS) or SV (strain Cantell).

Figure 2. RP-HPLC profiles of the NDV (strain ZG1999HDS) induced IFNs: (A) protein profiles of different IFNs at 280 nm; (B) protein profile at 280 nm ( ) and IFN profile at 214 nm ( ) of HuIFN- N3 induced with 100 HA/mL of NDV (strain ZG1999HDS); (C) protein profile at 280 nm ( ) and IFN profile at 214 nm ( ) of HuIFN- N3induced with 100 HA/mL of NDV (strain ZG1999HDS) + vitamin B6.


82

Figure 3. RP-HPLC profiles of the Sendai virus induced IFNs: (A) SV = Sendai virus (strain Cantell). Protein profiles of the various IFNs at 280 nm; (B) protein profile at 280 nm ( ) and IFN profile at 214 nm ( ) of HuIFN- N3induced with 100 HA/mL of SV (strain Cantell); (C) protein profile at 280 nm ( ) and IFN profile at 214 nm ( ) of HuIFN- N3 induced with 100 HA/mL of SV (strain Cantell) + vitamin B6.

Conclusions

The Newcastle disease virus (strain ZG1999HDS) HuIFN-N3 inducing capacity was compared to the HuIFN- N3

inducing capacity of the SV (strain Cantell) (Zeng et al.,2002b). The SV (strain Cantell) is a negative stranded RNA virus with the ability to induce very large quantities of the Type I IFNs, more precisely HuIFN- N3 in the PBMC from human buffy coats. The SV (strain Cantell) induced HuIFN-

N3 is composed of 14 different natural subtypes, which exhibit different antiviral, antiproliferative and immunomodulatory activity in vitro. With 100 HA of Sendai virus in the PBMC from human buffy coats, 584±52 pg/mL of the HuIFN- N3 can be obtained, which is ¼ more than 100 HA of NDV (strain ZG1999HDS). So, the IFN- N3 inducing capacity of the NDV (strain ZG1999 HDS) is comparable to the SV (strain Cantell). In the enhancement experiments with vitamin B6, a little lower level of 3.286±348 pg/mL of the HuIFN- N3 was obtained with the NDV (strain 1999HDS) as compared with SV (strain Cantell) (4.557±348 pg/mL). It is interesting to note that priming with 100 units of HuIFN- N3/107 of PMBC did not increase the level of the HuIFN- N3 produced after the addition of vitamin B6 to the NDV (strain 1999HDS) or SV (strain Cantell) Finally, it can be concluded that the NDV (strain ZG1999HDS) has the HuIFN- N3 inducing capacity similar to SV (strain Cantell). Its HuIFN- N3 inducing capability can be enhanced with 10% PBS to 3818±419 pg/mL in comparison to 100 HA of NDV ZG1999HDS alone, which yielded 483±45 pg/mL, despite its HuIFN- N3 induced lacking the natural subtype 14 and having a lower amount of the natural subtype 1.

Conflict of Interest

All the authors have declared, that there is no conflict of interest.

Acknowledgment

The research was partially supported by Mr. Ivan ermak (Croatia) and by grant from the Slovenian Research Agency, ARRS-NRU/P3-0083-0381.

References

ANONYMUS (2013): Human IFN- Platinum ELISA (BMS 216/BMS 216TEN), Affymetrix, eBioscience, CA 95051, USA.

ANONYMUS (2014): The sequence data were deposited in the GeneBank under the accession No: NDV_ZG1999HDS.sqn NDV_Zagreb_1999\Consensus KJ670427.

ANTONELLI, G. (2008): Biological basis for a proper clinical application of alpha interferons. New Microbiologica 31:305-318.

ATABEKOV, I. G. (1981): General virological practical course. Experiment 3: Determination of the virus titer using the haemagglutination reaction. Edition of the Moscow University, pp. 16-18. (in Russian)

BEKISZ, J., H. SCHMEISSER, J. HERNANDEZ, N. D. GOLDMAN, K. C. ZOON (2004): Human interferon alpha, beta and omega – mini review. Growth Factors 22:243-251.

BI IN, M., H. MAZIJA (2010): Immunogenicity of field strain of Newcastle disease virus ZG2000 applied to SPF chickens. VIII Symposium Poultry Days 2009, Croatia, Pore , March 25-28, 2009; pp 241-245. (in Croatian)

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) (2013): Virus NDV (strain


83

ZG1999HDS) was deposited at Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Paris, France. Accession No: CNCM I-4811.

DiPAOLA, M., K. FERENCZ-BRIO, L. MEI-JUNE, M. PADHYE, A. RASHIDBAIGI, D. TESTA (1993): Patent: Improved Alpha Interferon composition and methods for its production from human peripheral blood leukocytes. Publication No. WO 1993016107A1.

FASCIA, P., D. DeSMECHT (2006): Sendai virus, the mouse parainfluenza type 1: a longstanding pathogen that remains up-to-date. Res. Vet. Sci. 82:115-125.

IWATA, H., M. TAGAYA, K. MATSUMOTO, T. MIYADI, T. YOKOCHI, T. KIMURA (1990): Aerosol vaccination with Sendai virus ts mutant (HVJ-pB) derived from persistently infected cells. J. Infect. Dis. 162:402-407.

JAREKRANS, M., H. OLOVSSON (2001): Methionine contai-ning animal cell culture medium and its use. US Patent 6,309,862 B1.

JOHNSTON, M. D. (1981): The characteristics required for a Sendai virus preparation to induce high levels of interferon in human lymphoblastoid cells. J. Gen. Virol. 56:175-184.

KALLIOLIAS, D. G., B. L. IVASHKIV (2010): Overview of the biology of type I interferons. Arthritis Res. Ther. 12 (Suppl. 1):S1-S9.

MAZIJA, H. (2011): Pneumotropic lentogenic strain of Newcastle disease virus ZG1999HDS isolated in Croatia. Republic of Croatia. State Intellectual Property Office. (in Croatian) Patent application NoP20100579A.

MAZIJA, H., Ž. GOTTSTEIN, S. IVANKOVI , D. OVI(2011): Lentogenic cytolytic strain of the Newcastle disease virus isolated in Croatia. In: Balenovi M. (Ed) IX PoultryDays, Proceedings, Poultry Center Zagreb, 48-58. (in Croatian)

NEDELJKOVI , G. (2011): Genomic characterization and phylogenetic analysis of Newcastle disease virus isolate ZG1999HDS from the outbreak in 1999 in Croatia. Master's of Science, Master's Programme in Infection Biology, Uppsala University, Sweden.

PUNAINEN, S., U. R. VERIPAVEL, H. T L , J. PARKKINEN (1999). Alpha interferon manufacturing process using

immunoadsorption and virus removal filtration. Patent No WO 99/64440.

SALUNKHE, S. S., B. PRASAD, K. SABNIS-PRASAD, A. APTE-DESHPANDE, S. PADMANABHAN (2009): Expression and purification of SAK-fused human interferon alpha in Escherichia coli. J. Microbial Biochem. Technol. 1, 5-10.

STRAHLE, L., D. GARCIN, D. KOLAKOVSKY (2006): Sendai virus defective-interfering genomes and the activation of interferon-beta. Virology 351, 101-111.

TESTA, D., M. J. LIAO, F. KATALIN, A. RASHIDBAIGI, M. DIPAOLA (1997): Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof. US Patent Number: 5,676,942.

WASHBURN, B., M. A. WEIGAND, A. GROSSE-WILDE, M. JANKE, H. STAHL, E. RIESER, M. R. SPRICK, V. SCHIRRMACER, H. WALCZAK (2003): TNF-related apoptosis-inducing ligand mediates tumouricidal activity of human monocytes stimulated by Newcastle disease virus. J. Immunol. 170, 1814-1821.

WHEELOCK, E. F. (1966): Virus replication and high-titered interferon production in human leukocyte cultures inoculated with Newcastle disease virus. J. Bacteriol. 92, 1415-1421.

WERTZ, K., M. BÜTTNER, A. MAYR, O. R. KAADEN (1994): More than one component of the Newcastle disease virus particle is capable of interferon induction. Vet. Microbiol. 39, 299-311.

ZENG, J., P. FOURNIER, V. SCHIRRMACHER (2002a): Stimulation of human natural interferon response viaparamyxovirus hemagglutinin lectin-cell interaction. J. Mol. Med. 80, 443-451.

ZENG, J., P. FOURNIER, V. SCHIRRMACHER (2002b): Induction of interferon-alpha and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human blood mononuclear cells by hemagglutinin-neuraminidase but not F protein of Newcastle disease virus. Virology 297, 19-30.

ŽIDOVEC, S., R. MAŽURAN (1999): Sendai virus induces various cytokines in human peripheral blood leukocytes: different susceptibility of cytokine molecules to low pH. Cytokine 11, 140-143.

VITAMIN B6 POJA AVA INDUKCIJU INTERFERONA PARAMYXOVIRUSIMA NEWCASTLESKE BOLESTI SOJ ZG1999HDS I VIRUSOM SENDAI SOJA CANTELL

SAŽETAK Virus newcastleske bolesti (VNB) soj ZG1999HDS izdvojen je tkiva plu a tovnih pili a iz jata s o itovanom dišnom bolesti i nije istodobno dokazan u tkivu mozga. Dokazana su njegova lentogena svojstva iako je izazvao proved to be lentogenic never the less causing 77,29% uginu a što se pripisuje njegovu pneumotropizmu. Pripada genotipu II razreda II VNB te o ituje zna ajno izražena citoliti ka svojstva prema tumorskim stanicama in vitro te in vivo na pokusnim miševima, u usporedbi sa La Sota sojem virusa newcastleske bolesti. Sendai virus (SV) (soj Cantell) je mišji paramyxovirus tipa I, a koristi se opsežno kao induktor interferona HuIFN- N3 u leukocitima. Pokus je zamišljen radi usporedbe svojstva indukcije HuIFN- N3 ovim virusima in vitro te mogu em poja anju te indukcije primjenom vitamina B6. Soj ZG1999HDS VNB o itovao je svojstvo indukcije interferona sli no virusu SV (483±57 pg/mL versus 584±46 pg/mL). Svojstvo pove anja proizvodnje interferona HuIFN- N3 VNB sojem ZG1999HDS može se potaknuti dodatkom vitamin B6 do 3286±34 pg/mL, a sojem Cantell SV (strain Cantell) do 4557±34 pg/mL. Ipak svojstvo indukcije HuIFN- N3 razlikuje se od soja Cantell SV zbog izostale tvorbe HuIFN- N3 podtipa 14 i manje koli ine HuIFN- N3 podtipa 1.

Klju ne rije i: newcastleska bolesti, soj ZG1999HDS, Sendai virus, soj Cantell, indukcija interferona, vitamin B6, poboljšanje


SUPERIOR PRODUCTION RESULTS OF BROILERS FED WITH WATER-SOLUBLE FORM OF TANNIN (CASTANEA SATIVA MILL.) EXTRACT FORTIFIED BY CA-BUTYRATE

Maksimiljan Brus, Marko Volk

University of Maribor, Faculty of Agriculture and Life Sciences, Ho e, Slovenia

Summary

This article describes two trials conducted in the poultry test station at the Faculty of Agriculture and Life Sciences. The aimof the first experiment was to determine efficient doses of Ca-butyrate (250, 500 and 1000 g/t CFM) and combination of tannin and Ca-butyrate (250, 500 and 1000 g/t CFM) in comparison to the sole tannin extract in a concentration (750 g/t) proven as control in several previous experiments. All additives were used in powder form in complete feed mixtures (CFM). The purpose of the second experiment was to test different concentrations of the water-soluble form of additive combination comprising of tannin extract and Ca-butyrate (0, 0.5, 1 and 2 L/m3) where the experimental concentrations in water corresponded to the concentration of additive in CFM. Administration of additive in drinking water for broiler chickens was tested with regard to production results and intensive fattening conditions. Testing was carried out on broiler chickens Ross 308 hybrid from the regular commercial hatchery (Perutnina Ptuj). Animals were divided into groups or sections within groups with 90 animals per section for each concentration. The method of additive administration was CFM or orally in the second experiment as supplement in drinking water throughout the experiment. Weekly we monitored body weight, feed consumption, mortality and health status of animals and then calculated feed efficiency. On experimental day 42, the production economic efficiency (PEF) was calculated using the European formula. Statistical analysis was performed with the SPSS 21.0 for Windows. Results from the first experiment indicated that the combination of tannin and Ca-butyrate in concentration of 250 g/t enabled highest production results in the final body weight and production efficiency in experimental and control groups. The second experiment revealed that the dose of 1 L/m3 of additive led to outstanding production results where animals achieved the mean 2.806 kg live weight with 1.585 kg/kg feed efficiency and 412 PEF. The results obtained showed a real chance of tannin added to drinking water as a supplement to balance digestive processes, produce good feed efficiency and achieve top production results.

Key words: tannin (Castanea Sativa Mill.), broiler chickens, production parameters, Ca-butyrate

Introduction

Growing public concern about the use of antibiotics in livestock feed and the increasing number of resistant pathogens to these antibiotics has led to the fact that in January 2006 EU placed total ban on the use of antibiotics in animal feeds (Hooge, 2012). Following the ban on the use of antibiotic growth promoters in compound feed, indigestion emerged in chickens as one of the major health problems causing significant economic losses. Instead of antibiotics, manufacturers have started using other feed additives to improve health and enhance growth of domestic animals (Hooge, 2012; Verstegen and Williams, 2002). These

include direct addition of microbial feeds (Heugten et al.,2003; Li et al., 2006), organic acids (Kim et al., 2005), herbal extracts and spices (Manzanilla et al., 2004), nucleotide additions (Martinez-Puig et al., 2007), mannan oligosaccharides (Kogan and Kocher, 2007), fructo-carbohydrate (Mikkelsen et al., 2003) and oligofructose (Pellikaan et al., 2007). The mechanism of action of these additives can be described as primarily inhibiting the growth of pathogens and promoting the growth of beneficial bacteria for the gastrointestinal system of nonruminants. Tannins can also be considered in the group of plant extracts. Tannins belong to the group of secondary metabolites, which act as a defense

Maksimiljan Brus, University of Maribor, Faculty of Agriculture and Life Sciences, Pivola 10, Ho e 2311, Slovenia; tel.: +386(0)2 3209026; fax.: +386(0)2 6161158; e-mail: [email protected]

SUPERIOR PRODUCTION RESULTS OF BROILERS FED WITH WATER-SOLUBLE FORM OF TANNIN (CASTANEA SATIVAMILL.) EXTRACT FORTIFIED BY CA-BUTYRATE

85

mechanism of plants against herbivores. According to chemical structure, they can be divided into four groups (condensing tannins - proanthocyanidins, hydrolysable tannins, phlorotannins - brown algae, and complex tannins - bound to metals or proteins). Tannins extracted from hardwood such as oak and chestnut consist mainly of hydrolysable tannins. In the literature, hydrolysable tannin has been attributed antiviral and antibacterial activity, and antioxidant and anti-tumor activity on the cells of intestinal epithelium (Arapitsas, 2012). Therefore, tannins as a feed additive have a significant potential for livestock, but their use is hindered mainly due to the lack of knowledge about the role and impact of individual tannins on animals. A number of authors (Hooge, 2012; Hooge et al., 2012; Jamroz et al., 2009; McCann et al., 2006; Schiavone et al., 2006; Schiavone et al., 2007, 2008) conducted nutritional experiments on broiler chickens, at the beginning with a very wide range of concentrations of tannin chestnut extract (Castanea sativa Mill.) in the form of granules or powder. In the latest results of nutritional experiments on broiler chickens, four concentrations are most commonly reported: 250 g/t, 500 g/t in 750 g/t oz. 1000 g/t (Hooge, 2012; Hooge et al., 2012; Jamroz et al., 2009; McCann et al., 2006; Schiavone et al., 2006; Schiavone et al., 2007, 2008). Like tannins, butyrate also possesses many positive attributes, which are perfectly complemented by the action of tannin. Butyrate has been attributed a significant impact on the nutritional status of enterocyte as a source of energy (Claus et al., 2007; Guilloteau et al., 2010), positive action on vitality and proliferation of cells (Canani et al., 2011; Claus et al., 2007), important role as an anti-inflammatory agent (Canani et al., 2012; Canani et al., 2011), as cellular immune stimulator and defense mechanism (Van Immerseel et al., 2004, 2006; Sunkara et al., 2011), and maintaining integrity of the enterocyte monolayer in the gut as a barrier function (Hu and Guo, 2007; Ma et al., 2012; Peng et al.,2009; Ziegler et al., 2003). For these reasons, the combination of tannin and butyrate achieves better performance than each component separately.The aim of this study was to determine the usefulness of powder and water-soluble form of tannin extract (WSTE) of sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) added to the feed or drinking water in broiler chickens under intensive production conditions with respect to the production parameters.


Test station and animals The experiments were carried out on broiler chickens hybrid Ross 308. Chickens were taken from a larger commercial hatchery (Perutnina Ptuj) from one random regular incubation. One-day-old chickens were housed as hatched at a ratio of 50%:50% cockerels and pullets. Animals were housed separately in 18 sections divided by a wire barrier. Stocking density in each section was limited to 15 animals

per m2. The test was carried out in the test station for poultry. The barn is equipped with controlling computerized equipment for heating, lighting and ventilation to ensure optimal microclimate conditions for animals.

Complete feed mixtures (CFM) In both experiments, chickens were fed with CFM on the basis of corn-wheat-soy mixture. Feed was mixed according to a recipe that is used in regular commercial intensive production of broiler chickens provenience Ross 308. All CFM were produced in the Perutnina Ptuj mill. Basic CFM were mixed at the same time for all groups in both experiments. Then individual components were added according to the protocol and type of CFM. The first two-phase experiment was conducted with CFM Bro-S on 0-14th

day of life and Bro-F2 on 15th-42nd day of life. The second experiment included a three-phase feeding regimen, as follows: Bro-S from beginning to 14th day, then Bro-F1 from 15th to 35th day, and Bro-F2 for the last week till 42nd day of life. All CFM were in pelleted form.

The application of the additive In the first experiment, we used powder form of feed additive. Products of tannin extract were mixed into the CFM, which were free from any additives (organic acids, prebiotics, probiotics) added to the feed at this age in regular commercial fattening of broiler chickens. Both test additives for CFM were provided by Tanin Sevnica d.d. Dosage of tannin extract additives was done according to the manufacturer's instructions (Table 1):

Table 1. Experimental groups and concentrations of additives in the first experiment

Group Amount of additive in feed (g/t)

Farmatan (control) E1T0 750

Farmatan + Ca-butyrate coated

E1T1 1000

E1T2 500

E1T3 250

Ca-butyrate coated

E1T4 1000

E1T5 500

E1T6 250

In the second experiment, we used WSTE, which consisted of soluble tannin extract and Ca-butyrate. The chickens were divided into four groups (Table 2) depending on the amount of additive (WSTE) in drinking water. The additive was administered orally as a supplement in drinking water. Supply equipment is arranged into four independent units equipped with 60-liter water tanks, allowing separate additive dosing in drinking water for animals.


86

Table 2. Experimental groups and concentrations of additives in the second experiment (WSTE)

Group Amount of additive (L/m3) Calculated equivalent in feed (g/t) Calculated concentration of additive in water and feed (%)

E2T0 0.00 0 0.00 E2T1 0.50 250 0.05 E2T2 1.00 500 0.10 E2T3 2.00 1000 0.20

Drinking water with a particular concentration of tannin was prepared daily for each group of chickens. Water with water-soluble tannin extract (WSTE) was prepared in the container for drinking water nipple system for each group respectively. Daily water consumption for each group was recorded and smooth flow of drinking water with WSTE was provided to supply the chickens with water.

Breeding technology Chickens were bred according to the established technology in deep litter. The floor was covered with wood shavings 12 cm thick and lighting was continuous at the time of fattening. In the first experiment, chickens were divided into seven sections with 90 animals per section. In the second experiment, chickens were divided into four groups of four or five sections per group. Each section comprised 90 animals. The heating and ventilation equipment was software controlled and configured so as to provide the same microclimatic conditions in all sections. Heating was based on hot air heating; with supplying heated air through the duct under the ceiling and steady blowing in every department. Control was regulated through temperature and humidity sensors. Water supply was provided with nipple drinkers with a capacity of 10 animals per nipple. Nipples allow maximum pressure setting of the regulator for flow rate of 80 mL/min, which meets the needs of the animal weight 4 kg or more. At the beginning of the experiment till 7th day of age, chickens were fed from plastic plates, and later, by the end of the experiment, they received feed from hanging plastic feeder (Roxell) with a capacity of 65 animals.

Production results control During the experiment, chickens were weighed individually at the end of each week of age. On the day of weighing, feed consumption was calculated for the section and water consumption determined per group of animals, according to the experimental protocol.

Health status of chickens Throughout the experiment, we checked the status of chickens daily in all test groups. We observed their behavior and appearance. Losses were recorded continuously and the cause of death was determined. On the 14th day of age, all

chickens were vaccinated against Newcastle disease (La Sota) by drinking water method.

Statistical analysis Data obtained during consecutive weighing were used on statistical analysis. Statistical analysis was performed with SPSS 21.0 for Windows. Descriptive procedure was employed to calculate basic statistics. To compare between-group variability we used univariate GLM procedure and testing performed by Duncan test. The production index achieved and the water:feed ratio were compared with Grub's test. The groups that were significantly different from each other on the same day of age at P 0.05 were labeled with a, b and c.

Production efficiency factor (PEF) The following formula was used on calculation of the production efficiency factor Aviagen, 2014:

The higher the number the better technical productivity and higher economic achievement. The formula is used in many European countries for comparison of rearing and production between and within the farms. It is also referred to as European Production Efficiency Factor (EPEF) (Aviagen, 2014).

Results

Results of the first and second experiments are combined according to production parameters of mean live weight, mean feed efficiency, water:feed ratio and PEF.

Table 3 shows results of mean body weight of the animals included in the first experiment. It is evident that on 7th day of age, the E1T4 group chickens achieved maximum mass of 0.133 kg, which was not significantly (P>0.00) different from the control and the majority of test groups. On the following experimental days, at each successive weighing, the highest weight was reached in E1T3 groups and was significantly different (P 0.00) from other test groups.


87

Table 3. Mean live weight (kg) in experimental groups on control days during first experiment

Age (day) Groups

Sig. E1T0 E1T1 E1T2 E1T3 E1T4 E1T5 E1T6

7th 0.129b 0.122a 0.124a 0.131b 0.133b 0.130b 0.123a 0.000 14th 0.330b 0.325ab 0.324ab 0.351d 0.346cd 0.336bc 0.311a 0.000 21st 0.621ab 0.610a 0.610a 0.658c 0.651bc 0.628abc 0.611a 0.003 28th 0.956a 0.956a 0.953a 1.045b 1.000ab 0.976a 0.979a 0.001 35th 1.383a 1.361a 1.376a 1.502b 1.405a 1.380a 1.423a 0.000 42nd 1.948a 1.919a 1.924a 2.106ab 2.011ab 1.951a 2.023ab 0.001

Figure 1. Mean live weight (kg) of animals in experimental groups on control days during second experiment.

Figure 1 shows the mean body weight and statistically significant (P 0.05) between-group differences. From the second week onwards, statistical analysis showed statistically significant between-group differences on each control weighing day. On the 42nd day of age, the maximum mass was achieved in the E2T2 group (0.1% WSTE) compared to other test groups. All test groups exceeded the expected mean live weight by more than 15% according to broiler manuals (Aviagen, 2014).

Table 4. Mean feed conversion ratio (kg/kg) in experimental groups on control days during first experiment

Age (day) Groups E1T0 E1T1 E1T2 E1T3 E1T4 E1T5 E1T6

7th 1.213 1.130 1.159 1.071 1.037 1.147 1.215 14th 1.659 1.707 1.605 1.535 1.545 1.608 1.766 21st 1.710 1.729 1.677 1.634 1.658 1.661 1.731 28th 1.784 1.791 1.750 1.729 1.749 1.736 1.784 35th 1.812 1.850 1.797 1.781 1.816 1.826 1.825 42nd 1.820 1.896 1.823 1.834 1.810 1.830 1.870


88

Table 4 shows FCR values calculated for consecutive control days during the experiment. Comparison of the calculated FCR values shows the best feed efficiency in the E1T3 group at four consecutive weighing on the 14th day of age up to 35th

day of age. The second group with the best conversion was E1T4 with the most favorable conversion achieved at the first control weighing on the 7th day of age and at the last weighing on the 42nd day of age.

Figure 2. Mean FCR (kg/kg) in experimental groups on control days during second experiment.

Statistical analysis (P>0.05) showed no significant difference in FCR between control and test groups on control days during experiment (Figure 2).

Figure 3. Calculated water:feed (L/kg) ratio of consumed water and feed in experimental groups on control days during second experiment.


89

Statistical analysis (P>0.05) showed no significant difference in water consumption among test groups on any test day (Figure 3). Also, groups were not significantly different from the normative recommended water:feed ratio of 1.7 L/kg.

Figure 4. Calculated PEF in first experiment on 42nd day of age.

Calculated PEF on the 42nd day of age was highest in E1T3 group (Figure 4). Negative dose dependent linearity with the concentration of additives used is seen in the groups with a combination of additives. The E1T4, E1T5 and E1T6 groups reached better results in comparison with control group.

Figure 5. Calculated PEF in second experiment on 35th and 42nd day of age in experimental groups on control days during second experiment.


90

Figure 5 shows PEF values for the second experiment. On the 35th day of age, calculation of PEF showed maximum value in control group as compared with the test groups with lower values. On the 42nd day of age, the maximum value was calculated for the E2T0 group and E2T2 group with 0.1% added WSTE. Unfortunately, statistical analysis showed no statistically significant differences (P>0.05) between the test groups on the 35th or 42nd day of age.

Discussion

The results of the first experiment showed the combination of two products with different site of action according to the literature, i.e. tannins in the intestine and butyrate in the enterocytes, to be an excellent combination of regular feed additive in complete feed mixtures in commercial production. This confirms the results of the first experiment in the E1T3 group, which achieved the best growth results and is consistent with several authors (Panda et al., 2009). This same combination, used in E1T3 group, resulted in the best feed conversion ratio throughout the experimental period, and as a result of favorable combination of both additives yielded the best PEF. The results of the first experiment are logically related to the results of the second experiment in the same combination of additives. The main difference between the experiments was the form of the additives used; while a powder form was used in the first experiment, a water-soluble form was used in the second experiment. This indicates a more effective and practical, flexible use in practice, provided by the more useful water-soluble addition. At the end of the experiment, on the 42nd day of age, we found the lowest mortality in the E2T0 group, followed by the E2T1, E2T2 and E2T3 groups. On the day of slaughter, the statistically significantly (P 0.05) highest mean body mass was reached in E2T2 group compared to E2T0 and E2T3 groups, but not significantly different from E2T1 group. On average, the animals exceeded the normative values of provenience Ross 308 (Aviagen, 2014) by 15%. As noted by (Jamroz et al. 2009) that concentrations of 250 g/t and 500 g/t have no significant effect on the achieved final weight of the animals at the end of fattening in comparison with control group, we achieved comparable or even better results (E2T1 and E2T2) in the final weight of animals as compared with control group (E2T0). At higher weight and age, (Schiavone et al., 2007, 2008) found a more favorable effect of the concentration of 200 g/t on the final weight of animal. The most favorable feed conversion was calculated in the E2T0 group, followed by the E2T2, E2T3 and E2T1 groups. This is consistent with the data reported by many other authors (Hooge, 2012; Hooge et al., 2012; Jamroz et al.,2009; Schiavone et al., 2006; Schiavone et al., 2008). The PEF index was highest in the E2T0 group, followed by the E2T2, E2T1 and E2T3 groups, but the values did not differ statistically significantly among the test groups. During the experiment, no statistically significant differences were

found in the mean water consumption (L/animal), mean feed consumption (kg/animal) and water:feed ratio (L/ kg) among experimental groups on any control day. The calculated water:feed ratio was in accordance with that reported in (Aviagen 2014). The positive role of WSTE in the diet of broiler chickens was also confirmed by Brus et al. (2014) in their study on chicken primary epithelium cell culture of small intestine. The results showed that the use of 0.1% WSTE in the cell model had effects on the cell orientation, and thus enabled better between-cell communication, statistically nonsignificantly reduced metabolic activity of cells, stimulated proliferation of enterocytes, nonsignificantly increased the formation of free radicals and increased intracellular antioxidative potential.

Conclusion

During the present experiments, broiler chickens were constantly under favorable rearing conditions by software-controlled microclimate, fed with feed mixtures with components from the same origin and the same recipe, so that the groups differed only according to the concentration of the tannin additive in feed or drinking water. In the first experiment, we used powdery tannin extract added in complete feed mixture. - The difference recorded in production parameters between the groups can be attributed to the effect of additives in complete feed mixtures. - Considering health status and behavior of chicks, no differences were found among the test groups. No clinical signs of disease that could have an impact on production results were observed in any group of chickens, which resulted in very low mortality. - The development of body weight of the test groups showed positive tendency throughout the study, even in the final period of breeding. We recorded a significantly higher body weight during the experiment in the E1T3 group. - Among other experimental groups, there were no significant differences in the FCR. A favorable FCR was recorded in the E1T3 group throughout the experimental period. - The highest PEF was achieved the E1T3 group (270), followed by the E1T4 and E1T6 groups. The lowest PEF was recorded in the E1T1 group.

According to the results of the second experiment, we may conclude that: - The mean body weight achieved at the end of the experiment showed a statistically significant difference at P 0.05. The significantly highest mean body weight was reached in the E2T2 group (2.806 kg) compared with the E2T3 (2.723 kg) and E2T0 (2.762 kg) groups. No significant difference was found in the E2T1 group (2.783 kg). - Favorable conversion at the end of the experiment was reached in the E2T0 group (1.574 kg/kg) with minimum


91

tolerance, followed by the E2T2 (1.585 kg/kg), E2T3 (1.604 kg/kg) and E2T1 (1.615 kg/kg) groups. - At the end of the experiment, PEF showed the best economic efficiency in the E2T0 (413.11) and E2T2 (412.00) groups, followed by the E2T1 (402.19) and E2T3 (396.10) groups. - Death of chickens till the end of the experiment was minimal and much below the permitted or intended for technological norm limit of 4%-5%. - Water consumption per animal and water:feed ratio showed no significant differences between the test groups and control group. - Results of the second experiment indicated that it is possible to use water-soluble form of the tannin extract in drinking water and to grow healthy animals with production results comparable to literature data. The results obtained in the experiment confirmed the real possibility of using WSTE to drinking water as a supplement for balancing and controlling digestive processes, good feed efficiency and achieving top production results.

References

ARAPITSAS, P. (2012): Hydrolyzable tannin analysis in food. Food Chem. 135(3), 1708-1717.

AVIAGEN (2014): Broiler Management Handbook. BRUS, M., L. GRADIŠNIK, T. LANGERHOLC, D. ŠKORJANC

(2014): Proliferative effects of water-soluble form of the chestnut (Castanea Sativa Mill.) tannin extract on chicken enterocyte primary cell culture. J Biotechnol. 185: S19.

CANANI, R. B., M. Di COSTANZO, L. LEONE, M. PEDATA, R. MELI, A. CALIGNANO (2011): Potential beneficial effects of butyrate in intestinal and extraintestinal diseases. World J Gastroenterol. 17(12), 1519-1528.

CANANI, R. B., M. Di COSTANZO, L. LEONE (2012): The epigenetic effects of butyrate: potential therapeutic implications for clinical practice. Clin Epigen. 4(1), 4.

CLAUS, R., D. GÜNTHNER, H. LETZGUß (2007): Effects of feeding fat-coated butyrate on mucosal morphology and function in the small intestine of the pig. J Anim Physiol Anim Nutr. 91(7-8), 312-318.

GUILLOTEAU, P., L. MARTIN, V. EECKHAUT, R. DUCATELLE, R. ZABIELSKI, F. Van IMMERSEEL (2010): From the gut to the peripheral tissues: the multiple effects of butyrate. Nutr Res Rev. 23(2), 366-384.

HEUGTEN, E. V., D. W. FUNDERBURKE, K. L. DORTON (2003): Growth performance, nutrient digestibility, and fecal microflora in weanling pigs fed live yeast. J Anim Sci. 81, 1004-1012.

HOOGE, D. M. (2012): Tannins show fenefits. Feedstuffs; Nutrition & Health: Poultry, 16-17.

HOOGE, D. M., G. F. MATHIS, B. LUMPKINS, J. PONEBSEK. D. MORGAN (2012): Dose-responses of broiler chicks, given live coccidia vaccine on day of hatch, to diets supplemented with various levels of Farmatan® (sweet chestnut wood tannin) or BMD®/Stafac® in a 42-Day Pen Trial on Build-up Litter. Int J Poult Sci. 11(7), 474-481.

HU, Z., Y. GUO (2007): Effects of dietary sodium butyrate supplementation on the intestinal morphological structure,

absorptive function and gut flora in chickens. Anim Feed Sci Technol. 132(2004), 240-249.

Van IMMERSEEL, F., J. De BUCK, I. De SMET, F. PASMANS, F. HAESEBROUCK, R. DUCATELLE (2004): Interactions of butyric acid- and acetic acid-treated salmonella with chicken primary cecal epithelial cells in vitro. Avian Dis. 48(2), 384-391.

Van IMMERSEEL, F., J. B. RUSELL, M. D. FLYTHE, I. GANTOIS, L. TIMBERMONT, F. PASMANS, F. HAESEBROUCK, R. DUCATELLE (2006): The use of organic acids to combat salmonella in poultry: a mechanistic explanation of the efficacy. Avian Pathology, Journal of the W.V.P.A. 35(3), 182-188.

JAMROZ, D., A. WILICZKIEWICZ, J. SKORUPI SKA, J. ORDA, J. KURYSZKO, H. TSCHIRCH (2009): Effect of sweet chestnut tannin (SCT) on the performance, microbial status of intestine and histological characteristics of intestine wall in chickens. Br Poult Sci. 50(6), 687-699.

KIM, Y., D. Y. KIL, H. K. OH, I. K. HAN (2005): Acidifier as an alternative material to antibiotics in animal feed. Asian-Aust J Anim Sci. 18(7), 1048-1060.

KOGAN, G., A. KOCHER (2007): Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health protection. Livestock Sci. 109(1-3), 161-165.

LI, J., D. LI, L. GONG, Y. MA, Y. HE, H. ZHAI (2006): Effects of live yeast on the performance, nutrient digestibility, gastrointestinal microbiota and concentration of volatile fatty acids in weanling pigs. Arch Anim Nutr. 60(4), 277-288.

MA, X., P. X. FAN, L. S. LI, S. Y. QIAN, G. L. ZHANG, D. F. LI (2012): Butyrate promotes the recovering of intestinal wound healing through its positive effect on the tight junctions. J Anim Sci. 90(Suppl 4), 266-268.

MANZANILLA, E .G., J. F. PEREZ, M. MARTIN, C. KAMEL, F. BAUCELLS, J. GASA (2004): Effect of plant extracts and formic acid on the intestinal equilibrium of early-weaned pigs. J Anim Sci. 82, 3210-3218.

MARTINEZ-PUIG, D., E. G. MANZANILLA, J. MORALES, E. BORDA, J. F. PÉREZ, C. PIÑEIRO, C. CHETRIT (2007): Dietary nucleotide supplementation reduces occurrence of diarrhoea in early weaned pigs. Livestock Sci. 108(1-3), 276-279.

McCANN, M. E. E., E. NEWELL, C. PRESTON, K. FORBES (2006): The use of mannan-oligosaccharides and/or tannin in broiler diets. Int J Poult Sci. 5(9), 873-879.

MIKKELSEN, L. L., M. JAKOBSEN, B. B. JENSEN (2003): Effects of dietary oligosaccharides on microbial diversity and fructo-oligosaccharide degrading bacteria in faeces of piglets post-weaning. Anim Feed Sci Technol. 109(1-4), 133-150.

PANDA, A. K., S. V. R. RAO, M. V. L. N. RAJU, G. SHYAM SUNDER (2009): Effect of butyric acid on performance, gastrointestinal tract health and carcass characteristics in broiler chickens. Asian-Australas J Anim Sci. 22(7), 1026-1031.

PELLIKAAN, W. F., J. M. A. J. VERDONK, S. B. SHIM, M. W. A. VERSTEGEN (2007): Adaptive capacity of faecal microbiota from piglets receiving diets with different types of inulin-type fructans. Livestock Sci. 108(1-3), 178-181.

PENG, L., Z. R. LI, R. S. GREEN, I. R. HOLZMAN, J. LIN (2009): Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. J Nutr. 139(9), 1619-1625.


92

SCHIAVONE, A., K. GUO, S. TASSONE, L. GASCO, V. MALFATTO, I. ZOCCARATO (2007): Use of natural extract of chestnut (Silvafeed ENC®) in broiler feeding: Effect on growth performance. It J Anim Sci. 6, 731-733.

SCHIAVONE, A., K. GUO, S. TASSONE, L. GASCO, E. HEMANDEZ, R. DENTI, I. ZOCCARATO (2008): Effects of a natural extract of chestnut wood on digestibility, performance traits, and nitrogen balance of broiler chicks. Poult Sci. 87(3), 521-527.

SCHIAVONE, A., S. TASSONE, K. GUO (2006): Dietary administration of chestnut extract in chicken broilers. In: EPC 2006, 12th European Poultry Conference, Verona, 3-6.

SUNKARA, L. T., M. ACHANTA, N. B. SCHREIBER, Y. R. BOMMINENI, G. DAI, W. JIANG, S. LAMONT, H. S. LILLEHOJ, A. BEKER, R. G. TEETER, G. ZHANG (2011): Butyrate enhances disease resistance of chickens by inducing antimicrobial host defense peptide gene expression. PLoS ONE. 6 (11).

VERSTEGEN, M. W. A., B.A. WILLIAMS (2002): Alternatives to the use of antibiotics as growth promoters for monogastric animals. Anim Biotechnol. 13(1), 113-127.

ZIEGLER, T. R., M. E. EVANS, C. FERNÁNDEZ-ESTÍVARIZ, D. P. JONES (2003): Trophic and cytoprotective nutrition for intestinal adaptation, mucosal repair, and barrier function. Annu Rev Nutr. 23, 229-261.

VRHUNSKI PROIZVODNI REZULTATI TOVNIH PILI A HRANJENIH EKSTRAKTOM U VODI TOPLJIVOG OBLIKA TANINA (CASTANEA SATIVA MILL.) DOPUNJENOG CA-BUTIRATOM

Sažetak U radu se opisuju dva pokusa provedena u stanici za ispitivanje peradi na Poljoprivrednom fakultetu. Cilj prvog pokusa bio je utvrditi u inkovite doze Ca-butirata (250, 500 i 1000 g/t CFM) i kombinacije tanina i Ca-butirata (250, 500 and 1000 g/t CFM) u usporedbi s ekstraktom samog tanina u koncentraciji (750 g/t) utvr enoj kao kontrolna u nekoliko prethodnih pokusa. Svi aditivi su primijenjeni u obliku praška u potpunoj smjesi hrane (complete feed mixture, CFM). Namjera drugog pokusa bila je ispitati razli ite koncentracije u vodi topljivog oblika kombinacije aditiva koja se sastojala od ekstrakta tanina i Ca-butirata (0, 0,5, 1 i 2 L/m3), gdje su eksperimentalne koncentracije u vodi odgovarale koncentraciji aditiva u CFM. Davanje aditiva u vodi za pi e tovnim pili ima testirano je u odnosu na proizvodne rezultate i uvjete intenzivnog tova. Testiranje je provedeno na tovnim pili ima Ross 308 hibrid iz redovitog komercijalnog uzgoja (Perutnina Ptuj). Životinje su podijeljene u skupine ili sekcije unutar skupina s 90 životinja po sekciji za svaku koncentraciju. Aditivi su davani putem CFM ili peroralno u drugom pokusu kao dodatak vodi za pi e tijekom cijelog vremena pokusa. Tjedno smo pratili tjelesnu težinu, potrošnju hrane, smrtnost i zdravstveno stanje životinja te smo potom izra unali u inkovitost hrane. etrdesetdrugog dana pokusa izra unali smo proizvodnu ekonomsku u inkovitost (production economic efficiency, PEF) pomo u europske formule. Statisti ka analiza je napravljena programom SPSS 21.0 for Windows. Rezultati prvog pokusa pokazali su da je kombinacija tanina i Ca-butirata u koncentraciji od 250 g/t osigurala najviše proizvodne rezultate u kona noj tjelesnoj težini i proizvodnoj u inkovitosti i u eksperimentalnoj i u kontrolnoj skupini. Drugi pokus je pokazao da je doza o 1 L/m3 dovela do izvrsnih proizvodnih rezultata, jer su životinje postigle srednju težinu žive vage of 2,806 kg uz u inkovitost hrane od 1,585 kg/kg i 412 PEF. Dobiveni rezultati pokazali su stvarne izglede da tanin kao dodatak vodi za pi e uravnotežuje probavne procese, dovodi do dobre u inkovitosti hrane i postiže vrhunske proizvodne rezultate.

Klju ne rije i: tanin (Castanea Sativa Mill.), tovni pili i, proizvodni parametri, Ca-butirat


PATHOLOGY AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF SOME VIRUSES IDENTIFIED IN WILDLIFE BIRDS IN CROATIA: PRELIMINARY RESEARCH

Marina Tišljar1, Marina Bi in2, Zdenko Bi in2, Vladimir Savi 1, Borka Šimpraga1, Tajana Amšel Zelenika1

1Croatian Veterinary Institute, Poultry Centre, Zagreb, Croatia 2Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb, Zagreb, Croatia

Summary

The article documents the results of pathomorphological and molecular diagnostic testing (polymerase chain reaction, PCR) for adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadnavirus and coronavirus determination in a sample of 16 wildlife birds of nine various species (white stork (Ciconia ciconia), mute swan (Cygnus olor), Caspian gull (Larus cachinnans, Pallas 1811), mallard duck (Anas platyrhynchos), common buzzard (Buteo buteo), white-tailed eagle (Haliaeetus albicilla), domestic pigeon (Columba livia domestica), barn swallow (Hirundo rustica) and sparrow (Passer sp.). The birds were necropsied at the Laboratory of Pathology, Poultry Centre, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia. Dual infections with astrovirus and circovirus were confirmed in mallard duck having died of the consequences of botulism. The sequence DuCV/M10-448 derived from the mallard duck samples had the greatest nucleotide (99%) and amino acid (100%) similarities with duck circovirus (accession number DQ100076.1) detected in the USA. The PCR positive result of hepadnavirus infection was partly confirmed by histopathologic examination in Caspian gull which suffered from generalized amyloidosis. According to the authors' awareness, this was the very first finding of hepadnavirus in gulls. The circovirus sequence found in the domestic pigeon (PiCV/M10-513) showed a 100% nucleotide and amino acid homology with pigeon circovirus (accession number AF252610.1) identified in Germany. In one of virologically tested mute swans, pathomorphological examination confirmed iron storage disease (ISD), while the rest of the birds died of the consequences of ballistic trauma or gunshot wounds (GSW) and other traumatic lesions (white stork, mute swan, common buzzard, white-tailed eagle, barn swallow and sparrow). Molecular diagnostic test results for the West Nile, avian influenza and Newcastle disease viruses were negative.

Key words: wildlife birds, pathomorphology, histopathology, polymerase chain reaction, astrovirus, hepadnavirus, adenovirus, circovirus, coronavirus, Caspian gull (Larus cachinnans, Pallas 1811), mallard duck (Anas platyrhynchos),domestic pigeon (Columba livia domestica), mute swan (Cygnus olor), iron storage disease (ISD), amyloidosis

Introduction

Viruses from the genus Aviadenovirus, and Atadenovirus from the Adenoviridae family are known to infect domestic poultry and are described in several wild bird species, i.e. mallard duck, gulls, psittacines, owls, hawks, pigeons, ostriches and other avian species (McFerran and Smyth, 2000; Harrach and Kaján, 2011). Adenovirus infection has been widely investigated in domestic poultry, while there are not much data available on the infection and outcome of the disease in various wild bird species. Avian astroviruses are small (27-30 nm in size) positive sense RNA viruses, with

the genome length of approximately 7 kb. While astrovirus infection has been widely investigated in domestic poultry (enteric disease in chickens and turkeys, and fatal hepatitis in ducklings), little is known about the clinicopathologic manifestations of astrovirus infection in free-living birds. Recently, astroviruses have been identified in guinea fowl, pigeons, domestic geese and several duck species, suggesting that astroviruses are widespread among avian hosts (Schultz-Cherry and Lorne, 2013). Circoviruses are spherical and single-stranded (ssDNA) viruses with a genome of approximately 2 kb. They are currently classified into two genera, Circovirus and Gyrovirus, both found to

Marina Tišljar, DVM, PhD, Poultry Centre, Croatian Veterinary Institute, 10000 Zagreb, Croatia; tel: +385 (0)1 2440 214; fax: +385 (0)1 2441 396; e-mail: [email protected]


94

infect birds. Generally, circovirus infection results in immunosuppression accompanied by symptoms ranging from anemia and lymphoid atrophy in chickens, feather abnormalities in psittacines, diarrhea, ill-thrift in pigeons, to growth retardation in ducks (Todd, 2004). Par and Robert (2007) report on gull circovirus, goose circovirus, Laughing (Senegal) Dove circovirus, ostrich circovirus and canary circovirus. These authors also mention identification of avian circovirus in a spectrum of avian species encom-passing psittacines, Columbidae, passerines (Estrildidae, Fringillidae), Anatidae, Phasianidae and Struthionidae. Recently, new types of circoviruses have been identified in some mammalian species and chickens (Li et al., 2010). Avian hepadnaviruses are DNA viruses that have been primarily identified as the causative agents of hepatitis B in ducks. They are hepatotropic viruses with a very narrow host range (Schödel et al., 1989). So far, they have been described in a variety of domestic and exotic birds, including domestic ducks and geese, Mandarin duck, Ross’s goose, snow goose, ashy-headed sheldgoose, crane, heron, stork and parrot (Woolcock and Tsai, 2013). Since duck hepatitis B virus (DHBV) has been used as a common model for HBV infection in humans (Mason et al., 1980), the pathogenesis and histopathologic changes associated with DHBV infection have been widely investigated. Unlike that, other known avian hepadnaviruses have been characterized mostly upon their genomes. Coronaviruses are enveloped RNA viruses with a positive-strand genome, and have been associated with diseases in several mammalian species and birds. In poultry, coronaviruses cause infectious bronchitis in chickens and enteric disease in turkeys, while they have also been identified in peafowl, teal and racing pigeons (Monceyron Jonassen et al., 2005). Hughes et al.(2009) detected coronavirus in wildfowl (Anseriformes) and waders (Charadriiformes), and Chu et al. (2011) detected a high prevalence (12.5%) of novel avian coronaviruses in aquatic wild birds (Anseriformes, Ciconiiformes and Pelecaniformes birds). A total of 231 wildlife birds of various species (pigeons /Columbidae/, pheasants and grouse /Phasianidae/, birds of prey (eagles /e.g., white-tailed eagle - Haliaeetus albicilla, golden eagle - Aquila chrysaetos; hawks /Sparrowhawk - Accipiter nisus/, vultures /e.g., griffon vulture - Gyps fulvus/;owls (Ural Owl - Strix uralensis /Strigidae/), buzzard (e.g., common buzzard - Buteo buteo (Accipitridae); wading birds (e.g., white stork /Ciconiidae/); swans and ducks (e.g., mute swan - Cygnus olor and mallard duck - Anas platyr-hynchos/Anatidae/); gulls (e.g., Caspian gull - Larus cachinnans, Pallas 1811, European herring gull - Larusargentatus, Black-headed gull - Chroicocephalus ridibundus /Laridae/); passerine birds (e.g., great tit - Parus major/Paridae/, Euroasian tree sparrow - Passer montanus (Pas-seridae/, barn swallow - Hirundo rustica /Hirundinidae/; Sylvia Communis /Sylviidae/, etc.); woodpeckers (great spotted woodpecker – Dendrocopos maior /Picidae/;blackbird (common blackbird - Turdus Merula /Turdidae/, etc.) were routinely necropsied at the Laboratory of

Pathology, Poultry Centre, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia during the 2010-2014 period. Since there are not much available data on adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadnavirus and coronavirus infec-tions, outcome and clinicopathologic manifestations of the infection in free-living birds, preliminary pathomorphology and molecular biology investigations of the adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadnavirus and coronavirus pre-sence were carried out in a randomly chosen sample of 16 wildlife birds of nine various bird species (white stork (Ciconia ciconia), mute swan (Cygnus olor), Caspian gull(Larus cachinnans, Pallas 1811), mallard duck (Anas platyrhynchos), common buzzard (Buteo buteo), white-tailed eagle (Haliaeetus albicilla), domestic pigeon (Columbia livia domestica), barn swallow (Hirundo rustica)and sparrow (Passer sp.).


Case description and sampling methods Routine necropsy procedures of the total of 231 wildlife birds were performed during the 2010-2014 period at the Laboratory of Pathology, Poultry Centre, Croatian Vete-rinary Institute, Zagreb, and, where indicated, histologic, virologic, bacteriologic and other diagnostic techniques (x-ray examination) were applied. Only the birds examined in 2014 were tested for West Nile virus infection and the birds necropsied during the 2010-2014 period were tested for avian influenza and Newcastle disease virus infections (Laboratory of Virology, Poultry Centre, Croatian Vete-rinary Institute, Zagreb, Croatia). The organs dissected from 16 birds of nine various species (white stork (Ciconia ciconia), mute swan (Cygnus olor), Caspian gull (Larus cachinnans, Pallas 1811), mallard duck (Anas platyr-hynchos), common buzzard (Buteo buteo), white-tailed eagle (Haliaeetus albicilla), domestic pigeon (Columba livia domestica), barn swallow (Hirundo rustica) and sparrow (Passer sp.)) were tested using a molecular biology testing procedure for adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadna-virus and coronavirus infections (Department of Poultry Diseases with Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zagreb, Croatia).

Pathomorphology analysis During necropsy, tissues were taken for subsequent histopathologic, virologic, bacteriologic and other diagnostic examinations. For histopathologic analysis, organ samples were fixed in neutral 10% formalin solution, embedded in paraffin and cut into 4- m thick sections on a rotary microtome (MICROM HM 325; Zeiss, Austria). After deparaffinization, the sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) using Congo-red and Prussian Blue techniques for confirmation of amyloid and of iron. The slices were examined under the light microscope (LEICA DMLB, Germany) and the images were captured with a PIXERA Pro 150ES digital camera.


95

Molecular diagnostic testing for adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadnavirus and coronavirus determination

Molecular diagnosis The organs were dissected and collected for molecular diagnostic testing (Table 1). DNA and RNA were extracted in a volume of 50 L from organ homogenates using High Pure Viral Nucleic Acid Kit according to the manufacturer's instructions (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). DNA was synthesized using SuperScript TM III (Invitrogen,

Carlsbad, California, USA). Reverse transcription reaction (42 oC for 50 min and inactivation for 15 min at 70 oC) was carried out in the Gene AMP PCR Systems 2400 (California, USA). PCR reaction: 1.5 L of DNA or cDNK, 25 L of Go Taq Green Master Mix (Promega, Madison, USA) and 0.20 M forward and reverse primer contained in a total volume of 50 L. The PCR reaction conditions were adjusted according to the references shown in Table 2. The PCR reaction products were analyzed by 1.5% gel electrophoresis stained with ethidium bromide.

Table 1. Alphabetical list, scientific name, year of sampling, laboratory identifier and collected organs of birds tested Tablica 1. Abecedni popis i latinski naziv, godina prikupljanja, laboratorijska oznaka i uzorkovani organi ptica

Bird species Scientific name Year Identifier Organs White stork Ciconia ciconia 2013 M13-69 Intestine, liver, spleen, kidney Mute swan Cygnus olor 2011 M11-794 Intestine, liver Mute swan Cygnus olor 2013 M13-82 Intestine, kidney Mute swan Cygnus olor 2014 M14-01 Intestine, liver Mallard duck Anas platyrhynchos 2010 M10-448 Intestine, spleen, bursa of Fabricii Domestic pigeon Columba livia domestica 2010 M10-513 Liver, kidney Barn swallow Hirundo rustica 2012 M12-906 Intestine, liver, spleen, kidney Caspian gull Larus cachinnans, Pallas 1811 2012 M12-950 Liver, kidney Common buzzard Buteo buteo 2011 M13-54 Intestine, liver, spleen, kidney Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-55 Intestine, liver, spleen, kidney Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-56 Intestine, liver, spleen, kidney Common buzzard Buteobuteo 2013 M13-57 Intestine, liver, spleen, kidney Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-58 Intestine, liver, spleen, kidney Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-59 Intestine, liver, spleen, kidney White-tailed eagle Haliaeetus albicilla 2011 M12-792 Intestine, liver, spleen, kidney Sparrow Passer sp. 2012 M 12-907 Intestine, liver, spleen, kidney

Table 2. Oligonucleotide sequences, target gene, PCR amplicon size and references of primers used in the study Tablica 2. Sekvence, ciljni gen, veli ina proizvoda PCR i referenca po etnica korištenih za pretraživanje ptica na navedene

viruse

Virus Primers Target gene Amplicon size Reference

Adenovirus

F1: 5'-TNMGNGGNGGNMGNTGYTAYCC-3'

Polymerase 330 bp Wellehan et al., 2004 R1: 5'-GTDGCRAANSHNCCRTABARNGMRTT-3'F2: 5'-GTNWYGAYATHTGYGGHATGTAYGC-3' R2:5'-CBCDRTTRTGNARNGTRA-3'

Astrovirus F: 5'-GAYTGGACIMGITAYGAYGGIACIATICC-3'

Polymerase 434 bp Todd et al., 2009 R: 5'-YTTIACCCACATICCRAA-3'

Circovirus

F1: 5'-GGIAYICCIAYYTICARGG-3'

Replication gene 400 bp Li et al., 2010 R1: 5'-AWCCAICCRTARAARTCRTC-3' F2: 5'-GGIAYICCICAYYTICARGGITT-3' R2: 5'-TGYTGYTCRTAICCRTCCCACCA-3'

HepadnavirusF: 5'-CTCAAGAGATTCCTCAGCC-3'

Polymerase 906 bp Walters et al., 2004 R: 5'-GTCATACCATTCTCCTACT-3'

Coronavirus F: 5'-TCACAYTTWGGATARTCCCA-3' Replication gene 250 bp Stephenson et al., 1999


96

Sequence analysis The samples showing the expected amplicon length were purified using QI Aquick PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) and sequenced in Macrogen Inc. (Amsterdam, the Netherlands). The virus sequences were initially checked against BLAST search database (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). The sequences were assembled and analyzed using Bio Edit (Hall, 1999), Mega 6 (Tamura et al., 2013) and Staden (Bonfield et al., 1995). Phylogenetic analysis was performed using Mega 6, while the best-fit phylogenetic model was selected using Model Test 2 (Darriba et al., 2012) (Table 2). The Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) accession numbers of the circovirus sequences submitted through this study were KP773230 (sequence PiCV/M10-513) and KP773231

(sequence DuCV/M10-448), while the accession numbers of sequences retrieved from the Gen Bank, shown in Figure 1.

Molecular diagnostic testing for West Nile, avian influenza and Newcastle disease virus determination

RNA extraction Tissue samples were homogenized in the equal volume of sterile buffered saline. The homogenates were centrifuged at 2000 g for 20 minutes and the resulting supernatant was used for RNA extraction. RNA extraction was done manually from the supernatants using High pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Applied Science, Germany), as described in the kit protocol.

Figure 1. Phylogenetic Neighbor-Joining (NJ) tree based on alignments of the partial (417 nt) fragment of 26 circovirus replication gene sequences. The tree was constructed using JukesCantor model. Circovirus sequences identified in this study are highlighted in grey. Porcine circovirus was used as an outgroup. Bootstrap values (>70) were shown next to the branches. The scale on the bottom represents evolutionary distances of the compared sequences.

Slika 1. Filogenetsko Neighbor-Joining (NJ) stablo dobiveno analizom nukleotidnih sekvenci replikacijskog gena cirko virusa dužine 417 nukleotida. Korišten je JukesCantorov (JC) model odabran prema analizi BIC (engl. Bayesian Information Criterion). U analizu je uvršteno ukupno 26 sekvenci iz roda Circovirus. Sekvence dokazane u ovom radu ozna ene su sivom bojom. Cirko virus svinje je korišten kao tzv. vanjska skupina (engl. outgroup). Vrijednosti bootstrap probe (>70) ozna ene su uz ogranke stabla. Ljestvica na dnu slike ozna ava evolucijsku udaljenost uspore ivanih sekvenci.


97

Reverse transcription and real time PCR One-step reverse transcription followed by real time PCR was carried out in LightCycler 1.5 thermocycler using LightCycler RNA Master HybProbe (Roche Applied Science, Germany). For the detection of West Nile virus, avian influenza virus, Newcastle disease class I as well as class II viruses, protocols according to Tang et al. (2006), Spackman et al. (2002), Wise et al. (2004) and Kim et al.(2008) were used, respectively.

Bacteriology and mycology analyses

Salmonella spp. isolation Salmonella was isolated from the organs following the instructions for the standard EN ISO 6579:2002 and IOE methods (2008).

Isolation of the genus Streptococcus All the analyzed organs were trans-inoculated onto the blood agar (Columbia agar with the supplementation of 5%-10% of sheep blood), Columbia agar and MacConkey agar. Streptococci did not grow in MacConkey agar (Wages, 2003).

Isolation of the genus Staphylococcus All the investigated organs were trans-inoculated onto the blood agar (Columbia agar with the supplementation of 5%-10% of sheep blood), Columbia agar and MacConkey agar. Simultaneously, the organs were trans-inoculated onto mannitol salt agar and onto Baird-Parker agar, these representing selective culture media for Staphylococcus

isolation. Staphylococci did not grow in MacConkey agar (Andreasen, 2003).

Escherichia coli isolation At isolating the bacterium Escherichia coli, all the analyzed organs were trans-inoculated onto the blood agar (Columbia agar with the supplementation of 5%-10% of sheep blood), Columbia agar and MacConkey agar. Simultaneously, the organs were trans-inoculated onto the TBX agar, a selective medium for E. coli isolation (Barnes et al., 2003)

Clostridium spp. isolation All the analyzed organs were trans-inoculated onto the blood agar (Columbia agar with the supplementation of 5%-10% of sheep blood), and incubated in an anaerobic environment (Barnes, 2003).

Fungi and molds isolation Sabouraud glucose agar was used for the isolation of fungi and molds (Kunkle, 2003).

Shigella isolation All the analyzed organs were trans-inoculated onto the blood agar (Columbia agar with the supplementation of 5%-10% of sheep blood), Columbia agar and Mac Conkey agar, and incubated in an aerobic environment (Nagli etal., 2005)Biochemistry characterization for all the isolated bacteria was performed using API System strips.

Results Pathomorphology investigation

Table 3. Alphabetical list, scientific name, year of necropsy, laboratory identifier and pathomorphological findings in birds tested for adenovirus, astrovirus, hepadnavirus, coronavirus and circovirus in the present study

Tablica 3. Abecedni popis, latinski naziv, godina patoanatomske pretrage, laboratorijska oznaka (virusa) i patomorfološki nalazi ptica pretraživanih na prisutnost adenovirusa, astrovirusa, hepadnavirusa, koronavirusa i cirkovirusa

Birdspecies

Scientific name Year Identifier Pathoanatomical (PA)

diagnosis/findings

Histopathologic (HP) and/or x-ray analysis (diagnosis/findings)

White stork Ciconia ciconia 2013 M13-69 Gunshot wound (GSW) (frontal part of head)

X-ray findings of lead bullets (no HP investigation)

Mute swan Cygnus olor 2011 M11-794 Gunshot wounds (GSW) (left wing and ribs with internal hemorrhages)

X-ray findings of lead bullet particles (no HP investigation)

Mute swan Cygnus olor 2013 M13-82 Iron storage disease (ISD) Iron pigment in hepatocytes (Prussian Blue staining) and focal necroses in the liver

Mute swan Cygnus olor 2014 M14-01 Gunshot wounds (GSW) X-ray analysis (lead bullet particles)


98

Birdspecies

Scientific name Year Identifier Pathoanatomical (PA)

diagnosis/findings

Histopathologic (HP) and/or x-ray analysis (diagnosis/findings)

Mallard* duck Anas platyrhynchos 2010 M10-448 Type C botulism Adenovirus-like and circovirus inclusions in intestine

Domestic** pigeon Columba livia domestica

2010 M10-513 Sepsis Focal mononuclear cell myocarditis; intra-cytoplasmic inclusions in hepatocytes

Barn swallow Hirundo rustica 2012 M12-906 Traumatic wounds (head trauma)

No HP investigation

Caspian*** gull Larus cachinnans, Pallas 1811

2012 M12-950 Icterus, hepatomegaly, proventricular hyperplasia

Generalized amyloidosis (Congo-red staining for amyloid)

Common buzzard Buteo buteo 2011 M13-54 Traumatic wounds (head trauma)

No HP investigation

Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-55 Traumatic wounds (wing, leg and ribs)

No HP investigation

Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-56 Traumatic wounds (head, neck)

No HP investigation

Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-57 Gunshot wounds (GSW) X-ray analysis (lead bullet particles) Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-58 Traumatic wounds (legs) No HP investigation Common buzzard Buteo buteo 2013 M13-59 Traumatic wounds

(head, neck) No HP investigation

White-tailed eagle Haliaeetus albicilla 2011 M12-792 gunshot wounds (GSW) X-ray analysis (lead bullet particles) Sparrow Passer sp. 2012 M 12-907 Traumatic wounds (head) No HP investigation *dual infections with astrovirus and circovirus (mallard duck /Anas platyrhynchos/) **circovirus infection (domestic pigeon /Columba livia domestica/) ***hepadnavirus infection (Caspian gull /Larus cachinnans, Pallas 1811/)

Molecular diagnostic testing for adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadnavirus and coronavirus determination

PCR assays and sequence analysis Positive PCR results are shown in Table 4. The circovirus sequence found in pigeon (PiCV/M10-513) showed a 100% nucleotide and amino acid homology with pigeon circovirus (accession number AF252610.1) identified in Germany. The sequence DuCV/M10-448 derived from the mallard duck samples had the greatest nucleotide (99%) and amino acid (100%) similarities with duck circovirus (accession number DQ100076.1) detected in the USA. The sequence shared the greatest nucleotide (99%) and amino

acid (100%) similarities with duck circovirus (accession number DQ100076.1) detected in the USA. The phylogenetic analysis results were consistent with those of molecular analysis, and clustered the sequence PiCV/M10-513 within the group of pigeon circoviruses, while the sequence DuCV/M10-448 was grouped together with duck circoviruses (Figure 1).

Molecular diagnostic testing for West Nile, avian influenza and Newcastle disease virus determination Molecular diagnostic testing for West Nile virus, avian influenza and Newcastle disease virus determinations did not reveal positive results in any of the tested samples.

Table 4. Positive PCR results for one or more viruses Tablica 4. Ptice pozitivne na jedan ili više pretraživanih virusa

Identifier Host species Virus Organ

M10-448 Mallard duck Astrovirus Intestine, spleen

Circovirus Intestine, spleen, bursa of Fabricii

M12-950 Caspian gull Hepadnavirus Liver

M10-513 Domestic pigeon Circovirus Liver, kidney


99

Bacteriology and mycology analyses

The most severe mixed microbial infections were determined in the domestic pigeon (Columba livia domestica) infected with circovirus (E. coli, Shigella sp., Aspergillus fumigatus, and molds) and in mallard ducks (Anas platyrynchos) infected with astrovirus and circovirus (E. coli, Clostridium sp., Micrococcus sp., Bacillus sp.).

Discussion

In 12 out of 16 wildlife birds selected for preliminary virologic testing for the presence of adenovirus, astrovirus, circovirus, hepadnavirus and coronavirus, ballistic and/or traumatic lesions of various origin were confirmed by pathoanatomical and x-ray examinations (Table 3). In the mute swan (Cygnus olor) (M 13-82) (Table 3), the gross findings of hepatomegaly with multiple dark foci in gold-brown liver aroused suspicion of iron storage disease (ISD). The histopathology examination confirmed ISD using special histologic staining for iron pigment, Prussian Blue staining. The ISD is one of pigmentary hepatopathies developing due to iron accumulation in hepatocytes. It is predominantly a disease of captive mynahs (Gracula sp.),several species of toucans (Ramphastide) and birds of paradise (Paradisaeidae). Infrequently, it can be seen in other bird species. The most susceptible are birds highly efficient at absorbing dietary iron and not down regulating iron absorption sufficiently when fed iron-rich diets. However, in wild birds it is presumed that iron is in a form that is not readily absorbed from the digestive tract (Schmidt et al., 2003). Our pathomorphological findings (gold-brown liver with dark spots and the histopathologic findings of iron pigment in hepatocytes and Kupffer's cells) confirmed ISD and not just the excessive liver iron in this swan. Dual infection with astrovirus and circovirus was confirmed in the mallard duck (Anas platyrhynchos) died from botulism (Clostridium botulinum toxin type C) (Tables 3 and 4). Bacteriologic investigations were positive for Clostridium sp. in the gizzard, the most common site of Clostridium botulinum because of the anaerobic environment in the gizzard cuticle. Type C botulism can also be caused by the ingestion of a preformed toxin. Outbreaks in waterfowl and other water birds are the result of the consumption of toxin-laden invertebrates (Dohms, 2003). Histopathology findings of the inclusion typical of circovirus infection were shown in one intestinal sample (Table 3). In another duck, however, the adenovirus-like inclusions were confirmed in the liver and intestine. Since one of the most prominent charac-teristics of circovirus infection is its immunosuppressive effect, it may be possible that simultaneous (adeno)virus infection was present. According to the authors’ awareness, the hepadnavirus determined in the Caspian gull (Laruscachinnans, Pallas 1811) (Table 4) represents the very first finding of this virus in gulls so far. Generalized amyloidosis was confirmed by the special Congo-red staining for amyloid

(Table 3), and, according to Zschiesche and Jakob (1989), it represents a common finding in Laridae. Avian amlyoidosis can affect a wide variety of birds and is found following a number of diseases, especially chronic infections and inflammation. So, the simultaneous findings of hepadnavirus infection and amyloidosis in the Caspian gull (Tables 3 and 4) may arouse suspicion that generalized amyloidosis was the consequence of chronic hepadnavirus infection. Avian amyloidosis is normally a well-recognized pathologic disorder in birds, especially in the waterfowl (Landman et al., 1998). In the domestic pigeon (Columba livia domestica),circovirus presenting with gross lesions of sepsis and mycotic inflammation (E. coli, Shigella sp. and Aspergillus sp., and molds, respectively) (Table 3) were determined as well (Table 4). Atypical intracytoplasmic inclusions were found in the liver sample, but no typical circovirus inclusions were seen in immunocompetent organs. Schmidt et al. (2003) compared this type of inclusions with atypical adenovirus inclusions. In pigeons infected with circovirus, Abadie et al. (2001) also found lesions that could have been related to bacteria, but with no histologic evidence of concomitant viral infection (e.g., adenoviral and/or herpes-viral infections).

Conclusions

In conclusion, although this study was performed on a limited amount of samples, the findings of astrovirus, circovirus and hepadnavirus suggest that these viruses are widespread among avian hosts. Based on the molecular and phylogenetic analyses of circovirus sequences identified in the pigeon and in the mallard duck, it may be concluded that the same types of viruses circulate and can be found in different geographical regions. However, due to the possible limitations of PCR (e.g., sensitivity of primers), different levels of virus amount in the samples and the stage of autolysis of the collected organs, some viruses could have remained undetected using the current procedures. For that reason, further research combining molecular methods and histopathologic examination is needed to get deeper insight into the free-living bird diseases and pathology.

Acknowledgment

The research was supported by grant 053-0531863-1856 from the Ministry of Science, Education and Sports, Republic of Croatia.

References

ABADIE, J., F. NGUYEN, C. GROIZELEAU, N. AMENNA, B. FERNNADEZ, C. GUEREAUD, L. GUIGAND, P. ROBART, B. LEFEBVRE, M. WYERS (2001): Pigeon circovirus infection: pathological observations and suggested pathogenesis. Avian Pathol. 30, 149-158.


100

ANDREASEN, C. B. (2003): Staphylococcosis. In: Diseases of Poultry, 11th edn. (Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, Eds.), Ames, Iowa, 798-804.

BARNES, H. J. (2003): Clostridial diseases. In: Diseases of Poultry, 11th edn. (Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, Eds.), Ames, Iowa, 775-795.

BARNES, H. J., J.-P. VAILLANCOURT., W. B. GROSS (2003): Colibacillosis. In: Diseases of Poultry, 11th edn. (Y. M. Saif, H. J. Barnes, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, Eds.), Ames, Iowa, 631-656.

BONFIELD, J. K., K. F. SMITH, R. A. STADEN (1995): A new DNA sequence assembly program. Nucleic Acids Res. 23, 4992-4999.

CHU, D. K. W., CONNIE Y. H. LEUNG, M. GILBERT, PRISCILLA H. JOYNER, ERICA M. Ng, T. M. TSE, Y. GUAN, J. S. M. PEIRIS, L. L. M. POON (2011): Avian coronavirus in wild aquatic birds. J. Virol. 85, 12815-12820.

DARRIBA, D., G. L. TABOADA, R. DOALLO, D. POSADA (2012): Model Test 2: more models, new heuristics and parallel computing. Nat Methods 8, 772.

DOHMS, J. E. (2003): Botulism. In: Diseases of Poultry, 11th

edn. (Y. M. Saif, H. J. Barnes, S, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, Eds.), Ames, Iowa, 785-790.

EN ISO 6579:2002 Microbiology of food and animal feeding stuffs – horizontal methods for the detection of Salmonellaspp. (EN ISO 6579:2002).

HALL, T. A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp. Ser. 41: 95-98.

HARRACH, B., G. L. KAJÁN (2011): Aviadenovirus. In: The Springer Index of Viruses, 2nd edn. (C. A. Tidona, G. Darai, Eds.) Springer-Verlag, Berlin, 13-28.

HUGHES, L. A., C. SAVAGE, C. NAYLOR, M. BENNETT, J. CHANTREY, R. JONES (2009): Genetically diverse coronaviruses in wild bird populations of Northern England infectious bronchitis virus (IBV) causes. Emerg Infect Dis. 15, 1091-1094.

KIM, L. MIA, D. L. SUAREZ, C. L. AFONSO (2008): Detection of a broad range of class I and II Newcastle disease viruses using a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay. J Vet Diagn Invest. 20, 414-425.

KUNKLE, R. A. (2003): Fungal infections. In: Diseases of Poultry, 11th edn. (Y. M. Saif, H. J. Barnes, S, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, Eds.), Iowa State University Press, Blackwell Publ Comp, Ames, 883-899.

LANDMAN, W. J. M., E. GRUYS, A. L. J. GIELKENS (1998): Avian amyloidosis. Review article. Avian Pathol. 27, 437-449.

LI, LINLIN, A. KAPOOR, B. SLIKAS, O. S. BAMIDELE, C. WANG, S. SHAUKAT, M. A. MASROOR, M. L. WILSON, J. B. N. NDJANGO, M. PEETERS, N. D. GROSS-CAMP, M. N. MULLER, B. H. HAHN, N. D. WOLFE, H. TRIKI, J. BARTKUS, S. Z. ZAIDI, E. DELWART, (2010): Multiple diverse circoviruses infect farm animals and are commonly found in human and chimpanzee feces. J Virol. 84, 1674-1682.

MASON, W. S., G. SEAL, J. SUMMERS (1980). A virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis B virus. J Virol. 36, 829-836.

McFERRAN, J. B, J. A. SMYTH (2000): Avian adenoviruses. Rev Sci Tech Off Int Epiz. 19, 589-601.

MONCEYRON JONASSEN, C., T. KOFSTAD, I. L. LARSEN, A. LØVLAND, K. HANDELAND, A. FOLLESTAD, A. LILLEHAUG (2005): Molecular identification and characterization of novelcoronaviruses infecting gray lag geese (Anseranser), feral pigeons (Columba livia) and mallards (Ana splathyrhynchos). J. Gen. Virol. 86, 1597-1607.

NAGLI , T., D. HAJSIG, J. MADI , LJILJANA PINTER (2005): Rod Shigella. In: Veterinarska Mikrobiologija Specijalna bakteriologija i mikologija. Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Hrvatsko Mikrobiološko Društvo, Zagreb, 78-79.

OIE (2008): Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial, 6th edn. Salmonellosis. (D. Hajsig, Ed.), Part 2, Section 2.3, Ch. 2.9.9.

PAR, J. A., N. ROBERT (2007): Circovirus. In: Infectious Diseases of Wild Birds. (Nancy J. Thomas, D. B. Hunter, C. T. Atkinson, Eds.) Blackwell Publ., Ames, 194-206.

SCHMIDT, R. E., D. R. REAVILL, D. N. PHALEN (2003): Pathology of Pet and Aviary Birds. 1st edn. (R. E. Schmidt, D. R. Reavill, D. N. Phalen, Eds.). Iowa, Ames, 67-95.

SCHÖDEL, F., R. SPRENGEL, T. WEIMER, D. FERNHOLZ, R. SCHNEIDER, H. WILL (1989): Animal hepatitis B viruses. In: Advances in Viral Oncology, 8. (G. Klein, Ed.). Raven Press, New York, 73-102.

SCHULTZ-CHERRY, S., L. LORNE (2013): Astrovirus infections. In: Diseases of Poultry, 13th edn. (D. E. Swayne, J.R. Glisson, L.R. McDougald, V. Nair, L. Nolan, D.L. Suarez, Eds.) Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, 391-395.

SMYTH, J. A., J. WESTON, D. A. MOFFET, D. TODD (2001): Detection of circovirus infection in pigeons by in situhybridization using cloned DNA probes. J Vet Diagn Invest. 13, 475-482.

SPACKMAN, E., D. A. SENNE, T. J. MYERS, L. L. BULAGA, L. P. GARBER, M. L. PERDUE, K. LOHMAN, L. T. DAUM, D. L. SUAREZ (2002): Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260.

STEPHENSEN, C. B., D. B. CASEBOLT, N. N. GANGOPADHYAY (1999): Phylogenetic analysis from 11 coronaviruses and development of a consensus polymerase chain reaction assay. Virus Res. 60, 181-189.

TAMURA, K., G. STECHER, D. PETERSON, A. FILIPSKI, S. KUMAR (2013): MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30, 2725-2729.

TANG, Y., C. ANNE HAPIP, B. LIU, C. T. FANG (2006): Highly sensitive TaqMan RT-PCR assay for detection and quantification of both lineages of West Nile virus RNA. J Clin Virol. 36, 177-182.

TODD, D. (2004): Avian circovirus diseases: lessons for the study of PMWS. Vet Microbiol. 98, 169-174.

TODD, D., V. J. SMYTH, N. W. BALL, B. M. WYLIE, N. J. KNOWLES, B. M. ADAIR (2009): Identification of chicken enterovirus-like viruses, duck hepatitis virus type 2 and duck


101

hepatitis virus type 3 as astroviruses. Avian Pathol. 38, 21-29.

WAGES, D. P. (2003): Streptococcosis. In: Diseases of Poultry, 11th edn. (Y. M. Saif, H. J. Barnes, S, J. R. Glisson, A. M. Fadly, L. R. McDougald, D. E. Swayne, Eds.), Ames, Iowa, 805-808.

WALTERS, K. A, M. A. JOYCE, W.R. ADDISON, K. P. FISCHER, D. L. J. TYRRELL (2004): Superinfection exclusion in duck hepatitis B virus infection is mediated by the large surface antigen. J Virol. 15, 7925-7937.

WELLEHAN, J. F. X., A. J. JOHNSON, B. HARRACH, M. BENKÖ, A. P. PESSIER, C. M. JOHNSON, M. M. GARNER, A. CHILDRESS, E. R. JACOBSON (2004): Detection and analysis of six lizard adenoviruses by

consensus primer PCR provides further evidence of reptilian origin for the atadenoviruses. J Virol. 23, 13366-13369.

WISE, M. G., D. L. SUAREZ, B. S. SEAL, J.C. PEDERSEN, D. A. SENNE, D. J. KING, D. R. KAPCZYNSKI, E. SPACKMAN (2004): Development of a real-time reverse-transcription PCR for detection of Newcastle disease virus RNA in clinical samples. J Clin Microbiol. 42, 329-338.

WOOLCOCK, P. R., H. J. TSAI (2013): Duck hepatitis. In: Diseases of Poultry, 13th edn. (D. E. Swayne, J.R. Glisson, L.R. McDougald, V. Nair, L. Nolan, D.L. Suarez, Eds.) Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, 422-431.

ZSCHIESCHE, W., W. JAKOB (1989): Pathology of animal amyloidosis. Pharmacol Ther. 41,49-83.

BOLESTI I FILOGENETSKA ANALIZA NEKIH VIRUSA IDENTIFICIRANIH U SLOBODNO ŽIVU IHPTICA U HRVATSKOJ: PO ETNO ISTRAŽIVANJE

Sažetak

U radu su prikazani rezultati patološkomorfološke pretrage i pretrage metodama molekularne biologije (lan ana reakcija polimerazom /PCR/) za dokaz adenovirusa, astrovirusa, cirkovirusa, hepadnavirusa i koronavirusa u devet razli itih vrsta sveukupno 16 slobodnoživu ih ptica (bijela roda (Ciconia ciconia), crvenokljuni labud (Cygnus olor), galeb klaukavac (Larus cachinnans, Pallas 1811), divlja patka (Anas platyrhynchos), obi ni škanjac (Buteo buteo), orao štekavac (Haliaeetus albicilla), doma i golub (Columba livia domestica), lastavica poku arka (Hirundo rustica) i vrabac (Passer sp.)). Ptice su razu ene u Laboratoriju za patologiju Centra za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Zagreb. U divlje patke (Anas platyrhynchos) uginule od posljedica botulizma (C toksin Clostridium botulinum) dokazani su cirkovirus i astrovirus. Cirkovirus nukleotidnog slijeda DuCV/M10-448 dokazan u divlje patke pokazao je najve u nukleotidnu (99%) i amino kiselinsku sli nost (100%) s pa jim cirkovirusom (pristupni broj DQ100076.1) utvr enim u SAD. Pozitivni rezultat pretrage metodom PCR za dokaz hepadnavirusa u galeba klaukavca (Larus cachinnans, Pallas 1811) uginulog od posljedica amiloidoze potvr en je djelomice i patološkohistološkim nalazom. Prema saznanju autora, ovo je ujedno prvi nalaz hepadnavirusa u galebova. Cirkovirus utvr en u doma eg goluba (PiCV/M10-513) pokazao je 100%-tnu nukleotidnu i amnokiselinsku homolognost s golubljim cirkovirusom (pristupni broj AF252610.1) dokazanim u Njema koj. U jednog crvenokljunog labuda patološkohistološkom pretragom utvr ena je bolest odlaganja željeza (engl. iron storage disease/ISD/), dok su ostale ptice uginule pretežito od posljedica nastrijelnih rana i drugih vrsta traumatskih ozljeda (bijela roda, crvenokljuni labud, obi ni škanjac, orao štekavac, lastavica poku arka, vrabac). Metodama dijagnostike molekularne biologije nisu izdvojeni virusi groznice Zapadnog Nila, influence ptica i newcastleske bolesti.

Klju ne rije i: slobodno živu e ptice, patološka morfologija, patološka histologija, lan ana rekacija polimerazom (PCR), astrovirus, hepadnavirus, adenovirus, cirkovirus, koronavirus, galeb klaukavac (Larus cachinnans, Pallas 1811), divlja patka (Anas platyrhynchos), doma i golub (Columba livia domestica), crvenokljuni labud (Cygnus olor), bolest odlaganja željeza, amiloidoza


ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY PATTERNS OF ENTEROCOCCUS CECORUM AND ENTEROCOCCUS HIRAE ISOLATES FROM BROILERS

Majda Golob, Jasna Mi unovi , Jana Avberšek, Irena Zdovc

University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Institute of Microbiology and Parasitology, Ljubljana, Slovenia

Summary

Poultry production is one of the most important and successful sectors of food industry in Slovenia. In the last few years, Enterococcus (E.) cecorum and Enterococcus (E.) hirae infections with clinical course have increasingly been observed in Slovenian broilers. Enterococci are normal inhabitants of the intestinal microbiota of birds and mammals, but they are also important pathogens responsible for various infection. In poultry, enterococci are frequently isolated from birds with clinicaldisease, especially from young animals. However, E. cecorum and E. hirae have been known as important causes of arthritis and osteomyelitis lesions and can cause significant economic loss due to mortality and poor feed conversion. The objectives of this work were to highlight the importance of E. cecorum and E. hirae infections in poultry industry and to obtain the antimicrobial susceptibility patterns of these isolates. E. cecorum and E. hirae strains were isolated from affected joints, internal organs (liver and heart) and swab samples from airbag surfaces. All isolates were susceptibility tested using the microdilution method to determine minimal inhibitory concentration for 20 different antimicrobials. Resistance against tetracyclines differed between these two species: all tested E. cecorum isolates but none of E. hirae isolates were resistant to tetracyclines. Reduced susceptibility of E. hirae isolates was widespread for clindamycin and for the group of fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin). Enterococci are intrinsically resistant to many antimicrobial agents, which limits the choice of appropriate agents for enterococcal infection treatment. Therefore, antimicrobial susceptibility testing should be performed to ensure that the most efficacious antibiotic is used. In fact, clinicalexperiences also indicate that ampicillin remains the first choice for enterococcal infection treatment in poultry production.

Key words: Enterococcus cecorum, Enterococcus hirae, antimicrobial resistance, susceptibility testing, broilers

Introduction

Enterococci are commensal bacteria of gastrointestinal tract, inhabiting the skin and mucous membranes, but are also important pathogens responsible for various infections in humans and animals. Due to the increasing antimicrobial resistance, enterococci are recognized as feared pathogens that can be challenging to treat in human and also in veterinary medicine. In human medicine, they are important mainly because of nosocomial infections caused by van-comycin-resistant enterococci (VRE). In poultry, entero-cocci are frequently isolated from birds with clinical disease, especially from young animals.

Etiology and epidemiology Enterococci are gram-positive nonmotile and catalase-negative coccoid bacteria that appear singly, in pairs, or in short chains on stained smears. Enterococcus spp. isolated from birds with clinical disease include Enterococcus (E.) avium, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. cecorum and E. hirae. Transmission is via oral and/or aerosol routes, as well as from skin wounds. Infection may result in septicemia. Endocarditis can occur when the infection progresses to a subacute/chronic stage. Brain necrosis and encephalo-malacia in young chickens have been reported in entero-coccosis. Although enterococcosis has been reported in

Assist. Prof. Majda Golob DVM, University of Ljubljana, Veterinary Faculty, Institute of Microbiology and Parasitology, Gerbi eva 60, Ljubljana 1000 Slovenia; tel. : 00386 (0)14779166; fax.: 00386 (0)14779352; e-mail: [email protected]


103

poultry species, it should also be noted that some strains of enterococci have a beneficial effect on growth and feed efficiency and are used as probiotics (Merck Veterinary Manual, 2012).

Antimicrobial resistance Enterococci are intrinsically resistant to many classes of antimicrobial agents and also readily accumulate mutations and exogenous genes that confer additional resistance. Acquired resistance in enterococci can occur through sporadic mutations or through acquisition of foreign genetic material. Horizontal gene exchange among enterococci occurs through the transfer of pheromone-responsive or broad host range plasmids, or through the movement of transposons (Arias and Murray, 2012; Hollenbeck and Rice, 2012).

Figure 2. A 49-day-old male broiler breeder displaying a characteristic posture associated with compression of the spinal cord (Armour, 2011)

PathogenesisE. cecorum and E. hirae are considered as emerging pathogens in poultry and can cause substantial losses in broiler flocks. First described in the early 1980s, E. cecorumis increasingly found in broilers and broiler-breeder flocks with signs of lameness and is mostly associated with arthritis, spondylitis, femoral head necrosis and osteomyelitis (Devrise et al., 1983; Devrise et al., 2002; Aziz and Barnes, 2007). Clinical signs of infection are characterized by weakness, lameness and arched back in birds, which causes the bird to sit on its hock joints or tail or lay on its side. During progression of the infection, affected birds develop hind limb paralysis due to infection of the freely movable thoracic vertebra (Aziz and Barnes, 2007; Jackson et al., 2014). E. hirae has been reported in cases of focal necrosis of the brain of young chicks (Devrise et al., 1991) and in broilers with osteomyelitis (Kolbj rnsen et al., 2011; Velkers et al., 2011).

Figure 3. Pericarditis and fibrinous hepatic necrosis (arrows) of an Enterococcus cecorum infected broiler, 24 days post hatch (Jung, 2014)

Figure 1. Mechanisms of enterococcal antibiotic resistance (Arias and Murray, 2012)


104

Figure 4. Femoral head necrosis with mucopurulent exudate (arrow) of an Enterococcus cecorum infected broiler, 31 days post hatch (Jung, 2014)


Bacteriological examination (isolation and identification) After post mortem examinations, different samples from broilers (heart, liver, spleen, swabs of the airbags) were taken for bacteriological examination. All samples were inoculated onto blood agar, Drigalski agar and chromogenic agar (UriSelect, BioRad, USA) and incubated for 24-48 hours at 37 °C under aerobic and microaerophilic conditions. After 24 hours, agar plates were monitored for bacterial growth and pure subcultures from single colonies on blood agar incubated microaerophilic were obtained. Suspect colonies were processed for Gram staining, catalase reaction and biochemical tests (lactose, arabinose, sorbitol, mannitol, aesculin, raffinose, ADH) were used for identification and determination of the isolates. All isolates were subsequently confirmed using Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight (MALDI-TOF, Bruker, Germany).

Figure 5. Enterococcus cecorum: primary isolation on blood agar after 24 h incubation under microaerophilic (left) and aerobic (right) conditions

Figure 6. Typical color of Enterococcus spp. colonies onto chromogenic agar (UriSelect) after 48 h incubation at 37 °C

Figure 7. MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) is a new technology for routine identification of bacteria in clinical microbiology laboratories

Antimicrobial susceptibility testingThe colonies that corresponded to E. cecorum and E. hiraewere phenotypically tested for their susceptibility to 20 different antimicrobial agents using the microdilution method to determine minimal inhibitory concentration. All testing procedures were performed according to the manufacturer's instructions (GPALL1F, Sensititre, Trek Diagnostic System, Thermo Scientific). The following anti-microbials were tested: ampicillin, cefoxitin, chloram-phenicol, ciprofloxacin, clindamycin, daptomycin, erythro-mycin, gentamicin, linezolid, moxifloxacin, nitrofurantoin, oxacillin, penicillin, rifampicin, streptomycin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, vancomycin, levofloaxacin and tigecycline.


105

Figure 8. Antimicrobial susceptibility testing by micro-dilution method (Sensititre, Trek Diagnostic System, Thermo Scientific)


Enterococci are becoming an increasingly important cause of recurrent, serious infections in poultry. E. cecorum and E. hirae have been known as important causes of arthritis and osteomyelitis lesions and can cause significant economic loss due to mortality and poor feed conversion. In our clinical cases, E. cecorum and E. hirae strains were isolated from affected joints, internal organs (liver and heart) and swabs samples from broiler airbags. A total of 19 E.cecorum and E. hirae from broiler clinical samples were tested for antimicrobial resistance against a panel of 20 antimicrobials. Differences in antimicrobial resistance patterns were observed between the E. cecorum and E. hirae isolates. Resistance against tetracyclines differed between these two species: all tested E. cecorum isolates but none of E. hirae isolates were resistant to tetracyclines. Reduced susceptibility of E. hirae isolates was widespread for clindamycin and for the group of fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin). Because enterococci are intrinsically resistant to many antimicrobial agents, the choice of appropriate agents for enterococcal infection treatment is limited. Antimicrobial susceptibility testing should be performed to ensure that the most efficacious antibiotic is used. In fact, clinical experiences also indicate that ampicillin remains the first choice for enterococcal infection treatment in poultry production. E. cecorum and E. hirae associated disease in broilers impacts the farmers economically, not only as a result of

increased flock mortality but also because of higher condemnation rates at the slaughterhouse.

References

ARIAS, C. A. and B. MURRAY (2012): The rise of the Entero-coccus: beyond vancomycin resistance. Nat Rev Microbiol. 10, 266-278.

ARMOUR N. K., S. R. COLLETT, S. M. WILLIAMS (2011): Enterococcus cecorum-related arthritis and osteomyelitis in broilers and broiler breeders. The Poultry Informed Professional. 117: 1-7. (http://vet.uga.edu/images/uploads/ /pdrc/PIP%20Mar-Apr%2011%20Final.pdf).

AZIZ, T., H. J. BARNES (2007): Is spondylitis an emerging disease in broiler breeders? World Poult. 23, 44-45.

DEVRIESE, L. A., G. N. DUTA, J. A. E. FARROW, et al. (1983): Streptococcus cecorum, a new species isolated from chickens. Int J Syst Bacteriol, 33, 772-776.

DEVRIESE, L. A., R. DUCATELLE, E. UYTTEBROEK, et al.(1991): Enterococcus hirae infection and focal necrosis of the brain of chicks. Vet Rec. 129, 316.

DEVRIESE, L. A., K. CAUWERTS, K. HERMANS, et al. (2002): Enterococcus cecorum septicemia as a cause of bone and joint lesions resulting in lameness in broiler chickens. Vlaams Diergen Tijds. 71(3), 219-221.

HOLLENBECK, B. L., L. B. RICE (2012): Intrinsic and acquired resistance mechanisms in enterococcus. Virulence. 3(5), 421-433. (http://dx.doi.org/10.4161/viru.21282).

JACKSON, C. R., S. KARIYAWASAM, L. B. BORST, et al.(2014): Antimicrobial resistance, virulence determinants and genetic profiles of clinical and nonclinical Enterococcus cecorum from poultry. Lett Appl Microbiol. 60, 111-119.

JUNG A., S. RAUTENSCHLEIN (2014): Comprehensive report of an Enterococcus cecorum infection in a broiler flock in Northern Germany. BMC Vet Res. 10, 311. DOI 10.1186/s12917-014-0311-7.

KOLBJ RNSEN, ., B. DAVID, M. GILHUUS (2011): Bacterial osteomyelitis in a 3-week-old broiler chicken associated with Enterococcus hirae. Vet Pathol. 48(6), 1134-1137. DOI: 10.1177/0300985810396513.

MERCK VETERINARY MANUAL (2012): Overview of entero-coccosis in poultry. (http://www.merckmanuals.com/, 31. 3. 2015).

VELKERS, F. C., L. van de GRAAF-BLOOIS., J. A. WAGENAAR, et al. (2011): Enterococcus hirae-associatedendocarditis outbreaks in broiler flocks: clinical and pathological characteristics and molecular epidemiology. Vet Q. 31(1), 3-17. DOI: 10.1080/01652176.2011.570107.

ANTIMIKROBNA OSJETLJIVOST IZOLATA ENTEROCOCCUS CECORUM I ENTEROCOCCUS HIRAE IZ TOVNIH PILI A

Sažetak

Peradarska proizvodnja jedan je od najvažnijih i najuspješnijih sektora prehrambene industrije u Sloveniji. U posljednjih nekoliko godina sve eš e se u Sloveniji bilježe infekcije tovnih pili a bakterijama Enterococcus (E.) cecorum i Enterococcus (E.) hirae s klini kim tijekom. Enterokoki su normalno prisutni u crijevnoj mikrobioti ptica i sisavaca, ali su isto tako važni patogeni odgovorni za razne infekcije. Kod peradi enterokoki se esto izoliraju iz ptica s klini kom boleš u,poglavito mladih životinja. Me utim, E. cecorum i E. hirae poznati su kao zna ajni uzroci promjena udruženih s artritisom i osteomijelitisom te mogu prouzro iti znatne ekonomske gubitke zbog smrtnosti i slabe konverzije hrane. Ciljevi ovoga rada


106

su ukazati na važnost infekcija bakterijama E. cecorum i E. hirae u peradarskoj industriji te utvrditi kretanje antimikrobne osjetljivosti ovih izolata. Sojevi E. cecorum i E. hirae izolirani su iz zahva enih zglobova, unutarnjih organa (jetra, srce), a obrisci su uzeti s površine zra nih vre ica. Osjetljivost svih izolata ispitana je metodom mikrodilucije kako bi se utvrdila minimalna inhibicijska koncentracija za 20 razli itih antimikrobnih lijekova. Otpornost na tetracikline razlikovala se me uovim dvjema vrstama: otpornost na tetracikline pokazali su svi ispitani izolati E. cecorum, ali nijedan izolat E. hirae. Izolati E. hirae ve inom su pokazali smanjenu osjetljivost na klindamicin, kao i na skupinu fluorokinolona (ciprofloksacin, levofloksacin, moksifloksacin). Enterokoki su suštinski otporni na mnoga antimikrobna sredstva, što ograni ava izbor odgovaraju ih lijekova za lije enje enterokoknih infekcija. Zato treba provoditi testiranje antimikrobne osjetljivosti kako bi se osigurala primejna naju inkovitijeg antibiotika. Zapravo, klini ka iskustva tako er pokazuju da ampicilin ostaje prvi izbor za lije enje enterokoknih infekcija u peradarskoj proizvodnji.

Klju ne rije i: Enterococcus cecorum, Enterococcus hirae, ispitivanje osjetljivosti, tovni pili i


UPORABA KOKCIDIOSTATIKA U PERADI

Marija Berendika1, Marijana Sokolovi 1, Gabrijela Krivec2

1 Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Zagreb, Hrvatska 2 Prilaz Gjure Deželi a 16, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Najdostupniji i najjeftiniji izvor proteina životinjskog podrijetla za ljude su meso i jaja peradi. Zbog masovne proizvodnje ovih namirnica, a u svrhu sprje avanja širenja raznih zaraznih i nametni kih bolesti u uzgoju peradi, koriste se razli iti veterinarsko-medicinski proizvodi u koje pripadaju i antikokcidijska sredstva. Upotreba tih sredstava propisana je važe im zakonskim propisima u zemljama Europske Unije. I najmanja ošte enja crijeva mogu utjecati na rast i konverziju hrane u peradi ugrožavaju i uzgoj. Pri uzgoju nesilica, za razliku od tovnih pili a, poželjne su blage invazije kokcidijama zbog poticanja aktivnog imuniteta. Ako takva imunost nije postignuta postoji opasnost obolijevanja životinja i nastanak znatnih ekonomskih šteta uzrokovanih kokcidiozom.

Klju ne rije i: kokcidioza, kokcidiostatici, Eimeria, hrana za životinje, feces

Uvod

Kokcidioza je parazitska bolest probavnog sustava od koje mogu oboljeti gotovo sve doma e i divlje životinje kao i ovjek. Kokcidioza se smatra jednom od najzna ajnijih

invazivnih bolesti u intenzivnom uzgoju peradi, naro ito u mladih životinja. Uzro nik bolesti su protozoe iz roda Eimeria koje se nastanjuju i umnažaju u stijenci crijeva uzrokuju i ošte enja sluznice probavnog sustava, što dovodi do lakših ili težih promjena koje se klini ki prvenstveno manifestiraju u obliku proljeva, pojavi krvi u fecesu, gubit-kom tjelesne teku ine (dehidracijom), smanjenom proizvod-njom jaja u kokoši nesilica, a u najtežim slu ajevima i ugi-nu em zbog sekundarnih bakterijskih infekcija (McDougald, 2008.; Shirley i Lillehoj, 2012.).

Na in razmnožavanja i podjela kokcidija

Kokcidije iz roda Eimeria specifi ne su za svog nosioca kao i za dijelove probavnog sustava u kojima se razvijaju (cri-jeva i cekum). Razvoju oocista pogoduje toplina, prisutnost kisika, vlažnost tla i stelje, sporuliraju ve za dan-dva i tako postanu invazivne. Razvojni ciklus Eimeria možemo podijeliti na dva stadija, egzogeni i endogeni stadij. U egzogenom stadiju, koji se odvija u vanjskom okolišu, oociste sporuliraju kroz 48-72

sata pri temperaturi od 25-30 ºC. U endogenom stadiju, koji se odvija u probavnom traktu peradi nakon ingestije sporuli-ranih oocista (putem hrane, vode ili stelje zaga ene fece-som), dolazi do njihovog nespolnog umnažanja, a kasnije i do spolnog. Tijekom ovih ciklusa razmnožavanja dolazi do zna ajnijih ošte enja stanica probavnog sustava. Endogeni razvoj traje 4-7 dana nakon ega zapo inje masovno izlu-ivanje oocista u fecesu koje traje idu ih nekoliko dana te se

može na i i od 100 do 300000 oocista po gramu fecesa. Kod patogenih vrsta E. tenella i E. necatrix, najteže promjene nastaju još u doba multiple diobe, što se obi no dogodi 4-5 dana nakon invazije. Iako nije potreban posrednik za raz-vitak Eimeria spp., oociste se mogu širiti mehani kim putem, kontaminiranom opremom, ali i mnogim životi-njama, insektima, divljim pticama i prašinom. Op enito,oociste se smatraju otpornima na razli ite okolišne uvjete i dezinficijense, a vrijeme preživljavanja ovisi o uvjetima u kojima se nalaze. Oociste mogu preživjeti nekoliko tjedana pod optimalnim uvjetima, ali vrlo brzo ugibaju ako su iz-ložene visokim temperaturama ili suši (Reyna i sur., 1982.; Sharman i sur., 2010.), u vlažnoj stelji mogu preživjeti i do dvije godine (McDougald, 2008.; Fröhlich i sur., 2013.; Gerhold, 2014.).Opisano je devet vrsta kokcidija u peradi: Eimeria acer-vulina, Eimeria brunetti, Eimeria maxima, Eimeria mitis,Eimeria necatrix, Eimeria tenella, Eimeria mivati, Eimeria

Marija Berendika, dipl. ing. preh. teh., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Henizelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; Tel.: +385 (0)1 2441-394; Faks: +385 (0)1 2441-396; e-mail: [email protected]

UPORABA KOKCIDIOSTATIKA U PERADI 108

hagani i Eimeria praecox, a razlikovati ih se može prema morfologiji oocista i mjestu kolonizacije crijeva, kao i prema izgledu lezija koje uzrokuje pojedina vrsta. E. tenella uzrokuje promjene u slijepim crijevima. E. necat-rix najpatogenija je kokcidija tankog crijeva u peradi, a nastanjuje srednju tre inu tankog crijeva i o ituje se u proširenju tog dijela crijeva. E. acervulina, E. mivati, E. maxima i E. brunetti obi no dolaze u starijeg podmladka i slabije su patogene, mogu uzrokovati proljev, anemiju i smanjen prirast. U slu aju jakih invazija E. maxima i E.brunetti mogu uzrokovati i uginu a. Promjene uzrokovane vrstama E. acervulina i E. mivati ograni ene su na podru jeprve tre ine tankog crijeva, E. maxima srednji dio, a E.brunetti zadnji dio do rektuma. E. mitis uzrokuje promjene u donjem dijelu tankog crijeva (McDougald, 2008.; Iacob i Duma, 2009.; Gerhold, 2014.). S ekonomskog stajališta kokcidioza je jedna od najzna ajnih parazitskih bolesti u peradarskoj proizvodnji. Prema nekim istraživanjima smatra se da ekonomski trošak pojave kokci-dioze u uzgoju peradi iznosi 0,023 EUR-a po kilogramu tjelesne težine, odnosno najmanje 2,3 bilijuna EUR-a go-dišnje na razini svjetske peradarske proizvodnje. Kako je u toj procjeni gotovo 70% troškova povezano sa subklini kimoblicima kokcidioze, potreba kontrole i pravodobne di-jagnoze je neophodna (Williams, 1999.; Sørenson i sur., 2006.; Waldenstedt, 2004.). Navedeno je od osobite eko-nomske važnosti s obzirom na to da se jaja i meso peradi smatraju najdostupnijim i najjeftinijim izvorom proteina za ljude te je poizvodnja ovih namirnica u svijetu velikih razmjera (FAO, 2013.).

Klini ki simptomi i postavljanje dijagnoze

Kokcidioza se može pojaviti u bilo koje vrste peradi i u bilo kojoj vrsti nastambe. Prema tijeku bolest može biti akutna (uglavnom u mladih životinja) ili subakutna i kroni na (re-dovito u starijih životinja). Klini ki simptomi ovise o vrsti uzro nika, ja ini invazije te o otpornosti i zdravstvenom stanju životinje. U slu aju unosa malog broja oocista bolest uglavnom ima blage simptome (subklini ka kokcidioza) i esto pro e neprimjetno. Pritom dolazi do razvoja imunosti

u životinja koja je specifi na za odre enu vrstu kokcidija. Uz navedeno pojavljuju se i gubitak apetita, slabost, nako-striješenost perja, pospanost i anemija. Do uginu a dolazi kroz 2-3 dana nakon pojave prvih simptoma. Smrtnost može iznositi i više od 50%. Pili i koji prežive stje u imunitet, ali ostaju kržljavi. Tek izleženi pili i obi no imaju visoke koli ine antitijela, ali to ne ograni ava podložnost zarazi. Izbijanje kokcidioze nastaje oko 3-6 tjedana starosti, a rijetko su primije ene u pili a mla ih od 3 tjedna (McDougald, 2008.; Chapman, 2009.). Propadanjem stanica sluznice tankog crijeva koje su odgovorne za probavu dolazi do nemogu nosti upijanja hranjivih tvari i vode iz crijeva. Navedeno ošte enje tkiva i promjene u funkciji probavnog trakta može rezultirati nastankom sekundarnih bakterijskih infekcija patogenim vrstama kao što su bakterija Clos-tridium perfringens koja uzrokuje nekroti ni enteritis i

bakterijama iz roda Salmonella spp. (Arakawa i sur., 1981.; Williams i sur., 2003.; McDougald, 2008.; Verleyen, 2010.). Dijagnoza se za života može postaviti na osnovi epizo-otioloških podataka, klini kog nalaza (krvav proljev u pi-li a) i nalaza ve eg broja oocista u fecesu. Pouzdanija je postmortalna dijagnoza postavljena na osnovi patoana-tomske i patohistološke pretrage te nalaza razvojnih stadija kokcidija u odgovaraju im dijelovima probavnog trakta. Rutinsko odre ivanje vrsta Eimeria provodi se ocjenom le-zija, ljestvicom od 0, +1, +2, +3 i +4, u cilju odre ivanja ja ine invazije kokcidioze kao i za procjenu djelotvornosti korištenih kokcidiostatika (Long i Joyner, 1984.; Conway i McKenzie, 2007.). Mikroskopskom analizom razmaza sa-držaja crijeva ili fecesa može se potvrditi prisutnost infekcije kokcidijima, ali se ne može potvrditi klini ka kokcidioza. Kokcidioza bi trebala biti potvr ena ako su lezije puno ozbiljnije.

Suzbijanje i lije enje

Zbog potencijalne mogu nosti masovne invazije kokcidija s neželjenim ekonomskim gubicima u proizvodnji, u uzgoju podmladka u mati nih jata i nesilica primjenjuje se kon-tinuirana medikamentna profilaksa. Budu i da su mladi pili i osjetljiviji od odraslih važno ih je odvojeno uzgajati. Uvjeti u nastambama u kojima se uzgaja perad od velike su važnosti i za zdravlje same peradi i za uspješnu kontrolu kokcidioze i ostalih bolesti, a odnose se na temperaturu, optimalno suhu stelju, ventilaciju, prisutnost fecesa, gusto unasaljenosti peradi u peradnjaku, rasvjetu, ispravne pojilice i hranilice. Temperature izvan prihvatljivog raspona nepo-voljno utje u na konzumaciju hrane, a tako i na konzumaciju antikokcidijskih sredstava. U idealnim uvjetima temperaturu u nastambama bi trebalo održavati oko 33 ºC do 38 ºC pri useljavanju pili a i smanjivati ju za 3 ºC svaki tjedan dok se ne postigne temperatura od 21 ºC oko šest tjedana. Tamo gdje je zbog klimatskih uvjeta teško ili nemogu e održavati temperature blizu idealnih, ventilacija i dobra izolacija nastambe su neophodne (Arbor Acres Farm, 1988.; Keshavarz, 1990.; Charles i Walker, 2002.; Donald, 2003.; Czarick i Lacy, 2004.). Kontinuiranom opskrbom svježeg zraka uklanja se vlaga koju proizvodi perad i vlaga iz fecesa te time onemogu ava nastanak para amonijaka u zraku. Stelja ne smije biti prevlažna, a ni presuha te se smatra da je optimalna vlažnost stelje 20%-25% vode. Ako je prevlažna (25%-30% vode) stvaraju se povoljni uvjeti za razvoj kokcidija i plijesni, a ako je presuha dolazi do dizanja pra-šine, što pogoduje nastanku i širenju bolesti. Prije uselja-vanja novog jata obvezno je temeljito iš enje i dezinfekcija peradnjaka. Kokcidiostatici se u hrani koriste u proizvodnji tovnih pili atijekom cijelog proizvodnog razdoblja (osim nekoliko zad-njih dana prije klanja i obrade), kao i u prva 3-4 mjeseca uzgoja podmladka mati nih jata i nesilica. Prehrana peradi, odnosno kvaliteta i sastav hrane (pravilan omjer proteina, vitamina, minerala, energije i sl.) izravno utje u na uspješ-nost i troškove proizvodnje, a time osiguravaju nesmetano


djelovanje kokcidiostatika. Lije enje kokcidioze uspješno je samo u najranijem stadiju bolesti.

Antikokcidijske tvari koje se naj eš e primjenjuju u hrani za perad pripadaju skupini ionofornih antibiotika, iako na tržištu postoji velik izbor antikokcidijskih sredstava koja se dijele u dvije skupine: kokcidiocidna sredstva i kokci-diostatici.Kokcidiocidna sredstva uništavaju sporozoite i time sprje avaju invaziju ne dopuštaju i stvaranje aktivnog imu-niteta. U tu skupinu pripadaju ionoforni antibiotici: monen-sin, salinomicin, lasalocid, narasin, maduramicin i semdura-micin. Budu i da se nakon duže primjene u kokcidija može stvoriti otpornost, za njezinu odgodu preporu uje se planska primjena antikokcidijskih pripravaka te izmjena nakon nekoliko turnusa uzgoja tovnih pili a (tzv. switch-program) ili tijekom jednog tovnog turnusa (tzv. shuttle-program). Kokcidiostatici ine drugu skupinu antikokcidijskih sred-stava. Njihova glavna svrha je poticanje razvoja aktivnog imuniteta i sprje avanje patogenog djelovanja shizonta djeluju i na njihove kasnije razvojne stadije. Njihovim kasnijim isklju ivanjem iz hrane perad e aktivno ste enomotpornoš u odolijevati izbijanju kokcidioze (Vermeulen i sur., 2001.; McDougald, 2008.). Neke antikokcidijske tvari imaju i kokcidiocidnu i kokci-diostatku ulogu, npr. robenidin. Razvoj prirodne imunosti u tretiranih ptica ovisi o vrsti antikokcidijskog sredstva i broju kokcidija kojima su ži-votinje izložene tijekom prvih šest do sedam tjedana rasta. Me utim, i u najpovoljnijim uvjetima potpuna imunost u ptica stje e se tek u sedmom tjednu života (Chapman, 1999.). U novije vrijeme sve eš e se upotrebljavaju i cjepiva koja sadrže kombinacije razli itih sojeva Eimeria. U slu ajuvakcinacije ptice je potrebno redovito kontrolirati kako bi se sa sigurnoš u znalo da je došlo do stjecanja zaštitne imu-nosti. U slu aju izlaganja životinja ve em broju kokcidija prije razvoja potpune imunosti vakcinirano jato potrebno je dodatno tretirati antikokcidijskim sredstvima u vodi (npr. sulfakvinoksilin i toltrazuril). Kod primjene cjepiva tako ertreba obratiti pozornost na potrebe pilenki za vitaminima A, D, E i K budu i da reakcija životinja na E. acervulina i E.maxima može nepovoljno utjecati na njihovu apsorpciju iz hrane (Hofacre, 2003.). Neka od cjepiva koja su dostupna na hrvatskom tržištu su Livacox Q (Genera) – sadrži atenuirane linije oocista E. tenella, E. acervulina, E.maxima i E. necatrix, za aktivnu imunizaciju i sprje avanje kokcidioze pili a u uzgoju (budu i roditelji lakih i teških linija i budu enesilice konzumnih jaja) i Livacox T (Genera) – sadrži atenuirane linije oocista E. tenella, E. acervulina i E.maxima, za sprje avanje kokcidioze tovnih pili a. Prema navodima porizvo a a, kod obje vrste ovih cjepiva imunost se razvija 10-14 dana nakon cijepljenja, tj. nakon 2-3 razvojna ciklusa kookcidija i traje doživotno za vrste kokcidija koje cjepivo sadržava. Paracox-5 (Schering-Plough Animal Health) – sadrži atenuirane oociste E.acervulina, E. maxima, E. mitis i E. tenella, Baycox Oral

2,5% (KVP, Pharma-und Veterinär-Produkte GmbH) i drugo (tablica 1.).

Rezidue kokcidiostatika

Gospodarski subjekti koji proizvode hranu za životinje mogu unutar jednog pogona proizvoditi više vrsta hrane s velikom vjerojatnoš u da se razli ite vrste proizvoda pro-izvode jedna iza druge na istoj proizvodnoj liniji. U tom slu aju može se dogoditi da tragovi jednog proizvoda završe u po etnom dijelu proizvodnje drugog. Takva vrsta una-krsnog one iš enja postaje problem ako, primjerice, kok-cidiostatici završe u hrani za životinje za koju primjena kokcidiostatika nije dopuštena, a to bi moglo imati za posljedicu potencijalni rizik za zdravlje tih životinja kao i prisutnost tih tvari u hrani životinjskog podrijetla i putem lanca prehrane dospjeti u ljudski organizam i tako ugroziti njegovo zdravlje (Dorne i sur., 2013.). S ciljem zaštite zdravlja ljudi, Uredbom Komisije (EZ) br. 124/2009 propisane su najviše dopuštene koli ine kokcidiostatika i histomonostatika u hrani za: narasin, salinomicin natrij, monenzin natrij, semduramicin, robenidin, dekokvinat i halofuginon, dok su vrijednosti za lasalocid natrij, madu-ramicin, nikarbazin i diklazuril nadopunjene Uredbom Komisije (EZ) br. 610/2012 (tablica 2.). Najve e dopuštene koli ine moraju se stalno prilago avati kada nova znanstvena i tehni ka dostignu a na to ukazuju. U Republici Hrvatskoj postoji Državni program monitoringa rezidua (DPMG) zada a kojega je monitoring rezidua u živim životinjama i proizvodima koje su isklju ivo hrvat-skog podrijetla. U DPMR-u se pregledavaju dvije osnovne skupine tvari: rezidue – u najve em dijelu odnose se na ostatke veterinarsko-medicinskih proizvoda odnosno pesti-cide i kontaminanti – teški metali, mikotoksini, pesticidi i dr. Hrana koja sadrži rezidue ili kontaminante u koli ini ve ojod dopuštene smatra se zdravstveno neispravnom te se ne smije koristiti. Uz spomenute analize hrane i hrane životinjskog podrijetla na rezidue kokcidiostatika potrebno je analizirati i hranu kojoj je propisana odgovaraju a koli ina kokcidiostatika za pojedine vrste i dobne kategorije životinja. U Laboratorijima Centra za peradarstvo analizirana je hrana s propisanom koli inom kokcidiostatika (hrana za životinje, premiksi), ali i prisutnost rezidua kokcidostatika u hrani za životinje u kojoj oni nisu dozvoljeni. Od ukupnog broja analiziranih uzoraka u 2013. g. i 2014. g. 5,33% uzoraka nije zadovoljilo zakonski propisane koli ine kokcidiostatika u hrani za životinje. Naj eš i kokcidiostatici prisutnost kojih se odre ivala u dostavljenim uzorcima su: salinomicin natrij, monenzin, lasalocid, narasin i madu-ramicin. Uzorci koji nisu zadovoljili odnosili su se najve imdijelom na po etnu smjesu za tov pili a koja je bila de-klarirana da sadrži kokcidiostatik, a analizom nije utvr ena prisutnost kokcidiostatika u koli ini koja se preporu uje za sprje avanja pojave klini ke slike kokcidioze u tovnih pi-li a. Svi ispitani uzorci na prisutnost rezidua kokcidiostatika bili su ispod zakonski propisane koli ine (tablica 2.).


Tablica 1. Antiparazitici i imunološki veterinarsko-medicinski proizvodi (VMP) koji se nalaze na Popisu odobrenih veteri-narsko-medicinskih proizvoda (VMP) Uprave za veterinarstvo i sigurnost hrane zaklju no na dan 3. velja e 2015. g.

Table 1. Antiparasitic and immunologic veterinary drugs approved by Veterinary and Food Safety Directorate, Croatian Ministry of Agriculture until March 3, 2015

VMP (Proizvo a ) Farmaceutski oblik / Farmakoterapijska skupina / Djelatna tvar Primjena u Karencija

AMPROSID(Chemifarma S.p.A, Forli, Italija)

Koncentrirana otopina za primjenu u vodi za pi e / antiparazitik / amprolij hidroklorid

Kokoši (tovni pili i,pilenke, konzumne i rasplodne nesilice)

Meso i jestivi nusproizvodi: 0 dana; jaja: 0 dana

BAYCOX 2,5% (KVP, Pharma- und Veterinär- Produkte GmbH, Kiel, Njema ka)

Otopina za primjenu u vodi za pi e / antiparazitik / toltrazuril

Kokoši i purana Meso, organi i ostala jestiva tkiva kokoši itovni pili i: 21 dan; purani i puri i: 18 dana; jaja: toltrazuril se ne smije primjenjivati konzumnim nesilicama niti pilenkama ija se jaja koriste za hranu

LIVACOX Q (Biopharm Research Institute of Biopharmacy and VeterinaryDrugs a.s., Jilove near Prague, R. eška)

Suspenzija oocista za primjenu u vodi za pi e / imunološki VMP / atenuirane oociste Eimeria tenella, E. acervulina, E.maxima i E. necatrix

Kokoši (pili i u uzgoju)

Meso, organi, ostala jestiva tkiva i jaja: 0 dana

LIVACOX T (Biopharm Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs a.s., Jilove near Prague, R.

eška)

Suspenzija oocista za primjenu u vodi za pi e / imunološki VMP / sporulirane oociste atenuiranih linija kokcidija: E. acervulina 30.000-50.000 oocista, E. maxima 30.000-50.000 oocista i E. tenella 30.000-50.000 oocista

Kokoši (tovnih pili a)

Meso, organi i ostala jestiva tkiva: 0 dana

PARACOX(Schering-Plough Animal Health Division of Schering-Plough Ltd. Bearkspear Road South, Middlesex UB9 6LS, Ujedinjeno Kraljevstvo)

Suspenzija za peroralnu primjenu / imunološki VMP / sporulirane oociste od osam atenuiranih linija kokcidija: Eimeriaacervulina HP 500, E. brunetti HP 100, E. maxima CP 200, E. maxima MFP 100, E. mitis HP 1000, E. necatrix HP 500, E.preacox HP 100, E. tenella HP 500

Kokoši Meso i jestivi nusproizvodi: 0 dana; jaja: cjepivo se ne primjenjuje nesilicama

PARACOX 5 (Intervet International B.V., Boxmeer, Nizozemska)

Suspenzija za peroralnu primjenu Kokoši Meso i jestivi nusproizvodi: 0 dana; jaja: cjepivo se ne primjenjuje nesilicama

VMP – Veterinarsko-medicinski proizvod

Tablica 2. Najve a dopuštena koli ina kokcidiostatika u proizvodima koji su namijenjeni za hranu za životinje propisana Pravilnikom Ministarstva poljoprivrede (NN124/2012) – navedene vrijednosti u tablici odnose se na perad.

Table 2. Maximum allowed level of coccidiostats in feedstuffs by Ministry of Agriculture published in Official Gazette of the Republic of Croatia issue no. 124 of 14 November 2012 – values in table are for poultry

Kokcidiostatik Proizvodi namijenjeni za hranu za životinje Najve a dopuštena koli ina u

mg/kg (ppm) kada udio vlage u hrani za životinje iznosi 12%

DEKOKVINAT

Krmne smjese za svu perad koja služi za proizvodnju jaja i pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>16 tjedana) 0,4

Krmne smjese za tov za razdoblje prije klanja u kojem je zabranjeno koristiti dekokvinat (hrana za životinje s propisanom karencijom) 0,4

DIKLAZURIL


Krmne smjese za druge životinjske vrste osim pilenki koje se uzgajaju za nesenje (<16 tjedana), pili e za tov, biserke i purane za tov 0,03


Kokcidiostatik Proizvodi namijenjeni za hranu za životinje Najve a dopuštena koli ina u

mg/kg (ppm) kada udio vlage u hrani za životinje iznosi 12%

HALOFUGINON HIDROBROMID

Krmne smjese za svu perad koja služi za proizvodnju jaja, pilenke koje se uzgajaju za nesenje i purane (>12 tjedana) 0,03

Krmne smjese za pili e za tov i purane (<12 tjedana) za razdoblje prije klanja ukojem je zabranjeno koristiti halofuginon hidrobromid (hrana za životinje s propisanom karencijom)

0,03

LASALOCID A NATRIJ

Krmne smjese za pse, telad, kuni e, kopitare, životinje za proizvodnju mlijeka, svu perad koja služi za proizvodnju jaja, purane (>16 tjedana) i pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>16 tjedana)

1,25

Krmne smjese za pili e za tov, pilenke koje se uzgajaju za nesenje (<16 tjedana) i purane (<16 tjedana) za razdoblje prije klanja u kojem je zabranjeno koristiti lasalocid A natrij (hrana za životinje s propisanom karencijom)

1,25

LASALOCID A NATRIJ

Krmne smjese za fazane, biserke, prepelice i jarebice (osim peradi koja služi za proizvodnju jaja) za razdoblje prije klanja u kojem je zabranjeno koristiti lasalocid A natrij (hrana za životinje sa propisanom karencijom)

1,25

MADURAMICIN AMONIJ ALFA

Krmne smjese za kopitare, kuni e, purane (>16 tjedana), svu perad koja služi za proizvodnju jaja i pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>16 tjedana) 0,05

Krmne smjese za pili e za tov i purane (<16 tjedana) za razdoblje prije klanja ukojem je zabranjeno koristiti maduramicin amonij alfa (hrana za životinje sa propisanom karencijom)

0,05

MONENSIN NATRIJ

Krmne smjese za kopitare, pse, male preživa e (ovce i koze), patke, goveda, mlije ne krave, svu perad koja služi za proizvodnju jaja, pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>16 tjedana) i purane (>16 tjedana)

1,25

Krmne smjese za pili e za tov, pilenke koje se uzgajaju za nesenje (<16 tjedana) i purane (<16 tjedana) za razdoblje prije klanja u kojem je zabranjeno koristiti monensin natrij (hrana za životinje s propisanom karencijom)

1,25

NARAZIN Krmne smjese za purane, kuni e, kopitare, svu perad koja služi za proizvodnjujaja, pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>16 tjedana) 0,7

Krmne smjese za druge životinjske vrste 2,1

NIKARBAZIN Krmne smjese za kopitare, svu perad koja služi za proizvodnju jaja i pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>16 tjedana) 1,25

Krmne smjese za druge životinjske vrste 3,75

ROBENIDINHIDROKLORID


Krmne smjese za pili e za tov i uzgoj i purane za razdoblje prije klanja u kojemje zabranjeno koristiti robenidin hidroklorid (hrana za životinje s propisanom karencijom)

0,7

SALINOMICIN NATRIJ

Krmne smjese za kopitare, purane, svu perad koja služi za proizvodnju jaja i pilenke koje se uzgajaju za nesenje (>12 tjedana) 0,7

Krmne smjese za pili e za tov, pilenke koje se uzgajaju za nesenje (<12 tjedana) i kuni e za tov za razdoblje prije klanja u kojem je zabranjeno koristiti salinomicin natrij (hrana za životinje s propisanom karencijom)

0,7

SEMDURAMICIN NATRIJ


Krmne smjese za pili e za tov za razdoblje prije klanja u kojem je zabranjeno koristiti semduramicin natrij (hrana za životinje s propisanom karencijom) 0,25


Zaklju ak

Kokcidioza je zna ajna bolest u peradarstvu ne samo zbog potencijalnog obolijevanja životinja i rizika za zdravlje ljudi, nego i zbog ekonomskih šteta do kojih može do i u uzgoju peradi. Ve spomenuta raširenost uzro nika imbenik je koji je nužno kontrolirati te primijeniti sve dostupne mjere dobre proizvo a ke prakse kako bi se mogu nost pojave ove bolesti svela na minimum. Uz navedeno, osobitu pozornost treba posvetiti i proizvodnji hrane i hrane za životinje, što se postiže uporabom kvalitetnih sirovina, pravilnom pripre-mom i kontrolom hrane i dodataka hrani za životinje. Navedenim postupcima smanjit e se rizik nastanka kok-cidioze i nepovoljnih u inaka za zdravlje životinja i nepo-sredno za zdravlje ljudi.

Literatura

ARAKAWA, A., E. BABA, T. FUKATA (1981): Eimeria tenellainfection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens. Poultry Sci. 60(10), 2203-2209.

ARBOR ACRES FARM. (1988): Broiler Feeding and Management, Glastonbury, CT: Arbor Acres Farm, Inc. BAYER VETERINA HRVATSKA. Link:http://bayer-vete-rina.hr/scripts/pages/hr/farmske_zivotinje/perad/bolesti/kokcidioza_peradi/

CHAPMAN, H. D. (1999): Anticoccidial drugs and their effects upon the development of immunity to Eimeria infections in poultry. Avian Pathol. 28, 521-535.

CHAPMAN, H. D. (2009): A landmark contribution to poultry science – prophylactic control of coccidiosis in poultry. Poultry Sci. 88(4), 813-815.

CHARLES, D., A. WALKER (2002): Poultry Environment Problems. Nottingham, UK: Nottingham University Press.

CONWAY, D.P., M. E. MCKENZIE (2007): Poultry Coccidiosis, Diagnostics and Testing Procedures, 3rd ed. Blackwell Publishing, Ames, Iowa.

CZARICK, M., M. P. LACY (2004): Maximizing bird cooling in tunnel ventilated houses. Poultry Informed Professional. 78, 1-3.

DONALD, J. (2003): Principles of successful wintertime broiler house ventilation. Poultry Informed Professional. 75, 1-6.

DORNE, J. L. C. M., M. L. FERNÁNDEZ-CRUZ, U. BERTELSEN , D. WRENSHAW , K. PELTONEN , A. ANADON , A. FEIL , P. SANDERS , P. WESTER , J. FINK-GREMMELS (2013): Risk assessment of coccidiostatics during feed cross-contamination: animal and human health aspects. Toxicol Appl Pharmacol. 270, 196-208.

FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION of the United Nations (FAO), Statistic Division (FAOSTAT), Trends in the livestock sector, part 3, 2013, http://www.fao.org/docrep/ /015/i2490e/i2490e03c.pdf.

FRÖHLICH, S., J. FARHAT, M. WALLACH (2013): Designing strategies for the control of coccidiosis in chickens on poultry farms using modern diagnostic tools. Rep Parasitol. 3:1-10.

GERHOLD, R. W. (2014) Overview of Coccidiosis in Poultry. The Merck Veterinary Manual http://www.merckmanuals.com/vet/ /poultry/coccidiosis/overview_of_coccidiosis_in_poultry.html [25.02.2015.]

HOFACRE, C. L. (2003): Combating coccidiosis in broiler breeders. Poultry Informed Professional. 74, 2-5.

IACOB, O. C., DUMA V. (2009): Clinical, paraclinical and morphopathological aspects in cecal eimeriosis of broilers. Sci Parasitol. 10, 43-50.

KESHAVARZ, K. (1990): Managing in hot weather. Broiler Industry. 53, 24-32.

LONG P. L., JOYNER L. P. (1984): Problems in the identification of species of Eimeria. J Parasitol. 31(4), 535-541.

MCDOUGALD, L. R. (2008): Protozoal infections. In: Diseases of Poultry, 12th ed. Y. M. Saif, A. M. Fadly, J. R. Glisson, L. R. McDougald, L. K. Nolan and D. E. Swayne, eds. Blackwell Publishing, Ames, Iowa, 1067-1085.

MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, Uprava za veterinarstvo i sigurnost hrane (2015). Link: http://www.veterinarstvo.hr/ /default.aspx?id=140

NARODNE NOVINE (124/2012): Pravilnik o izmjenama Pravilnika o nepoželjnim tvarima u hrani za životinje kojim se provode Uredbe Europske komisije o izmjenama Direktive 2002/32/EZ Europskog parlamenta i Vije a od 7. svibnja 2002. o nepoželjnim tvarima u hrani za životinje.

REYNA, P. S., G. F. MATHIS, R. McDOUGALD (1982): Survival of coccidia in poultry litter and reservoirs of infection. Avian Dis. 27, 464-473.

SHARMAN, P. A., N. C. SMITH, M. G. WALLACH, M. KATRIB (2010): Chasing the golden egg: vaccination against poultry coccidiosis. Parasit Immunol. 32 (8): 590-598.

SHIRLEY, M. W., H. S. LILLEHOJ (2012): The long view: a selective review of 40 years of coccidiosis research. Avian Pathol. 41(2), 111-121.

SORENSEN, J. T., S. EDWARDS, J. NOORDHUIZEN, S. GUNNARSSON, S. (2006): Animal production systems in the industrialised world. Scientific and Technical Review OIE 25(2):493-503.

Uredba Komisije (EZ) br. 124/2009 od 10. velja e 2009. o odre ivanju najviših dopuštenih koli ina kokcidiostatika ili histomonostatika u hrani koji su posljedica neizbježnog prenošenja tih tvari u neciljnu hranu za životinje.

Uredba Komisije (EZ) br. 610/2012 od 9. srpnja 2012. o izmjeni Uredbe (EZ) br. 124/2009 od 10. velja e 2009. o odre ivanju najviših dopuštenih koli ina kokcidiostatika ili histomono-statika u hrani koji su posljedica neizbježnog prenošenja tih tvari u neciljnu hranu za životinje.

VERLEYEN, T. (2010): Keeping clostridial enteritidis away from poultry flocks. World Poultry.

VERMEULEN, A. N., D. C. SCHAPP, T. P. M. SCHETTERS (2001): Control of coccidiosis in chicken by vaccination. Vet Par. 100, 13-20

WALDENSTEDT, L. (2004) An estimation of the cost of coccidiosis to Swedish poultry production. Proceedings of XII World's Poultry Congress, 8-13 June, 2004, Istanbul, Turkey.

WILLIAMS, R. B. (1999): A compartmentalised model for the estimation of the cost of coccidiosis to the world's chicken production industry. Int J Parasitol. 29(8):1209-1229.

WILLIAMS, R. B., MARSHALL R. N., LA RAGIONE R. M., CATCHPOLE J. (2003): A new method for the experimental production of necrotic enteritis and its use for studies on the relationships between necrotic enteritis coccidiosis and anti-coccidial vaccination of chickens. Parasitol Res. 90(1), 19-26.


USE OF COCCIDIOSTATICS IN POULTRY

Summary

Eggs and poultry meat are considered as the best protein source for humans because of price and availability. Various veterinary drugs including anticoccidials are used in intensive production of these products, as well as to avoid the spread ofzoonoses and parasitic diseases in poultry production. Use of these compounds has been regulated by the current European Union Directive. Even a minor intestinal damage can influence growth characteristics and feed conversion in poultry, resulting in poor production performance. In contrast to broilers, mild invasion with coccidia is considered favorable for development of active immunity in hens. If such immunity is not developed, there is a potential for development of diseases and great economic losses due to coccidiosis.

Key words: coccidiosis, coccidiostatics, Eimeria, animal feed, feces


PREGLED POJAVNOSTI MIKOTOKSINA U EU

Marijana Sokolovi , Borka Šimpraga, Marija Berendika


Sažetak

Mikotoksini su sekundarni metaboliti mikroskopskih filamentoznih plijesni koji uzrokuju intoksikacije u ljudi i životinja. Do intoksikacija naj eš e dolazi konzumacijom kontaminirane hrane, ali su mogu i i drugi na ini intoksikacije (inhalacijom ili putem kože). Za procjenu potencijalnog nepoželjnog u inka mikotoksina na ljude i životinje potrebno je poznavati uvjete njihova nastanka, u estalost, toksi nost, biotransformaciju te mogu nosti inaktivacije u slu aju kada je njihova pojavnost neizbježna. Uz to što mikotoksini mogu uzrokovati intoksikacije u životinja te utjecati na proizvodne rezultate i umanjiti hranidbenu vrijednost hrane za životinje, važna je i mogu nost pojave rezidua u proizvodima animalnog podrijetla, jer konzumacija takvih proizvoda može dovesti do intoksikacija u ljudi. Relativno mali broj usporedivih podataka o u estalosti mikotoksina u hrani i hrani za životinje rezultat je heterogenosti postupaka uzorkovanja i korištenih analiti kih metoda te ukazuje na neophodnu kontinuiranu procjenu mikološkog statusa hrane i hrane za životinje primjenom usporedivih i validiranih analiti kih metoda, jer se jedino tako postižu optimalni proizvodni rezultati u uzgoju životinja i u kona nici sigurnost hrane i hrane za životinje U ovom radu bit e prikazana u estalost mikotoksina koji se smatraju najzna ajnijim i naj eš im u hrani i hrani za životinje u zemljama Europske Unije s osvrtom na toksi nost i intoksikacije u peradi.

Klju ne rije i: mikotoksini, perad, mikotoksikoze, plijesni, hrana

Uvod

Saprofitske plijesni koje rastu i razmnožavaju se u razli itim vrstama hrane i hrane za životinje i patogene su za biljke predstavljaju potencijalni rizik za zdravlje ljudi i životinja, jer kao sekundarne metabolite proizvode mikotoksine. Mikotoksini su toksi ne molekule razli ite kemijske strukture i male molekularne težine (do 700 Da) koji mogu imati imunosupresivni, karcinogeni, mutageni i teratogeni u inak. Dosad je opisano oko 400 razli itih mikotoksina, ali svega manji broj povezuje se s nastankom akutne ili kroni ne intoksikacije u ljudi i životinja. Do intoksikacije dolazi unosom mikotoksina u organizam ingestijom, inha-lacijom ili putem kože, s time da se konzumacija konta-minirane hrane smatra primarnim na inom intoksikacije. U ljudi izlaganje mikotoksinima mogu e je putem konta-miniranih žitarica ili indirektno konzumacijom proizvoda animalnog podrijetla (npr. mlijeko, meso i jaja). Niske razine kontaminacije hrane i hrane za životinje smatraju se "neopasnim" za zdravlje ljudi i životinja (CAST, 2003.; Wu, 2004., 2007; Bryden, 2012.).

Uvjeti koji pogoduju rastu plijesni i proizvodnji miko-toksina, kao što su ekstremne vremenske prilike, ošte enjazrna, prisutnost insekata, loši uvjeti pohrane žitarica i hrane, uzrok su neizbježne pojave mikotoksina u velikom broju uzoraka hrane kao i pojavi intoksikacija ve ih razmjera. Kontaminacija nastaje na polju, tijekom žetve i/ili pohrane žitarica. Mikotoksini su u pravilu stabilne tvari otporne na razli ite postupke prerade hrane i širok raspon temperatura (80-120 °C). Ipak, pojedini postupci prerade hrane koji uklju uju visoke temperature (iznad 150 °C) mogu znatno umanjiti razinu kontaminacije mikotoksinima. Uz navedeno, pojedini agronomski postupci i primjerena uporaba insek-ticida, fungicida, biološke kontrole te pravilni uvjeti pohrane (aktivnost vode u hrani) mogu umanjiti rast plijesni i pro-izvodnju mikotoksina u hrani (Bullerman i Bianchini, 2007.; Bozoglu, 2009.; Paterson i Lima, 2010.). Prema procjeni Organizacije za hranu i poljoprivredu Uje-dinjenih naroda (engl. Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) barem 25% svjetske proizvodnje žitarica godišnje kontaminirano je mikotoksinima (Boutrif i Canet, 1998.). Brojna istraživanja ukazala su na zna ajne

Dr. sc. Marijana Sokolovi , dr. med. vet, HVI - Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, RH; Tel.: +385(0)1 2440-214; Faks: +385(0)1 2441-396;e-mail: [email protected]

PREGLED POJAVNOSTI MIKOTOKSINA U EU 115

ekonomske gubitke u proizvodnji i preradi žitarica, hrane i hrane za životinje kao i u uzgoju životinja. Prema istraži-vanju Vardona i sur. (2003.) ekonomski gubici u proiz-vodnji, preradi i prodaji žitarica i hrane uzrokovani pojavom mikotoksina u Sjedinjenim Ameri kim Državama iznose oko milijardu i pol dolara godišnje. Ekonomski u inak mikotoksina teško je procijeniti, jer treba uzeti u obzir brojne imbenike (npr. postupanje, obrada i pohrana hrane, gubici povezani sa zdravstvenim i veterinarskim troškovima, smrt ljudi, gubici u proizvodnji životinja, gubici u proiz-vodnji žitarica i hrane, troškovi primjene zakonskih propisa, istraživanja, tržišta i drugo) (CAST, 2003.; Bryden, 2012.; Wu, 2004., 2007.). S obzirom na rezultate dosadašnjih istraživanja o u estalosti, toksikogenosti plijesni i toksi nosti mikotoksina, otkrivanje i kontrola usredoto eni su na plijesni rodova Aspergillus, Alternaria, Claviceps, Fusarium, Penicillium i Stachybotrys,odnosno na aflatoksine, ohratoksin A, fumonizin B1, zearalenon, patulin te trikotecene (T-2/HT-2 toksin, dia-cetoksiscirpenol i deoksinivalenol). Za navedene miko-toksine u zemljama Europske Unije propisane su najve edozvoljene ili preporu ene koli ine u hrani i hrani za životinje (Pitt, 2000.; Milicevic i sur., 2010.; Reddy i sur., 2010.; Solomon, 2011.). Cilj ovoga rada je prikaz pojavnosti mikotoksina koji se smatraju najzna ajnijim i naj eš im u hrani u zemljama Europske Unije te osvrt na toksi nost i intoksikacije u peradi.

Aflatoksini su toksi ni metaboliti plijesni Aspergillus (A.) flavus i A. parasiticus. Ovoj skupini pripadaju aflatoksin B1 (AFB1), AFG1, njihovi dihidro-derivati AFB2 i AFG2, te metaboliti AFM1 i AFM2 koji se izlu uju mlijekom, mokra om i fecesom. Identificirani su u razli itim siro-vinama i gotovoj hrani, a mogu se proizvoditi i tijekom skladištenja hrane. Uvjeti koji pogoduju biosintezi aflatoksina uklju uju širok raspon temperatura (optimalno 30 °C) i visoku relativnu vlagu zraka (od 88% do 95%), zbog ega se u uvjetima suše i visokih temperatura pove avaproizvodnja ovog mikotoksina u polju. AFB1 je naj eš i i ujedno i najtoksi niji predstavnik ove skupine za koji je dokazan karcinogeni, imunosupresivni i hepatotoksi ni u inak. Klasificiran je u "skupinu 1" karcinogena za ljude, a povezuje se s bolestima u razli itih vrsta životinja i u ljudi. Ciljni organ djelovanja aflatoksina je jetra. Nadalje, unos AFB1 hranom esto rezultira pojavom AFM1 u mlijeku ve12 sati nakon unosa hranom. Kontaminacija mlijeka ne-dozovoljenim koli inama AFM1 zabilježena je u nekoliko zemalja Europske Unije i rezultirala je zna ajnim eko-nomskim gubicima (IARC, 1993.; Leeson i sur., 1995.; Bondy i Pestka, 2000.; Wyatt, 2005.; Bilandži i sur., 2010.; Streit i sur., 2012.; Bilandži i sur., 2014.; Zachariasova i sur., 2014.). Zbog navedenog, u zemljama Europske Unije propisane su najve e dopuštene koli ine aflatoksina u hrani i hrani za životinje. Iako se pa i i i puri i smatraju najosjetljivijima na djelo-vanje aflatoksina, nepovoljni u inci na proizvodne rezultate i zdravlje životinja opisani su u svih vrsta i kategorija peradi.

Kao i kod drugih mikotoksina, toksi nost ovisi o dozi, trajanju izloženosti toksinu, dobi i zdravstvenom stanju životinje i u pravilu se javlja u dva oblika: akutni i kroni ni. LD50 vrijednost za aflatoksin u tovnih pili a iznosi 2,1 mg/kg. U tovnih pili a opisani su: smanjena tjelesna težina i unos hrane te pojava makroskopskih i histoloških lezija u jetri. U akutnim otrovanjima nastaju depresija, ikterus, hemoragije, ataksije te uginu e unutar tjedan-dva. Kroni ni oblik karakteriziraju nespecifi ni slabiji proizvodni rezultati, a nastaje primjerice pri unosu hrane kontaminirane s 0,5 do 2,5 mg/kg AFB1 u trajanju od mjesec dana. U kokoši nesilica hrana kontaminirana s 1-5 mg/kg može dovesti do smanjene proizvodnje jaja, masne jetre i promjene nekih biokemijskih parametara. Prema istraživanju Jacobsona i Wisemana (1974.) unos 100-400 μg/kg AFB1 hranom rezultira pojavom rezidua AFB1 u jajima u koncentraciji od 0,2-3,3 μg/kg (Leeson i sur., 1995.). Prema istraživanju Fareeda i sur. (2014.) aflatoksin je dokazan u 80,64% ispitanih sirovina (kukuruz, brašno od suncokreta, pamuka i kukuruza) i hrane za perad podrijetlom iz Pakistana. Najve a koli ina mikotoksina (110 μg/kg) prona ena je u uzorcima kukuruza. Prema rezultatima istraživanja u estalosti aflatoksina u hrani za životinje i sirovinama podrijetlom iz zemalja Europske Unije, najve ekoli ine aflatoksina u hrani za životinje iznose 80 μg/kg, a kontaminirano je bilo do 37% uzoraka. U sirovinama i krmivima prisutnost mikotoksina zabilježena je u ak 100% uzoraka s maksimalnim koli inama od 103 μg/kg (Vlachou i sur., 2004.; Martins i sur., 2007.; Martins i sur., 2008.; Griessler i sur., 2010.; Tabuc i sur., 2011.; Grajewski i sur., 2012.; Ibáñez-Vea i sur., 2012.b; Rodrigues i Naehrer, 2012.; Streit i sur., 2012.; Zachariasova i sur., 2014.). Prema istraživanju Pleadin i sur. (2014.) aflatoksin B1 dokazan je u uzorcima kukuruza podrijetlom iz podru ja RH u kojima su 2013. godine dokazane povišene vrijednosti aflatoksina M1 u mlijeku (Bilandži i sur., 2014.) u prosje noj vrijednosti od 81 μg/kg i najve oj vrijednosti od 2072 μg/kg (Pleadin i sur., 2014.).

Ohratoksin A (OTA) proizvode plijesni iz roda Aspergillus (A. ochraceus, A. melleus, A. astianus, A. sulphurues, A. niger, A. carbonarium, A. albertensis, A, auricomus, A. wentii) te plijesan Penicillium verrucosum (a rje e plijesni P. nordicum, P. viridicatum i P. aurantiogriseum). Uz ohratoksin A opisani su još i ohratoksin B (deklorinirani oblik OTA), ohratoksin C (etilirani oblik OTA) te etiri derivata. Ohratoksini se proizvode pri širokom rasponu temperatura i visokom udjelu vlage. Optimalni uvjeti za proizvodnju ohratoksina u plijesni Penicillium verrucosum su temperatura od 20 °C, pH od 6,0 do 7,0 uz minimalnu aktivnost vode od 0,86. Plijesan A. ochraceus raste pri temperaturama od 24 do 37 °C, proizvodi toksine pri 31 °C, pri pH od 3 do 10 te uz minimalnu aktivnost vode od 0,8. OTA je naj eš i i najtoksi niji predstavnik ove skupine toksina i može djelovati prvenstveno nefrotoksi no, a pri izrazito visokim dozama i teratogeno, embriotoksi no,imunosupresivno i karcinogeno. Dokazano je da uzrokuje


nastanak tumora, stvara DNA adukte i kromosomske abe-racije u bubrezima. Povezuje se s nastankom endemske nefropatije u ljudi i izoliran je u velikom broj slu ajeva iz seruma ljudi u koncentracijama do 2 μg/kg. Prema klasifikaciji IARC spadaju u skupinu 2b (potencijalni karcinogeni u ljudi). Procijenjeno je da je najve a dopuštena koli ina OTA u hrani 5 ng/kg tjelesne mase dnevno (IARC, 1993.; Wyatt, 2005.; Reddy i Bhoola, 2010.). Od životinja, svinje su najosjetljive (nefropatija). LD50vrijednost OTA u peradi iznosi od 0,5 mg/kg tjelesne težine u pa i a, 2,1-3,9 u pili a te 4,6-7,8 u puri a. Koli ine OTA u hrani za perad u rasponu od 0,3-16,0 mg/kg mogu uzrokovati intoksikaciju u tovnih pili a, nesilica i purana sa simptomima slabog rasta, smanjene u inkovitosti hrane, pove ane konzumacije vode i pove ane koli ine fecesa. U kokoši nesilica javlja se i slabija proizvodnja jaja kao i pojava mrlja na ljusci jajeta. Patoanatomski, promjene su uglavnom vidljive u bubrezima. Zbog relativne u estalosti u hrani dugotrajni unos kontaminirane hrane može rezultirati pojavom rezidua u jajima, organima i mesu peradi (Leeson i sur., 1995.), što se smatra problemom javnog zdravstva. Stoga su u hrani za ljude zakonskom regulativom EC 1881/2006. propisane najve e dopuštene koli ine aflatoksina u razli itim vrstama hrane (raspon od 0,5-10,0 μg/kg). Za hranu za životinje propisane su smjernice te je najve apreporu ena koli ina u žitaricama i proizvodima od žitarica 0,25 mg/kg, dok je u gotovoj i dopunskoj hrani za svinje preporu ena najviša koli ina od 0,05 mg/kg, a za perad 0,1 mg/kg (2006/576/EC) (tablica 1.). Identificirani su u razli itim žitaricama (pšenica, pšeni nemekinje, zob), hrani za životinje, za inima, vo u, vinu, aju,kavi i pivu. Otkriveni su i u mesu, mlijeku i prera evinama (Pfohl-Leszkowicz i Manderville, 2007.). Prema istraživanju Fareeda i sur. (2014.) ohratoksin je dokazan u 63,15% ispitanih uzoraka hrane te u 29,17% sirovina (naj eš ekukuruzno brašno) podrijetlom iz Pakistana, ali u koli-inama unutar dozvoljenih granica propisanih u zemljama

EU. U Italiji OTA je dokazan u svim ispitanim uzorcima hrane za perad u rasponu od 0,04 do 6,50 μg/kg (Schiavone i sur., 2008.). U Španjolskoj OTA je otkriven u 33% uzoraka hrane i sirovina (Jaimez i sur., 2004.). U Hrvatskoj OTA je otkriven u 39% uzoraka kukuruza (Domijan i sur., 2005.). Analizom dostupnih rezultata o u estalosti OTA u hrani i sirovinama podrijetlom iz EU prisutnost OTA u hrani dokazana je u 2%-87% ispitanih uzoraka u rasponu od 0,10 do 760,00 μg/kg. U sirovinama OTA je otkriven u 22%-70% ispitanih uzoraka u rasponu od 4,00 do 2.248,00 μg/kg (Jaimez i sur., 2004.; Domijan i sur., 2005.; Griessler i sur., 2010.; Monbaliu i sur., 2010.; Almeida i sur., 2011.; Tabuc i sur., 2011.; Grajewski i sur., 2012.; Ibáñez-Vea i sur., 2012.a; Rodrigues i Naehrer, 2012.; Streit i sur., 2012.; Zachariasova i sur., 2014.).

Zearalenon (ZON) je nesteroidni estrogeni mikotoksin koji proizvode plijesni roda Fusarium i to prvenstveno F. roseum (F. graminearum, F. gibbosum, F. culmorum, F. equiseti), F. tricinctum, F. sporotirchioides, F. oxysporum i F. mo-

niliforme. Naj eš e su kontaminirane žitarice (kukuruz, pšenica, je am, soja i zob) te u velikom broju slu ajevadolazi u kombinaciji s drugim mikotoksinima. Optimalni uvjeti za proizvodnju su visoka vlaga i niske temperature zraka (10-15 °C). Tijekom pohrane žitarica u nepovoljnim uvjetima (vlaga kukuruza iznad 22%) dolazi do pove anjakoli ine toksina. Povezuje se s nekim bolestima u ljudi i hiperestrogenizmom u životinja, a zabilježeni su neplodnost, oticanje mamarnih žlijezda, smanjena proizvodnja mlijeka, vaginitis i vaginalne sekrecije. Svinje se smatraju naj-osjetljivijima te su opisani slu ajevi gdje su u kon-centracijama od 0,5-8,0 mg/kg uo eni nate enost uterusa i vulve, prolaps vagine, smrt embrija i smanjenje veli ine legla. Perad se u pravilu smatra otpornom na njegovo estrogeno djelovanje te koli ine toksina koje se nalaze u hrani za životinje uglavnom ne e uzrokovati zna ajnijenepovoljne u inke za zdravlje peradi. Dodatno zna enje prisustva ZON-a u hrani za životinje je opasnost postojanja rezidua u tkivima, mlijeku i jajima. Kako ni pri visokim dozama (od 100-800 mg/kg) nisu uo ene promjene u proizvodnim karakteristikama i zdrastvenom stanju peradi, nalaz ZON-a u hrani za životinje u pravilu predstavlja „biomarker“ za druge fuzarijske mikotoksine (Leeson i sur., 1995.; Agag, 2004.; EFSA, 2004.; Binder, 2007.; Bryden, 2012.). U hrani za životinje ZON je naveden u smjericama s preporu enim najve im koli inama toksina (tablica 1.). U estalost zearalenona dokazana je u 8%-88% ispitanih uzoraka u rasponu koncentracija u hrani za životinje od 0,50-387,00 μg/kg i sirovinama u rasponu od 0,40-2.939,00 μg/kg (Jaimez i sur., 2004.; Domijan i sur., 2005.; Labuda i sur., 2005.; Martins i sur., 2008.; Manova i Mladenova, 2009.; Goertz i sur., 2010.; Griessler i sur., 2010.; Monbaliu i sur., 2010.; Almeida i sur., 2011.; Banu i sur., 2011.; Dorn i sur., 2011.; Tabuc i sur., 2011.; Grajewski i sur., 2012.; Ibáñez-Vea i sur., 2012.b; Pleadin i sur., 2012.; Rodrigues i Naehrer, 2012.; Pleadin i sur., 2013.; Zachariasova i sur., 2014.).

Fumonizini (FB) su metaboliti plijesni roda Fusarium (F. verticilioides (moniliforme), F. proliferatum) i Alternaria te plijesni Aspergillus niger. Uz najrašireniji i najtoksi niji fumonizin B1 opisani su i fumonizin B2 (FB2), fumonizin B3 (FB3), fumonizin B4 (FB4), fumonizin A1 (FA1) i fumonizin A2 (FA2). S obzirom na toksi nost u ljudi (hepatotoksi nost, nefrotoksi nost, neurotoksi nost i karci-nogenost) svrstani su prema klasifikaciji IARC u skupinu 2B potencijalnih karcinogena za ljude (IARC, 1993.). Naj eš ekontaminiraju kukuruz i proizvode od kukuruza te hranu za ljude, a esto su istodobno prisutni u hrani s drugim mikotoksinima stvaraju i aditivini i singergisti ni toksi niu inak. U životinja je zabilježen hepatotoksi ni, nefro-toksi ni, neurotoksi ni i karcinogeni u inak, a povezuju se s pojavom leukoencefalomalacije u konja te nastankom edema plu a u svinja. Smatraju se izrazito toksi nim za konje i svinje, dok u peradi i razina od 80 mg/kg fumonizina u hrani uglavnom ne e izazvati promjene u proizvodnim


karakteristikama peradi. Pri konzumaciji hrane konta-minirane ve im koli inama fumonizina uo eni su smanjeni prirast i konverzija hrane, pove ana težina jetre, bubrega i guštera e, pove ane razine aspartat aminotransferaze u serumu te pad razine alkalne fosfataze, kolesterola i hemoglobina. Me utim, u prisustvu drugih mikotoksina kao

što su trikotecenski mikotoksini dokazane su aditivne toksi ne interakcije koje su rezultirale slabijim proizvodnim rezultatima i pojavom gore navedenih simptoma (Leeson i sur., 1995.). U hrani za životinje fumonizini (FB1+FB2) su navedeni u smjericama s preporu enim najve im koli inama toksina (tablica 1.).

Tablica 1. Preporu ene najviše vrijednosti deoksinivalenola (DON), zearalenona (ZON), ohratoksina A (OTA) i fumonizina B1+B2 u hrani za životinje (2006/576/EC)

Mikotoksin Hrana za životinje Preporu ne razine (mg/kg)

DON

Sirovine Žitarice i proizvodi od žitarica osim nusproizvoda kukuruza 8 Nusproizvodi kukuruza 12 Dopunska i potpuna hrana za životinje osim: 5 Dopunska i potpuna hrana za svinje 0,9 Dopunska i potpuna hrana za telad (<4 mjeseca), janjad i jarad 2

ZON

Sirovine Žitarice i proizvodi od žitarica osim nusproizvoda kukuruza 2 Nusproizvodi kukuruza 3 Dopunska i potpuna hrana za životinje Dopunska i potpuna hrana za prasad i prvopraskinje (mlade krma e) 0,1 Dopunska i potpuna hrana za krma e i svinje u tovu 0,25 Dopunska i potpuna hrana za telad, muzne krave i ovce (uklju uju i janjad) i koze (uklju uju ijarad) 0,5

OTA

Sirovine Žitarice i proizvodi od žitarica 0,25 Dopunska i potpuna hrana za životinje Dopunska i potpuna hrana za svinje 0,05 Dopunska i potpuna hrana za perad 0,1

FB1+FB2

Sirovine Kukuruz i proizvodi od kukuruza 60 Dopunska i potpuna hrana za: Svinje, konje (Equidae), ze eve, ku ne ljubimce 5 Ribe 10Perad, telad (<4 mjeseca), janjad i jarad 20 Odrasli preživa i (>4 mjeseca) i životinje za proizvodnju krzna 50

Table 1. Guidance values for deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZON), ochratoxin A (OTA) and fumonisins (FB1+FB2) in feed (2006/576/EC)

Mycotoxin Product intended for animal feed Guidance value (mg/kg)

DON

Feed materials Cereals and cereal products with the exception of maize by-products 8 Maize by-products 12 Complementary and complete feedingstuffs with the exception of: 5 complementary and complete feedingstuffs for pigs 0.9 complementary and complete feedingstuffs for calves (<4 months), lambs and kids 2


Mycotoxin Product intended for animal feed Guidance value (mg/kg)

ZON

Feed materials Cereals and cereal products with the exception of maize by-products 2 Maize by-products 3Complementary and complete feedingstuffs Complementary and complete feedingstuffs for piglets and gilts (young sows) 0.1 Complementary and complete feedingstuffs for sows and fattening pigs 0.25 Complementary and complete feedingstuffs for calves, dairy cattle, sheep (including lamb) andgoats (including kids) 0.5

OTA

Feed materials Cereals and cereal products 0.25 Complementary and complete feedingstuffs Complementary and complete feedingstuffs for pigs 0.05 Complementary and complete feedingstuffs for poultry 0.1

FB1+FB2

Feed materials Maize and maize products 60 Complementary and complete feedingstuffs for: pigs, horses (Equidae), rabbits and pet animals 5 fish 10poultry, calves (<4 months), lambs and kids 20 adult ruminants (>4 months) and mink 50

U istraživanju u estalosti fumonizina u hrani i hrani za životinje prisutnost fumonizina u hrani dokazana je u 38%-92% ispitanih uzoraka u rasponu od 36,00-9.409,00 μg/kg. U sirovinama zabilježena je prisutnost u 0-100% ispitanih uzoraka u rasponu od 10,00-36.390,00 μg/kg. Izrazito vi-soke vrijednosti fumonizina zabilježili su Griessler i sur. (2010.) pri analizi uzoraka podrijetlom iz Portugala, Špa-njolske, Italije, Gr ke i Cipra. Od ukupno 416 ispitanih uzoraka prosje na koncentracija fumonizina u gotovoj hrani iznosila je 1.411,00 μg/kg, dok su u kukuruzu (podrijetlom iz Italije) dokazane i koli ine od 36.390,00 μg/kg. Navedene visoke koncentracije nisu prona ene u drugim žitaricama (npr. je am i pšenica) (Domijan i sur., 2005.; Labuda i sur., 2005.; Martins i sur., 2008.; Manova i Mladenova, 2009.; Goertz i sur., 2010.; Griessler i sur., 2010.; Monbaliu i sur., 2010.; Almeida i sur., 2011.; Dorn i sur., 2011.; Tabuc i sur., 2011.; Grajewski i sur., 2012.; Rodrigues i Naehrer, 2012.; Pleadin i sur., 2013.; Zachariasova i sur., 2014.).

Trikotecenski mikotoksini skupina su od oko 200 razli itih metabolita plijesni koju karakterizira osnovna tetracikli naseskviterpenoidna struktura molekule. Dijele se na makro-cikli ke i nemakrocikli ke, a najpoznatiji predstavnici su T-2 toksin, diacetoksiscirpenol (DAS) i deoksinivalenol.

T-2 toksin i DAS su molekule niske molekularne težine vrlo otporne na razli ite uvjete okoliša (inaktiviraju se tek pri temperaturama od 200 do 210 °C u trajanju od 30-40 minuta

ili djelovanjem nekih bakterija i plijesni). T-2 toksin pro-cesom biotransformacije iz najtoksi nijeg spoja prelazi u uglavnom slabije toksi ne molekule HT-2 toksin i T-2 tetraol, a DAS u monoacetoksiscirpenol. Proizvode ih plijesni roda Fusarium (F. acuminaturm, F. nivale, F. oxysporum, F. poae, F. sporotrichoides, F. solani) te plijesni rodova Trichoderma, Myrothecium i druge. Prisutnost T-2/HT-2 toksina opisana je u cijelom svijetu, a proizvodnja toksina je najve a u širokom rasponu temperatura (od 0 do 32 °C, optimalno pri 5-15 °C), u hrani s udjelom vlage od 13%-22%, u toplim i vlažnim klimatskim uvjetima i pri ošte enju zrna. Naj eš e je izdvojen iz kukuruza, pšenice, je ma, zobi, raži i gotove hrane. Toksi ni u inak T-2 toksina i srodnih trikotecena (HT-2 toksin, DAS) ovisi o na inu unosa toksina u organizam, trajanju izlaganja toksinu, dozi, dobi, spolu i zdravstvenom stanju životinje te prisutnosti drugih plijesni i/ili mikotoksina. LD50 vrijednost u pili aiznosi 4,97 mg/kg te ak 7,22 mg/kg za HT-2 toksin. LD50

vrijednost za DAS u tovnih pili a iznosi 2,00-5,90 mg/kg. Prema istraživanju Hoerra i sur. (1982.) hranidba pili ahranom kontaminiranom s 10 mg/kg T-2 toksina u trajanju od tjedan dana uzrokuje uginu e životinja. U peradi je opi-san genotoksi ni, citotoksi ni, neurotoksi ni, imunomodu-lacijski u inak, u inak na stanice probavnog sustava i jetre kao i slabija proizvodnost u uzgoju životinja. Pritom se javljaju smanjeni unos hrane, inhibicija rasta, pojava lezija u ustima, depigmentacija kože nogu, nakostriješenost perja i neurološki simptomi. U kokoši nesilica smanjena je pro-


izvodnja jaja (tanka ljuska jaja), nesivost i unos hrane, javlja se cijanoza krijeste te je patoanatomski karakteristi an nalaz nekroti nih lezija u ustima, voljci te sluznici crijeva i jetri (Leeson i sur., 1995.; JECFA, 2001.; Hoerr, 2003.; Sokolovi i sur., 2008.). Za razliku od deoksinivalenola, T-2 toksin i DAS rje e su prisutni u hrani i hrani za životinje. U Hrvatskoj T-2 toksin je tijekom petnaestogodišnjeg razdoblja (1989.-2004.) otkriven u 16,8%-18% ispitanih uzoraka hrane za perad u rasponu od 0,10 do 0,70 mg/kg. U istom razdoblju diacetoksiscirpenol (DAS) je otkriven u 27,60% uzoraka u rasponu od 0,10 do 1,20 mg/kg, a deoksinivalenol (DON) u 41,2% ispitanih uzorka u rasponu od 0,05 do 3,44 mg/kg (Leeson i sur., 1995.; Brlek i sur., 1999.; Pavi i i sur., 1999.; Pepeljnjak i Šegvi , 2004.; Sokolovi i Šimpraga, 2006.; Sokolovi i sur., 2008.). Prema novijim istra-živanjima u estalost T-2 toksina i njegovog metabolita HT-2 prili no varira. Na temelju dostupnih rezultata istraživanja o u estalosti mikotoksina u hrani podrijetlom iz EU trikoteceni su otkriveni u 9%-90% ispitanih uzoraka hrane za životinje u koncentracijama od 1,00-173,00 μg/kg. U sirovinama T-2/HT-2 toksini otkriveni su u 8%-33% ispi-tanih uzoraka u rasponu koncentracija od 35,00-533,00 μg/kg. Vrlo malen broj istraživanja ukazuje na prisutnost DAS-a te je zabilježena njegova prisutnost u 25% ispitanih uzoraka sirovina, pri em je najve a otkrivena koncentracija iznosila svega 2 μg/kg (Labuda i sur., 2005.; Griessler i sur., 2010.; Monbaliu i sur., 2010.; Ibáñez-Vea i sur., 2012.a; Streit i sur., 2012.; Pleadin i sur., 2013.; Zachariasova i sur., 2014.). Deoksinivalenol (DON) naj eš e proizvodi plijesan Fu-sarium graminearum i F. culmorum koja je široko raspro-stranjena u polju te esto kontaminira žitarice. DON se u prirodi esto pojavljuje zajedno sa svojim acetilnim derivatima 3-acetil-deoksinivalenol (3-Ac-DON) i 15-acetil-deoksinivalneol (15-Ac-DON). Smatra se da je najve adopuštena koli ina u ljudi 1,00 μg/kg tjelesne težine na dan te da su akutne referentne doze za DON, 3-Ac-DON i 15-Ac-DON 8,00 μg/kg tjelesne težine. U pravilu DON se

smatra najmanje toksi nim u peradi, iako je istodobno jedan od naju estalijih mikotoksina u sirovinama (pšenica, je am, kukuruz) i hrani za životinje. LD50 vrijednost za deoksini-valenol u tovnih pili a iznosi 140 mg/kg. Prema dosa-dašnjim istraživanjima smatrano je da tek doza od 16 mg/kg tjelesne težine u hrani može utjacati na rast peradi (Eriksen i Pettersson, 2004.) te je op e prihva ena vrijednost prep-oru ene najve e koncentracije DON-a od 5 mg/kg u hrani za perad. Me utim, prema novijim istraživanjima smatra se da i koncentracija od 3,5 mg/kg DON-a pri dugotrajnoj izlo-ženosti može uzrokovati promjene u sluznici tankog crijeva s posljedi nom slabijom apsorpcijom hranjivih tvari. Tak-o er je uo eno da dolazi do neke vrste prilagodbe pro-bavnog sustava (manja apsorpcija mikotoksina u lumenu crijeva i transport u cirkulaciju te umjerena detoksifikacija DON-a u crijevima) (Awad i sur., 2006.; Girgis i sur., 2010.; Yunus i sur., 2012.). Ukratko, toksi ni u inak u svinja karakterizira imunosupresija, odbijanje hrane i povra anje uz slabiji prirast, dok su u peradi dokazani odbijanje hrane i promjene u probavnom sustavu. U hrani za životinje DON je naveden u smjernicama te su preporu ene najve e koli ine toksina za koje se smatra da ne e toksi no djelovati (tablica 1,). U istraživanju u estalosti DON-a i njegovih derivata u zemaljama EU dokazana je prisutnost toksina u 6%-63% uzoraka hrane u rasponu od 64,00-9.528,00 μg/kg. Istodobno, sirovine su bile konta-minirane u rasponu od 6%-100% ispitanih uzoraka u rasponu od 19,00-49.000,00 μg/kg. Najve e koncentracije mikotoksina u hrani zabilježene su u hrani za svinje, pšenici i kukuruzu, pri em je 75% ispitanih uzoraka bilo kontami-nirano s nekoliko mikotoksina. Najve e koli ine DON-a zabilježene su u je mu (14.137 μg/kg) i pšenici (49.000 μg/kg) iz uzoraka podrijetlom iz Austrije (Labuda i sur., 2005.; Sokolovic i Šimpraga, 2006.; Martins i sur., 2008.; Goertz i sur., 2010.; Griessler i sur., 2010.; Monbaliu i sur., 2010.; Almeida i sur., 2011.; Banu i sur., 2011.; Dorn i sur., 2011.; Tabuc i sur., 2011.; Grajewski i sur., 2012; Ibáñez-Vea i sur., 2012.a; Pleadin i sur., 2012.; Rodrigues i Naehrer, 2012.; Pleadin i sur., 2013.; Zachariasova i sur., 2014.).

Tablica 2. Obavijesti o pojavnosti mikotoksina u hrani i hrani za životinje (RASFF, 2014., 2015.)

Mikotoksin 2010. 2011. 2012. 2013. 2014.

Aflatoksini 649 585 484 341 338

DON 2 11 4 8 6

FB 3 4 4 7 2

OTA 34 35 32 54 37

Patulin 0 0 0 0 0

ZON 0 0 0 0 0

Ukupno 688 635 528 410 383 DON – deoksinivalenol; FB – fumonizini; OTA – ohratoksin A, ZON – zearalenon


Table 2. Notifications on mycotoxins in food and feed (RASFF, 2014, 2015)

Mycotoxin 2010 2011 2012 2013 2014 Aflatoxins 649 585 484 341 338 DON 2 11 4 8 6 FB 3 4 4 7 2 OTA 34 35 32 54 37 Patulin 0 0 0 0 0 ZON 0 0 0 0 0 Total 688 635 528 410 383 DON – deoxynivalenol; FB – fumonisins; OTA – ochratoxin A, ZON – zearalenone

Patulin (PAT) proizvodi nekoliko vrsta plijesni iz rodova Aspergillus (A. clavatus, A. giganteus, A. longivesica), Penicillium (P. carneum, P. clavigerum, P. concentricum, P. coprobium, P. dipodomyicola, P. expansum, P. glandicola, P. gladioli, P. griseofulvum, P. marinum, P. paneum, P. sclerotigenum, P. vulpinum) te plijesni Paecylomyces saturatus i Byssochlamys nivea. Toksin je est kontaminant vo a i proizvoda od vo a (naj eš e jabuka) u koncen-tracijama od 45,00 do 1.000,00 mg/kg. Uz navedeno dokazana je prisutnost i u povr u, žitaricama i silaži. Prema klasifikaciji IARC svrstan je u skupinu 3 karcinogena, a dokazano je da uzrokuje imune, neurološke, probavne pro-mjene te tumore kože (IARC, 1993.; Frisvad i sur., 2004.; Varga i sur., 2007.; Puel i sur., 2010.). Zbog navedenog njegova prisutnost u hrani regulirana je u mnogo zemalja svijeta te u EU najve a dopuštena koli ina u vo nimsokovima i proizvodima od vo a iznosi 50 μg/L, a u hrani za djecu i vrstim proizvodima od jabuke iznosi 25 μg/L (EC, 1425/2003.). Mikotoksikoza u životinja opisana je u goveda gdje je u jednom slu aju intoksikacije u Japanu patulin izdvojen iz hrane, a životinje su o itovale simptome bolesti živ anog sustava, hemoragije u mozgu i uginu e više od sto životinja (Hori i sur., 1954.; Ukai i sur., 1954.; Hori i Yamamoto, 1953.; Yamamoto, 1954.a,b). Sli an slu aj zabi-lježen je u Francuskoj, a uklju ivao je i edem plu a i kongestiju u krava koje su hranjene gotovom smjesom kontaminiranom plijesni A. clavatus (Jacquet i sur., 1963.). Ista vrsta plijesni prona ena je i u slu ajevima intoksikacije goveda u Njema koj (Schultz, 1968.; Schultz i sur., 1969.). U vrlo malom broju slu ajeva izdvojen je iz hrane za perad. U pravilu se smatra da u peradi nije toksi an, ali su uo enisimptomi vodenastog proljeva, ascitesa, hemoragije u probavnom sustavu i supresija rasta u kombinaciji s drugim toksinima. U kokoši nesilica uo ene su promjene u obliku jaja i manja koli ina kalcija u ljuski jaja. Zabilježena je LD50vrijednost u pili a koja iznosi 170 mg/kg/peroralno. Teži simptomi (3-6-puta toksi niji) su uo eni pri unosu toksina intravenskim, intraperitonejskim ili subkutanim putem, a opisani su: agitacija, konvulzije, dispneja, kongestija i edem plu a, ulceracije, hiperemija i distenzija probavnog sustava. U istraživanju subkroni nog u inka patulina (oralna doza od 100 μg svaki drugi dan u trajanju od mjesec dana) dokazani su poreme aji u probavnom sustavu i u funkciji bubrega.

Kao i u slu aju diacetoksiscirpenola, pri njegovom otkri usmatralo se da patulin ima antibiotsku sposobnost, ali zbog brojnih nuspojava i toksi nog djelovanja u ljudi i životinja pokazao se neuspješnim (Lovett, 1972.; Ciegler i sur., 1977.; Devaraj i sur., 1987.; Abdelhamid i Dorra, 1990., 1993; JECFA, 1998.; Puel i sur., 2010). Prema bazi podataka sustava RASFF, patulin je dokazan u 17 slu ajeva u razdoblju od 2005. do 2015. godine i to u soku od jabuke, soku od grejpa, soku od mrkve, pireu od jabuka i hrani za djecu (RASFF, 2015.). Analizom gore navedenih istraživanja o u estalosti miko-toksina (aflatoksina, zearalenona, ohratoksina A, fumoni-zina, T-2/TH-2 toksina, deoksinivalenola, diacetoksiscir-penola i patulina) gdje je pretraženo više od 20.000 uzoraka sirovina i gotove hrane za životinje (oko 9.500 uzoraka gotove hrane i 10.500 uzoraka sirovina) tijekom proteklih deset godana dokazana je prisutnost barem jednog miko-toksina, a vrlo esto je istodobno bilo prisutno više mi-kotoksina. Prosje na u estalost barem jednog mikotoksina iznosila je od 10,67% do 74,15% ispitanih uzoraka hrane i sirovina, pri em se je prosje ni raspon u estalosti barem jednog mikotoksina kretao od 14,23 do 5.930,48 μg/kg. Sirovine su naj eš e pretraživane na prisutnost zearalenona i deoksinivalenola, a najviše koli ine mikotoksina u sirovi-nama su bile za fumonizin. Od hrane, ve ina uzoraka bila je analizirana na prisutnost aflatoksina, a znatno manje na ostale mikotoksine, pri em su najviše koncentracije miko-toksina u hrani bile za fumonizin i deoksinivalenol. Rezultati ovih istraživanja su prili no heterogeni, jer nema dovoljno podataka o na inu uzimanja i pripreme uzoraka, a ponekad ni o vrsti uzorka. Nadalje, u istraživanjima su korištene razli ite metode (imunoenzimski testovi, kromatografija), što onemogu ava to nu procjenu u estalosti mikotoksina. Navedeno bi bilo mogu e tek primjenom programa koji bi s obzirom na vrstu uzorka i postupak i u estalost uzorkovanja, uporabu inter-laboratorijski validiranih metoda i analizom reprezentativnog broja uzoraka.

Zakonski propisi i smjernice. Obvezni zakonski propisi o najve im dopuštenim koli inama mikotoksina u hrani za životinje propisani su za AFB1 (2002/32/EC), dok su smjer-nice propisane za deoksinivalenol, zearalenon, fumonizin i


ohratoksin A (2006/576/EC). Razina aflatoksina B1 pro-pisana je propisom Europskog Parlamenta iz razloga što AFB1 u hrani za životinje redovito rezultira prisutnoš uAFM1 u mlijeku i to u koli inama koje se smatraju opasnima za zdravlje ljudi. Najve e dopuštene koli ine AFB1 u hrani za životinje (govedo, ovce i koze (osim za životinje u laktaciji, telad i janjad) i odraslu perad) te u dopunskoj hrani za goveda, ovce i koze (osim za životinje u laktaciji, telad i janjad) iznose 0,02 mg/kg. U hrani za telad, janjad, pili e i životinje za proizvodnju mlijeka dozvoljena je najve a koli ina AFB1 od 0,005 mg/kg. U ostalim potpunim gotovim vrstama hrane za životinje dozvoljeno je 0,001 mg/kg, a u ostalim dopunskim vrstama hrane za životinje 0,005 mg/kg.

Sustav obavještavanja RASFF Uz navedeni velik broj istraživanja u estalosti mikotoksina u hrani za životinje u zemljama Europske Unije uspostavljen je i sustav RASFF (engl. Rapid Alert System for Food and Feed) koji služi za pravodobno informiranje o pojavnosti kontaminanata u analiziranim uzorcima hrane i stvaranje baze podataka o u estalosti istih. Navedene obavijesti obra-uju se u obliku godišnjih izvješ a te je trenutno dostupno

izvješ e za 2013. godinu. Prema navedenom izvješ u, tijekom 2013. godine bilo je 37 obavijesti o nalazu mikotoksina u sirovinama, hrani i hrani za životinje, od ega je devet bilo zbog prisutnosti afla-toksina u orašastim proizvodima razli itog podrijetla, dok je 21 bila zbog nalaza mikotoksina u kukuruzu podrijetlom iz zemalja jugoisto ne Europe (Bugarska, Rumunjska, Srbija, Ukrajina, Ma arska, Španjolska, Slova ka Republika, Gr kai Italija) u kojima je tijekom 2012. g. zabilježeno razdoblje jakih suša te pove ana u estalost aflatoksina (RASFF, 2014.). Tijekom 2014. godine bilo je 338 notifikacija o prisutnosti mikotoksina u hrani. Od 26 obavijesti vezanih za kategoriju hrane za životinje 42,3% odnosile su se na kukuruz. Prikaz obavijesti o pojavnosti mikotoksina u hrani i hrani za životinje u razdoblju od 2010. do 2014. prikazan je u tablici 2. U hrani za životinje najve i broj obavijesti odnosio se je na aflatoksin, što se objašnjava postojanjem zakonske regulative samo za navedeni toksin u hrani za životinje, dok za ostale mikotoksine postoje samo smjernice.

Zaklju ak

Prikazani rezultati nesumnjivo ukazuju na visoku prisutnost mikotoksina u hrani i hrani za životinje. Dodatni problem u slu aju mikotoksina predstavlja istodobna prisutnost (više) vrsta toksikogenih plijesni koje mogu proizvoditi više mikotoksina, kao i injenica da se gotova hrana kombinira od više vrsta sirovina od kojih svaka može biti potencijalno kontaminirana istim ili razli itim plijesnima i/ili miko-toksinima. Stoga je u hranidbi životinja posebnu pozornost potrebno usmjeriti na odabir kvalitetnih sirovina kako bi se umanjila izloženost životinja razli itim mikotoksinima koji bi mogli imati nepoželjan u inak na zdravlje životinja i proizvodne rezultate te posljedi no neizravno ugroziti i

zdravlje ljudi zbog pojave rezidua u proizvodima životinj-skog podrijetla. Uz navedeno, zaštita zdravlja ljudi podrazumijeva i druge pristupe uklju uju i i kontrolu hrane potencijalno kontaminirane mikotoksinima kao i podizanje razine znanja o zna enju mikotoksina i na inu smanjivanja rizika mikotoksina za ljude koji može nastati njihovim unosu putem hrane.

Literatura

ABDELHAMID, A. M., T. M. DORRA (1990): Study on effects of feeding laying hens on separate mycotoxins (aflatoxins, patulin, or citrinin)-contaminated diets on the egg quality and tissue constituents. Arch Tierernahr. 40(4), 305-316.

ABDELHAMID, A. M., T. M. DORRA (1993): Effect of feed-borne pollution with some mycotoxin combinations on broiler chickens. Arch Tierernahr. 44(1), 29-40.

AGAG, B. I. (2004): Mycotoxins in foods and feeds 3-zearalenone. Ass Univ Bull Environ Res. 7(2), 159-176.

ALMEIDA, I., H. M. MARTINS, S. SANTOS, J. M. COSTA, F. BERNARDO, (2011): Co-occurrence of mycotoxins in swine feed produced in Portugal. Mycotoxin Res. 27(3), 177-181.

AWAD W. A., J. BÖHM, E. RAZZAZI-FAZELI, K. GHAREEB, J. ZENTEK (2006). Effect of addition of a probiotic microorganism to broiler diets contaminated with deoxynivalenol on performance and histological alterations of intestinal villi of broiler chickens. Poult Sci. 85(6), 974-979.

BANU, I., I. APRODU, A. NICOLAU (2011): Occurrence of Fusarium mycotoxins (deoxynivalenol and zearalenone) in wheat and high fibre wheat bread in Eastern Romania. J Environ Prot Ecol. 12(2), 519-525.

BILANDŽI , N., . BOŽI , M. OKI , M. SEDAK, B. SOLOMUN KOLANOVI , I. VARENINA, Ž. CVETNI(2014): Assessment of aflatoxin M1 contamination in the milk of four dairy species in Croatia. Food Control. 43, 18-21.

BILANDŽI , N., I. VARENINA, B. SOLOMUN (2010): Aflatoxin M1 in raw milk in Croatia. Food Control. 21(9), 1279-1281.

BINDER, E. M., L. M. TAN, L. J. CHIN, J. HANDL, J. RICHARD (2007): Worldwide occurrence of mycotoxins in commodities, feeds and feed ingredients. Anim Feed Sci Technol. 137(3-4), 265-282.

BONDY, G. S., J. J. PESTKA (2003): Immunomodulation by fungal toxins. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 3(2), 109-143.

BOUTRIF, E., C. CANET (1998): Mycotoxin prevention and control: FAO programmes. Revue Med Vet. 149(6), 681-694.

BOZOGLU, F. (2009): Different mycotoxin inactivation application and their inactivation mechanisms. Proc Nat Sci Matica Srpska Novi Sad, 117, 27-35.

BRLEK, V., P. PAVI I , J. VEDRINA (1999): Prisutnost fuzarijskih plijesni i nekih njihovih mikotoksina u žitaricama namijenjenim hranidbi životinja. Krmiva 41, 195-199.

BRYDEN, W. L. (2012): Mycotoxin contamination of the feed supply chain: implications for animal productivity and feed security. Anim Feed Sci Tech. 173(1-2), 134-158.

BULLERMAN, L.B., A. BIANCHINI (2007). Stability of mycotoxins during food processing. Int J Food Microbiol. 119(1-2), 140-146.


CAST, COUNCIL FOR AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY (2003). Mycotoxins: Risks in Plant, Animal, and Human Systems. Task Force Report No. 139. Ames, IA.

CIEGLER, A. R., F. VERSONDER, L. K. JACKSON (1977): Production and biological activity of patulin and citrinin from Penicillium expansum. Appl Environ Microbiol. 33(4), 1004-1006.

COMMISSION DECISION 2002/657/EC on implementation Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (consolidated version 2004-01-10).

COMMISSION RECOMMENDATION 2006/576/EC on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding.

COMMISSION RECOMMENDATION 2013/165/EU on the presence of T-2 and HT-2 toxin in cereals and cereal products.

COMMISSION REGULATION (EC) No 1425/2003 of 11 August 2003 amending Regulation (EC) No 466/2001 as regards patulin (Text with EEA relevance). Official Journal L 203, 12/08/2003.

DECASTELLI, L., J. LAI, M. GRAMAGLIA, A. MONACO, C. NACHTMANN, F. OLDANO, M. RUFFIER, A. SEZIAN, C. BANDIROLA (2007): Aflatoxin occurrence in milk and feed in Northern Italy during 2004-2005. Food Control 18(10), 1263-1266.

DEVARAJ, H., R. E. SUSEELA, N. DEVARAJ (1986): Patulin toxicosis in chicks. Curr Sci 55, 998-999.

DIRECTIVE 2002/32/EC on undesirable substances in animal feed (consolidated version 2010-03-02).

DOMIJAN, A. M., M. PERAICA, Ž. JURJEVI , D. IVI , B. CVJETKOVI (2005): Fumonisin B1, fumonisin B2, zearalenone and ochratoxin A contamination of corn in Croatia. Food Addit Contam. 22(7), 677-680.

DORN, B., H. R. FORRER, E. JENNY, F. E. WETTSTEIN, T. D. BUCHELI, S. VOGELGSANG (2011): Fusarium species complex and mycotoxins in grain maize from maize hybrid trials and from grower's fields. J Appl Microbiol. 111(3), 693-706.

EFSA (2004): Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food Chain on a request from the Commission related to zearalenone as undesirable substance in animal feed. EFSA J. 89, 1-35.

ERIKSEN, G. S., H. PETTERSSON (2004): Toxicological evaluation of trichothecenes in animal feed. Anim Feed Sci Technol. 114(1-4), 205-239.

EUROPEAN COMMISSION. RASFF Portal. [(accessed on 08 March 2015)]. Dostupno na: https://webgate.ec.europa.eu/ /rasff-window/portal/.

FAREED, G., S. H. KHAN, M. A. ANJUM, N. AHMED (2014): Determination of aflatoxin and ochratoxin in poultry feed ingredients and finished feed in humid semi-tropical environment. J Adv Vet Anim Res. 1(4), 201-207.

FRISVAD, J. C., J. SMEDSGAARD, T. O. LARSEN, R. A. SAMSON (2004): Mycotoxins, drugs and other extrolites produced by species in Penicillium subgenus Penicillium. Stud Mycol. 49, 201-242.

GIRGIS, G. N., J. R. BARTA, M. BRASH, T. K. SMITH (2010): Morphological changes in the intestine of broiler breeder pullets fed diets naturally contaminated with Fusariummycotoxins with or without coccidial challenge. Avian Dis. 54(1), 67-73.

GOERTZ, A., S. ZUEHLKE, M. SPITELLER, U. STEINER, H. W. DEHNE, C. WAALWIJK, I. VRIES, E. C. OERKE (2010): Fusarium species and mycotoxin profiles on commercial maize hybrids in Germany. Eur J Plant Pathol. 128, 101-111.

GRAJEWSKI, J., A. B AJET-KOSICKA, M. TWARU EK, R. KOSICKI (2012): Occurrence of mycotoxins in Polish animal feed in years 2006-2009. J Anim Physiol Animal Nutr (Berl). 95(5), 870-7.

GRIESSLER, K., I. RODRIGUES, J. HANDL, U. HOFSTETTER (2010): Occurrence of mycotoxins in Southern Europe. World Mycotoxin J. 3(3), 301-309.

HOERR, F. J. (2003): Mycotoxicoses. U: SAIF YM, editor. Diseases of Poultry. 11th ed. Ames, Iowa, USA: Iowa State University Press; 1103-1132.

HOERR, F. J., W. W. CARLTON, B. YAGEN, A. Z. JOFFE (1982): Mycotoxicosis caused by either T-2 toxin or diacetoxyscirpenol in the diet of broiler chickens. Fund Appl Toxicol. 2(3), 121-124.

HORI, M., T. YAMAMOTO (1953): Studies on the chemical constituents of poisonous substances from Penicillium (Hori-Yamamoto strain). I Morphology and characters of the Penicillium separated. J Pharm Soc Jpn. 73, 1097.

HORI, M., T. YAMAMOTO, A. AZEWA, Y. MATSUKI, A. HAMAGUICHI, H. SORAOKA (1954): Studies on a fungus species isolated from the malt feed which caused mass death of cows. III Classification of the isolated fungus, mechanism of its toxin production, and chemical nature of the toxin. Jpn J Bacteriol. 9, 1105.

IARC (1993) International Agency for Research on Cancer. Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. Some Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents, Heterocyclic Amines and Mycotoxins. Lyon: IARC Press.

IBÁÑEZ-VEA, M., E. GONZÁLEZ-PEÑAS, E. LIZARRAGA, A. LÓPEZ DE CERAIN (2012b): Co-occurrence of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in barley from a northern region of Spain. Food Chem. 132(1), 35-42.

IBÁÑEZ-VEA, M., E. LIZARRAGA, E. GONZÁLEZ-PEÑAS, A. LÓPEZ DE CERAIN (2012a): Co-occurrence of type-A and type-B trichothecenes in barley from a northern region of Spain. Food Control 25(1), 81-88.

JACOBSON, W. C., H. G. WISEMAN (1974): The transmission of aflatoxin B1 into eggs. Poult Sci. 53(5), 1743-1745.

JACQUET, J., P. BOUTIBONNES, J. P. CICILE (1963): Observations sur la toxicite d' Aspergillus clavatus pour les animaux. Bull Acad Vet. 32, 119-207.

JAIMEZ, J., C. A. FENTE, C. M. FRANCO, A. CEPEDA, B. I. VAZQUEZ (2004): A survey on the fungal contamination and presence of ochratoxin A and zearalenone on Spanish feed and raw materials. J Sci Food Agric. 84(8), 832-840.

JECFA, Joint Expert Committee on Food Additives (2001): T-2 and HT-2 toxins. Monographs & Evaluations No. 47, 2001. Dostupno na: http://www.inchem.org/documents/jecfa/ /jecmono/v47je06.htm

JECFA, Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (1998): Position paper on patulin, 30th session, The Hague, The Netherlands, 9-13 March.

LABUDA, R., A. PARICH, E. VEKIRU, D. TANCINOVÁ (2005): Incidence of fumonisins, moniliformin and Fusariumspecies in poultry feed from Slovakia. Ann Agric Environ Med. 12(1), 81-86.


LABUDA, R., A. PARICH, F. BERTHILLER, D. TAN INOVÁ (2005): Incidence of trichothecenes and zearalenone in poultry feed mixtures from Slovakia. Int J Food Microbiol. 105(1), 19-25.

LEESON, S., G. DIAZ, J. D. SUMMERS (1995): Poultry Metabolic Disorders and Mycotoxins. Ontario, Canada: University Books.

LERDA, D. (2011): Mycotoxin Factsheet. JRC Technical Notes. https://ec.europa.eu/jrc/sites/default/files/Factsheet%20Mycotoxins_2.pdf.

LOVETT, J. (1972): Patulin toxicosis in poultry. Poult Sci. 51(6), 2097-2098.

MANOVA, R., R. MLADENOVA (2009): Incidence of zearalenone and fumonisins in Bulgarian cereal production. Food Control. 20(4), 362-365.

MARTINS, H. M., M. M. MENDES GUERRA, F. M. D'ALMEIDA BERNARDO (2007): Occurrence of aflatoxin B1 in dairy cow's feed over 10 years in Portugal (1995-2004). Rev Iberoam Micol. 24(1), 69-71.

MARTINS, H. M., M. MARQUES, I. ALMEIDA, M. M. GUERRA, F. BERNARDO (2008): Mycotoxins in feedstuffs in Portugal: an overview. Mycotoxin Res. 24(1), 19-23.

MILI EVI , D., R., M. ŠKRINJAR, T. BALTI (2010): Real and perceived risks for mycotoxin contamination in foods and feeds: challenges for food safety control. Toxins. 2, 572-592.

MONBALIU, S., C. VAN POUCKE, C. L. DETAVERNIER, F. D. R. DUMOULIN, M. VAN DE VELDE, E. SCHOETERS, S. VAN DYCK, O. AVERKIEVA, C. VAN PETEGHEM, S. DE SAEGER (2010): Occurrence of mycotoxins in feed as analyzed by a multi-mycotoxin LC-MS/MS method. J Agric Food Chem. 58(1), 66-71.

PATERSON, R. R. M., N. LIMA (2010): How will climate change affect mycotoxins in food? Food Res Int. 43(7), 1902-1914.

PAVI I , P., V. BRLEK, A. NEMANI (1999): U estalost fuzarijskih mikotoksina u krmnim smjesama: 1989-1998. Krmiva 41, 183-188.

PEPELJNJAK, S., M. ŠEGVI (2004): An overview of mycotoxins and toxigenic fungi in Croatia. U: Logrieco A, Visconti A, ur. An Overview on Toxigenic Fungi and Mycotoxins in Europe. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, str. 33-50.

PFOHL-LESZKOWICZ, A., R. MANDERVILLE (2007): Ochra-toxin A: an overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans. Mol Nutr Food Res. 51(1), 61-99.

PITT, J.I. (2000): Toxigenic fungi and mycotoxins. Br Med Bull. 56(1), 184-192.

PLEADIN, J. A. VULI , N. PERPI, M. ŠKRIVANKO, B. CAPEK, Ž. CVETNI (2014): Aflatoxin B1 occurrence in maize sampled from Croatian farms and feed factories during 2013. Food Control. 40, 286-291.

PLEADIN, J. J.VAH I , N. PERŠI, D. ŠEVELJ, K. MARKOV, J. FRECE (2013): Fusarium mycotoxin occurrence in cereals harvested from Croatian fields. Food Control. 32(1), 49-54.

PLEADIN, J., M. SOKOLOVI , N. PERŠI, M. ZADRAVEC, V. JAKI, A. VULI (2012): Contamination of maize with deoxynivalenol and zearalenone in Croatia. Food Control. 28(1), 94-98.

PUEL, O., P. GALTIER, I. P. OSWALD (2010): Biosynthesis and toxicological effects of patulin. Toxins (Basel). 2(4), 613-631.

RASFF (2014): The Rapid Alert System for Food and Feed. 2013. Annual Report. http://ec.europa.eu/food/safety/rasff/portal/ /index_en.htm.

REDDY, L., K. BHOOLA (2010): Ochratoxins – food contami-nants: impact on human health. Toxins (Basel). 2(4), 771-779.

RODRIGUES, I., K. NAEHRER (2012): Prevalence of mycotoxins in feedstuffs and feed surveyed worldwide in 2009 and 2010. Phytopathol Mediterr. 51(1), 175-192.

ROMER, T. (1990): Advances in mycotoxin analysis: making Fusarium. Feed Manag. 41, 30- 32.

SCHIAVONE, A., C. CRISTINA, G. LUIGI, P. LUISA, A. SARA, C. LAURA (2008): A survey on the occurrence of ochratoxin A in feeds and sera collected in conventional and organic poultry farms in Northern Italy. It J Anim Sci. 7(4), 495-503.

SCHULTZ, J. (1968): Zur Toxizität von Aspergillus clavatus aus Malzkeimen. Monatschr Veterinarmed. 23, 598.

SCHULTZ, J., R. MOTZ, M. SCHIFER, W. BAUMGART (1969): Experimentelle Untersuchungen zur Aspergillus clavatusVergiftung beim Rind. Monatschr Veterinarmed. 24, 14.

SOKOLOVIC, M., V. GARAJ-VRHOVAC, B. ŠIMPRAGA (2008): T-2 toxin: incidence and toxicity in poultry. Arh Hig Rada Toksikol. 59, 43-52.

SOKOLOVI M., B. ŠIMPRAGA (2006): Survey of trichothecene mycotoxins in grains and animal feed in Croatia by thin layer chromatography. Food Control. 17(9), 733-740.

SOLOMON, P. S. (2011): Assessing the mycotoxigenic threat of necrotrophic pathogens of wheat. Mycotoxin Res. 27(4), 231-237.

STREIT, E., G. SCHATZMAYR, P. TASSIS, E. TZIKA, D. MARIN, I. TARANU, C. TABUC, A. NICOLAU, I. APRODU, O. PUEL, I. P. OSWALD (2012): Current situation of mycotoxin contamination and co-occurrence in animal feed – focus on Europe. Toxins. 4(10), 788-803.

TABUC, C., I. TARANU, L. CALIN (2011): Survey of mould and mycotoxin contamination of cereals in south-eastern Romania in 2008-2010. Arch Zootech. 14(4), 25-38.

THE EUROPEAN COMMISSION. Commission recommendation of 17 August 2006 on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding. Off J Eur Union. 2006/576/EC).

THE EUROPEAN COMMISSION. Commission Regulation (EU) No 165/2010 of 26 February 2010 amending Regulation (EC) No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins. Off J Eur Union. 2010:L50/8–L50/12.

UKAI, T., Y. YAMAMOTO, T. YAMAMOTO (1954): Substance from a strain of Penicillium. II Culture method of Hori-Yamamoto strain and chemical structure of its poisonous substance. J Pharm Soc Jpn. 74, 450.

VARDON, P., C. MCLAUGHLIN, C. NARDINELLI (2003): Potential Economic Costs of Mycotoxins in the United States. U: Council for Agricultural Science and Technology (CAST). Mycotoxins: Risks in Plant, Animal, and Human Systems. Task Force Report No. 139: Ames, IA, 2003.

VARGA, J., M. DUE, J. C. FRISVAD, R. A. SAMSON (2007): Taxonomic revision of Aspergillus section Clavati based on molecular, morphological and physiological data. Stud Mycol. 59, 89-106.


VLACHOU, S., P. E. ZOIOPOULOS, E. H. DROSINOS (2004): Assessment of some hygienic parameters of animal feeds in Greece. Anim Feed Sci Technol. 117(3-4), 331-337.

WU, F. (2004): Mycotoxin risk assessment for the purpose of setting international regulatory standards. Environ Sci Technol. 38(15), 4049-4055.

WU, F. (2007): Measuring the economic impacts of Fusariumtoxins in animal feeds. Anim Feed Sci Tech. 137(3-4), 363-374.

WYATT, D. R (2005): Mycotoxin interactions. U: D.E. Diaz, (ur.), The Mycotoxin Blue Book: Nottingham University Press, Nottingham, str. 269-278.

YAMAMOTO, T. (1954a): Studies on the poison-producing mold isolated from dry malt. I Distribution, isolation, cultivation and formation of the toxic substance. J Pharm Soc Jpn. 74, 797.

YAMAMOTO, T. (1954b): Studies on the poison-producing mold isolated from dry malt. IV On the toxicity. J Pharm Soc Jpn. 74, 810.

YUNUS, A. W., A. BLAJET-KOSICKA, R. KOSICKI, M. Z. KHAN, H. REHMAN, J. BÖHM (2012): Deoxynivalenol as a contaminant of broiler feed: intestinal development, absorptive functionality, and metabolism of the mycotoxin. Poult Sci. 91(4), 852-861.

ZACHARIASOVA, M., Z. DZUMAN, Z. VEPRIKOVA, K. HAJKOVA, M. JIRU, M. VACLAVIKOVA, A. ZACHARIASOVA, M. POSPICHALOVA, M. FLORIAN., J. HAJSLOVA (2014): Occurrence of multiple mycotoxins in European feeding stuffs, assessment of dietary intake by farm animals. Anim Feed Sci Tech. 193, 124-140.

INCIDENCE OF MYCOTOXINS IN EU

Summary

Mycotoxins are secondary metabolites of microscopic filamentous moulds that cause intoxications in humans and animals. Intoxication mainly results from contaminated food intake or via other routes of exposure (inhalation or dermal route). For evaluation of the potential adverse effects of mycotoxins in humans and animals, it is necessary to understand the condition of their production, incidence, toxicity, biotransformation and possibility of inactivation in case when their occurrence is notavoidable. Besides the intoxications in animals, impairment of production results and reduced nutritive value of feed caused by mycotoxins, it is important to be aware of the possible presence of residues in food of animal origin because it can lead to intoxication in humans. A relatively low number of comparable data on the occurrence of mycotoxins in food and feed is a result of rather heterogeneous sampling procedures and analytical methodologies applied. It points to the necessity of continuous monitoring of mycological quality of feed by use of comparable and validated analytical methodology. It is the only way to ensure optimal production results in animal production systems and eventually food safety. This paper will summarize the incidence of mycotoxins that are considered most important and most frequent in the EU with respect to toxicity and intoxication in poultry.

Key words: mycotoxins, poultry, mycotoxicosis, moulds


FENOTIPSKA OBILJEŽJA KRIŽEVA KE KUKMASTE KOKOŠI

Marija Meštrovi 1, Zlatko Janje i 2, Dalibor Bedekovi 2, Gordana Duvnjak3

1 Visoko gospodarsko u ilište Križevci, Križevci, Hrvatska 2 Agronomski fakultet, Sveu ilište u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska 3 Hrvatska poljoprivredna agencija, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Križeva ka kukmasta kokoš nastala je u osamdesetim godinama 20. stolje a selekcijskim radom na doma im kokošima uzgajanim u Kalni kom prigorju, koje je karakterizirala osrednja kukmica te srednje teško tijelo. Te su kokoši planski križane s pijetlovima pasmine Orpington. Do današnjeg vremena nisu provedena znanstvena istraživanja kako bi se dobile spoznaje o njihovim fenotipskim i proizvodnim karakteristikama pa je stoga cilj ovog istraživanja bio utvrditi vrijednosti tjelesnih mjera kokoši i pijetlova te odrediti izgled i kakvo u jaja kako bi se moglo zapo eti s izradom pasminskog standarda potrebnog za njezino priznavanje kao autohtone pasmine kokoši. U istraživanje su bile uklju ene kokoši i pijetlovi s etiri obiteljska gospodarstva na podru ju grada Križevaca. Utvr ena je boja perja, nogu i podušnjaka kod životinja u dobi od šest mjeseci i godinu dana te su iste izvagane, a provedeno je i mjerenje vrijednosti za još deset tjelesnihmjera. Prikupljena su i kokošja jaja kako bi se utvrdile vrijednosti mase jaja, vrsto e ljuske, udjela žutanjka, bjelanjka i ljuske te utvrdila boja žutanjka. Križeva ka kukmasta kokoš je skladnog tijela kvadratnog oblika i bujnog perja žute boje obrubljenog tamnom gotovo crnom bojom. Glava je srednje veli ine, na njoj se nalazi kukmica naran asto-žute boje kod pijetlova, a crno-sme e kod kokica. Tjelesne mase pijetlova u dobi od 6 i 12 mjeseci u prosjeku su iznosile 2,33 i 2,95 kg, a kod kokoši u istoj dobi 2,06 i 2,71 kg.

Klju ne rije i: fenotip, obilježje, križeva ka kukmasta kokoš

Uvod

U Hrvatskoj je posljednjih godina porastao interes za uzgoj izvornih pasmina peradi kako bi se iste sa uvale od zaborava te se ujedno i zaštitili proizvodi dobiveni njihovim uzgojem. Prema Posavi i sur. (2004.) križeva ka kukmasta kokoš nastala je u osamdesetim godinama 20. stolje a selekcijskim radom na doma im kokošima uzgajanim u Kalni kom prigorju, koje je karakterizirala osrednja kukmica te srednje teško tijelo. Te su kokoši planski križane s pijetlovima pasmine Orpington. Broj životinja koje se trenutno uzgajaju kao i broj uzgajiva a zasad nije poznat, jer je njihov prikaz jedino vidljiv na izložbama malih životinja koje se orga-niziraju na podru ju sjeverozapadne Hrvatske. Prve rezultate o tjelesnim i gospodarskim odlikama križeva ke kukmaste kokoši iznijeli su Pinti i sur. (2010.), koji navode da je ova pasmina kokoši prilago ena dvojakom na inu uzgoja, slobodnom potpuno ekstenzivnom na inu i kombiniranom, tj. s ograni enom mogu nosti kretanja. Kako nakon toga

nisu provedena opsežnija znanstvena istraživanja kojima bi se dobile spoznaje o fenotipskim i proizvodnim karak-teristikama križeva kih kukmastih kokoši, cilj je ovog istraživanja bio utvrditi vrijednosti tjelesnih mjera kokoši i pijetlova te odrediti izgled i kakvo u jaja kako bi se moglo zapo eti s izradom pasminskog standarda potrebnog za njezino priznavanje kao autohtone pasmine kokoši te za-štitila izvornost njenih proizvoda, mesa i jaja.

Materijal i metode

U istraživanje su bila uklju ena etiri jata kokoši i pijetlova u dobi od šest mjeseci i etiri jata u dobi od dvanaest mjeseci s etiri obiteljska gospodarstva na podru ju grada Križevaca. Utvr ena je boja perja, nogu i podušnjaka kod osam pijetlova i etrdeset kokoši, životinje su izvagane, a pro-vedeno je i mjerenje vrijednosti za još deset tjelesnih mjera. Kao mjerne instrumente pri provedbi ovih izmjera korišteni su šestar i pomi no mjerilo te prijenosna vise a vaga za

prof. dr. sc. Zlatko Janje i , Sveu ilište u Zagrebu, Agronomski fakultet Zagreb, Zavod za hranidbu životinja, Svetošimunska 25, 10 000 Zagreb, Republika Hrvatska; Tel.: +385 (0) 1 239 3951, faks: +385 (0) 1 239 3932, e-mail: [email protected]

FENOTIPSKA OBILJEŽJA KRIŽEVA KE KUKMASTE KOKOŠI 126

vaganje peradi s preciznoš u od 10 g. Za izmjere tjelesnih mjera korišteni su standardi koje je opisao Kodinetz (1940.), pri em su za duljinu trupa kao ishodišne to ke služile vrh sjedne kosti s jedne strane i frontalni rub klju ne kosti s druge strane. Za duljinu prsne kosti mjerena su ishodišta kranijalnog i kaudalnog vrha ove kosti. Duljina batka mjerena je od koljenog do tarzalnog zgloba, a duljina piska od tarzalnog do metatarzalnog zgloba. Za širinu trupa je uzimana mjera na me usobno najudaljenijim to kama re-bara. Dubina prsiju je mjerena od najdublje to ke prsne kosti do le nog kralješka koji leži iznad te to ke. Duljina glave je utvr ena tako da je mjeren razmak od vrška kljuna do njemu nasuprot leže e to ke zatiljka. Duljina kljuna mjerena je od vrška kljuna pa do to ke u vrš ivanja kljuna na glavi, odnosno do mjesta gdje se kljun veže s nosnom kosti. Za širinu glave uzimana je mjera me usobno udaljenih zigo-matskih lukova, a širina piska mjerena je na polovici duljine te kosti. Prikupljeno je i po dvadeset jaja od kokoši u dobi od šest i dvanaest mjeseci kako bi se utvrdile vrijednosti mase jaja, indeksa oblika jaja, vrsto e ljuske, udjela žu-tanjka, bjelanjka i ljuske te utvrdila boja žutanjka. Cijela jaja i dijelovi jaja su vagani na preciznoj vagi Mettler s od-stupanjem 0,0001 g. Za utvr ivanje boje žutanjka korištena je lepeza La Roche. Svi dobiveni podaci statisti ki su obra eni pomo u programa MS Excel.


Križeva ka kukmasta kokoš je skladnog tijela kvadratnog oblika i bujnog perja žute boje obrubljenog tamnom gotovo crnom bojom. Glava je srednje veli ine, na njoj se nalazi kukmica naran asto-žute boje kod pijetlova, a crno-sme ekod kokica. Boja nogu kod pijetlova bila je blijedo-ruži aste boje, dok su kod kokoši samo kod dvije životinje noge bile blijedo-ruži aste boje, a kod ostalih sive. Ovakve razlike u

obojenosti nogu upu uju na potrebu daljnjeg selekcijskog rada kako bi se dobile životinje istih pasminskih svojstava glede obojenosti nogu. Podušnjaci su kod svih životinja bili crvene boje. U tablici 1. dan je prikaz prosje nih tjelesnih masa i vrijednosti tjelesnih izmjera kokoši i pijetlova u dobi od šest i dvanaest mjeseci. Kako je vidljivo iz tablice 1. pijetlovi u dobi od dvanaest mjeseci postižu prosje nu tjelesnu masu od 2,95 kg, a kokoši 2,62 kg. Time ih prema Uremovi i sur. (2002.) možemo ubrojiti u kombiniranu pasminu kokoši. Križeva kekukmaste kokoši su teže od kokoši hrvatica koje u dobi od godinu dana u prosjeku postižu prosje nu tjelesnu masu od 2,15 kg (Janje i i sur., 2007.). Isti autori navode da su jaja crvenog soja kokoši hrvatica u dobi od 44 tjedna u prosjeku teška 52,95 g, dok su jaja križeva ke kukmaste kokoši u dobi o dvanaest mjeseci, kako je prikazano u tablici 2., u prosjeku teška 56,32 g. Udio žutanjka, bjelanjka i ljuske u jajima križeva ke kukmaste kokoši u dobi od dvanaest mjeseci iznosio je 32,65%, 54,70% i 12,65%, dok je taj udio u jajima kokoši starih šest mjeseci iznosio 29,68%, 57,50% i 12,82%. Trp i i sur. (2010.) navode da udjeli žutanjka, bjelanjka i ljuske u jajima hibridnih kokoši nesilica u prosjeku iznose 31,9%, 55,80% i 12,30%. Jaja su kod kokoši u dobi od šest mjeseci imala okruglast oblik, dok su s dvanaest mjeseci zaprimila nešto izduženiji oblik. Boja žutanjka kod svih ispitivanih kokoši prema ljestvici La Roche iznosila je u prosjeku vrlo visokih 14, uz napomenu da su kokoši na sva etiri gospodarstva hranjene isklju ivo mješavinom mljevenog kukuruza i je ma te su se tijekom cijelog dana napasivale na zatravnjenom ispustu. Kralik i sur. (2006.) navode da se kod konzumnih jaja dobivenih od hibridnih nesilica u RH vrijednosti boje žumanjka u prosjeku kre u od 12,76 do 13,08. No, zasluga za takvu obojenost žutanjaka može se isklju ivo pripisati umjetnim pigmentima koji se dodaju u hranu za nesilice.

Tablica 1. Prosje ne tjelesne mase i vrijednosti tjelesnih izmjera kokoši i pijetlova u dobi od 6 i 12 mjeseci

Pijetlovi 6 mjeseci

Pijetlovi 12 mjeseci

Kokoši 6 mjeseci

Kokoši 12 mjeseci

Broj životinja 4 4 20 20 Tjelesna masa, kg 2,33±0,12 2,95±0,26 1,91±0,16 2,62±0,27 Duljina trupa, cm 20,75±0,50 22,67±0,29 19,07±0,79 20,22±0,87 Duljina prsne kosti, cm 14,75±2,72 17,33±0,58 14,79±0,95 15,56±0,73 Duljina batka, cm 17,38±2,06 18,17±1,04 15,29±0,76 15,72±0,44 Duljina piska, cm 13,00±2,16 13,67±0,29 10,50±0,87 11,17±0,94 Širina trupa, cm 8,00±0,82 7,83±1,04 7,57±0,61 7,78±0,36 Dubina prsiju, cm 15,13±1,03 16,00±0,50 13,29±0,57 14,28±0,97 Duljina glave, cm 7,92±0,57 8,37±0,35 7,65±0,18 7,68±0,38 Duljina kljuna, cm 2,13±0,21 2,20±0,10 2,01±0,21 2,11±0,12 Širina glave, cm 3,29±0,28 3,57±0,18 3,03±0,24 3,11±0,12 Širina piska, cm 1,63±0,17 1,78±0,16 1,38±0,09 1,52±0,09


Table 1. Mean body weight and body measurements in hens and roosters aged 6 and 12 months

Rooster 6 months

Rooster12 months

Hen6 months

Hen12 months

Number of animals 4 4 20 20

Body weight, kg 2.33±0.12 2.95±0.26 1.91±0.16 2.62±0.27

Body length, cm 20.75±0.50 22.67±0.29 19.07±0.79 20.22±0.87

Sternum length, cm 14.75±2.72 17.33±0.58 14.79±0.95 15.56±0.73

Shank length, cm 17.38±2.06 18.17±1.04 15.29±0.76 15.72±0.44

Tarsometatarsus length, cm 13.00±2.16 13.67±0.29 10.50±0.87 11.17±0.94

Body width, cm 8.00±0.82 7.83±1.04 7.57±0.61 7.78±0.36

Breast depth, cm 15.13±1.03 16.00±0.50 13.29±0.57 14.28±0.97

Head length, cm 7.92±0.57 8.37±0.35 7.65±0.18 7.68±0.38

Beak length, cm 2.13±0.21 2.20±0.10 2.01±0.21 2.11±0.12

Head width, cm 3.29±0.28 3.57±0.18 3.03±0.24 3.11±0.12

Tarsometatarsus width, cm 1.63±0.17 1.78±0.16 1.38±0.09 1.52±0.09

Tablica 2. Prosje ne mase jaja, dijelova jaja i boja žutanjka

Dob kokoši 6 mjeseci 12 mjeseci Broj jaja 20 20 Masa jaja, g 44±3,10 56,32±2,60 Indeks oblika jaja, % 81,48±2,06 77,66±1,18

vrsto a ljuske, kg/cm2 1,57±0,35 1,87±0,81 Masa ljuske, g 5,64±0,36 7,12±0,33 Masa žutanjka, g 13,06±2,24 18,39±2,44 Masa bjelanjka, g 25,30±1,30 30,81±3,37 Boja žutanjka, g 13,60±0,71 14,12±1,34

Table 2. Mean egg weight, parts of egg and yolk color

Age of hens 6 months 12 months Egg number 20 20 Egg weight, g 44.00±3.10 56.32±2.60 Egg shape index, % 81.48±2.06 77.66±1.18 Shell strength, kg/cm2 1.57±0.35 1.87±0.81 Shell weight, g 5.64±0.36 7.12±0.33 Yolk weight, g 13.06±2.24 18.39±2.44 Albumen weight, g 25.30±1.30 30.81±3.37 Yolk color 13.60±0.71 14.12±1.34

Zaklju ak

Iz provedenog je istraživanja vidljivo da treba i dalje raditi na selekciji rasplodnih kokoši i pijetlova križeva ke kuk-maste kokoši kako bi se dobile fenotipski ujedna ene životinje. Uz taj je posao potrebno raditi na poboljšanju proizvodnih pokazatelja pijetlova gledanih kroz ostva-rivanje ve ih tjelesnih masa te nesivosti kokoši za koju se zapravo i ne zna kolika je. Tek tada e se mo i pri ipriznavanju križeva ke kukmaste kokoši kao autohtonoj pasmini te zaštititi izvornost njenih proizvoda, mesa i jaja.

LiteraturaJANJE I , Z., S. MUŽIC, V. HERAK-PERKOVI (2007):

Proizvodnost kokoši Hrvatica. Praxis veterinaria 55,117-124. KRALIK, G., Z. TOLUŠI , Z. GAJ EVI , I. KRALIK, D.

HANŽEK (2006): Commercial quality evaluation of different weight-grade eggs. Acta Agraria Kaposváriensis, 10 (2), 199-206.

KODINETZ, G. (1940): Beitrag zur Kenntnis der Rasse und der Entwicklung des Zagorianer Truthuhnes (Meleagris gallo-pavo). Zeitschrift für Tierzüchtung and Züchtungsbiologie (47) 2,140-165.

PINTI , V., M. MEŠTROVI , , T. JELEN, D. MAREN I , N. PINTI PUKEC (2010): Tjelesne i gospodarske odlike kri-ževa ke kukmice. Zbornik sažetaka „2. Konferencija o izvornim pasminama i sortama kao dijelu prirodne i kulturne baštine s me unarodnim sudjelovanjem”, Pore , 83.

POSAVI, M., M. ERNOI , R. OZIMEC, F. POLJAK (2002): Hrvatske pasmine doma ih životinja. Ministarstvo zaštite oko-liša i prostornog ure enja, Zagreb.

TRP I , I., B. NJARI, N. ZDOLEC, Ž. CVRTILA FLECK, T. FUMI , L. KOZA INSKI (2010): Mikrobiološka kakvo a i ocjena svježine konzumnih jaja. Meso, 5, 286-293.

UREMOVI , Z., M. UREMOVI , V. PAVI , B. MIO , S. MUŽIC, Z. JANJE I (2002): Sto arstvo. Agronomski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zagreb.


PHENOTYPIC TRAITS OF KRIŽEVCI CRESTED HEN

Summary

Križevci crested hen was created in the 1980s through selective work on domestic hens grown in Kalnik hills, which was characterized by crest and medium-hard body. These hens were crossbred with Orpington breed roosters. Until now, there have not been any scientific researches to gain knowledge about their phenotypic and production characteristics. Therefore, the aim of this study was to determine the values of physical measures of hens and roosters and the appearance and quality of eggs in order to start creating breed standards required for its recognition as a native breed of hens. The study involved hens and roosters from four family farms in the town of Križevci. The color of feathers, legs and ear lobe in animals aged between six months and one year was determined and animals were weighed. Values of ten body measurements were recorded. Eggs were collected to determine egg mass, shell thickness, the share of egg yolk, albumen and shell, and color of albumen. Križevci crested hen has a harmonious square shaped body and lavish black bordered yellow feathers. The head is of medium size, there is a crest with orange-yellow color in roosters and black-brown in hens. The mean body mass of roosters aged 6 and 12 months was 2.33 kg and 2.95 kg, and in hens of the same age 2.06 kg and 2.71 kg, respectively.

Keywords: phenotype, characteristic, Križevci crested hen


PREGLED MORFOLOŠKIH SVOJSTAVA AUTOPODIJA PILI A U TOVU KAO POKAZATELJA KVALITETE SMJEŠTAJA I DOBROBITI

Kristina Matkovi 1, Danijel Maruši 2, Željko Pavi i 1, Nina Polji ak Milas3, Mario Ostovi 1,Hrvoje Luci 4

1Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za higijenu, ponašanje i dobrobit životinja, Zagreb, Hrvatska 2Županija brodsko posavska, Slavonski Brod, Hrvatska 3Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za patološku fiziologiju, Zagreb, Hrvatska 4Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Brzi rast pili a u tovu prati smanjena aktivnost te produženo razdoblje sjedenja i ležanja, što s obzirom na gusto u smještaja i njen utjecaj na kvalitetu stelje predstavlja glavni imbenik smanjenja dobrobiti. Visoka koncentracija amonijaka u vlažnoj stelji utje e na pojavu kontaktnog dermatitisa u podru ju tarzusa i prstiju. U ovom preglednom radu opisane su dosadašnje spoznaje o utjecaju gusto e smještaja i oboga enja okoliša na pojavu kontaktnog dermatitisa tarzusa i prstiju te procjena dobrobiti analizom morfoloških svojstava autopodija pili a u tovu. Planira se provesti istraživanje koje e uklju itioboga enje okoliša, uz pretpostavku ve e miši ne aktivnosti pokusne skupine pili a u tovu u odnosu na konvencionalno držane te o ekivanu razliku u broju i veli ini svih miši nih vlakana pili a. Istražit e se morfološka svojstva miši a s obzirom na razli ite gusto e naseljenosti, gra u bedrene kosti i goljenice (oblik i veli ina kosti) te odnos debljine kompaktne kosti i medularne šupljine kosti. Tako er e se istražiti morfološka svojstva bedrenog i prsnoga miši ja s obzirom na svojstva miši nih vlakana.

Klju ne rije i: pili i u tovu, gusto a smještaja, oboga eni okoliš, morfološka svojstva, dobrobit

Uvod

Genetski odabir, na in i gusto a smještaja, ostvarena tjelesna masa i neposredni okoliš definiraju dobrobit pili a u tovu (Bessei, 2006.). Slaba pokretljivost zbog ranog i brzog prirasta dovodi do pretjeranog sjedenja i ležanja, što u kombinaciji s vlažnom steljom uzrokuje kontaktni dermatitis (KD) podru ja tarzusa i prstiju. Zna ajno smanjena po-kretljivost pili a utvr ena je pri gusto i od 33 do više od 42 kg/m2 (Buijs i sur., 2010., Zuowei i sur., 2011.). Ako je tehnologijom odre ena ve a gusto a životinja stelja može postati vlažnija, ime bi se pove ala u estalost navedenih promjena (Dawkins i sur., 2004.). Izrazita vlažnost stelje pove ava aktivnost mikroorganizama prisutnih u njoj, koji zbog pove ane temperature i koncentracije amonijaka u stelji i nastambi mogu uzrokovati nastanak KD (Reiter i Bessei, 2000.). Oboga enje okoliša uvo enjem nove vrste stelje te postavljenjem pre ki može pove ati aktivnost pili ai time umanjiti nastanak navedenih promjena i poboljšati

dobrobit. Uporaba pijeska kao stelje pretpostavlja druga ije koncentracije amonijaka i temperature, a održavanje ravno-teže tijekom stajanja na pre kama i penjanje poti e miši nuaktivnost nogu, prsa i zglobova krila na na in druga iji od hodanja (Le Van i sur., 2000.; Simsek i sur., 2009.). U ovom preglednom radu opisuju se dosadašnje spoznaje o utjecaju gusto e smještaja i oboga enja okoliša na pojavu KD u podru ju tarzusa i prstiju te procjeni dobrobiti ana-lizom morfoloških svojstava autopodija pili a u tovu.

Pregled dosadašnjih istraživanja

Ovisno o ciljanoj završnoj masi tehnologija držanja pili a u tovu predvi a razli itu gusto u smještaja pili a po m2

prostora. Kre e se od relativno niske gusto e (11 pili a/m2,odnosno 22,5 kg/m2) do visoke gusto e (20 ptica/m2, od-nosno 42 kg/m2). Brojna istraživanja donijela su proturje nezaklju ke o utjecaju gusto e pili a na pojavu KD, ali svima je zajedni ko da provo enje istraživanja bilo u pokusnim

doc. dr. sc. Kristina Matkovi , Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za higijenu, ponašanje i dobrobit životinja, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, tel. +38512390292, e-mail: [email protected]


130

uvjetima ili konvencionalnom uzgoju, zbog ve eg broja životinja i specifi nih mikroklimatskih uvjeta, utje e na rezultate (Jones i sur., 2005., Buijs i sur., 2010.). Zbog o ekivanih rezultata proizvodnje potrebno je utvrditi idealnu gusto u pili a/m2, ime se bave brojna istraživanja (Sekeroglu i sur., 2011., Simsek i sur., 2011., Zuowei i sur., 2011.). Utjecaj gusto e smještaja na pojavu KD i kvalitetu dobrobiti je dokazan (Spindler i Hartung, 2011.). Nešto manja gusto a smještaja uz ne preskupe metode oboga-ivanja okoliša ne e zna ajnije utjecati na ekonomsku

isplativost njihove primjene (Verspecht i sur., 2011.). Hepworth i sur. (2011.) zaklju ili su da utjecaj gusto e na pojavu KD ovisi o uvjetima neposrednog okoliša. Za-bilježene su ozbiljnije ozljede kože pri ve oj gusto i pili akoji se zbog manjka prostora guraju i penju jedni na druge traže i mjesto za odmor, hranu ili vodu (Buijs i sur., 2010., Ventura i sur., 2012.). Buijs i sur. (2012.) istražili su utjecaj velike gusto e pili a na pove anje zakrivljenosti tibije i smanjenje kvalitete kosti. Vlažna stelja glavni je imbenik rizika pojave KD (Shepherd i Fairchild, 2010.). Stupanj vlažnosti ovisi o vrsti, koli ini i teksturi stelje, gusto i pili a, izvedbi pojilica, potrošnji vode, temperaturi zraka, sezoni, dobi, zdravstvenom stanju (pro-ljevi) i sastavu hrane. Baeza i sur. (2012.) dokazali su da s dobi zna ajno raste vlažnost te koli ina amonijaka u stelji, a posljedi no i pojava KD. Veli ina estica stelje ima izravan utjecaj na pojavu KD (Cengiz i sur., 2011.). Kao mogu azamjena danas naj eš e korištenim steljama od sjeckane slame i strugotine drva istraživani su brojni materijali poput recikliranog papira, piljevine, strugotine od borovine i rižine ljuskice. Zabilježeni rezultati nisu ukazali na zna ajniji utjecaj tih materijala na pokazatelje dobrobiti (pokretljivost, pojavu KD, prirast, diskondroplaziju tibije (Xavier i sur., 2010., Villagra i sur., 2011.).

Oboga enje okoliša Pili i se tove u okolišu koji im osigurava dostupnost hrani i vodi uz ograni enu mogu nost kretanja. Podovi su naste-ljeni, zidovi jednoli no oli eni, a hranilice i pojilice uni-formno postavljene. Sve to nudi minimalnu stimulaciju. Stoga je korisno obogatiti okoliš, ali uz velik oprez budu ida neke intervencije mogu biti nekorisne ili ak dovesti do neželjenih u inaka (Jones, 2004.). Oboga enje mora izazvati i zadržati zanimanje pili a, pove ati pojavu poželjnog ponašanja, umanjiti neželjeno ponašanje i biti prakti no za izvedbu u kontekstu biosigurnosnih mjera i integracije u okoliš. Primjena pre ki kojima se oboga uje okoliš ovisi o hibridu, spolu, gusto i i izvedbi. Op enito, sporije rastu ihibridi više iskorištavaju pre ke od brzo rastu ih. Tako er je utvr eno da pili i ve inom koriste pre ke tijekom dana (Ventura i sur., 2012.), a prema istraživanju koje su proveli Le Van i sur. (2000.) koriste ih i no u. Nielsen (2004.) je utvrdio cirkadijalni ritam korištenja pre ki, od 30 minuta nakon zalaska sunca do 1 sat prije izlaska sunca. Brzo rastu i sojevi najviše ih koriste oko 3. do 5. tjedna starosti, a kasnije korištenje opada (Ventura i sur., 2012.). Izbor vrste stelje tako er je jedan od na ina oboga enja okoliša u smislu

korištenja materijala koji dobro apsorbira i brzo propušta vlagu, primjerice pijeska (Cengiz i sur., 2011.).

Kontaktni dermatitis U istraživanjima provedenim u UK Hepworth i sur. (2011.) utvrdili su prosje nu pojavnost kontaktnog dermatitisa na tarzalnom podru ju od 12% te naglasili da je to zna ajan pokazatelj dobrobiti jata. Primjenom protokola za pili e u tovu Animal Welfare Quality® (2009.), pregledom na liniji klanja utvr ena je pojavnost KD na tarzalnom podru ju u 20% pili a brzo rastu eg hibrida. Shepherd i Fairchild (2010.) naglašavaju važnost prevencije KD ne samo s gledišta dobrobiti, ve i zbog ekonomske isplativosti. Naime, pile e noge postaju sve zanimljiviji proizvod na svjetskom tržištu. Samo 2008. godine zarada od prodaje pile ih nogu bila je $280 milijuna. Pritom je jako važno da noge moraju biti bez KD.

Morfologija kostiju U svome radu o oboga enju okoliša u kojem se drže pili i u tovu Simsek i sur. (2009.) su istraživali dužinu i širinu tibiotarzusa te utvrdili pozitivnu korelaciju tih morfoloških pokazatelja s oboga enim okolišem u odnosu na pili ekontrolne skupine iz konvencionalnog uzgoja. Promjene oblika goljeni ne kosti pili a u smislu ve ih ili manjih zakrivljenja dijafize kosti s obzirom na gusto u naseljenosti nastambe istraživali su Buijs i sur. (2012.) te tako er utvrdili zna ajno smanjenu pojavu spomenutih promjena na kostima životinja pokusne skupine u odnosu na konvencionalni uzgoj kontrolne skupine životinja. Spomenuti autori nisu se bavili razlikama u debljini kompaktne kosti na popre nom presjeku kostiju, što bi tako er moglo pokazati razliku u pili a koji su držani u oboga enom okolišu u odnosu na kon-vencionalno držane. Pravilnost oblika kosti, kao i deblje i vrš e kosti zna ajno smanjuju rizike od napuknu a i

lomova kostiju koja vrlo esto nastaju prilikom hvatanja i prijevoza pili a u tovu (Sanotra i sur., 2011.; Buijs i sur., 2012.).

Morfologija miši aUhrin (1995.) utvrdio je da debljina miši nih vlakana u razli itih vrsta ptica nije povezana s njihovom masom, ali se vrsno razlikuje. Pove anje miši ne mase klju ni je imbenik visoke proizvodnje pili a u tovu, a selekcija novih hibrida u tome je najvažniji element. Brzi rast i velika miši na masa pili a rezultat je brze hipertrofije miši nih vlakana i pove anja njihovog broja (Aberle i Stewart, 1983.). Berri (2000.) navodi da uzgojni i klaoni ki postupci sa životinjama utje u na histološku i biokemijsku strukturu miši nih vlakana. U tom smislu, Stickland (1995.) navodi da brzo rastu e životinje imaju brojnija miši na vlakna, a Pingel i Kunst (1993.) su utvrdili da je u pataka držanih na paši manji promjer crvenih i bijelih miši nih vlakana nego u pataka držanih u intenzivnom uzgoju. Poznato je da brzi rast miši a stvara vlakna koja prerastaju svoje fiziološke granice, što posljedi no dovodi do njihovih ošte enja (Swatland, 1990.; Wilson, 1990.).


131

Umjesto zaklju ka

Planira se provesti istraživanje, koje e uklju iti oboga enjeokoliša uz pretpostavku ve e miši ne aktivnosti pokusne skupine pili a u tovu u odnosu na konvencionalno držane te o ekivanu razliku u broju i veli ini svih miši nih vlakana pili a. Pokusne skupine pili a držat e se u uvjetima okoliša oboga enog pre kama i pijeskom kao steljom, uz razli ite gusto e naseljenosti. Glavni cilj bit e odrediti u kojoj mjeri takvo oboga enje smanjuje pojavu KD na podru ju tarzusa i prstiju. Noge pili a u tovu bit e istražene makroskopskom patomorfološkom i histološkom pretragom s ciljem utvr i-vanja veze izme u makroskopskih i histoloških osobitosti te osmišljavanja vjerodostojnog sustava bodovanja dobrobiti koji e se mo i jednostavno primjenjivati u uvjetima uzgoja.

Literatura

ABERLE, E. D., T. S. STEWART (1983): Growth and certain fibre types in skeletal muscles in broilers and layers. Growth. 47, 135-144.

BAEZA, E., C. ARNOULD, M. JLALI, P. CHARTRIN, V. GIGAUD, F. MERCERAND, C. DURAND, K. METEAU, E. LEBIHAN-DUVAL, C. BERRI (2012): Influence of increasing slaughter age of chickens on meat quality, welfare and technical and economic results. J Anim Sci. 90, 2003-2013.

BERRI, C. (2000): Variability of sensory and processing qualities of poultry meat. World Poult Sci J. 56, 209-224.

BESSEI, W. (2006): Welfare of broilers: a review. World Poult Sci J. 62, 455-466.

BUIJS, S., L.J. KEELING, C. VANGESTEL, J. BAERT, J. VANGEYTE, F. A. M. TUYTTENS (2010): Resting or hiding? Why broiler chickens stay near walls and how density affects this. Appl Anim Behav Sci. 124, 97-103.

BUIJS, S., E. VAN POUCKE, S. VAN DONGEN, L. LENS , J. BAERT, F. A. TUYTTENS (2012): The influence of stocking density on broiler chicken bone quality and fluctuating asymmetry. Poult Sci. 91, 1759-1767.

CENGIZ, O., J. B. HESS, S. F. BILGILI (2011): Effect of bedding type and transient wetness on footpad dermatitis in broiler chickens. J Appl Poult Res. 20, 554-560.

DAWKINS, M. S., C. A. DONNELLY, T. A. JONES (2004): Chicken welfare is influenced more by housing conditions than by stocking density. Nature. 427, 342-344.

HEPWORTH, P. J., A. V. NEFEDOV, I. B. MUCHNIK, K. L. MORGAN (2011): Hock burn: an indicator of broiler flock health. Vet Rec. str. 168.

JONES, R. B. (2004): Environmental enrichment: the need for practical strategies to improve poultry welfare. In: Welfare of the laying hen. Zbornik radova, Perry, G.C. (ur.). 27th Poultry Science Symposium of the World's Poultry Science Association (UK Branch), Bristol, UK, CABI Publishing, Wallingford, UK.

JONES, T. A., C. A. DONNELLY, M. S. DAWKINS (2005): Environmental and management factors affecting the welfare of chickens on commercial farms in the United Kingdom and Denmark stocked at five densities. Poult Sci. 84, 1155-1165.

LE VAN, N. F., I. ESTEVEZ, W. R. STRICKLIN (2000): Use of horizontal and angled perches by broiler chickens. Appl Anim Behav Sci. 65, 349-365.

NARODNE NOVINE (79/08): Pravilnik o odre ivanju minimalnih pravila za zaštitu pili a koji se uzgajaju za proizvodnju mesa.

NIELSEN, B. L. (2004): Breast blisters in groups of slow-growing broilers in relation to strain and the availability and use of perches. Br Poult Sci. 45, 306-315.

PINGEL, H., U. KUNST (1993): Review on duck meat quality. Proceedings of the XI European Symposium on the Quality of Poultry Meat, Vol. 1. Tours, France, str. 26-38.

REITER, K., W. BESSEI (2000): Einfluss der Besatzdichte bei Broilern auf die Temperatur in der Einstrau und zwischen den Tieren. Arch Geflugelkd. 64, 1-3.

SANOTRA, G. S., J. D. LUND, A. K. ERSBOLL, J. S. PETERSEN, K. S. VESTERGAARD (2011): Monitoring leg problems in broilers: a survey of commercial broiler production in Denmark. World Poult Sci J. 57, 55-69.

SEKEROGLU, A., M. SARICA, M. S. GULAY, M. DUMAN, (2011): Effect of stocking density on chick performance, internal organ weights and blood parameters in broilers. J Anim Vet Advan. 10, 246-250.

SHEPHERD, E. M., B. D. FAIRCHILD (2010): Footpad dermatitis in poultry. Poult Sci. 89, 2043-2051.

SIMSEK,U. G., B. DALKILIC, M. CIFTCI, I. H. CERCI, M. BAHSI (2009): Effects od enriched housing design on broiler performance, welfare, chicken meat composition and serum cholesterol. Acta Vet Brno. 78, 67-74.

SIMSEK, U. G., M. CIFTCI, I. H. CERCI, M. BAYRAKTAR, B. DALKILIC, O. ARSLAN, T. A. BALCI (2011): Impact of stocking density and feeding regimen on broilers: per-formance, carcass traits and bone mineralisation. J Appl Anim Res. 39, 230-233.

SPINDLER, B., J. HARTUNG (2011): Prevalence of podo-dermatitis in broiler chickens kept according to Directive 2007/43/ec stocking densities. The XVth International Congress of the International Society for Animal Hygiene, 3-7 July 2011, Vienna, Austria, str. 39-42.

STICKLAND, N. C. (1995): Microstructural aspects of skeletal muscle growth. Proceedings of the 2nd Dummerdorf Muscle Workshop – Muscle Growth and Meat Quality. Rostock, Germany, str. 1-9.

SWATLAND, H. J. (1990): A note of growth of connective tissues binding turkey muscle fibers together. Can Inst Food Sci Tecnol J. 23, 239-241.

UHRIN, V. (1995): Structural differences between white and red muscles of birds. Živo išna Vyroba. 40, 337-342.

VENTURA, B. A., F. SIEWERDT, I. ESTEVEZ (2012): Access to barrier perches improves behavior repertoire in broilers. PLoS ONE 7(1): e29826. doi:10.1371/journal.pone.0029826

VERSPECHT, A., F. VANHONACKER, W. VERBEKE, J. ZOONS, G. VAN HUYLENBROECK (2011): Economic impact of decreasing stocking densities in broiler production in Belgium. Poult Sci. 90, 1844-1851.

VILLAGRA, A., I. OLIVAS, V. BENITEZ, M. LAINEZ (2011): Evaluation of sludge from paper recycling as bedding material for broilers. Poult Sci. 90, 953-957.

WILSON, B. W. (1990): Developmental and maturational aspects of inherited avian myopathies. Proc Sci Exp Biol Med. 194, 87-96.


132

ZUOWEI, S., L. YAN, L. YUAN, H. JIAO, Z. SONG, Y. GUO, H. LIN (2011): Stocking density affects the growth performance of broilers in a sex-dependent fashion. Poult Sci. 90, 1406-1415.

XAVIER, D.B., D.M. BROOM, C.M.P. McMANUS, C. TORRES, F.E.M. BERNAL (2010): Number of flocks on the same litter and carcass condemnations due to cellulitis, arthritis and

contact foot-pad dermatitis in broilers. Br Poult Sci. 51, 586-591.

* Uputa za obavljanje i procjenu rezultata post mortem (lat.) pregleda u svrhu utvr ivanja mogu ih znakova loših uvjeta držanja na farmi s obzirom na dobrobit pili a koji se uzgajaju za proizvodnju mesa

* Animal Welfare Quality® protokol za pili e u tovu

REVIEW OF BROILER AUTOPODIUM MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS AS AN INDICATOR OF ACCOMMODATION QUALITY AND WELFARE

Summary

The rapid growth of fattening chickens is accompanied by decreased activity and an extended period of sitting and lying, which is considering accommodation density and its impact on the quality of the litter the main factor of reduced welfare. Wet litter due to high ammonia concentrations favors the occurrence of contact dermatitis in tarsal and finger area. This review presents the state-of-the-art on the impact of accommodation density and environmental enrichment on the incidence of contact dermatitis in the tarsal and finger area, as well as welfare assessment by analysis of morphological characteristicsof broiler autopodium. It is planned to conduct a research which will include enrichment of the environment, assuming greater muscle activity of experimental groups of broilers compared to those conventionally held and the expected difference in the number and size of muscle fibers in chickens. The study will assess morphological characteristics of muscles considering different population density, femur and tibia structure due to the shape and size of bones, and relationship between compact bone thickness and bone marrow cavity. Also, thigh muscle and shin structure will be studied for muscle fiber properties.

Key words: broilers, accommodation density, enriched environment, morphological characteristics, welfare


UTJECAJ ULTRAZVUKA VISOKOG INTENZITETA NA KVALITETU PILE EG MESA

Helga Medi , Tibor Jan i, Mladen Brn i , Filip Dujmi , Ksenija Markov, Duška uri

Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

Cilj ovoga istraživanja bio je odrediti parametre kvalitete svježeg pile eg mesa nakon tretmana ultrazvukom visokog intenziteta. Rezultati su pokazali da ne postoji zna ajna razlika u ukupnom broju bakterija izme u tretmana u ultrazvu noj kupelji kroz 5 i 15 minuta u ispitanim uzorcima pile eg mesa te da tretman ultrazvukom nema trajan u inak na uništavanje bakterija u pile em mesu. Nasuprot tomu, funkcionalna svojstva pile eg mesa su poboljšana tretmanom ultrazvukom u trajanju od 5 minuta pri frekvenciji 37 kHz, snazi 380 W i amplitudi 100%.

Klju ne rije i: meso, pile a prsa, ultrazvuk, trajnost

Uvod

U posljednjih nekoliko desetlje a potražnja za mesom peradi zna ajno raste i o ekuje se da e ovaj segment tržišta u budu nosti i dalje rasti. Glavni razlozi pove ane potražnje su percepcija mesa peradi kao zdravog proizvoda povoljnog nutritivnog sastava zahvaljuju i visokom udjelu proteina, niskom udjelu masti i kolesterola, povoljnom omjeru omega-3 i omega-6 masnih kiselina te prisutnosti odre enih funkcionalnih komponenata, prikladnosti mesa peradi za preradu što omogu uje plasman široke palete proizvoda te odsutnosti kulturoloških i religijskih normi koje ograni a-vaju njegovu konzumaciju (Petracci i sur., 2013.). Istodobno se bilježi i porast potražnje za polugotovom i gotovom hranom koja zahtijeva minimalnu obradu prije konzumacije, zbog ega su nove tehnologije i metode produljenja trajnosti hrane predmet brojnih istraživanja. Jedna od novijih tehnologija je i primjena ultrazvuka viso-kog intenziteta u proizvodnji i preradi hrane. Uslijed širenja ultrazvu nih valova visokog intenziteta frekvencije više od 20 kHz kroz biološki materijal u sustav (namirnicu) unosi se velika koli ina energije koja može imati razli ite mehani ke,kemijske i biokemijske u inke i na taj na in utjecati na kva-litetu namirnica tijekom i nakon prerade (Mason i sur., 2011.). Dosadašnja istraživanja dokumentirala su brojne utjecaje ultrazvuka visokog intenziteta na procese prerade poput ekstrakcije, kristalizacije i stvaranja emulzije (Higaki i sur., 2001.), sušenja (Fernandes i Rodrigues, 2008.), zamrza-vanja (Delgado i sur., 2009.) i odmrzavanja (Kissam i sur.,

1982.) te fizikalno-kemijska i biokemijska svojstva na-mirnica i/ili njihovih komponenata poput funkcionalnih svojstava proteina (Jambrak i sur., 2008.), aktivnosti enzima (Vercet i sur., 1999.) i mikroorganizama (Piyasena i sur., 2003.). U tehnologiji prerade mesa primjena ultrazvuka visokog intenziteta istraživala se primarno u svrhu omekšavanja go-ve eg mesa, a rezultati razli itih istraživanja pokazali su da u inak na omekšavanje mesa ovisi o procesnim parametrima poput frekvencije i intenziteta ultrazvuka te temperature i trajanja ultrazvu nog tretmana (Dolatowski i sur., 2007.). Kako je utjecaj na teksturu mesa prvenstveno posljedica promjena na proteinima mesa zabilježene su i promjene dru-gih karakteristika mesa vezanih uz proteine poput naruša-vanja tipi ne miofibrilarne strukture, pove anja sposobnosti vezanja vode i so nosti finalnog proizvoda. Još jedna od istraživanih mogu nosti primjene ultrazvuka u tehnologiji prerade mesa i mesa peradi je smanjenje broja mikroorganizama (Boysen i Rosenquist, 2009.; Haughton i sur., 2012.). Kao i kod omekšavanja mesa, stupanj sma-njenja mikroorganizama ovisi o procesnim parametrima, a najbolji rezultati postignuti su primjenom ultrazvuka nižih frekvencija (20-40 kHz) pri tretmanu ultrazvukom visokog intenziteta (Dolatowski i sur., 2007.). Cilj ovoga istraživanja bio je odrediti parametre kvalitete svježeg pile eg mesa koji uklju uju sposobnost vezanja vode, prinos pri kuhanju, teksturna svojstva i ukupan broj bakterija tijekom 7 dana nakon tretmana ultrazvukom viso-kog intenziteta.

izv. prof. dr. sc. Helga Medi , Prehrambeno-biotehnološki fakultet, Sveu ilište u Zagrebu, Pierottijeva 6, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel: 01 4605126; faks: 01 4605072; e-mail: [email protected]

UTJECAJ ULTRAZVUKA VISOKOG INTENZITETA NA KVALITETU PILE EG MESA 134

Materijali i metode

Materijal Uzorci pile ih prsa nabavljeni su u prodavaonici proiz-vo a a Vindija d.d. i preneseni u laboratorij. Pojedina nepolovice pile ih prsa mase 135,7-158,8 g vakumski su pakirane u plasti ne vre ice sastava poliamid 20 μm/poli-etilen 70 μm. Pakirani uzorci su podijeljeni u tri skupine: kontrolni uzorci (bez tretmana ultrazvukom), uzorci tretirani ultrazvukom u trajanju 5 min i uzorci tretirani ultrazvukom u trajanju 15 min. U svakoj skupni je bilo 7 uzoraka.

Tretman ultrazvukom visokog intenziteta Pakirani uzorci pile eg mesa uronjeni su u ultrazvu nu kupelj Elmasonic P300H (Elma, Njema ka). Odre eni broj uzoraka je tretiran u razdoblju od 5 minuta, a drugi dio uzorka je tretiran u trajanju od 15 minuta. Ostali parametri rada ultrazvu ne kupelji bili su jednaki za obje skupine uzo-raka, a iznosili su kako slijedi: frekvencija 37 kHz, efektivna snaga ultrazvuka 380 W, ciklus 100% i po etna temperatura kupelji 21 °C.

Odre ivanje sposobnosti vezanja vode i prinosa pri kuhanju Sposobnost vezanja vode (SVV) i prinos pri kuhanju odre ivani su metodom po Van Laacku i sur. (2000.). Šest g usitnjenog uzorka je izvagano u plasti nu epruvetu od 50 mL. Dodano je 10 mL 3,5% otopine NaCl te je epruveta zatvorena i protresena 15 s. Otopina je ostavljena 30 min na 25 °C te centrifugirana 10 min na 3 000 g. Nakon toga je supernatant odba en, a epruveta osušena. Potom je epruveta izvagana s peletom i izra unata sposobnost vezanja vode prema formuli:

SVV (%) = [(težina peleta + epruvete) –– težina epruvete – 6,00]/6x100

Nakon vaganja epruvete su za epljene i stavljene na 80 °C tijekom 20 min. Nakon kuhanja teku ina je izlivena iz epruvete, a teku ina zaostala na stijenkama obrisana. Epru-vete su izvagane, a prinos pri kuhanju je izra unat prema formuli:

Prinos pri kuhanju (%) = [(težina peleta + epruvete) – – težina epruvete]/6x100

Instrumentalno odre ivanje teksture mesa Tekstura je mjerena pomo u teksturometra Instrumental Texture Analyzer TA HDPlus (Stable Micro Systems, Velika Britanija). Pripadaju i alat je set noževa, brzina rezanja je 1 mm/s, dubina mjerenja 15 mm, a preciznost mjerenja ±0,01 N.

Priprema uzoraka Korištenjem digitalne pomi ne mjerke i oštrog noža (skal-pela) izrezuje se uzorak svježeg mesa peradi dimenzija 15x20x10 mm (širina x dužina x visina). Temperatura uzo-raka se do po etka ispitivanja održava na konstantnoj tempe-raturi od 4±1 °C.

Kalibracija ure aja Prije po etka serije ispitivanja nužno je provesti kalibraciju ure aja kako bi sustav mogao odrediti vezu izme u signala (elektri ni otpor) i postignute sile. Kalibracija se provodi korištenjem programa Exponent. U programu se izabirom opcija T.A. – Calibrate – Calibrate Force i T.A. – Calibrate – Calibrate Height kalibriraju sila ili visina.

Analiza uzorka i rezultata Nakon instalacije postolja i sonde uzorak se postavlja na sredinu metalnog postolja. U programu Exponent brzina prodiranja sonde namještena je na 1 mms-1 uz dubinu pro-diranja od 15 mm. Ra unalo se postavlja tako da po inje zapisivati vrijednosti kada sonda do e u kontakt s uzorkom, pri emu minimalna izmjerena sila potrebna za po etakmjerenja iznosi 0,001 N. Instrumentom se mjeri jedan puni TPA (Texture Profile Analysis, analiza teksturnog profila) ciklus te se kao rezultat dobivaju vrijednosti sile potrebne za prodiranje sonde u uzorak i vrijednosti sile potrebne za izvla enje sonde iz uzorka za svakih 0,001 s. Na temelju dobivenih rezultata iz grafa ovisnosti sile pri-mijenjene za prodiranje u uzorak i prije enog puta sonde tvrdo a (N) se ra una kao maksimalna sila postignuta prilikom prodiranja sonde u uzorak. Elasti nost se ra unakao udaljenost koju je sonda prešla od po etka prodiranja do lomljenja uzorka te se izražava u mm. Rad potreban za prvi zagriz u materijal ra unat je kao površina ispod krivulje ovisnosti sile o putu, sve do krajnje to ke prodora sonde u uzorak. Rad se izražava u N·m odnosno J, ali se u istraživanjima esto koristi N·mm ili mJ (Lu i Abbot, 2004.; Kilcast, 2004.). Tekstura je odre ivana na dva na ina: rezanje Kramer Warner-Bratzlerovim nožem i penetracija sondom. Osnovni podaci o ispitivanju: Kramer Warner-Bratzler ravni nož; brzina rezanja: 0,1 mm/s; dubina rezanja: 20 mm; load cell: 30 kg. Penetracija: 6 mm cilindri na eli na sonda; brzina rezanja: 0,1 mm/s; dubina rezanja: 20 mm; load cell: 30 kg.

Neizravno odre ivanje broja živih bakterija (metoda brojenja mikroorganizama) Provodi se nacjepljivanjem poznatog volumena suspenzije na vrstu podlogu na kojoj se o ekuje razvoj kolonija. Tijekom odre ivanja broja živih stanica mikroorganizama uzorak se esto mora razrijediti, jer sadržava prevelik broj živih stanica koje mogu tvoriti kolonije, što otežava ili akonemogu uje njihovo brojanje na vrstim podlogama. Stoga je potrebno na initi seriju decimalnih razrje enja (u omjeru 1:10). Postupak treba voditi tako da na vrstoj podlozi u Petrijevoj zdjelici ne poraste više od 300, a ni manje od 30 kolonija. Statisti ki valjan uzorak je onaj koji ima izme u 30 i 300 jedinica koje tvore kolonije. Metoda se osniva na pretpostavci da e iz svake žive stanice porasti jedna kolonija mikroorganizma. Postupak razrje ivanja treba po-navljati sve dok nije na injeno prikladno razrje enje.


Po 1 mL uzorka otpipetirano je u praznu Petrijevu zdjelicu, dodan je rastaljeni hranjivi agar za bakterije i ohladi se. Nakon što se podloga stvrdne provede se inkubacija u termostatu pri 37 °C tijekom 24 sata. Cijeli postupak je vo en u sterilnim uvjetima kako bi se sprije ila konta-minacija uzoraka. Kolonije bakterija koje su porasle na vrstoj hranjivoj podlozi predstavljaju stvaran broj živih

stanica te su prebrojane na broja u kolonija. Tako dobivene vrijednosti se ozna avaju kao CFU vrijednost (Colony Forming Units).

CFU = (broj poraslih kolonija)/(volumen upotrebljenog uzorka) × recipro na vrijednost decimalnog razrje enja [jed/mL]


U tablici 1. prikazana je sposobnost vezanja vode i prinos pri kuhanju pile eg mesa prije i nakon tretmana ultrazvukom, dok su u tablici 2. prikazana teksturna svojstva ispitivanih uzoraka pile eg mesa. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.

Tablica 1. Funkcionalna svojstva pile eg mesa nakon tretma-na ultrazvukom visokog intenziteta

Table 1. Functional properties of chicken meat treated with high power ultrasound

Sposobnost vezanja vode (%) Prinos pri kuhanju (%) K 68,86±9,76 116,72±7,65 5 74,64±7,58 117,55±4,30 15 59,15±5,42 103,18±5,93 K-kontrola; 5-vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom 5 min; 15-vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom 15 min

Tablica 2. Teksturna svojstva pile eg mesa tretiranog ultrazvukom visokog intenziteta

Table 2. Effect of ultrasound treatment on the chicken meat texture

Tvrdo a [N] Elasti nost [mm] Rad potreban za zagrizK 99,29±30,50 28,24±4,63 89947,58±23738,71 5 89,79±18,33 27,89±8,07 81857,18±20360,49 15 107,96±7,93 28,35±8,59 101068,28±9197,28 K-kontrola; 5-vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom 5 min; 15-vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom 15 min

Tretman ultrazvukom visokog intenziteta koristi se, izme uostalog, zbog poboljšanja teksture mesa, mariniranja, spo-sobnosti vezanja vode i prinosa pri kuhanju, esto pri frekvencijama od 24-45 kHz i vremenu tretmana od 2 do 120 minuta (Turanta i sur., 2015.). Rezultati ovoga istraživanja pokazuju poboljšanu sposobnost vezanja vode kao i prinos pri kuhanju pile eg mesa nakon tretmana ultrazvukom visokog intenziteta u trajanju od 5 minuta pri

frekvenciji 37 kHz. Produženjem trajanja tretmana došlo je do smanjenja sposobnosti vezanja vode i prinosa pri kuhanju u odnosu na uzroke pile eg mesa koji su bili tretirani 5 minuta i uzorke koji nisu bili tretirani ultrazvukom. Razli ito vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom razli ito je utjecalo na teksturna svojstva pile eg mesa. Sam u inak ultrazvuka u smislu omekšavanja mesa postiže se raza-ranjem miši nih stanica ili biokemijski, kroz poticanje enzimskih reakcija (Chemat i sur., 2011.). Iz rezultata prikazanih u tablici 2. je vidljivo da je tretman u trajanju od 5 minuta pri frekvenciji 37 kHz, snazi 380 W i amplitudi 100% smanjio tvrdo u pile eg mesa, elasti nost i rad potreban za zagriz, dok je tretman u trajanju od 15 minuta negativno utjecao na navedena svojstva. Pozitivan u inak ultrazvuka na teksturna svojstva gove eg mesa utvrdili su Jayasooriya i sur. (2007.), a pile eg i svinjskog mesa Turanta i sur. (2015.). Utjecaj djelovanja ultrazvuka visokog intenziteta kroz 5 i 15 minuta na mikrobiološku sliku vakuumski pakiranog svje-žeg pile eg mesa neposredno nakon tretmana u ultrazvu noj kupelji te pra enje ukupnog broja bakterija nakon 3, 5 i 7 dana uvanja u hladnjaku prikazan je u tablici 3.

Tablica 3. Srednje vrijednosti ukupnog broja bakterija nakon tretiranja pile eg mesa ultrazvukom visokog in-tenziteta

Table 3. Total bacterial count in chicken meat after treatment with high power ultrasound

Dan - Day CFU/g

K 5 15

0 6,1x105 2,1x105 2x105

3 6,5x105 6x105 5,3x105

5 2x106 2,8x106 2,5x106

7 2x106 2,5x106 2x106

K-kontrola; 5-vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom 5 min; 15-vrijeme trajanja tretmana ultrazvukom 15 min

Iz dobivenih rezultata vidljivo je da je broj bakterija smanjen odmah nakon tretmana za 0,5 log CFU/g, iz ega proizlazi da tretman ultrazvukom visokog intenziteta u ultrazvu noj kupelji nema zna ajan utjecaj na smanjenje broja bakterija na uzorcima svježeg pile eg mesa. U literaturi postoji vrlo malo podataka o tretiranju krute hrane ultrazvukom, iako postoje brojne prednosti primjene ultrazvuka u smanjenju broja mikroorganizama u odnosu na toplinsku sterilizaciju koje uklju uju minimiziranje gubitka okusa proizvoda, poboljšanje homogenosti i uštedu energije. Smanjenje broja aerobnih bakterija na uzorcima pile eg mesa nakon tretmana ultrazvukom postignuto je u rasponu od 0 do 0,8 log CFU/cm2, a autori su ponudili nepravilnost površine uzorka koja pruža zaštitu bakterijama kao mogu e objašnjenje tako ograni enog u inka tretmana ultrazvukom (Loretz i sur., 2010.). Stoga se tretman ultrazvukom koristi za smanjenje


broja bakterija naj eš e u kombinaciji s drugim metodama konzerviranja ili uz primjenu topline i povišenog tlaka, jer se tada u inak ultrazvuka pove ava (Turanta i sur., 2015.). Nadalje, nije utvr en pozitivan utjecaj ultrazvuka visokog intenziteta na ukupan broj bakterija tijekom uvanja, kao što je vidljivo u tablici 3. Ne postoji zna ajna razlika u broju bakterija u tretiranim i netretiranim uzorcima pile eg mesa kroz razdoblje od 7 dana. Iz rezultata proizlazi da tretman ultrazvukom nema dugotrajni u inak na smanjenje broja bakterija u uzorcima pile eg mesa pa se na takav na intretiranom pile em mesu ne može produžiti trajnost.

Zaklju ci

Funkcionalna i teksturna svojstva pile eg mesa poboljšana su tretmanom ultrazvukom u trajanju od 5 minuta pri frekvenciji 37 kHz, snazi 380 W i amplitudi 100%. Nije se pokazala zna ajna razlika izme u tretmana ultrazvukom u trajanju od 5 i 15 minuta u odnosu na ukupan broj bakterija u ispitanim uzorcima pile eg mesa. Postignuto je smanjenje broja bakterija od 0,5 log CFU/g. Budu i da antimikrobni u inak tretmana ultrazvukom viso-kog intenziteta u ultrazvu noj kupelji pri frekvenciji 37 kHz, snazi 380 W i amplitudi 100% nije trajan i ima samo ograni eni u inak na smanjenje broja bakterija, za postizanje odgovaraju eg antimikrobnog u inka tretman ultrazvukom trebao bi se primjenjivati u kombinaciji s drugim antimi-krobnim sredstvima.

LiteraturaBOYSEN, L., ROSENQUIST, H. (2009): Reduction of thermo-

tolerant Campylobacter species on broiler carcasses following physical decontamination at slaughter. J. Food Protect. 72, 497-502.

CHEMAT, F., ZILL-E-HUMA, M. K. KHAN (2011): Appli-cations of ultrasound in food technology: processing, preser-vation and extraction. Ultrasonics Sonochemistry 18, 813-835.

DELGADO, A. E., L. ZHENG, D. W. SUN (2009): Influence of ultrasound on freezing rate of immersion-frozen apples. Food Bioprocess Tech. 2, 263-270.

DOLATOWSKI, Z. J., J. STADNIK, D. STASIAK (2007): Appli-cations of ultrasound in food technology. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment. 6, 89-99.

FERNANDES, F. A. N., S. RODRIGUES (2008): Application of ultrasound and ultrasound-assisted osmotic dehydration in drying of fruits. Dry Technol. 26, 1509-1516.

HAUGHTON, P. N., J. G. LYNG, D. J. MORGAN, D. A. CRONIN, F. NOCI, S. FANNING, P. WHYTE (2012): An evaluation of the potential of high-intensity ultrasound for improving the microbial safety of poultry. Food Bioprocess Technol. 5, 992-998.

HIGAKI, K., S. UENO, T. KOYANO, K. SATO (2001): Effects of ultrasonic irradiation on crystallization behavior of tripal-mitoylglycerol and cocoa butter. J. Am. Oil Chem. Soc. 78, 513-518.

JAMBRAK, A. R., T. J. MASON, V. LELAS, Z. HERCEG, I. L. HERCEG (2008): Effect of ultrasound treatment on solubility and foaming properties of whey protein suspensions. J. Food Eng. 86, 281-287.

JAYASOORIYA, S. D., P. J. TORLEY, B. R. D’ARCY, B. R. BHANDARI (2007): Effect of high power ultrasound and ageing on the physical properties of bovine semitendinosus and longissimus muscles. Meat Sci. 75, 628-639.

KILCAST, D. (2004): Measuring consumer perceptions of texture: an overview. In: Texture in Food, Volume 2: Solid Foods. (D. Kilcast, ed.). Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 3-32.

KISSAM, A., R. NELSON, J. NGAO, P. HUNTER (1982): Water thawing of fish using low frequency acoustics. J. Food Sci. 47, 71-75.

LORETZ, M., R. STEPHAN, C. ZWEIFEL (2010): Antimicrobial activity of decontamination treatments for poultry carcasses: a literature survey. Food Control 21, 791-804.

LU, R., J. ABBOTT (2004): Force/deformation techniques for measuring texture. In: Texture in Food, Volume 2: Solid Foods. (D. Kilcast, ed.). Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 109-145.

MASON, J., F. CHEMAT, M. VINATORU (2011): The extraction of natural products using ultrasound or microwaves. Curr. Org. Chem. 15, 237-247.

PETRACCI, M., M. BIANCHI, S. MUDALAL, C. CAVANI (2013): Functional ingredients for poultry meat products. Trends Food Sci. Tech. 33, 27-39.

PIYASENA, P., E. MOHAREB, R. C. MCKELLAR (2003): Inactivation of microbes using ultrasound: a review. Int. J. Food Microbiol. 87, 207-216.

TURANTA , F., G. B. KILIÇ, B. KILIÇ (2015): Ultrasound in the meat industry: general applications and decontamination efficiency. Int. J. Food Microbiol. 198, 59-69.

VAN LAACK, R. L. J. M., C.-H. LIU, M. O. SMITH, H. D. LOVEDAY (2000): Characteristics of pale, soft, exudative broiler breast meat. Poult. Sci. 79, 1057-1061.

VERCET, A., P. LOPEZ, J. BURGOS (1999): Inactivation of heat-resistant pectinmethylesterase from orange by manothermo-sonication. J. Agr. Food Chem. 47, 432-437.

INFLUENCE OF HIGH POWER ULTRASOUND ON THE QUALITY OF CHICKEN MEAT

Summary

The aim of this study was to determine quality parameters of raw chicken meat after treatment with high power ultrasound. The results showed that there was no significant difference in the total number of bacteria between the samples treated in ultrasonic bath for 5 and 15 minutes and that ultrasound treatment had no lasting effect on destruction of bacteria in chicken meat. In contrast, functional properties of chicken meat were improved by treatment with ultrasound for 5 minutes at a frequency of 37 kHz, 380 W power and amplitude of 100%.

Key words: chicken meat, high power ultrasound, texture, quality


U INAK BOSILJKA (OCIMUM BASILICUM CV. "GENOVESE") U HRANI ZA KONZUMNE NESILICE NA HUMORALNU I STANI NU IMUNOST

Mirta Balenovi 1, Tajana Amšel Zelenika1, Zlatko Janje i 2, Klaudija Carovi -Stanko3, Maja Popovi 4, Dalibor Bedekovi 2, Vladimir Savi 1

1Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Zagreb, Hrvatska 2Agronomski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za hranidbu životinja, Zagreb, Hrvatska 3Agronomski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za sjemenarstvo, Zagreb, Hrvatska 4Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za biologiju, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U radu je istražena u inkovitost osušenog bosiljka u hrani konzumnih nesilica na kinetiku ukupnih leukocita, pomo ni kih i citotoksi nih T limfocita kao i B limfocita u perifernoj krvi te titara protutijela za newcastlesku bolest i sindrom pada nesivosti. U istraživanju je korištena kultivirana botani ka vrsta bosiljka Ocimum basilicum "Genovese". Nesilice su hranjene uobi ajenom smjesom za nesilice uz dodatak 1% i 3% samljevene herbe bosiljka. U obje pokusne skupine vidljiv je statisti ki zna ajan porast (p<0,01) ukupnih leukocita kao i pomo ni kih i citotoksi nih T limfocita u odnosu na kontrolnu skupinu, pri emu je taj porast bio intenzivniji i brži u pokusnoj skupini koja je dobila 3% samljevene herbe bosiljka. Zastupljenost B limfocita bilježi statisti ki zna ajne promjene (p<0,05) u skupini koja je dobivala 1% samljevene herbe bosiljka, dok je u skupini s 3% zastupljenost B limfocita opadala kroz promatrano razdoblje. Prema dobivenim rezultatima može se zaklju iti da je bosiljak izazvao pove anje B limfocita, ali to pove anje nije bilo statisti ki zna ajnove e. Relativno slabi porast B limfocita može se povezati sa slabim porastom titra inhibicije aglutinacije protutijela na viruse newcastleske bolesti i sindroma pada nesivosti. Naše istraživanje potvr uje da postoji imunostimulacijsko djelovanje bosiljka dodanog u hrani konzumnih nesilica. Za istraživanje utjecaja na humoralni imuni odziv i poboljšanje imunog odziva na cijepljenje valjalo bi ispitati u inak dodanog bosiljka u vrijeme prije i tijekom provo enja uobi ajenog programa iumunoprofilakse.

Klju ne rije i: bosiljak, imunostimulacijsko djelovanje, stani na imunost, humoralna imunost, konzumne nesilice

Uvod

Peradarska proizvodnja sve više je usmjerena prema za-dovoljavanju zahtjevnog tržišta koje traži kvalitetnu i zdravu hranu. Intenziviranjem peradarske proizvodnje mijenjale su se uzgojne i hranidbene metode radi bolje iskorištenosti genetskog proizvodnog potencijala peradi. Takva pro-izvodnja rezultirala je visokom proizvodnoš u, ali neiz-bježno i ve om osjetljivoš u peradi na stres i zarazne bolesti. Hranidba je vrlo važan modulator imunog sustava, stoga je odgovaraju a uravnoteženost hranjivih tvari i koli ina prehrane vrlo važna za razvoj, održavanje i odgovor imunog sustava životinje. Oblikovanje imunog sustava putem pre-hrane ima cilj smanjenje pojavnosti zaraznih bolesti, a time i

smanjenje nepovoljnog u inka imunog odgovora na rast, proizvodnju jaja i u estalost bolesti metabolizma u peradi (Koutsos i Klasing, 2003.). Hranidbene potrebe mogu biti znatno promijenjene kod pojave klini ke, ali i subklini kebolesti, dok hranidba može utjecati na imunokompetenciju, a posljedi no tomu i na otpornost životinje prema uzro -nicima bolesti (Grimble, 2001.). Imuni sustav doma ih životinja nije autonoman, ve je pod stalnim utjecajem ostalih fizioloških sustava, ali i pod utjecajem velikog broja okolišnih initelja pa tako i uobi ajenih sastojaka hrane i dodataka hrani, odnosno nutrijenata i nutraceutika (Mrši i sur., 2011.). Za poticanje rasta esto su se primjenjivali antibiotski poticatelji rasta (APR). Zbog mogu e pojave rezistencije na neke patogene bakterije i parazite, a time i

dr. sc. Mirta Balenovi , dr. vet. med., Centar za peradarstvo, Hrvatski veterinarski institut, Heinzelova 55, 10000 Zagreb; tel: +385 (1) 2440209; faks: +385 (1) 2441392; e-mail: [email protected]


138

ugrožavanja zdravlja ljudi, primjena mnogih APR zabra-njena je diljem Europske Unije, ali i u dijelovima Azije (Lillehoj i Lee, 2012.). Hranidba, uz to što mora zadovoljiti nutritivne potrebe ovisno o uzgojnoj kategoriji, mora stimu-lacijski djelovati i na sve aktivne sudionike imunog sustava i time poja avati otpornost organizma na zarazne bolesti. Sve manja upotreba APR u intenzivnom uzgoju doma ih životinja namijenjenih prehrani ljudi potakla je intenzivno istraživanje alternativnih tvari (probiotici, prebiotici i imu-nomodulatori) kao dodataka hrani koji bi trebali nadomjestiti APR (Gallois i sur., 2009.). Ljekovito bilje i bilje koje nalazimo u prirodi od davnina se koristi za lije enje ljudi. Aktivni sastojci u liš u, stabljici, sjemenki i korijenu poje-dinih ljekovitih biljaka su vrlo u inkoviti u borbi protiv zaraznih bolesti i poboljšanju probave (Ashayerizadeh i sur., 2009.). Imuni sustav životinja kao i ljudi predstavlja specifi numrežu specijaliziranih organa, tkiva i stanica kao i razli itih bitnih biokemijskih tvari koje štite organizam od djelovanja patogenih imbenika. On ima važnu ulogu u održavanju otpornosti organizma. Isto tako poznato je da neke skupine hranjivih tvari mogu djelovati pozitivno ili negativno na imuni odgovor životinja. Me u dodacima u prehrani za životinje koji mogu utjecati na imuni odgovor organizma zna ajan utjecaj imaju eteri na biljna ulja i razli iti biljni ekstrakti. U na inu djelovanja biljnih aktivnih tvari naj-važnije aktivnosti su: poboljšanje endogenih enzima sekreta, poticanje apetita, probavljivost i uzimanja hrane, poboljšanje ravnoteže mikroflore, smanjenje broja E. coli i Clostridiumspp. i stimulacija proliferacije Lactobacillus spp., antibak-terijska, antivirusna i stimulacija imunog sustava. (Jamroz, 2005.). Lillehoj i Lee (2012.) u svom radu isti u da fitonutrijenti i fitokemikalije kao biljni ili vo ni kemijski spojevi imaju u inak na zdravlje, uklju uju i i ubijanje tumorskih stanica i pove anje otpornosti organizma na zarazne bolesti te se koriste za dobrobit zdravlja u mnogim kulturama vetisu lje ima. Tako er navode da su brojne studije pokazale kako fitonutrijenti sudjeluju u prevenciji bolesti ili ja anju imunog odgovora, ali isto tako da ima vrlo malo istraživanja koja ispituju temeljne mehanizme njihovih specifi nih imunomodulacijskih u inaka. Ve ina fitokemikalija poznata je po svojim protuupalnim svojstvima, a sve ve i broj istraživanja pokazao je da prehrana bogata protuupalnim fitokemikalijama može imati pozitivne u inke na oporavak organizma nakon bolesti. Primjena ovakvih aktivnih tvari omogu ava novi na in razvojne strategije u kontroli bolesti korištenjem prirodnih namirnica i biljnih proizvoda u smanjenju u inka infekcije i u ja anju imunog odgovora doma ina protiv mikrobnih infekcija. Ovaj pristup temelji se na brojnim znanstvenim podacima koji pokazuju da imu-nomodulatori prirodnih i biljnih proizvoda imaju zna ajanpozitivni u inak u mnogim uzgojima farmskih životinja, kao i kod ljudi. Bosiljak smatraju kraljem me u biljkama i jedna je od najstarijih i najpopularnijih biljaka prepuna zna ajnih zdrav-stveno korisnih fitonutrijenata. Ova biljka štuje se kao

"Sveta biljka" u mnogim tradicijama širom svijeta. Bosiljak pripada obitelji Lamiaceae, rodu: Ocimum, a njegovo botani ko ime je Ocimum basilicum L. (Bilal i sur., 2012.; Charles, 2013.). Glavni aktivni sastojci lista bosiljka su flavonoidi, vicenin, estragol, linalool, cineol, eugenol, limo-nene i sabinene (Jamroz, 2005.). Flavonoidi su fitokemijske aktivne tvari u biljaka pa tako i bosiljka za koje se zna da imaju iznena uju e u inke na zdravlje. Njihova modula-cijska uloga u nekim biološkim procesima identificirana je kao oksidacija, detoksikacija enzima, apoptoza te ja anjeimunog sustava doma ina. Tako er su poznati u poboljšanju morfologije i funkcionalnosti sluznice crijeva, utje u na veli inu imunih organa i regulaciju toplinskog stresa u doma ih životinja (Kamboh i sur., 2015.). Jamroz (2005.) navodi da flavonoidi iz lista bosiljka imaju imuno-stimulativno djelovanje te da imaju zna ajnu ulogu kod podržavanja stani nih antioksidacijskih mehanizama. Ta-ko er Kamboh i Zhu (2014.) u svom istraživanju dokazuju da aktivne tvari kao što su izoflavoni i flavanoni mogu utjecati na imunostimulaciju, te da se mogu koristiti kao alternativni dodatak u hranidbi u peradarskoj proizvodnji kao promotori zdravlja crijeva i poboljšanja imunog sustava. Flavonoidima se pripisuju mnoga terapijska djelovanja kao što su antibakterijsko, protuupalno, antialergijsko, antimu-tageno, antiviralno i antikancerogeno (Kazazi , 2004.). Cilj našega istraživanja bio je dokazati u inkovitost osu-šenog bosiljka u hrani konzumnih nesilica na kinetiku ukupnih leukocita, pomo ni kih i citotoksi nih T limfocita kao i B limfocita u perifernoj krvi te titara protutijela za newcastlesku bolest i sindrom pada nesivosti. U istraživanju smo koristili kultiviranu botani ku vrstu bosiljka Ocimumbasilicum "Genovese" (Carovi -Stanko i sur., 2010.).

Materijal i metode

Biološko istraživanje U istraživanju smo koristili konzumne nesilice linije Tetra SL u dobi od 22 tjedna. Tri tjedna prije po etka pokusa nesilice su bile hranjene smjesom za nesilice bez dodanog sintetskog pigmenta radi iš enja organizma od nataloženog pigmenta. Nesilice su raspodijeljene u tri skupine po 15 nesilica: kontrolnu skupinu (K) koja je hranjena uobi a-jenom smjesom za nesilice sa sintetskim pigmentom; poku-snu skupinu B1 hranjenu uobi ajenom smjesom za nesilice uz dodatak 1% samljevene herbe bosiljka i pokusnu skupinu B3 hranjenu uobi ajenom smjesom za nesilice uz dodatak 3% samljevene herbe bosiljka. Bosiljak je uzgojen u Zavodu za sjemenarstvo na Agronomskom fakultetu Sveu ilišta u Zagrebu. Tijekom pokusa u trajanju od 4 tjedna nesilicama su hrana i voda bila dostupne po volji (ad libitum). Krv smo uzorkovali nasumice odabranim nesilicama punkcijom iz krilne vene uz dodatak citrata kao antikoagulansa na po etkupokusa, 14. i 28. dana pokusa, odnosno u dobi konzumnih nesilica od 25, 27 i 29 tjedana. Radi lakšeg pra enjarezultata ozna ili smo svaku skupinu s dobi u kojoj je krv uzorkovana (tablica 1.).


139

Tablica 1. Oznake i objašnjenje skupina

K-25 Kontrolna skupina u dobi od 25 tjedana (0. dan pokusa) K-27 Kontrolna skupina u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) K-29 Kontrolna skupina u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) B1-27 Pokusna skupina koja je dobila 1% samljevene herbe bosiljka u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) B3-27 Pokusna skupina koja je dobila 3% samljevene herbe bosiljka u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) B1-29 Pokusna skupina koja je dobila 1% samljevene herbe bosiljka u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) B3-29 Pokusna skupina koja je dobila 3% samljevene herbe bosiljka u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa)

astatisti ki zna ajno ve a vrijednost (p<0,01) u odnosu na vrijednost utvr enu u kontrolnoj skupini u istom razdoblju / Statistically significant higher value (p<0.01) in comparison to the value determined in the control group in the same period

b statisti ki zna ajno ve a vrijednost (p<0,01) u odnosu na prethodno utvr enu vrijednost unutar iste skupine / Statistically significant higher value (P<0.01) in relation to the previously determined value within the same group

K-25: kontrolna skupina u dobi od 25 tjedana (0. dan pokusa) /

control group at the age of 25 weeks (0 day of the trial);K-27: kontrolna skupina u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) /

control group at the age of 27 weeks (14th day of the trial);K-29: kontrolna skupina u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) /

control group at the age of 29 weeks (28th day of the trial);B1-27: pokusna skupina koja dobila 1% samljevene herbe bosiljka u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) /

group treated with 1% milled herb basil at the age of 27 weeks (14th day of the trial);B3-27: pokusna skupina koja dobila 3% samljevene herbe bosiljka u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) /

group treated with 3% milled herb basil at the age of 27 weeks (14th day of the trial);B1-29: pokusna skupina koja dobila 1% samljevene herbe bosiljka u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa)

group treated with 1% milled herb basil at the age of 29 weeks (28th day of the trial);B3-29: pokusna skupina koja dobila 3% samljevene herbe bosiljka u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) /

group treated with 3% milled herb basil at the age of 29 weeks (14th day of the trial).

Slika 1. Zastupljenost ukupne leukocitne populacije heterogenog uzorka pune periferne krvi konzumnih nesilica sve tri skupine tijekom istraživa kog razdoblja.

Figure 1. Abundance of total leukocyte population of a heterogeneous sample in the peripheral blood of laying hens in all threegroups during the trial period.


140

Proto na citometrija

Za odre ivanje ukupnog broja leukocita, subpopulacije T limfocita i B limfocita koristili smo monoklonska protutijela (mPt) protiv kokošjih CD antigena CD45

+, CD4+, CD8

+ i CD21

+ (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birming-ham, SAD) koja su obilježena fluorescentnim bojama. Broj leukocita iz uzoraka periferne krvi (100 mL) odre en je proto nim citometrom (Coulter EPICS-XL, Beckman Coulter, SAD). Uzorci krvi su razrije eni otopinom fosfatnog pufera (PBS) do postizanja koncentracije leukocita od 5.0-9.7x109/L. Na 100 L tako pripremljene krvi dodano je 50 μL monoklonskih protutijela protiv pti jih CD+

limfoidnih markera (biljega?). Uzorci su ra eni u triplikatu, iz svakog je analizirano 10 000 stanica u proto nom citometru.

Inhibicija hemaglutinacije Inhibicija hemaglutinacije (IHA) za virus newcastleske bolesti i sindrom pada nesivosti izvedena je beta postupkom u plasti nim mikrotitracijskim plo ama s „V“ dnom. Upotrijebljene su 4 hemaglutinacijske jedinice odgova-raju eg antigena i 1%-tni eritrociti pijetla. Titri inhibiraju ih protutijela prikazani su kao negativni logaritam baze 2 najve eg razrje enja seruma pri kojem je još uvijek bila prisutna inhibicija hemaglutinacija.


b statisti ki zna ajno ve a vrijednost (p<0,01) u odnosu na prethodno utvr-enu vrijednost unutar iste skupine /

Statistically significant higher value (P<0.01) in relation to the previously determined value within the same group

K-25: kontrolna skupina u dobi od 25 tjedana (0. dan pokusa) / control group at the age of 25 weeks (0 day of the trial);K-27: kontrolna skupina u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) / control group at the age of 27 weeks (14th day of the trial);K-29: kontrolna skupina u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) / control group at the age of 29 weeks (28th day of the trial);B1-27: pokusna skupina koja dobila 1% samljevene herbe bosiljka u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) / group treated with 1% milled herb basil at the age of 27 weeks (14th day of the trial);B3-27: pokusna skupina koja dobila 3% samljevene herbe bosiljka u dobi od 27 tjedana (14. dan pokusa) / group treated with 3% milled herb basil at the age of 27 weeks (14th day of the trial);B1-29: pokusna skupina koja dobila 1% samljevene herbe bosiljka u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) group treated with 1% milled herb basil at the age of 29 weeks (28th day of the trial);B3-29: pokusna skupina koja dobila 3% samljevene herbe bosiljka u dobi od 29 tjedana (28. dan pokusa) / group treated with 3% milled herb basil at the age of 29 weeks (14th day of the trial).

Slika 2. Zastupljenost pomo ni kih T limfocita u ukupnom homogenom uzorku leukocita pune periferne krvi konzumnih nesilica u sve tri skupine tijekom istraživa kog razdoblja.

Figure 2. Abundance of helper T lymphocyte of a homogeneous sample of the total leukocytes in the peripheral blood of laying hens in all three groups during the trial period.


141

Statistika Prikupljene podatke obradili smo primje-nom statisti kogra unalnog referentnog programa Statistica 10 (StatSoft, Inc., 2011.). Osnovnu obradu podataka obavili smo postup-cima deskriptivne statistike. Za utvr ivanje zna ajnosti razlika izme u kontrolne skupine i pokusnih skupina kon-zumnih nesilica koje su tretirane dodatkom 1% i 3% sa-mljevene herbe bosiljka koristili smo t-test zavisnih uzoraka.

Rezultati i rasprava Statisti ka obrada podataka provedena je na uzorcima kon-zumnih nesilica u kontrolnoj skupini, pokusnoj skupini kon-

zumnih nesilica koja je dobila 1% samljevene herbe bosiljka i pokusnoj skupini konzumnih nesilica koja je dobila 3% samljevene herbe bosiljka u odre enim vremenskim raz-macima. Kretanje ukupnih leukocita, pomo ni kih T lim-focita, citotoksi nih T limfocita i B limfocita po skupinama tijekom promatranog razdoblja prikazano je na slikama 1., 2., 3. i 4., gdje je ucrtana aritmeti ka sredina, standardna devijacija i standardna pogreška za pojedina razdoblja i skupine. Utvr ene aritmeti ke sredine i standardna devijacija prikazani su u tablicama 2. i 3. za inhibiciju hemaglutinacije titra (log2) za newcastlesku bolest i sindrom pada nesivosti.




Slika 3. Zastupljenost citotoksi nih T limfocita u ukupnom homogenom uzorku leukocita pune periferne krvi konzumnih nesilica u sve tri skupine tijekom istraživa kog razdoblja.

Figure 3. Abundance of cytotoxic T lymphocyte of a homogeneous sample of the total leukocytes in the peripheral blood of laying hens in all three groups during the trial period.


142




Slika 4. Zastupljenost B limfocita u ukupnom homogenom uzorku leukocita pune periferne krvi konzumnih nesilica u sve tri skupine tijekom istraživa kog razdoblja.

Figure 4. Abundance of B lymphocyte of a homogeneous sample of the total leukocytes in the peripheral blood of laying hens in all three groups during the trial period.

Tablica 2. Srednje vrijednosti i standardna devijacija titra IHA protutijela za virus newcastleske bolesti po skupinama tijekomistraživa kog razdoblja

Table 2. Mean value and standard deviation of HI antibody titres to Newcastle disease virus in groups during the trial period.

Skupine / Groups

IHA titar* ± SD** / HI titer* ± SD**Dob 25. tjedan (0. dan pokusa)

25 weeks of age(0 day of the trial)

Dob 27. tjedan (14. dan pokusa)27 weeks of age

(14th day of the trial)


(28th day of the trial)Kontrola / Control 8,5±1,29 8,4±2,27 8,6±1,71 Bosiljak 1% / Sweet basil 1% - 9,0±2,00 9,1±1,10 Bosiljak 3% / Sweet basil 3% - 9,4±1,59a 8,8±1,09astatisti ki zna ajno ve a vrijednost (p<0,05) u odnosu na vrijednost utvr enu u kontrolnoj skupini u istom razdoblju / statistically significant higher value (p<0.05) in comparison to the value determined in the control group in the same period *srednja vrijednost IHA titra (log2) / mean value of HI titres (log2)**standardna devijacija / standard deviation


143

Tablica 3. Srednje vrijednosti i standardna devijacija titra IHA protutijela za virus sindroma pada nesivosti po skupinama tijekom istraživa kog razdoblja

Table 3. Mean value and standard deviation of HI antibody titres to egg drop syndrome virus in groups during the trial period.

Skupine / Groups

IHA titar* ± SD** / HI titer* ± SD**Dob 25. tjedan (0. dan pokusa)

25 weeks of age(0 day of the trial)

Dob 27. tjedan (14. dan pokusa) 27 weeks of age

(14th day of the trial)


(28th day of the trial)Kontrola / Control 4,3±1,11 4,2±0,45 4,2±0,44 Bosiljak 1% / Sweet basil 1% - 4,6±0,55 5,0±0,87a

Bosiljak 3% / Sweet basil 3% - 4,8±0,45 5,3±0,49a

astatisti ki zna ajno ve a vrijednost (p<0,05) u odnosu na vrijednost utvr enu u kontrolnoj skupini u istom razdoblju / statistically significant higher value (p<0.05) in comparison to the value determined in the control group in the same period *srednja vrijednost IHA titra (log2) / mean value of HI titres (log2)**standardna devijacija / standard deviation

U stani noj imunosti T limfociti imaju vrlo važnu ulogu. Pomo ni ki T limfociti imaju regulacijsku ulogu i uklju enisu u stani nu i humoralnu imunu reakciju. U sisavaca i ptica ste ena imunost prema patogenima ovisi o odzivu T lim-focita, osobito o odzivu pomo ni kih T limfocita. Cito-toksi ni T limfociti imaju izvršnu ulogu u stani noj imunoj reakciji, a najve a uloga citotoksi nih T limfocita je uklanjanje virusno inficiranih stanica (Balenovi , 2008.). Na slikama 1., 2. i 3. je vidljivo da u kontrolnoj skupini (K-25, K-27, K-29) nije došlo do statisti ki zna ajne promjene niti jednog promatranog parametra kroz istraživano razdoblje. Zastupljenost ukupnih leukocita i leukocitnih subpolulacija u kontrolnoj skupini odgovara kategoriji peradi (Fair i sur., 2008.). U obje pokusne skupine vidljiv je statisti ki zna ajan porast (p<0,01) ukupnih leukocita kao i pomo ni kih i citotoksi nih T limfocita u odnosu na kontrolnu skupinu (osim skupine B1-27), pri emu je taj porast bio intenzivniji i brži u pokusnoj skupini koja je dobila 3% samljevene herbe bosiljka. Tako er statisti ki zna ajan porast (p<0,01) zabilježen je u istoj pokusnoj skupini u odnosu na prethodno razdoblje. Na temelju dobivenih rezultata može se re i da je ve a koli ina bosiljka u hrani pokazala bolju u inkovitost i brže postizanje stani nog imunog odgovora. Promatraju izastupljenost B limfocita (slika 4.) zabilježene su statisti ki zna ajne promjene (p<0,05) u skupini koja je dobivala 1% samljevene herbe bosiljka, dok je u skupini s 3% zastup-ljenost B limfocita opadala kroz promatrano razdoblje. Prema dobivenim rezultatima može se zaklju iti da je bosiljak izazvao pove anje B limfocita, ali to pove anje nije bilo statisti ki zna ajno ve e.Humoralni imuni odziv temelji se na djelovanju humoralnih protutijela (lat. humor, tjelesni sok, teku ina) koja se nalaze u krvi i drugim tjelesnim teku inama i izlu evinama. Tvore ih plazma-stanice koje nastaju od B limfocita. Svaki B limfocit specifi an je samo za odre en antigen, odnosno antigensku determinantu, a prepoznaje ga pomo u povr-šinskih imunoglobulina koji služe kao receptori antigena. Imunoglobulini su glavni proteini u prepoznavanju antigena koji se mogu povezati sa slobodnim antigenskim peptidima i

prijeko su potrebni u kona nom uklanjanju patogena. Imunoglobulini su površinski proteinski receptori na B limfocitima i mogu biti u cirkulaciji i na mukoznoj površini pomo u plazma-stanica kao protutijela (Balenovi , 2008.). S obzirom na to da su B limfociti odgovorni za prepoznavanje antigena te tvorbu specifi nih protutijela kao odgovor na antigene, relativno slabi porast B limfocita možemo povezati sa slabim porastom titra IHA protutijela na viruse newcastleske bolesti i sindroma pada nesivosti. U tablicama 2. i 3. prikazane su srednja vrijednost i standardna devijacija za IHA protutijela za virus newcastleske bolesti i sindroma pada nesivosti u konzumnih nesilica koje su cijepljene prema utvr enom programu provedene imunoprofilakse. Iz tablice 2. je vidljivo da u kontrolnoj skupini nije došlo do statisti ki zna ajnih promjena kroz cijelo promatrano raz-doblje. U pokusnoj skupini koja je dobivala 3% samljevene herbe bosiljka zabilježen je statisti ki zna ajan porast (p>0,05) u odnosu na vrijednost utvr enu u kontrolnoj skupini u 14. danu istraživanja. U ostalim skupinama nije zabilježen statisti ki zna ajan porast titra protutijela na virus newcastleske bolesti. Statisti ki zna ajan porast (p>0,05) titra protutijela za virus sindroma pada nesivosti zabilježen je u obje pokusne skupine u odnosu na vrijednost utvr enu u kontrolnoj skupini u 28. danu istraživanja (tablica 3.). Perelman i sur. (2013.) su u svom istraživanju zabilježili statisti ki ve u vrijednost titra protutijela na virus newcastleske bolesti te su dokazali da primjena fitokemijske tvari može oja ati imuni odgovor izazvan cijepljenjem protiv virusa newcastleske bolesti u pili a, a vjerojatno i drugih animalnih virusa. Tako er zaklju uju da su fito-kemikalije (sekundarni biljni metaboliti) kao biološki aktivni spojevi biljaka poja ali imuni odgovor i potisnuli upalne reakcije. Naše istraživanje potvr uje da postoji imunostimulacijsko djelovanje bosiljka dodanog u hrani konzumnih nesilica. No, za istraživanje utjecaja na humoralni imuni odziv i po-boljšanje imunog odziva na cijepljenje valjalo bi proširiti istraživanje na uzgojne kategorije nesilica, odnosno istražiti u inak dodanog bosiljka u vrijeme prije i tijekom provo-enja uobi ajenog programa imunoprofilakse.


144

Literatura

ASHAYERIZADEH, O., B. DASTAR, M. SHAMS SHARGH, A. ASHAYERIZADEH, E. RAHMATNEJAD, S. M. R. HOSSAINI (2009): Use of garlic (Allium sativum), black cumin seeds (Nigella sativa L.) and wild mint (Mentha longifolia) in broiler chickens diets. J. Animal Vet. Adv. 8(9), 1860-1863.

BALENOVI , M. (2008): Kinetika tvorbe IFN- , IL-2 i T limfocita u tovnih pili a imuniziranih živim i inaktiviranim cjepivom protiv newcastleske bolesti. Doktorska disertacija. Veteri-narski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zagreb.

BILAL, A., N. JAHAN, A. AHMED, S. N. BILAL, A. HABIB, S. HAJRA (2012): Phytochemical and pharmacological studies on Ocimum basilicum Linn – a review. Int. J. Cur. Res. Rev. 23(4), 73-83.

CAROVI -STANKO, K., S. ORLI , O. POLITEO, F. STRIKI ,I. KOLAK, M. MILOŠ, Z. SATOVI (2010): Composition and antibacterial activities of essential oils of seven Ocimum taxa. Food Chem. 119, 196-201.

CHARLES, D. J. (2013): Basil. U: Antioxidant Properties of Spices, Herbs and Other Sources, Springer, New York, 173-179.

FAIR, J. M., K. J. TAYLOR-McMABE, Y. SHOU, B. L. MARRONE (2008): Immunophenotyping of chicken peripheral blood lymphocyte subpopulations: individual variability and repeatability. Vet. Immunol. Immunopathol. (125) 268-273.

GALLOIS, M., H. J. ROTHKØTTER, M. BAILEY, C. R. STOKES, I. P. OSWALD (2009): Natural alternatives to in-feed antibiotics in pig production: can immunomodulators play a role? Animal 3, 1644-1661.

GRIMBLE, R. F. (2001): Nutritional modulation of immune function. Proc. Nutrit. Soc. 60, 389-397.

JAMROZ, D. (2005): Nutritional factors supporting the immune response in animals. Krmiva, 47(4), 207-219.

KAMBOH, A. A., W. Y. ZHU (2014): Individual and combined effects of genistein and hesperidin on immunity and intestinal morphometry in lipopolysaccharide-challenged broiler chickens. Poult. Sci. 93(9), 2175-2183.

KAMBOH, A. A., M. A. ARAIN, M. J. MUGHAL, A. ZAMAN, Z. M. ARAIN, A. A. SOOMRO (2015): Flavonoids: health promoting phytochemicals for animal production – a review. J. Animal Health Product. 3(1), 6-13.

KAZAZI , S. P. (2004): Antioksidacijska i antiradikalska aktivnost flavonoida. Arh. Hig. Rada Toksikol. 55, 279-290.

KOUTSOS, E. A., K. C. KLASING (2008): Factors modulating the avian immune system. U: Avian Immunology (Eds. F. Davison, B. Kaspers, K. A. Schat). Academic Press, Elsevier Ltd. 323-338.

LILLEHOJ, H. S., K. W. LEE (2012): Immune modulation of innate immunity as alternatives-to-antibiotics strategies to mitigate the use of drugs in poultry production. Poult. Sci. 91, 1286-1291.

MRŠI , G., D. ŠPOLJARI , H. VALPOTI , M. BALENOVI ,L. KOZA INSKI, I. ŠPOLJARI , I. VALPOTI , V. SAVI ,S. SRE EC, M. POPOVI (2011): imunomodulacijski u inak plemenite pe urke Agaricus bisporus u tovnih pili a. Vet. stanica 42(3), 431-439.

PERELMAN, D., W. F. GOLDMAN, R. J. WERNIK, G. BORKOW (2013): Enhancement of antibody titers against Newcastle disease virus in vaccinated chicks by administration of Phyto V7. J Vaccines Vaccin. 4:203. doi: 10.4172/2157-7560.1000203.

EFFECT OF SWEET BASIL (OCIMUM BASILICUM CV. 'GENOVESE') IN LAYING HEN FEED ON HUMORAL AND CELLULAR IMMUNITY

Summary

The aim of the study was to assess the effects of dried basil in laying hen feed on total leukocyte, helper and cytotoxic T lymphocyte and B lymphocyte kinetics in peripheral blood, and on the titers of Newcastle disease and egg drop syndrome antibodies. The botanic basil cultivar Ocimum basilicum cv. 'Genovese' was used in the study. Laying hens were fed the usual feed mixture with the addition of 1% and 3% milled basil herb. In comparison with control group, both experimental groups showed a statistically significant increase (p<0.01) in total leukocytes, helper and cytotoxic T lymphocytes; this increase was more intensive and faster in the experimental group that received 3% milled basil herb. The level of B lymphocytes showed a statistically significant change (p<0.05) in the group administered 1% basil herb, whereas a decrease was recorded in the group that received 3% milled basil herb. Study results suggested that the addition of basil in laying hen feed induced an increase in B lymphocytes, however, without statistical significance. The relatively weak B lymphocyte increase could be related to the weak increase in the hemagglutination inhibition (HI) titer of antibody to the Newcastle disease and egg drop syndrome viruses. Our study confirmed the immunostimulatory effect of basil added to laying hen feed. Concerning its effect on humoral immune response and enhanced immune response to vaccination, the effect of basil should be assessed before and during implementation of the usual immunoprophylaxis program.

Key words: basil, immunostimulatory effect, cellular immunity, humoral immunity, laying hens


OBRAZOVNE POTREBE HRVATSKIH PERADARSKIH PROIZVO A A

ur ica Žutini 1, Radmila Raguž- uri 2

1Agronomski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za agrarnu ekonomiku i ruralni razvoj, Zagreb, Hrvatska 2Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U radu se prikazuje dio rezultata empirijskog istraživanja o stru nom usavršavanju i obrazovnim potrebama peradarskih proizvo a a provedenog na reprezentativnom uzorku. Cilj rada bio je ustanoviti kako peradarski proizvo a i prosu uju potrebu o stru nom usavršavanju, koja znanja i vještine smatraju najpotrebnijim za unaprje enje svoje proizvodnje te postoje li statisti ki zna ajne razlike u njihovim stavovima i mišljenjima. Analiza je pokazala da ve ina peradarskih proizvo a a (82,1%) drži korisnim uspostavu sustava za trajno stru no usavršavanje. Ispitanici su najviše zainteresirani za stru na predavanja i te ajeve iz podru ja bolesti peradi (prosje na ocjena u rasponu od 3,82 do 3,78) te iz tehnologije proizvodnje i hranidbe peradi (prosje na ocjena u rasponu od 3,68 do 3,61).

Klju ne rije i: obrazovne potrebe, stru no usavršavanje, kompetencije i vještine, peradarski proizvo a i

Uvod

Posljednjih desetlje a poljoprivredni proizvo a i se suo a-vaju s brojnim izazovima kao što su sve ve a konkurentnost na globalnom tržištu hrane, brzi razvoj i primjena novih tehnologija u poljoprivrednoj proizvodnji, uskla ivanje proi-zvodnje s visokim standardima kvalitete i sigurnosti proiz-voda, poštivanje i primjena na ela održivog upravljanja okolišem, rigorozni propisi u osiguranju zdravlja i dobrobiti životinja i dr. Da bi odgovorili tim izazovima poljoprivredni proizvo a i moraju stalno usavršavati svoja stru na znanja, razvijati nove organizacijske sposobnosti i vještine kako bi uspješnije upravljali farmom i u inkovitije koristili proiz-vodne resurse. Klju nu ulogu u stvaranju tih kompetencija i vještina ima cjeloživotno u enje u konceptu kojega sve više dolaze do izražaja neformalni i informalni oblici u enja i obrazovanja. Po ocjeni stru njaka Hrvatska unato svojim komparativnim prednostima za razvoj peradarske proizvodnje (dugogo-dišnja tradicija, genetski potencijal peradi za produktivnu proizvodnju, izvorne pasmine i dr.) nije dosegla željenu razinu proizvodnje u raznovrsnosti asortimana te u koli ini peradarskih proizvoda dodane vrijednosti (Raguž- uri i sur. 2006.). Jedan od bitnih uvjeta snaženja konkurentnosti doma e peradarske proizvodnje na lokalnom i EU tržištu

jest razvoj ljudskih potencijala (radne snage) kroz razli ite oblike cjeloživotnog u enja.Istraživanja o cjeloživotnom obrazovanju peradarskih proiz-vo a a su tema prou avanja mnogih autora. Tako Pardue (1997.) u svom radu naglašava da zbog rasta potrošnje pera-darskih proizvoda u svijetu proizvo a i se moraju dodatno osposobljavati i usavršavati kako bi uspješno savladali taj izazov. Roberts (2010.) u svom istraživanju o pristupima cjeloživotnog u enja u peradarskoj industriji Australije isti eda ta proizvodnja postaje tehnološki sve zahtjevnija te pera-dari trebaju stjecati nove kompetencije i vještine za uspješno poslovanje. U svom radu Flock i Damme (2010.) smatraju da je jedan od važnijih ciljeva obrazovanja budu ih pera-darskih proizvo a a pripremiti ih za cjeloživotno u enje.Leenstra i sur. (2010.) argumentiraju da peradarski proiz-vo a i uz specifi na tehnološka znanja i vještine iz podru japroizvodnje, prerade, hranidbe i zdravlja peradi sve više moraju imati vještine za upravljanje ljudskim resursima te vještine za procjenjivanje i selektiranje brojnih informacija. Istodobno srodna istraživanja o cjeloživotnom obrazovanju u poljoprivredno-prehrambenom sektoru naglašavaju da je u osmišljavanju programa stru nih te ajeva i na ina komuni-kacije s farmerima nužno empirijski ustanoviti koje su nji-hove obrazovne potrebe (Ford, 1995.; Lans i sur., 2004.; Žutini i Raguž- uri , 2009.; Žutini i sur. 2010. i drugi).

prof. dr. sc. ur ica Žutini , Agronomski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za agrarnu ekonomiku i ruralni razvoj, Svetošimunska 25, Zagreb, Hrvatska. Tel: +385(0) 1 2393-742, Fax: +385(0) 1 2393-745. e-mail: [email protected]

OBRAZOVNE POTREBE HRVATSKIH PERADARSKIH PROIZVO A A146

U ovom lanku iznosimo dio rezultata istraživanja o cjelo-životnom obrazovanju peradarskih proizvo a a. Osnovni cilj rada bio je ustanoviti: (a) subjektivne prosudbe peradarskih proizvo a a o važnosti stru nog usavršavanja; (b) utvrditi koja znanja i vještine smatraju najpotrebnijima za unaprje enje svoje proizvodnje i u inkovitost poslovanja te (c) utvrditi razlike u njihovim mišljenjima s obzirom na socio-demografska obilježja i proizvodne karakteristike.

Materijal i metode

Analiza po iva na nalazima anketnog istraživanja koje je provedeno krajem 2014. godine na uzorku peradarskih farmi. Za odabir jedinica uzorka koristili smo službenu bazu Hrvatske poljoprivredne agencije u kojoj je evidentirana 951 peradarska farma s kapacitetom ve im od 500 kljunova. U prvom koraku iz te su baze izdvojene peradarske farme (n=503) koje su bile poslovno aktivne posljednje dvije godine. U drugom koraku, vode i ra una o razmjernom udjelu pojedinih tipova proizvodnje i veli ini proizvodnih kapaciteta, odabran je uzorak od 302 farme. Anketni upitnik bio je sastavljen od 32 pitanja složena u etiri tematske cjeline. Prva su pitanja o proizvodnim kapa-

citetima gospodarstva, druga o kanalima i oblicima infor-miranja i stru nog usavršavanja, tre a obuhva a stavove i mišljenja o potrebi stru nog usavršavanja, a etvrta osnovne informacije o ispitaniku. Prije provedbe istraživanja anketni je upitnik radi razumljivosti pitanja testiran na 5 peradarskih

farmi. Potom je upitnik uz popratno pismo odaslan poštom voditeljima farmi. Od ukupnog broja vra eno je 106 (ili 35,1%) anketa od kojih su 95 bile ispravno popunjene te su one podloga za predo enu analizu. Za potrebe ovoga priloga izdvojili smo setove pitanja o so-cio-ekonomskim obilježjima anketiranih peradarskih gospo-darstava te stavove i mišljenja o stru nom usavršavanju. Stajališta ispitanika o važnosti pojedinih tema/vještina stru nog usavršavanja mjerena su ljestvicom od 4 ocjene. Podatci su obra eni pomo u programskog paketa SPSS 17 na razini jednovarijatne analize (izra un frekvencija, posto-taka i srednjih vrijednosti), a zna ajnost razlika izme upojedinih parova varijabla je testirana Pearsonovim ²- testom uz toleranciju mogu e pogreške od 5% (p<0,05).


Osnovne socioekonomske karakteristike anketiranih peradarskih gospodarstva Me u ispitanicima bila su 74 (77,9%) muškarca i 21 (22,1%) žena prosje ne dobi od 55 godina (tablica 1.). Prema stupnju školske naobrazbe više od polovice ispitanika (58,9%) ima završenu srednju etverogodišnju ili trogodi-šnju školu, 36,8% je završilo višu školu ili fakultet, a svega 4,2% su ispitanici sa završenom osnovnom školom. Prema tim podacima peradarski proizvo a i u prosjeku imaju bolju školsku naobrazbu u odnosu na obrazovnu strukturu hrvatskih poljoprivrednika (Žutini i Markovina, 2009.).

Tablica 1. Socio-demografska obilježja ispitanika

Obilježje Broj %

SpolMuško 74 77,9 Žensko 21 22,1

DobManje od 45 godina 40 42,1 46 godina i više 55 57,9

Školska naobrazba Osnovna škola 4 4,2 Srednja škola (zanat, trogodišnja, etverogodišnja) 56 58,9 Viša škola, fakultet i više 35 36,8

Izvor: Vlastito istraživanje

Table 1. Sociodemographic characteristics of respondents

Characteristic n %

SexMale 74 77.9 Female 21 22.1

Age (yrs) <45 40 42.1

46 55 57.9

Level of education Elementary school 4 4.2 Secondary school (trade, 3-year, 4-year) 56 58.9 College, university and higher 35 36.8

Source: Own investigation

OBRAZOVNE POTREBE HRVATSKIH PERADARSKIH PROIZVO A A 147

Prema funkciji koju obnašaju na gospodarstvu 75,8% ispitanika su vlasnici i upravitelji svojih peradarskih farmi, a preostali su zaposleni kao menadžeri (voditelj, direktor). Ve ina anketiranih gospodarstava (68,4%) bavi se tovom peradi, a preostala (31,6%) proizvodnjom konzumnih i rasplodnih jaja. Nešto više od polovice gospodarstava s tovom peradi (49,2%) ima proizvodni kapacitet ve i od petnaest tisu a pili a. U podskupni farmi s proizvodnjom jaja (konzumna i rasplodna) 46,7% raspolaže s proiz-vodnim kapacitetom ve im od petnaest tisu a nesilica.

Stavovi i mišljenja o potrebi stru nog usavršavanja

U istraživanju su sudjelovali ispitanici s višegodišnjim iskustvom u peradarskoj proizvodnji te na osnovi tih iskustava mogu dobro prosuditi koje kompetencije i vještine su potrebne u radu na peradarskoj farmi. Našim uzorkom su obuhva eni ispitanici od kojih se 42,1% bavi ovom proizvodnjom više od dvadeset godina, 53,6% u rasponu od šest do dvadeset godina, a svega 4,2% obavlja taj posao pet i manje godina. Ve ina ispitanika (68,4%) je na anketno pitanje jesu li tijekom redovitog školovanja stekli potrebna znanja za organiziranje peradarske proizvodnje odgovorilo da im ta znanja nisu ili su vrlo malo pomogla u njihovoj proizvodnji. Prema njihovim odgovorima naj eš e kanale koje koriste u informiranju o novih tehnologijama u proizvodnji su internet (52,6%) i tvrtke s kojima poslovno sura uju (46,3%). Nadalje, svega 3,2% smatra da je u

Hrvatskoj dobra i sadržajem kvalitetna ponuda obrazovnih programa za stru no usavršavanje peradarskih proiz-vo a a.Cjeloživotno u enje podrazumijeva proces usvajanja razli-itih znanja, stjecanja vještina, kvalifikacija i kompetencija

za osobne, profesionalne i društvene potrebe tokom cijelog života. Stoga nas je zanimalo drže li ispitanici korisnim organiziranje polivalentnog sustava za trajno stru no usa-vršavanje i osposobljavanje za potrebe peradarskih proiz-vo a a. Kao što je vidljivo iz priložene slike 1., ve ina njih smatra da bi bilo korisno ili jako korisno (82,1%) uspostaviti takav sustav. Pritom njih 54,7% je izjavilo da bi trebalo osnovati zaseban centar za cjeloživotno obrazo-vanje peradara. Osnovni pristup u planiranju cjeloživotnog u enja odraslih osoba jest usmjerenost na korisnika i njegove potrebe. Drugim rije ima, u osmišljavanju te ajeva, radionica i drugih oblika prijenosa informacija, znanja i stjecanja vještina važno je empirijski ustanoviti koje su specifi ne potrebe potencijalnih korisnika. Stoga je ispitanicima ponu ena lista stru nih tema i vještina za stru no usa-vršavanje1, uz mogu nost da i osobno dodaju teme koje ih zanimaju. Koriste i ljestvicu od 1 do 4 trebali su procijeniti koje od njih smatraju važnim za unaprje enje vlastite proizvodnje i poslovanja gospodarstva. Razdioba njihovih ocjena i rang važnosti pojedinih tema/vještina prikazani su u tablici 2. 1 Lista stru nih kompetencija i vještina potrebnih peradarskom proizvo a unastala je temeljem prethodno provedenog istraži-vanja me u peradarskim stru njacima primjenom metode Delfi.

Slika 1. Ocjene o korisnosti organiziranja sustava za trajno stru no usavršavanje peradarskih proizvo a a.Figure 1. Evaluation of usefulness of the system for continuous vocational training of poultry farmers.


Tablica 2. Ocjene važnosti pojedinih tema/vještina za unaprje enje peradarske proizvodnje

Stru na tema/vještina Ocjena u %

Srednja vrijednost1+2* 3+4*

Prepoznavanje znakova pojave bolesti u jatu 4,2 95,8 3,82 Mjere za suzbijanje zaraznih bolesti 4,2 95,8 3,78 Postupci s peradi u proizvodnji 4,2 95,8 3,68 Hranidba peradi 3,2 96,8 3,67 Mikroklima u proizvodnji 4,2 95,8 3,63 Sanitarni postupci u proizvodnji 3,2 96,8 3,61 Zbrinjavanje otpada i zaštita okoliša 8,4 91,6 3,43 Planiranje i financijski plan proizvodnje 11,6 88,4 3,42 Zakoni i propisi u peradarstvu 8,4 91,6 3,36 Proizvodna oprema i njena funkcionalnost 11,6 88,4 3,35 Organizacija rada na farmi 20,0 80,0 3,15 Tržište i marketing u peradarstvu 22,1 77,9 3,07 O pasminama peradi 31,6 68,4 2,86 Vještina korištenja ra unala u peradarskoj proizvodnji 38,9 61,1 2,77 Komunikacijske vještine 49,5 50,5 2,46 Strani jezik 55,8 44,2 2,42 Izvor: Vlastito istraživanje *Stupanj važnosti: 1-nevažno; 2-malo je važno; 3-važno; 4-veoma važno

Table 2. Ranking the role of particular topics/skills for poultry farming improvement

Vocational topic/skill Rank of relevance (%)

Mean1+2* 3+4*

Recognizing signs of disease onset in the flock 4.2 95.8 3.82 Measures of infectious disease control 4.2 95.8 3.78 Poultry procedures in production 4.2 95.8 3.68 Poultry feed 3.2 96.8 3.67 Production microclimate 4.2 95.8 3.63 Sanitary procedures in production 3.2 96.8 3.61 Waste disposal and environmental protection 8.4 91.6 3.43 Production planning and financial plan 11.6 88.4 3.42 Legal acts and regulations in poultry production 8.4 91.6 3.36 Production equipment and its functionality 11.6 88.4 3.35 Work organization on the farm 20.0 80.0 3.15 Market and marketing in poultry production 22.1 77.9 3.07 On poultry breeds 31.6 68.4 2.86 Use of computer in poultry production 38.9 61.1 2.77 Communication skills 49.5 50.5 2.46 Foreign language proficiency 55.8 44.2 2.42

Source: Own investigation *Rank of relevance: 1-not relevant; 2-low relevance; 3-relevant; and 4-highly relevant

OBRAZOVNE POTREBE HRVATSKIH PERADARSKIH PROIZVO A A 149

Prema distribuciji frekvencija stupnja važnosti i malih raz-lika u rasponu prosje nih vrijednosti može se zaklju iti da su na vrhu prioritetnih tema za stru no usavršavanje pre-poznavanje i razumijevanje postupaka za suzbijanje bolesti u jatu, postupci s peradi u proizvodnji, hranidba peradi te razumijevanje mikroklime i sanitarnih postupaka. Prema procjenama ispitanika najmanje su im potrebni te ajevi za stjecanje vještina korištenja ra unala u proizvodnji, komunikacijskih vještina i u enja stranog jezika. Nisko rangirana potreba za stjecanjem vještina primjene ra unala i informati kih znanja u poslovanju donekle se može razložiti podatkom da ve ina ispitanika posjeduje osobno ra unalo (89,5%), iako ga samo 48,4% koristi za potrebe poslovanja. Me utim, ocjene o važnosti komunikacijskih vještina i poznavanje stranog jezika upu uju na razmjerno nerazvijenu svijest ispitanika o njihovoj svrsishodnosti u poslovnoj praksi budu i da uspješnost poslovanja u procesu globalizacije tržišta hrane i usmjerenosti ka potroša u sve više ovisi o tim vještinama (Lans i sur. 2004.)2.

Da bismo dobili podrobniji uvid u teme/vještine za stru na usavršavanja ispitanici su trebali izdvojiti tri teme za koje osobno smatraju da su im najpotrebnije. Na osnovi najfrek-ventnijih odgovora njihove prijedloge iznosimo u sljede oj 2 Istraživanje o konkurentnosti radne snage u Hrvatskoj pokazalo je da radna snaga u nas nema potrebnih vještina, znanja i stru nosti za natjecanje na EU tržištu rada, osobito se naglašava nedostatak poznavanja stranih jezika, informati kih i komunikacijskih vještina (Bejakovi ,2004.).

tablici (tablica 3.). U organiziranju (budu ih) stru nih te a-jeva i radionica valja voditi ra una o njihovim prijedlozima, tim više što se skoro dvije tre ine (62,1%) peradarskih proizvo a a izjasnilo da bi sigurno poha ali stru ne te ajevekreirane prema njihovim interesima.

Utjecaj socio-demografskih i proizvodnih karakteristika na stavove o važnosti pojedinih tema stru nog usavršavanja

Jedan od ciljeva ovoga istraživanja bio je odrediti razlike me u stavovima o važnosti pojedinih tema za stru nousavršavanje s obzirom na socio-demografska obilježja ispi-tanika (dob, spol, školska naobrazba i iskustvo u peradarskoj proizvodnji) i proizvodne karakteristike gospodarstva (pro-izvodnja jaja ili tov, kapaciteti farme do petnaest ili više od petnaest tisu a tisu a kljunova). Kontingencijska analiza je pokazala da na ve ini spomenutih varijabla nema statisti ki zna ajnih razlika me u stavovima ispitanika (p>0,05). Sta-

tisti ki zna ajne razlike me u ispitanicima uo ene su na ocjeni važnosti dviju stru nih tema 'Mikroklima u proiz-vodnji' (p=0,03) i 'Mjere za suzbijanje bolesti' (p=0,03) s obzirom na kapacitete farme. Drugim rije ima, peradarski proizvo a i koji dolaze s gospodarstava manjeg kapaciteta pridaju ve u važnost tim temama u odnosu na ispitanike s farmi ve eg kapaciteta. Tako er, ispitanici s ve im radnim iskustvom u peradarskoj proizvodnji više su zainteresirani za stru nu temu 'Pasmine peradi' (p=0,00).

Tablica 3. Prijedlog najvažnijih tema za stru no usavršavanje

Stru na tema Udio ispitanika, %

Prva Druga Tre a Ukupno Prepoznavanje znakova pojave bolesti u jatu 18,9 18,9 13,7 51,5 Postupci s peradi u proizvodnji 21,1 13,7 10,5 45,3 Mjere za suzbijanje zaraznih bolesti 4,2 18,9 15,8 38,9 Hranidba peradi 11,6 13,7 12,6 37,9 Mikroklima u proizvodnji 10,5 9,5 4,2 24,2 Sanitarni postupci u proizvodnji 9,5 5,3 7,4 22,2 Izvor: Vlastito istraživanje

Table 3. Most relevant topics proposed for vocational training

Vocational topic Proportion of respondents (%)

First Second Third Total Recognizing signs of disease onset in the flock 18.9 18.9 13.7 51.5 Poultry procedures in production 21.1 13.7 10.5 45.3 Measures of infectious disease control 4.2 18.9 15.8 38.9 Poultry feed 11.6 13.7 12.6 37.9 Production microclimate 10.5 9.5 4.2 24.2 Sanitary procedures in production 9.5 5.3 7.4 22.2 Source: Own investigation


Zaklju ak

Istraživanje provedeno na reprezentativnom uzorku peradarskih proizvo a a o važnosti stru nog usavršavanja i njihovim obrazovnim potrebama pokazalo je sljede e:- Svega 3,2% peradarskih proizvo a a smatra da je ponuda

obrazovnih programa za stru no usavršavanje odraslih u peradarstvu dostatna i sadržajem kvalitetna.

- Ve ina ispitanika (82,1%) drži korisnim sustavno orga-niziranje razli itih oblika stru nog usavršavanja i ospo-sobljavanja peradarskih proizvo a a.

- Za unaprje enje proizvodnje i poslovanja na gospodarstvu ispitanici najve u važnost daju stru nom usavršavanju iz podru ja o bolesti peradi, hranidbe peradi, mikroklime i sanitarnih postupaka u peradarskoj proizvodnji, a naj-manju stjecanju informati kih i komunikacijskih vještina i u enju stranih jezika.

- Dvije tre ine (62,1%) ispitanika izrazilo je spremnost da poha aju stru ne te ajeve koji su „skrojeni“ prema nji-hovim potrebama.

Na kraju, što potvr uju i brojna istraživanja u svijetu, uspješan i daljnji razvoj peradarske proizvodnje usko je povezan sa znanjem i poznavanjem suvremenih tehnoloških dostignu a u peradarstvu i poduzetništvu pa je nužno razviti u inkovit sustav trajnog stru nog usavršavanja proizvo a a i prenošenja novih spoznaja, vještina i informacija.

Literatura

BEJAKOVI , P. (2004): Konkurentnost radne snage u Hrvatskoj: stanje i problemi. U: Konkurentnost hrvatske radne snage (P.

Bejakovi , J. Lowther, ur.). Institut za javne financije. Zagreb, 1-12.

FLOCK, D., K. DAMME (2010): Poultry education in Germany. CD of Proceedings of the XIIIth European Poultry Conference. Tours, France.

FORD, L. C. (1995): Educational priorities of small farmers in West Tennessee. J Agric Educ. 36(1), 31-37.

LANS, T., R. WESSELINK, H. J. A. BIEMANS, M. MULDER (2004): Work-related lifelong learning for enterpreneurs in the agri-food sector. Int J Train Dev. 8(1), 73-89.

LEENSTRA, F., S. YALCIN, E. SOSSIDOU, S. BILGILI, R. KWAKKEL (2010): Poultry science education and its interaction with research and industry. CD of Proceedings of the XIIIth European Poultry Conference. Tours, France.

PARDUE, S. L. (1997): Educational opportunities and challenges in poultry science: impact of resource allocation and industry needs. Poult Sci. 76(7), 938-943.

RAGUŽ- URI , R., . ŽUTINI , A. KOLEGA, S. MUŽIC, V. SAVI , E. PRUKNER-RADOV I (2006): Croatian poultry production in transition. World Poult Sci J. 62(2), 354-360.

ROBERTS, J. (2010): New learning approaches in the poultry industry – an Australian perspective. CD of Proceedings of the XIIIth European Poultry Conference. Tours, France.

ŽUTINI , ., J. MARKOVINA (2009): Cjeloživotno obrazovanje za razvoj hrvatskog sela i poljoprivrede. Globalizacija i regionalni identitet. 25.-26.9.2009., Osijek, Hrvatska, 73-86.

ŽUTINI , ., R. RAGUŽ- URI (2009): Obrazovanje kao uvjet razvitka hrvatske peradarske proizvodnje. VIII. simpozij Peradarski dani 2009. s me unarodnim sudjelovanjem. 25.-28.3.2009., Pore , Hrvatska, 26-30.

ŽUTINI , ., R. RAGUŽ- URI , E. PRUKNER-RADOV I(2010): Poultry education in Croatia. World Poult Sci J. 66, Suppl. 774.

EDUCATIONAL NEEDS OF POULTRY PRODUCERS

Summary Results of the empirical study on vocational training and educational needs of poultry producers, conducted on a representative sample, are partially presented. The aim of the study was to reveal how poultry producers estimate the need of vocational training, what competences and skills they consider most relevant for upgrading their production, and whether there are statistically significant differences in their attitudes and opinions. Analysis showed the majority (82.1%) of poultryproducers to consider establishment of a system for continuous vocational training useful. Respondents were most interested in professional lectures and courses in the field of poultry diseases (mean rank ranging from 3.82 to 3.78), and in production technology and poultry feed (mean rank ranging from 3.68 to 3.61).

Key words: educational needs, vocational training, competences and skills, poultry producers


SMJEŠTAJ I DRŽANJE PTICA KAO ŽIVOTINJSKIH MODELA U POKUSIMA

Gordana Greguri Gra ner1, Željko Pavi i 1, Marija Lipar2, Jadranka Bubi Špoljar3, Damjan Gra ner4, Luka Jurinovi 5

1 Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za higijenu, ponašanje i dobrobit životinja, Zagreb, Hrvatska 2 Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Klinika za kirurgiju, ortopediju i oftalmologiju, Zagreb, Hrvatska 3 Medicinski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Zavod za biologiju, Hrvatska 4 Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Klinika za unutarnje bolesti, Zagreb, Hrvatska 5 Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Zagreb, Hrvatska

Sažetak

U brojnim se pokusima u svijetu kao životinjski modeli koriste i ptice. Me u njima je najbrojnija doma a perad, uklju uju imanji broj purana i prepelica te golubovi, vorci, zebovke i vodarice. Ptice se u Republici Hrvatskoj mogu koristiti kao životinjski modeli u istraživanjima, no tek iznimno i uz dozvolu nadležnog tijela, odnosno Uprave za veterinarstvo pri Ministarstvu poljoprivrede i to sukladno zakonodavnom okviru. Izme u ostaloga, on propisuje i odre ene smjernice za smještaj i držanje ptica u pokusima. U ovome radu predstavljamo op enito najzna ajnije od njih, jer tijek i rezultati istraživanja na pticama kao životinjskim modelima umnogome ovise o razini osigurane dobrobiti za životinje, pri emiznimno zna enje imaju upravo prikladan smještaj i držanje.

Klju ne rije i: životinjski model, znanstveno istraživanje

Uvod

Svake se godine u laboratorijima širom svijeta u razli itim istraživanjima kao životinjski modeli koriste milijuni ptica. Prema Prilogu I. Pravilnika o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (NN RH br. 44/2013.) niti jedna ptica nije navedena me u životinjama koje se, da bi se mogle koristiti u pokusima, moraju za pokus uzgojiti. Iako je u posljednjih dvadesetak godina gotovo prepolovljen broj životinja korištenih u istraživanjima, to se, nažalost, ne odnosi i na udio ptica u njemu, koji je sve ve i (United Poultry Concerns, 2015.). Na primjer, u razdoblju od 1997. do 2002. godine znatno je porastao broj kokoši korištenih u biomedicinskim istraživanjima, osobito u proizvodnji poliklonskih protutijela nužnih za druga istraživanja (Fulton, 2002.). Još je jedan razlog pove anju broja ptica u ukupnom broju laboratorijskih životinja. Naime, jedno od pravila 3R koja se odnose na korištenje pokusnih životinja (engl. replacement, zamjena; reduce, smanjenje broja; refinement, poboljšanje metoda i procedura) koje su utemeljili Russel i Burch godine 1959. nalaže da se kadgod je mogu eživotinjski modeli zamijene alternativnima. Me utim, ta zamjena alternativnim modelom ne pretpostavlja uvijek

apsolutnu zamjenu, tj. zamjenu životinjskog modela ne-životinjskim. Po esto to podrazumijeva zamjenu odre ene životinje drugom koja je na nižoj evolucijskoj razini pa se, na primjer, sisavac zamjenjuje pticom. Smatra se, naime, da je inteligencija ptica, složenost njihova ponašanja kao i sposobnost da osje aju fizi ku bol manja u odnosu na sisavce (Anonimno, 2001.).

Zakonodavni okvir korištenja ptica u pokusima u Republici Hrvatskoj

Ptice se i u Republici Hrvatskoj mogu koristiti kao živo-tinjski modeli u istraživanjima, no tek iznimno i uz dozvolu nadležnog tijela, odnosno Ministarstva poljoprivrede, Upra-ve za veterinarstvo. Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (NN RH br. 55/13.) u Odsjeku B (Odsjek o pojedina nim životinjskim vrstama) za istraži-vanja u poljoprivredi predvi a korištenje sljede ih vrsta ptica: doma u kokoš, doma eg purana, prepelice, patke i guske, golubove i australske zebice. Me utim, u tom slu aju držanje i smještaj navedenih vrsta mora biti u skladu sa Zakonom o zaštiti životinja (NN RH br. 135/06.), Zakonom

doc. dr. sc. Gordana Greguri Gra ner, Zavod za higijenu, ponašanje i dobrobit životinja, Veterinarski fakultet Sveu ilišta u Zagrebu, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; tel. +385 1 2390 293; faks. +385 1 2441 390; e-mail: [email protected]

SMJEŠTAJ I DRŽANJE PTICA KAO ŽIVOTINJSKIH MODELA U POKUSIMA 152

o izmjenama i dopunama Zakona o zaštiti životinja (NN RH br. 37/13.) te ispunjavati i standarde propisane Pravilnikom o zaštiti životinja koje se uzgajaju u svrhu proizvodnje (NN RH br. 44/10.), Pravilnikom o minimalnim uvjetima za zaštitu kokoši nesilica (NN RH br. 77/10., NN RH br. 99/10. i NN RH br. 51/11.) i Pravilnikom o odre ivanju mini-malnih pravila za zaštitu pili a koji se uzgajaju za proiz-vodnju mesa (NN RH br. 79/08.).

Smještaj i držanje ptica u pokusima

Op enito, objekti za smještaj ptica u pokusima morali bi biti izgra eni tako da osiguravaju okruženje koje e omogu iti podmirenje fizioloških, kao i etoloških potreba vrste ptica koje se u njima drže. Nužno je pritom sprije iti pristup neovlaštenim osobama i bijeg ptica (NN RH br. 55/13.). Smještaj, hranjenje i napajanje, režim prozra ivanja i osvjet-ljenja, kao i mogu nost zadovoljenja etoloških potreba u objektima za držanje ptica trebaju odgovarati specifi nimpotrebama vrste ptica u pokusu bez obzira na tip istraži-vanja. Optimalno bi bilo osigurati smještaj što sli niji pri-rodnom okruženju ptice. Ako životinja ipak stalno ili povremeno boravi u ograni enom prostoru treba joj na temelju postoje e prakse i znanstvenih spoznaja osigurati dovoljno prostora u skladu s njezinim fizi kim, fiziološkim i etološkim potrebama (NN RH br. 44/10.) za rast, postizanje zrelosti i reprodukciju (Anonimno, 2011.). Dobar smještaj omogu ava životinji da se osje a sigurno, da se može kretati i ponašati svojstveno vrsti te da može biti u vizualnom kontaktu s istovrsnim jedinkama (Nicol, 1995.). Tako se, izme u ostaloga, ne bi smjelo ograni avati kretanje životinja protivno prihva enim zoohigijenskim standardima za pojedinu vrstu, ime bi se kod životinja mogla uzrokovati bol, patnja, ozljede ili strah (NN RH br. 135/06.). Me utim, u laboratorijskim uvjetima ptice se naj eš e smještaju u kaveze u kojima im je, primjerice, onemogu eno širenje krila ili kretanje svojstveno vrsti, a osiromašeni okoliš dodatno ugrožava njihovu dobrobit. Neophodno povremeno uznemiravanje ionako plahih životinja u takvim uvjetima može dovesti i do zna ajnih ozljeda. Intervencije u primarne smještajne objekte za držanje ptica stoga podrazumijevaju osiguravanje dovoljno velikih kaveza oboga enih materi-jalima za pravljenje gnijezda, pre kama koje su prikladne vrsti i kadicama s pijeskom ili vodom za kupanje u prašini ili vodi. Kaveze se može obogatiti i mjestima za skrivanje (za prepelice) ili predmetima kojima ptice mogu manipulirati (vrane, papige) (Anonimno, 2001.). Me utim, treba voditi ra una o tome da svaka promjena opreme u tome smislu može u životinja, naro ito neofobi nih, uzrokovati stres (Anonimno, 2011.). Navedeni predmeti kojima oboga u-jemo okoliš ptice ne smiju biti uneseni na štetu propisane površine poda. Onim pticama koje lete morao bi biti omogu en prostor za let, onima koje tr e za tr anje, a vodaricama bazen za plivanje i ronjenje. Iznimno društvene ptice poput vodarica moraju pak biti držane u stabilnim, kompatibilnim skupinama (Anonimno, 2001.). Ako zbog protokola pokusa nije mogu e ptice držati u skupinama, tada im se mora omogu iti vizualni kontakt ili je potrebno u kaveze postaviti zrcala.

Prostor za smještaj životinja i oprema s kojom životinje dolaze u doticaj moraju biti izgra eni i održavani tako da nemaju oštrih rubova ili izbo ina na koje bi se životinje mogle ozlijediti (NN RH br. 44/10.). Posebnu pozornost treba posvetiti podovima kaveza. Podovi od žice (bez oštrih krajeva te obloženi plastikom) moraju dobro podupirati noge koje kroz okna ne smiju propadati, a najmanje tre ina kaveza treba biti punoga poda (Anonimno, 2001.). Materijali koji se koriste za izgradnju prostora za smještaj životinja, a naro ito onoga s kojim životinje mogu do i u doticaj, ne smiju biti štetni za zdravlje životinja i moraju se mo itemeljito istiti i dezinficirati (NN RH br. 44/10.). Svu automatsku ili mehani ku opremu nužnu za zdravlje i dobrobit životinja moralo bi se kontrolirati barem jedanput na dan i nedostatke odmah ispravljati. Ako to nije mogu etreba poduzeti sve mjere kako bi se osiguralo zdravlje i dobrobit životinja (NN RH br. 135/06.). Ptice nemaju žlijezda znojnica, normalna tjelesna tempera-tura im je 41°C, a perje pomaže o uvanju tjelesne tempera-ture na nižim vanjskim temperaturama. Previsoka tempera-tura okoliša uzrokuje im toplinski stres te se ptice nastoje rashladiti dahtanjem i širenjem krila (Vu emilo, 2008.). Temperaturno podru je ograni eno najvišom i najnižom kriti nom temperaturom naziva se termoneutralna zona (Gordon, 2005.). Prilago avanje dnevnom temperaturnom ritmu unutar te termoneutralne zone u ptica e uzrokovati tek minimalan stres i neznatnu promjenu fizioloških para-metara. Za ptice u pokusima preporu a se temperatura okoliša u rasponu od 16 do 27 °C (Anonimno, 2011.). Me utim, dok kokošima odgovara raspon temperature okoliša od 15 do 25 °C, prepelicama odgovara 20 do 24 °C (Anonimno, 1969.). Pritom treba voditi ra una da mla edobne kategorije ptica zahtijevaju i višu vrijednost temperature okoliša. Ako je mogu e, preporu a se razli itatemperatura (unutar termoneutralne zone) u razli itimdijelovima objekta kako bi ptica sebi izabrala optimalnu (Anonimno, 2001.). Temperatura i relativna vlažnost u nastambi mora biti prilago ena vrsti i dobnoj skupini držanih životinja te svakodnevno mjerena i bilježena (NN RH br. 55/13.). Prostorije trebaju biti izgra ene tako da izolacija, grijanje i prozra ivanje nastamba omogu e da strujanje zraka, razina prašine i koncentracija plinova budu unutar granica koje nisu štetne za smještene životinje (NN RH br. 55/13.; NN RH br. 44/10.). Nadzor nad sustavom prozra ivanja bit e olakšan ugradnjom sustava za uzbunji-vanje u slu aju kvara, koji treba redovito provjeravati (NN RH br. 44/10.). U slu aju kvara umjetnog prozra ivanja osiguran pri uvni sustav prozra ivanja bio bi jamstvom dovoljne obnove zraka u svrhu o uvanja zdravlja i dobrobiti životinja (NN RH br. 135/06.). Preporu ena vrijednost relativne vlage u zraku za perad je od 50% do 70%, dok bi idealna bila oko 50%. Niska relativna vlaga zraka za perad smještenu na stelji doprinijet e stvaranju ve e koli ine prašine u zraku, dok e previsoka

vlaga uzrokovati nastajanje gljivica i plijesni stelje. Pove ana koncentracija prašine u zraku koja na sebe veže patogene mikroorganizme može u peradi uzrokovati razli ite


bolesti dišnog sustava. Tako er, niska relativna vlaga zraka može uzrokovati sušenje sluznica o iju i gornjih dišnih putova te dovesti do razvoja konjunktivitisa i poreme aja u metabolizmu minerala (Vu emilo, 2008.). Ako protokol pokusa iznimno ne propisuje druga ije, životinjama mora biti osigurana hrana primjerena njihovoj dobi i vrsti i u koli ini dostatnoj za održanje dobrog zdravlja i zadovoljenja njihovih nutritivnih potreba. Na in napajanja i hranjenja kao i tvari u hrani i vodi ne smiju uzrokovati nepotrebnu patnju ili ozljede. Pritom sve životinje moraju imati pristup hrani u vremenskim razmacima koji su pri-mjereni njihovim fiziološkim potrebama (NN RH br. 44/10.) i tako da se zadovolje njihove etološke potrebe. Tako, na primjer, rastresanje hrane po podu posutom piljevinom ili nasjeckanim papirom te, kako je ve napomenuto, hrana poslužena u obliku blokova iz kojih moraju iskljucati zrnje zadovoljit e potrebu ptice za istraživanjem i traženjem hrane.Tako er, svim životinjama mora biti osiguran pristup vodi primjerene kvalitete u dovoljnim koli inama ili moraju biti u mogu nosti zadovoljiti svoje potrebe za unosom teku ine na drugi na in, pri em oprema za hranjenje i napajanje mora biti osmišljena, izra ena i postavljena tako da se na naj-manju mogu u mjeru smanji one iš enje hrane i vode i sukob me u životinjama (NN RH br. 44/10.). Životinje držane u objektima ne smiju biti cijelo vrijeme u mraku niti bez primjerenog razdoblja odmora od umjetnog osvjetljenja. Razdoblja svjetlosti i mraka, dakle, moraju biti uskla ena s uobi ajenim dnevnim ritmom vrste kako im se ne bi ugrožavala dobrobit (Anonimno, 2011.). Ako dostupno prirodno svjetlo nije dostatno za osiguranje fizioloških i etoloških potreba životinja mora se osigurati primjereno umjetno osvjetljenje (NN RH br. 44/10.). Intenzitet umjet-nog osvjetljenja treba postupno mijenjati od zore prema sumraku te razmotriti mogu nost korištenja visokofrekvent-nih fluorescentnih svjetiljaka koje emitiraju svjetlost sli nudnevnoj (Anonimno, 2001.). Pažljivo, obzirno postupanje sa životinjama, pri em se nastoji ne stvarati buku, dobra izolacija prostorije te prema potrebi ugradnja materijala koji upija zvuk može puno pripomo i smanjenju razine buke kao izrazito stresogenog imbenika. Bu nije vrste fizi ki moraju biti odvojene od

tiših. Prema Pravilniku o zaštiti životinja koje se uzgajaju u svrhu proizvodnje (NN RH br. 44/10.) i Pravilniku o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (NN RH br. 55/13.) sve životinje trebalo bi nadgledati barem jedanput na dan ili u vremenskim razmacima dostatnim da se na vrijeme uo i bilo kakva patnja životinja, odnosno da se otkriju sve bolesne ili ozlije ene životinje. Me utim, ptice se u po-kusima preporu a nadgledati najmanje dva puta na dan, a ovisno o vrsti i protokolu pokusa i eš e. Dobra suradnja voditelja istraživanja, veterinara i tehni ara koji životinjama barata te o njima skrbi klju na je u osiguranju zdravlja i dobrobiti ptica u pokusu (Anonimno, 2001.). Potrebno je omogu iti prostor u kojem se mogu izolirati nove životinje dok se ne odredi njihov zdravstveni status, a

mogu i rizik za ve nastanjene životinje svede na najmanju mjeru (NN RH br. 55/13.). U slu ajevima kada primarni smještajni objekti zadovo-ljavaju fiziološke i etološke potrebe ptica svaki otklon od ponašanja uobi ajenog za vrstu može biti pokazateljem razvoja odre enih patoloških procesa i razlogom izdvajanja ptice iz jata. U tom slu aju bolesne ili ozlije ene životinje moraju se odvojiti u primjereni prostor sa, tamo gdje je to primjenjivo, suhom i udobnom steljom (NN RH br. 44/10.). Zdravstveni nadzor zna ajno e olakšati detaljan plan zdravstvenog nadzora koji prije po etka pokusa izra ujeveterinar (Anonimno, 2001.).

Zaklju ak

Nije izgledno da e se u skorijoj budu nosti broj ptica korištenih u pokusima smanjivati, a upravo se ptice koriste kao alternativni modeli u pokusima. Prema pticama koje se koriste u pokusima preostaje tek primjenjivati pravilo po-boljšanja uzgoja, smještaja i skrbi kako bi se na taj na in osigurala njihova dobrobit nužna za nesmetan tijek pokusa koji e potom polu iti vjerodostojne rezultate, a dobrobit bilo koje životinje, pa tako i ptica, ne može se razmatrati izvan konteksta vrsti prikladnog smještaja i držanja.

Literatura

ANONIMNO (1969): Coturnix (Coturnix coturnix japonica): standards and guidelines for the breeding, care, and management of laboratory animals: a report. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). Subcommittee on Avian Standards. National Academies. Dostupno na: http://books.google.hr/books?hl=hr&id=zmsrAAAAYAAJ&q= [13.01.2013]

ANONIMNO (2001): Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW. Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 35, 1, 1-163.

ANONIMNO (2011): Guide for the care and use of laboratory animals. Eighth ed. The National Academic Press. Washington D.C., 41-103.

FULTON, L., M. A. HALL, G. BIRRENKOTT (2002): The Laboratory Chicken. Boca Raton, FL: CRC Press.

GORDON, C. J. (2005): Temperature and Toxiology: An integrative, Comparative and Environmental Approach. Boca Raton, FL: CRC Press.

NARODNE NOVINE (135/2006): Zakon o zaštiti životinja. Narodne novine.

NARODNE NOVINE (37/2013): Zakon o izmjenama i dopunama Zakona o zaštiti životinja. Narodne novine.

NARODNE NOVINE (44/2010): Pravilnik o zaštiti životinja koje se uzgajaju u svrhu proizvodnje. Narodne novine.

NARODNE NOVINE (55/2013): Pravilnik o minimalnim uvjetima za zaštitu kokoši nesilica (NN 77/2010). Narodne novine.

NARODNE NOVINE (55/2013): Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe. Narodne novine.


NICOL, C. J. (1995) Environmental enrichment for birds. In: Environmental Enrichment Information Resources for Laboratory Animals 1965-1995. Maryland: AWIC, str. 1-3.

UNITED POULTRY CONCERNS: The Experimental Use of Chickens and Other Birds in Biomedical and Agricultural

Research. Dostupno na: http://www.upc-online.org/ /experimentation/experimental.htm (30.3.2015.)

VU EMILO, M. (2008): Higijena i bioekologija u peradarstvu. Veterinarski fakultet, Zagreb.

HOUSING AND HUSBANDRY OF BIRDS AS ANIMAL MODEL IN EXPERIMENTS

Summary

In numerous experiments worldwide, birds are used as animal models. Among them, there is the largest number of domestic poultry, including a small number of turkeys and quails, then pigeons, starlings, finches and waterfowls. Also, birds could be used in researches in the Republic of Croatia, but only exceptionally and only with permission of the competent authority, i.e. Veterinary and Food Safety Department of the Ministry of Agriculture and in accordance with the legislative framework. Furthermore, they lay down certain guidelines for housing and husbandry of birds in experiments. This paper presents generally the most important ones because the results of the research undertaken on birds as experimental model depend on the level of animal welfare provided, where proper housing and husbandry have a major role.

Key words: animal model, scientific research


UPORABA ENZIMSKIH PRIPRAVAKA U HRANIDBI PERADI

Tihomir Zglavnik, Milivoj Mikec, Tajana Amšel Zelenika


Sažetak

Posljednjih dvadesetak godina iznalaze se na ini kako pove ati iskoristivost hrane za perad, posti i dobre proizvodne i zdravstvene rezultate u uzgoju pili a, a istodobno sniziti njenu cijenu. Tome doprinosi upotreba enzimskih ili multienzimskih pripravaka u hrani. Prema mnogim istraživanjima uporaba enzimskih pripravaka u hranidbi peradi o itovala se boljim prirastom tjelesne mase, konzumacijom, konverzijom hrane, ali i povoljnim utjecajem na zdravlje peradi. U hranidbi kokoši nesilica dodatak razli itih enzimskih pripravaka u obrok povoljno je utjecao na nesivost, kvalitetu jaja i ljuske jaja (deblja i vrš a ljuska te manja zaprljanost jaja). Dodatak razli itih enzimskih pripravaka u hrani smanjuje one iš enje okoliša (dušikom, amonijakom, kao i fosfatima).

Klju ne rije i: enzimi, NSP, viskoznost, fitati, tovni pili i, nesilice

Uvod

U uzgoju i proizvodnji peradi hrana ini 65%-70% ukupnih troškova proizvodnje. U sadržaju krmnih smjesa najzna-ajnije komponente su: 60%-70% žitarice (uglavnom ku-

kuruz), 20%-30% sa me (uglavnom soja). Uporaba pojedi-nih krmiva (kukuruz, pšenica, uljana repica) u proizvodnji bio-energenata (bioetanol, biodizel) ima zna ajan utjecaj na nestabilnost tržišta istim. Visoka cijena i smanjivanje pro-izvodnje ili nestanak pojedinih krmiva na tržištu ugrožavaju peradarsko-sto arsku proizvodnju. Javlja se potreba za za-mjenskim krmivom ili krmivima (alternativa). Ta alternativa mogu e je jeftinija od uobi ajenih standardnih krmiva (kukuruz, pšenica, soja), no može uzrokovati slabiji prirast, ve u potrošnju i konverziju hrane pa se postavlja pitanje gospodarske dobiti, tj. opravdanosti u usporedbi sa stan-dardnim krmivima.

EnzimiDodaci enzimskih pripravaka u hranu za perad imaju danas sve ve i utjecaj na proizvodnju, jer poboljšavaju proizvodne rezultate te omogu uju primjenu brojnih krmiva u sastav-ljanju krmnih smjesa. Enzimski pripravci u hrani koriste se prvenstveno radi pove anja probavljivosti i iskoristivosti pojedinih hranjivih tvari, uklanjanja antinutritivnih tvari, zbog smanjenja one iš enja, odnosno o uvanja okoliša.

Devedesetih godina prošloga stolje a zabilježen je zna ajanporast uporabe enzima. Prema podrijetlu dijelimo ih na: endogene nastale kao pro-izvod probavnog sustava i egzogene koji mogu biti biljnog podrijetla (razli ite hranjive biljke) ili mikrobnog podrijetla kao proizvod bakterija, gljivica i kvasaca. Izlu ivanje i za-stupljenost endogenih enzima nisu jednaki u svakoj životnoj dobi. U prvim danima života probavni sustav je relativno male mase s nerazvijenim sustavom žlijezda koje izlu ujuendogene enzime. Aktivnost endogenih enzima lipaze, ami-laze, proteaze zapo inje u prvom tjednu. Pankreasna amilaza aktivira se prvog dana, dok tripsin i lipaza postižu uobi a-jenu razinu aktivnosti u petom do šestom danu. Ugljiko-hidratni enzimi u prvom danu imaju 10% nižu aktivnost, no ve u tre em i etvrtom danu imaju uobi ajenu aktivnost (Nitsan i sur., 1991., Akiba i sur., 1995.). Za razliku od endogenih, egzogeni enzimi se umješavaju u hranu, a dijelimo ih po podrijetlu na biljne, bakterijske, gljivi ne i kvasne. Do danas je proizvedeno i opisano oko 2500 razli itih enzima. Prema podjeli me unarodne komi-sije EU iz 1961. enzimi se dijele u šest skupina: oksido-reduktaze, transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze i ligaze. Za ugradnju u hranu za životinje upotrebljavaju se hidrolaze. Po supstratu djelovanja dijele se na karbohidrataze, proteaze, lipaze i fitaze. Svaki od enzima je specifi an i djeluje po na elu klju a i brave te mijenja brzinu kemijske reakcije kao biološki aktivator.

Tihomir Zglavnik, dr. med. vet., Hrvatski veterinarski institut, Centar za peradarstvo, Heinzelova 55, 10000 Zagreb, Hrvatska; e-mail: [email protected]

UPORABA ENZIMSKIH PRIPRAVAKA U HRANIDBI PERADI 156

Da bi se mogli ugra ivati u hranu za životinje moraju ispu-njavati uvjete: neškodljivost za ljude i životinje, otpornost na niski pH želudca i endogene enzime, stabilnost na skla-dištenje, termostabilnost (peletiranje), aktivnost pri što ve-em rasponu pH u temperaturno-vlažnim uvjetima probave

uz prisutnost inhibitora ili aktivatora, uniformne aktivacije i djelovanja u uvjetima probave, tako da u fekalnoj masi nisu više prisutni i ne mogu djelovati nekontrolirano u okolišu (Bühler i sur., 2004., Direktiva 70/524/EEC). Biljni enzimi rijetko se upotrebljavaju zbog visoke cijene, nestabilnosti proteinskih komponenata i neotpornosti prema probavnim enzimima. U smjesama za perad naj eš e se upotrebljavaju enzimi bakterijskog, gljivi nog i kvasnog podrijetla, kao npr. Enzi-

mi podrijetlom iz rodova Bacillus., Citrobacter, Butiauxella spp., Aspergillus, Penicillium, Humicola, Trichoderma, Mucor, Saccharomyces, Escherichia, Peniophora (Bedford i sur., 2012., Bühler i sur., 2004., FDA 2013., Directive 70/524/EEC). Tržište zahtijeva enzime koji su cijenom prihvatljivi, a istodobno smanjuju viskoznost, degradiraju stani ne stijenke i polimere ugljikohidrata ine i hranidbene tvari dostupnijim probavnim enzimima. U tablici 1. prikazani su naj eš e upotrebljavani hidrolazni egzogeni enzimi bakterijskog, gljivi nog i kvasnog podri-jetla s podjelom prema supstratu djelovanja. Pojedini mikro-organizmi proizvode više enzima koji cijepaju hranjive tvari na razli itim mjestima umanjuju i antinutritivne u inke, što je vidljivo u boljem iskorištavanju hrane.

Tablica 1. Najzastupljeniji hidrolazni egzogeni enzimi i njihova podjela s obzirom na djelovanje (Bedford i sur., 2012., Bühler i sur., 2004., Direktiva 70/524/EEC, FDA 2013.)

Enzim Supstrat Podrijetlo Djelovanje

Karb

ohidr

ataze

Alfa galaktosidaza Soja, slatka lupina Aspergillus niger Hidroliza oligosaharida

Alfa galaktosidaza Soja, slatka lupina Saccharomyces sp.fermentacijski ekstrakt Hidroliza oligosaharida

Amiloglukosidaza (glukoamilaza)

Je am, kukuruz, soja, pšenica, riža, sjeme uljane repice, graška i njihovi nusproizvodi

Aspergillus niger, Aspergillus oryzae Hidroliza škroba u glukozu

Bakterijska i gljivi na alfa amilaza

Je am, kukuruz, soja, pšenica, riža, sjeme uljane repice i graška i njihovi nusproizvodi

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus niger Aspergillus oryzae

Hidroliza škroba

Beta glukanaza Je am, kukuruz, soja, pšenica, riža, raž, sjeme uljane repice i graška i njihovi nusproizvodi

Trichodermalongibrachiatum, Aspergillus aculeatus

Hidroliza betaglukana

Celulaza Je am, kukuruz, riža, raž, pšenica i njihovi proizvodi

Trichodermalongibrachiatum Hidroliza celuloze

Celulaza Je am, kukuruz, riža, raž, pšenica i njihovi proizvodi Humicola insolens Hidroliza celuloze

Celulaza Je am, kukuruz, riža,pšenica i njihovi proizvodi Aspergillus niger Hidroliza celuloze

Gljivi na kiselina- alfa amilaza

Je am, kukuruz, soja, pšenica, riža, raž, sjeme uljane repice i graška i njihovi nusproizvodi

Aspergillus oryzae Hidroliza škroba

Hemicelulaza Je am, kukuruz, soja, pšenica, riža, raž, sjeme uljane repice i graška i njihovi nusproizvodi

Aspergillus niger, Bacillus subtilis Hidroliza hemiceluloze

Pektinaza Kukuruz, pšenica Aspergillus niger Hidroliza pektina

Ksilanaza Je am, kukuruz, riža, pšenica, zob, sirak

Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Trichoderma longibrachiatum

Hidroliza ksilana, manoze

Endo- 1,4-ß-D-manaza

Pšenica, kukuruz, soja, je am, raž, zob Bacillus lentus Hidroliza/razgradnja NSP

vlakana

Pululaza Je am, kukuruz, soja, pšenica, riža, sjeme uljane repice i graška i njihovi nusproizvodi

Bacillus licheniformis Hidroliza škroba


Enzim Supstrat Podrijetlo Djelovanje

Prote

aze

Neutralna proteaza Biljne i životinjske bjelan evine Bacillus subtilis Hidroliza proteina, peptida, aminokiselina

Gljivi na kiselina- proteaza Biljne i životinjske bjelan evine Aspergillus oryzae Hidroliza proteina, peptida,

aminokiselina pri nižem pH

Peptidaza Biljne i životinjske bjelan evine Aspergillus oryzae Kataliziranje uklanjanja peptida iz krajeva lanca proteina, hidroliza proteina

Fitaz

e

Gljivi na fitaza Kukuruz, soja, suncokret, tapioka Aspergillus niger, Aspergillus oryzae

Hidroliza ftinske kiseline- osloba anje fosfora

Gljivi na fitaza Kukuruz, soja, suncokret, tapioka Penicillium purpurogenum Hidroliza fitinske kiseline- osloba anje fosfora

Gljivi na fitaza Kukuruz, soja, suncokret, tapioka Rhizopus oligosporus Hidroliza fitinske kiseline- osloba anje fosfora

Gljivi na fitaza Kukuruz, soja, suncokret, tapioka Mucor Hidroliza fitinske kiseline- osloba anje fosfora

Bakterijska fitaza Kukuruz, soja, suncokret, tapioka Escherichia coli Hidroliza fitinske kiseline- osloba anje fosfora

Lipaz

a

Lipaza Biljni i životinjski izvori-ulja i masti Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Rhizopus arrhizus

Hidroliza triglicerida

Enzimi dolaze na tržište u krutom i teku em obliku, a pri-mjenjuju se u vodi za pi e i u hrani. Pri rukovanju s kon-centriranim enzimima treba voditi ra una o zaštiti osoblja zbog snažnih kontaktnih i inhalacijskih alergijskih reakcija.

Škrob, NSP, fitati i gra a žitarica Škrob je glavni strukturni deponirani polisaharid žitarica i najvažniji lako probavljivi energetski nutrijent u hranidbi peradi, a najzastupljeniji je u kukuruzu. NSP (neškrobni polisaharidi) je prisutan u strukturi brojnih žitarica (kukuruz, pšenica, je am, raž, tritikal, zob, sunco-kretova i uljana poga a i sa ma i dr.). Gra en je od celuloze, neceluloznih topivih i netopivih polisaharida (sirova vlakna). NSP i svojim pasivnim higroskopskim svojstvom pove ava viskoznost hrane stvaraju i gel, uve ava se volumen hrane,

izaziva osje aj sitosti, stimulira brži prolazak himusa kroz probavni sustav, tako da brojni hranjivi sastojci budu za-robljeni u formiranom gelu i ostaju nedostupni enzimima guštera e i drugim crijevnim izlu evinama, te neprobavljeni. NSP je gra en od udjela neprobavljivih sirovih vlakna koje abrazivnim djelovanjem dovode do skra ivanja, zadebljanja i atrofije crijevnih resica, što posljedi no rezultira smanji-vanjem resorptivne površine (Jaroni i sur., 2004., Moharrery i Mohammadpour, 2005., Kund i Kundensen, 2014.). U strukturi žitarica NSP je jedan od glavnih zaštitnih elementa zrna, povezan je s mnogim hranjivim tvarima: proteinima, mineralima, mastima i dr. (glikoproteidi, kelati i dr.). Slikom 1. prikazan je presjek vanjskih slojeva i škrobnatog endo-sperma kukuruza, pšenice, je ma s prikazom mogu nosti djelovanja enzima.

Slika 1 Presjek vanjskih slojeva i škrobnatog endosperma kukuruza, pšenice, je ma s prikazom mogu nosti djelovanja enzima (Kund i Kundensen, 2014.) (Prikazano: 1. kukuruz, 2. pšenica, 3. je am. Gledano odozgo prikaz gra e zrna žitarica: košuljica i aleuron (sa slabim ili nikakvim djelovanjem enzima), subaleuron i endosperm (s dobrim mogu nostima djelovanja enzima).


Gradivi i zaštitni elementi žitarica su složenog sastava, što ima utjecaj na probavljivost pojedinih dijelova. Teško pro-bavljiva košuljica i aleuron dijelovi su vanjskog omota akojima je funkcija zaštita zrna. Po funkcionalnoj prirodi zaštite zrna, aleuron i košuljica imaju nisku probavljivost, gra eni su od dijelova netopivih i polutopivih ksilana, beta glukana te dijelova netopivih ksilana, celuloze i lignina. Subaleuron i endosperm su unutarnji dijelovi zrna koji sadrže lakše probavljive komponente proteina i škroba uz potporna teže probavljiva vlakna sastavljena od ksilana i beta glukana (Kund i Kundensen, 2014.). Fitati su glavni oblik pohrane fosfora u mnogim biljkama. Imaju složeni inozitolni prsten kojim vežu mnoge katione (Ca, K, Mg, Zn, Cu), tvore kelate s NSP-om, proteinima i aminokiselinama grade i složene komplekse. Fitazom (glji-vi ne, bakterijske) se hidrolizira fitinska kiselina i oslo-ba aju se kelirani spojevi, pove ava se biološka raspo-loživost minerala i drugih nutrijenata (Gontia-Mishra i Tiwari, 2013.).

Dobrobit dodavanja enzima u krmnu smjesu pili a u tovu

Kakvo a smjesa u prvim danima života pili a vrlo je važna za rast i razvoj probavnog sustava. Fiziološki perad u od-nosu na sisavce ima slabije razvijene slinske žlijezde i ima manju koli inu slinske amilaze i slabiju probavljivost škroba (Svihus, 2014.). U uvodnom dijelu opisali smo da je u prvim danima života enzimska aktivnost manja, a postupno raste s razvojem probavnog sustava. Takav nedostatak može se popraviti ugradnjom multienzimnih pripravaka u smjese za pili e. Pili i imaju vrlo nisku sposobnost probave biljnih stanica, a djelomi na probava se odvija u slijepom crijevu sudjelovanjem simbiotske mikroflore (Care i sur., 1993.).

Dodatkom enzima poput ksilanaze, beta glukanaze, pekti-naze, celulaze, manaze, galaktanaze može se posti i bolje iskorištavanje krmnih smjesa smanjivanjem udjela NSP-a te se tako umanjuje depresija rasta pili a izazvana nedostatkom vlastitih enzima. Pozitivan u inak upotrebe enzima vidljiv je u boljem zdravlju pili a, boljoj resorpciji nutrijenata, boljem prirastu pili a, izlaznim težinama i randmanu na klaonici (Senkoylu i Dale, 1999., Noy i sur. 2001.). Zhou sa suradnicima je 2009. godine napravio pokus s kukuruzno-sojinim smjesama u koje su ugradili komercijalni multienzimni preparat sa ksilanazom, alfa amilazom, prote-azom (Yiduozyme 9680, GuangDong, VTR Bio-TechCo. Ltd., China) u starteru, groveru i finišeru. Pokus je obu-hvatio tri skupine tovnih pili a ije su se smjese razlikovale prema visini metaboli ke energije (5 razina) i ugradnji enzima. Postigli su uve ane vrijednosti metaboli ke energije (ME) u starteru za 0,07-0,62 u groveru za 0,15-0,56 i finišeru za 0,12-0,43 MJ/kg, koje prikazujemo u tablici 2. Isti autori dalje navode da je u inak enzima u navedenim krmnim smjesama za pili e s kukuruzno-sojinim sirovinama bio najbolji u razinama oko 11,50 ME/MJ/kg, što je prikazano u slici 2. Dokaz da enzimi dodani u krmnu smjesu peradi mogu poboljšati prirast i konverziju hrane pružili su svojim pokusom Cowieson i Ravindran 2008. Pili i jedne pokusne skupine hranjeni su uobi ajenom smjesom, a pili i druge pokusne skupine krmnom smjesom u kojoj je smanjen udio energije i aminokiselina za 3%. U obje krmne smjese dodana je jednaka koli ina enzima ksilanze, amilaze i pro-teaze. U obje pokusne skupine dokazana je bolja konverzija hrane i prirast za 3%, a istodobno analizom fekalnog dušika je utvr eno 11,7% više zadržanog/iskorištenog dušika. Dodatkom sli nih multienzimskih pripravaka kukuruznim smjesama Cowieson (2005.) dokazuje bolju konverziju za 10,5% i ve u izlaznu težinu za 10,9%.

Tablica 2. Poboljšana energetska u inkovitost korištenjem enzima u smjesama za tovne pili e s razli itim razinama metaboli keenergije (ME/MJ/kg) (Zhou i sur., 2009.)

Skupina 10-12 dana starter 20-22 grover 40-42 finišer

(ME/MJ/kg) U inak (ME/MJ/kg) U inak (ME/MJ/kg) U inak1 kontrola 12,92 12,83 12,51

2 + enzimi 12,99 0,07 13,02 0,19 12,69 0,18

3 kontrola 12,72 12,16 12,18

4 + enzimi 12,90 0,18 12,31 0,15 12,30 0,12

5 kontrola 11,91 11,92 12,10

6 + enzimi 12,17 0,26 12,38 0,46 12,43 0,33

7 kontrola 11,63 11,70 12,09

8 + enzimi 11,96 0,33 12,26 0,56 12,34 0,25

9 kontrola 11,64 11,44 11,68

10+enzimi 12,26 0,62 11,99 0,55 12,11 0,43

ME - metaboli ka energija


Slika 2. U inak dodatka enzima na metaboli ku energiju (5 razina ME/MJ/kg) u starteru za brojlere (Zhou i sur., 2009.) (razine metaboli ke energije ME - metaboli ka energija, AME - dostupna metaboli ka energija, kontrola -, enzimi – ---)

Može se zaklju iti da se ugradnjom enzima postiže bolja probavljivost i iskoristivost hranjivih tvari iz inkapsulirane energije u stani nim stijenkama biljnih sirovina. Otapanjem NSP-a pove ava se energija, umanjuje viskoznost, a hidro-lizom drugih ugljikohidratno-proteinskih veza poboljšava se iskoristivost aminokiselina i osloba a se fitatni fosfor (Bedford i Morgan, 1996., Shivus i sur., 2005.). Kao što je napomenuto, na sastav krmne smjese utje etrenutno stanje na tržištu i cijena sirovina. U slu ajunedostatka kukuruza ili njegove previsoke cijene peradari esto ugra uju druge sirovine poput pšenice, je ma i sl.

Svaka od tih sirovina ima razli ito visok udio energije (kukuruz 3600 kcal/kg, pšenica 3250 kcal/kg, je am 2750 kcal/kg). Prema podacima NRC-a iz 1994. (engl. National Research Council) pšenica ima nižu energetsku vrijednost od kukuruza, ali je bogatija mnogim drugim hranjivim tvarima poput proteina, aminokiselina lizina, metionina, arginina, fenilalanina i triptofana. Nižu energetsku vrijednost može se popraviti dodatkom enzima. To dokazuju Choct i sur. (1995.) koji su uz dodatak komercijalnog multienzim-nog preparata Avizyme TX® (Danisco Animal Nutrition) (sadrži glikanazu i alfa amilazu) smjesi s pšenicom pove ali

energetsku vrijednost smjese s 12,02 na 14,94 MJ/kg te smanjili viskozitet himusa s 20,28 na 10,36 mPa, pove ali probavljivost škroba s 0,584 na 0,861, a koeficijent pro-bavljivosti proteina podigli s 0,689 na 0,745. (tablica 3.). Ksilanaza i beta glukanaza pokazale su se vrlo u inkovitima u razgradnji stani nih stijenki raži, je ma i pšenice te umanjuju viskoznost himusa u crijevima pili a (Chesson, 1992., Chesson, 2001.). U inak enzima u svojim istra-živanjima potvr uju Peterson i Aman (1989.), te Wang i sur. (2005.) pokusima s linearnim pove anjem enzima pentonaze i beta glukanaze. Rezultat je pove anje težine pili a za 27% mjereno 15. dana i 15% 27. dana, istodobno je pove anunos hrane za 15% i 8% te smanjena konverzija za 10% i 5% (tablica 4.). Smjese u kojima djelomice ili potpuno zamijenimo udio kukuruza sirovinama bogatim NSP-om (poput pšenice, je ma, raži i sl.) mogu uzrokovati zna ajne zdravstvene probleme poput malapsorpcije te proljevaste stolice, a u objektu visoku vlažnost i ljepljivost stelje (Barens i sur., 1993., Salah, 2012.). Ve i udio vlage i duši nih spojeva u stelji pogoduje razvoju infektivnih promjena na nogama (Mycoplasma spp., Staphylococcus spp.) (slika 3.).

Tablica 3. U inci djelovanja glikanaze i alfa amilaze na prirast, konverziju, metaboli ku energiju, probavljivost škroba i proteina, viskoznost (Choct i sur., 1995.)

Skupina Prirast

g/tj.Unos hrane

Konverzija g prirasta/g hrane

Dostupnametaboli ka energija

MJ/kg suhe tvari

Probavljivost ViskoznostmPa/sProteina Škroba

Kukuruz (kontrola) 438 852 0,514 16,65 0,900 0,769 3,16

Metaboli ka energija pšenica 306 771 0,397 12,02 0,584 0,689 20,28

Metaboli ka energija pšenica s enzimima 397 786 0,505 14,94 0,861 0,745 10,36


Tablica 4. U inak enzima pentonaze i beta glukanaze linearnim pove anjem na prirast, unos hrane i konverziju (Peterson i Aman, 1989.)

Proizvodne varijacije Dan Pove anje linearne razine enzima g/kg

0 0,11 0,22 0,44 0,88

Tjelesna težina/g 15 282 387 350 364 373 27 810 893 914 941 951

Prirast/g 15-27 524 545 564 576 577

Unos hrane/g 1-15 413 470 464 477 482 1-27 1410 1532 1519 1533 1531 15-27 997 1062 1055 1056 1049

Konverzija hrane/g hrane/g tjelesne težine

1-15 1,46 1,36 1,33 1,31 1,29 1-27 1,74 1,72 1,66 1,63 1,61 15-27 1,89 1,94 1,87 1,83 1,82

Slika 3. Dermatitis mekuši kod pili a hranjenih je momzbog pove ane vlažnosti stelje (bez dodanih enzima) makroskopski i histološki (Cengiz i sur., 2012).

Ekonomski gubitak u takvih pili a hranjenih krmnom smjesom bogatom je mom i sojom može zbog manjeg prirasta i zdravstvenih problema dovesti do velikih

ekonomskih gubitaka (do 25%). Cengiz i sur. (2012.) su dokazali da dodatkom komercijalnog preparata Farmazyme BR-M (Farmavet laç San. ve Tic. A. . Pendik) koji sadrži ksilanazu, beta glukanazu, celulazu, pektinazu, amilazu i manazu nema proizvodnih gubitaka proizašlih iz manjeg prirasta zbog o uvanja zdravlja pili a i boljeg iskorištavanja hrane.Radi o uvanja cjelovitosti crijevne stijenke potrebno je vremenski postupno ugra ivati teže probavljive sirovine kako bi se enzimski sustav i mikroflora prilagodili novim uvjetima. Preduvjet za dobru apsorpciju je cjelovitost površine crijevne stijenke kojom je osigurana kvalitetna apsorpcija nutrijenata (Mikec i sur., 2009.). Ve smo naveli da ve i udio teže probavljivih tvari (pektini, NSP, lektini i dr.) abrazivno djeluje na sluznicu crijeva u mlade peradi umanjuju i resorptivnu površinu. Njihovo djelovanje na tkivo tunica muscularis poja ava peristaltiku crijeva umanjuju i zadržavanje himusa u crijevima. Takve promjene negativno djeluju na aktivni prijenos hranjivih tvari putem krvožilnog dijela crijeva te nastupa limfoidna infiltracija koja pogoduje razvoju oportunisti ke mikroflore (Brown i sur., 1979., Jamroz, 1993.). Promjene morfologije i funkcije crijeva potaknute ve im udjelom NSP-a u nekim žitaricama poti u razvoj bolesti „nekroti ni enteritis“ uzrokovane bakterijom Clostridium perfringens koja dodatno toksinima ošte uje crijevnu sluznicu. Pove ana prisutnost proteina i izlu ivanje tripsina poti e osloba anje kokcidia (Eimeria tenella i Eimeria acervulina) u crijevima. Poboljšanje iskoristivosti smjesa dodatkom egzogenih enzima karbohidrataza i proteaza vidi se u boljoj razgradnji arabino-ksilo-oligosaharida do karboksilnih kiselina koje stvaraju stimuliraju e uvjete za rast probiotskih bakterija (Bacillus spp., Lactobacilus spp.), ime se smanjuje broj uvjetno patogenih bakterija (Salmonella, E. coli, Campylobacter, Clostridium). Kod mladih pili a u inak hidroliti ke enzimske razgradnje s prebiotskim u inkom vidljiv je u boljem razvoju resorptivne površine crijeva i zdravlju mladih pili a (Slominski, 2007.). Trend u novim


istraživanjima je nalaženje novih enzima koji bi prebiotskim u inkom stimulirali razvoj probiotske mikroflore. Kemmet (2014.) provodi istraživanje u kojem je u inak enzima bio bolja razgradnja neprobavljivih sastojaka krmnih smjesa do karboksilnih kiselina koje pospješuju kiselost probavnog su-stava i razvoj probiotske mikroflore dobivši 14%-tnu uštedu u krmnim smjesama po izra unu konverzije, a završnom analizom troškova dobiveni profit iznosio je 2,5%. Suncokretove poga e i sa me obiluju visokim udjelom proteina, masti i NSP-a. Dodatkom enzima (celulaze, beta glukanaze, ksilanaze, fitaze) u suncokretovu sa mu može se ugraditi u iznosu do 20% bez štetnih posljedica na zdravlje i prirast brojlera, ali po završnoj analizi troškova u prove-denim pokusima to je imalo negativan ekonomski rezultat (Senkoylu i Dale, 1999., Tavenari i sur., 2008.). Cilj upotrebe enzima je pove anje vrijednosti sirovina i jeftiniji finalni proizvod.

Egzogenim lipazama pospješujemo probavu i resorpciju masti koja se fiziološki odvija isklju ivo u tankom crijevu aktivnoš u pankreasne lipaze i žu nih kiselina. Dodanim egzogenim lipazama pospješuje se probava masno a iz hrane. Resorpcija masti se odvija ako su estice manje od 0,5 mikrona, jer tada budu resorbirane, putem krvi otprem-ljene te se iskorištavaju kao energetski supstrat ili budu deponirane, što se pozitivno odražava na oboga ivanje pile eg mesa i jaja nezasi enim masnim kiselinama (Kralik i sur., 2002.). Loš u inak NSP-a na probavu masti zamije en je kod purana i brojlera hranjenih krmnim smjesama na bazi pšenice s dodanom masti. Zapaženo je da je zbog prisutne viskoznosti himusa u crijevu otežana konjugacija sa žu nimkiselinama, pankreasnom amilazom i lipazom (Salah, 2012.). Santos i sur. (2004.) endoksilanazom i fosfolipazom postižu bolje emulgiranje, razgradnju masti i apsorpciju vita-mina topivih u mastima s uštedom hrane i boljim prirastom. Kod hrane koja sadrži visok udio masti dodanim lipazama može se polu iti negativan u inak na konzumaciju (Al-Marzooqi i Leeson, 1999.), tako što kolecistokinin stimulira proizvodnju žu i u jetri, bolje pražnjenje žu nog mjehura, bolje emulgiranje i resorpciju masti, u kona nosti prisutni kolecistokinin u središnjem živ anom sustavu veže se na ko-lecistokininske receptore, što daje osje aj sitosti i nedostatak apetita. Fitaza je najzastupljeniji egzogeni enzim u smjesama za perad, hidrolizira fitinsku kiselinu. U biljkama je 50%-70% fosfora vezano u obliku neprobavljivih fitata pa velik udio fosfora bude neprobavljen u krmnim smjesama. Djelo-vanjem fitaza osloba aju se kelirani spojevi i pove ava se

biološka raspoloživost minerala (Ca, K, Mg, Zn, Cu) i drugih nutrijenata (proteina, aminokiselina, še era, masnih kiselina) (Gontia-Mishra i Tiwari, 2013.). Pozitivni u inci fitaze vide se u boljem prirastu, iskorištavanju hrane, sastavu tibijalnog pepela, umanjivanju prisutnosti tibijalne dishon-droplazije, boljem imunom odazivu, manjem udjelu amo-nijaka i vlažnosti stelje (Viveros i sur., 2002., Shirley i Edvards, 2003., Gehring i sur., 2013.). U istraživanju djelovanja fitaze s niskim udjelom fosfora (0,46%) u pokusnim skupinama s tovnim pili ima genetike Cobb u dobi od 0-16 dana Shirley i Edvards (2003.) ugradili su razli ite razine fitaze u koli ini od 0-12.000 jedinica fitaze po kg krmne smjese. Najbolje su rezultate dobili s 12.000 jedinica fitaze koje prikazujemo u tablici 5. s usporednom negativnom kontrolom koja nema ugra enufitazu bez prikaza ostalih skupina radi bolje preglednosti. U tablici 5. se vidi da je u razdoblju pokusa od 0. do 16. dana s

ugra enom fitazom postignut bolji prirast za 228 g, a unos hrane bio je ve i za 214 g po pili u. Bilo je bolje iskorištavanje kalcija 12,8% i fosfora 28,9%. Prisutnost rahitisa u negativnoj kontroli je zabilježena u 80% pili a, dok je u skupini s fitazom rahitis prisutan u 3,3% pili a. Tibijalni pepeo bio je ve i za 14,7%, iskorištavanje duši nih tvari u smjesi bilo je ve e za 19,3%, analizom dostupne metaboli ke energije utvr en je porast za 199 kcal/kg smjese. Dobiveni rezultati potvrdili su opravdanost ugradnje fitaze u smjese tovnih pili a.

Dobrobit dodavanja enzima u krmnu smjesu kokoši nesilica

Složenost tehnoloških uvjeta u odgoju pilenki traži po-sebno razmatranje koje bi u ovom radu bilo neprikladno, stoga se usmjerujemo na elemente dobrobiti ugradnje enzi-ma. Novak i sur. (2007.) pratili su u inak multienzimskog pripravka Avizyme 1505® (Danisco Animal Nutrition) u pilenki White Leghorn u razdoblju od 0-126 dana života. Skupine su podijelili u etiri kontrolne bez dodatka multienzimskog pripravka i etiri skupine s dodatkom multienzimskog pripravka. Smjese su prilagodili uzrasnim potrebama: starter 0-42 dana, grover 43-70 dana, odgoj 71-105 dana, krmna smjesa pred nesenje 106-126 dana. Po analizi rezultata u svim skupinama na kraju pokusa nije bilo zna ajnije razlike u tjelesnim težinama, ali je zabilje-žena kumulativna ušteda u konverziji smjesa s ugra enimenzimima u iznosu od 0,27 ameri kih dolara po pilenki.

Tablica 5. Rezultati u inka fitaze (12.000 U/kg) uspore eni s negativnom kontrolom (0,46% fosfora) (Shirley i Edvards, 2003.)

FitazaU/kg Težina pili a/g Unos

hrane/g/pile

Ugradnja % Rahitis%

Tibijalni pepeo %

Iskorištavanje dušika

%

AMEkcal/kg Ca P

0 287 381 40,6 51,0 80,0 26 58,4 3216 12.000 515 595 53,4 79,9 3,3 40,7 77,7 3415

U - jedinica fitaze, AME - dostupna metaboli ka energija


Kod konzumnih nesilica ugradnjom enzima tražimo proiz-vodnju koja se bez obzira na promjenu sirovinskog sastava ne e odraziti na postotak nesivosti, kakvo u i težinu jaja, tjelesnu težinu. Jaroni i sur. (1999.) su proveli istraživanje na dvije hibridne linije konzumnih nesilica Deklab Delta i Hyssex White, pri emu su koristili preparat Avizyme 1300 (Finnfeeds International) koji sadrži ksilanazu i pro-teazu. Pokus su inile tri pokusne skupine: kontrolna s 0,00% enzima i dvije s ugra enim enzimima 0,1% i 0,2%. Cilj istraživanja bio je utvrditi mogu nost zamjene kuku-ruza pšenicom u iznosu od 8% i 16%, pri emu su pra enisljede i parametri: unos hrane, tjelesna težina nesilica, postotak nesivosti, kakvo a i težina jaja, udio bjelanjaka i žumanjaka te postotak prljavih jaja. Zamjenom dijela udjela kukuruza pšenicom uz dodane enzime pokazalo se da pra eni parametri nisu negativno promijenjeni u odnosu na kontrolnu skupinu. Protein je najskuplja komponenta krmnih smjesa pa se traže mogu nosti umanjivanja koli ine proteina ugradnjom enzima. Pomo u enzima možemo posti i bolju konverziju, a time uštedu na proteinu i umanjiti okolišno zaga ivanje duši nim spojevima. Santos-Ricarde i sur. (2013.) su koristili hibridne nesilice ISA Babcock B-300. Dodatkom Avizima (Danisco Animal

Nutrition; sadrži ksilanazu, proteazu, alfa amilazu) u hranu s 5 razina proteina (Tablica 6) utvrdili su da smanjivanje proteina nije imalo utjecaja na kvalitetu jaja, ali je pove-ana konverzija hrane za 6 g po proizvedenom jajetu u

skupinama koje nisu dobivale enzime. Junqueira i sur. (2006.) pripisuju pove anu konverziju hrane poja anojnervozi u jatu nesilica proizašloj zbog umanjivanja pro-teina. Dobre rezultate s poboljšanjem iskoristivosti hrane djelovanjem enzima potvrdili su Jakob i sur. (2000.) i Yörük i sur. (2006.) u svojim istraživanjima konverzije hrane i kakvo e jaja s umanjenjem ME i proteina. Svi biljni izvori fosfora imaju oko 66% fitatnog fosfora, stoga se name e potreba dopunjavanja smjesa skupim anorganskim izvorima fosfora. Casartelli i sur. (2005.) istraživali su mogu nost boljeg iskorištavanja fosfora ugra ivanjem fitaze u smjese za konzumne nesilice Hysex Brown u vrhuncu nesivosti od 32. do 48. tjedna i poslije vrha nesivosti od 48. do 64. tjedna. Formulirali su krmne smjese s 18% proteina, 2800 kcal/ME/kg i kalcija 3,64%. U pokusu su imali kontrolnu skupinu s 0% fitaze i pokusnu skupinu s ugra enom fitazom od 1000 FTU/kg hrane (FTU - fitazne jedinice). Dobiveni rezultati pokazuju da je dodatkom fitaze mogu epoboljšati iskorištavanje fosfora za 47,1%, kalcija za

Tablica 6. Ušteda hrane po dobivenim rezultatima s 5 razina proteina uz dodane enzime (Santos-Ricarde i sur., 2013.)

Protein % Unos hrane/g Jaja/g 18,80 95,00 62,4 16,60 + enzimi 89,90 (ušteda oko 6 g hrane) 62,0 16,60 91,10 61,2 16,00 93,60 61,3 15,40 96,50 61,8

Tablica 7. Podaci o unosu hrane, postotku nesivosti, težini jaja, postotku konverzije u kontrolnoj skupini bez fitaze i u skupini s ugra enom fitazom (Casartelli i sur., 2005.)

g/%/nesilica Unos hrane/g % nesivosti Težina jaja/g % konverzije

28.-48. tj. 48.-64. tj. 28.-48. tj. 48.-64. tj. 28.-48. tj. 48.-64. tj. 28.-48. tj. 48.-64. tj.Fitaza 0,00% 106,45 105,12 94,48 88,54 62,79 64,13 1,796 1,874 Fitaza 1000 FTU/kg smjese 105,76 105,43 94,62 88,19 61,70 63,15 1,801 1,918 FTU/kg - aktivnost fitaze u fitatnim jedinicama

Tablica 8. Podaci o konzumaciji i izlu ivanju fosfora, kalcija, dušika u kontrolnoj skupini bez fitaze i u skupini s ugra enomfitazom (Casartelli i sur., 2005.)

Nesilica Fosfor/mg Kalcij/g Dušik/g

Konzumacija Izlu ivanje Konzumacija Izlu ivanje Konzumacija Izlu ivanje Fitaza 0,00% 496 369 3,42 1,13 2,69 1,55 Fitaza 1000 FTU/kg smjese 269 195 2,86 0,99 2,48 1,28 FTU/kg - aktivnost fitaze u fitatnim jedinicama


12,4% i duši nih tvari (protein, aminokiseline) za 17,4% (Tablice 7. i 8.). Ovi podaci pružaju dokaz da fitaza ima zna ajnu ulogu u iskorištavanju fitatno-proteinskih komponenata, bolje je iskorištavanje mineralnog udjela u smjesama, što doprinosi jeftinijem finalnom proizvodu i manjoj fekalnoj poluciji u okoliš. Graham i sur. (2003.) u svojim istraživanjima navode da se može smanjiti volumen stajskog gnoja do 14%, fekalnog dušika 13%, fosfora do 70%. Korištenjem enzima u hrani štedi se u obradi i transportu fekalnih tvari, umanjuje se koli ina nitrata, fosfata, amonijaka, eutrofikacija voda, koli ina stakleni kih plinova u okolišu, ime se uvazdravlje ljudi i sprje ava one iš enje prirodnih resursa (Oxtenbol i sur., 2011.).

Zaklju ak

Tehnološki napredak u istraživanju novih ina ica enzima je svakodnevan, donose se rješenja kojima se unaprje uju i proizvode novi enzimi koji bi probiotskim u inkom na crijevnu mikrofloru djelovali na zdravlje. Dosadašnja iskustva govore o pozitivnim u incima enzima: podiže se metaboli ka energija, postigla se ušteda na proteinu, fosforu, bilježi se bolji prirast i konverzija krmnih smjesa. Proširila se mogu nost ugra ivanja razli itih sirovina bez štetnih utjecaja na zdravlje peradi. Boljim iskorištavanjem esen-cijalnih nutrijenata podigla se kvaliteta mesa, jaja i nespecifi na otpornost peradi. Štedi se na transportu i obradi fekalija. Manji je štetni okolišni utjecaj fekalne mase. U inak multienzimnih pripravaka kojih se danas na tržištu nalazi sve više prvenstveno ovisi o znanju nutricionista i pravilnom odabiru kombinacija enzima u pripravku koji ese primijeniti u hrani odre enog sirovinskog sastava ije nutritivne elemente treba odre ivati u specijaliziranim laboratorijima.

Literatura

AL-MARZOOQI, W., S. LEESON (1999.): Evaluation of dietary supplements of lipase, detergent, and crude porcine pancreas on fat utilization by young broiler chicks. Poult. Sci.;78(11):1561-1566.

AKIBA, Y., H. MURAKAMI (1995.): Partitioning of energy and protein during early growth of broiler chicks and contribution of vitelline residue. U: Proceedings of the 10th European Symposium on Poultry Nutrition. World Poult. Sci. Assoc., Antalya, Turkey, 44-52.

BRENES, B., M. SMITH, W. GUENTER, R. R. MARQUARDT (1993.): Effect of enzyme supplementation on the performance and digestive tract size of broiler chickens fed wheat- and barley-based diets. Poult. Sci. 72:1731-1739.

BEDFORD, M. R., A. J. MORGAN (1996.): The use of enzymes in poultry diets. World Poult. Sci. J. 52:61-68.

BEDFORD, M. R., C. L. WALK (2012.): Phytase development, usage, and interactions with other ingredients. Poultry Science Association 101st Annual Meeting. Poult. Sci. 91 (Suppl. 1)

BÜHLER, M., J. LIMPNER, A. MÜLLER, G. SHWARZ, O. SIMON, M. SOMMER, W. SPRING (2004.): Enzymes in animal nutrition. Arbeitsgemeinschaft für Wirkstoffe in der

Tieremarung ev(AWT). http://www.awtfeedadditives.de/ /ckfinder/userfiles/files/publication/Enzymbro-engl.pdf

BROWN, R. C., M. S. KELLNER, M. S. KOSOVSKY (1979.): The effect off pectin on the rat small intestine. Br. J. Nutr. 42:357-365.

CASARTELLI, E. M., O. M. JUNQUEIRA, A. C. LAURENTIZ, R. S. FILARDI, J. LUCAS JÚNIOR, L. F. ARAUJO (2005.): Effect of phytase in laying hen diets with different phosphorus sources. Rev. Bras. Cienc. Avic. vol. 7 no. 2 .

CARRE, B. (1993.): Digestbility of carbohydrates in poultry. World Poultry Science Association. 9 European Symposium on Poultry Nutrition. Jelenia Gora 5-9. 10. 1993. pp148-163.

CENGIZ, O., B. H. KOKSAL, A. G. ONOL, O. TATLI, O. SEVIM, H. AVICI, S. F. BILGILI (2012.): Influence of dietary enzyme supplementation of barley-based diets on growth performance and footpad dermatitis in broiler chickens exposed to early high-moisture litter. J. Appl. Poult. Res. 21(1):117-125.

CHESSON, A., (1992): Feed Enzyme. In: Feed Additives and Supplements. Dmello, J.P.F. and C.M. Duffus (Ed.). SAC, Edinburgh, pp 61-76.

CHESSON, A. (2001.): Non-starch polysaccharide degrading enzymes in poultry diets: Influence of ingredients on the selection of activities. W. Poult. Sci. J. 57:251-263.

CHOCT, M., R. J. HUGHES, R. P. TRIMBLE, K. ANGKANAPORN, G. ANNISON (1995.): Non-starch polysaccharide-degrading enzymes increase the performance of broiler chickens fed wheat of low apparent metabolizable energy. J. Nutrit. Volume 125, Issue 3, 1995, pp 485-492.

COWIESON, A. J. (2005.): Factors that affect the nutritional value of maize for broilers. Anim. Feed Sci. Tech. 119:293-305.

COWIESON, A. J., V. RAVINDRAN (2008.): Effect of exogenous enzymes in maize-based diets varying in nutrient density for young broilers growth performance and digestibility of energy, mineral and amino acids. Br. Poult. Sci. 49(1):37-44.

DIRECTIVE 70/524/EEC: List of currently authorised feed additives under Directive 70/524/EEC and products listed in points 2.1, 3 or 4 of the Annex to Directive 82/471/EEC, which appear to have not been the object of a notification to the European Commission according to Article 10 of Regulation (EC) No 1831/2003at the date of 11/10/2004.. Official Journal L 268, 18/10/2003, p. 29. http://ec.europa.eu/food/food/animalnutrition/feedadditives/list_additives.pdf

FDA (2013.): Enzyme preparations used in food http://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/EnzymePreparations/default.htm

GEHRING, C. K., M. R. BEDFORD, W. R. DOZIER (2013.): Extra-phosphoric effects of phytase with and without xylanase in corn-soybean meal-based diets fed to broilers. Poult. Sci. 92(4):979-991. doi: 10.3382/ps.2012-02769.

GRAHAM, H., P. H., SIMMINS, J. SANDS (2003.): Reducing environmental pollution using animal feed enzymes. Commun Agric Appl Biol Sci. 68 (2 Pt A): 285-289.

GONTIA-MISHRA, I., S. TIWARI (2013.): Phylogenetic Analysis of Fungal Phytases, Food Technol. Biotechnol. 51(3):313-326.

JACOB, J. P., S. IBRAHIMI, R. BLAIR, H. NAMKUNG, I. K. PAIK (2000.): Using enzyme supplemented, reduced protein diets to decrese nitrogen and phosporus excretion of white leghorn hens. Asian-Aus. J. Anim. Sci.. 13(12):1743-1749.


JUNQUEIRA, O. M., A. C. DE LAURENTIZ, R. DA SILVA FILARDI, E. M. CASARTELLI (2006.): Effects of energy and protein levels on egg quality and performance of laying hens at early second production cycle. J. Appl. Poult. Res. 15(1):110-115.

JARONI, D., S. E. SCHEIDELER, M. BECK, C. WYATT (1999.): The effect of dietary wheat middlings and enzyme supplementation.1. Late egg production efficiency, egg yields, and egg compositionin two strains of Leghorn hens. Poult. Sci. 78:841-847.

JARONI, D., S. E., SCHEIDELER, M. M. BECK, C., WYATT (2004.): The effect of dietary wheat middlings and enzyme supplementation II: apparent nutrient digestibility, digestive tract size, gut viscosity, and gut morphology in two strains of leghorn hens. Poult. Sci. 78:1664-1674.

JAMROZ, D. (1993.): Some aspects of layer geese nutrytion. Worlds poultry science association. 9 European symposium on poultry nutrition Jelenia Gora 5-9. 10. 1993. pp 88-120.

KEMMET, K. (2014.): Probiotics and enzymes: a good combi-nation. All about feed Vol. 22, No 10.

KUND, E., B. KUNDSEN (2014.): Fiber and nonstarch polysaccharide content and variation in common crops used in broiler diets. Poult. Sci. 93:2380-2393.

KRALIK, G., S. IVANKOVI , Z. ŠKRTI (2002.): Mijenjanje profila masnih kiselina u miši nom tkivu brojlera. Zagreb, Krmiva 44(6):297-305.

MOHARRERY, A., A. A. MOHAMMADPOUR (2005.): Effect of diets containing different qualities of barley on growth performance and serum amylase and antestinal villus morphology. Int. J. Poult. Sci. 4(8):549-556.

MIKEC, M., Z. BI IN, M. BALENOVI (2009.): Zdravlje crijeva u peradi. “Zbornik radova Peradarski dani 2009“ s me unarodnim sudjelovanjem. Pore , 25.-28. ožujka 2009. pp. 206-212.

NRC – NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1994.): Nutrient requirements of poultry. Ninth Revised Edition. http://www.nap.edu/openbook.php?isbn=0309048923

NOY,Y., A. GEYRA, D. SKLAN (2001.): The effect of early feeding on growth and small intestinal development in the posthatch poult. Poult. Sci. 80:912-919.

NITSAN, Z., G. BEN-AVRAHAM, Z. ZOREF, I NIR (1991.): Growth and development of the digestive organs and some enzymes in broiler chicks after hatching. Br. Poult. Sci. 32:515-523.

NOVAK, C., H. M. YAKOUT, J. REMUS (2007.): Response of varying dietary energy and protein with or without enzyme supplementation on growth and perfonmance of Leghorns: Growing period. J. Appl. Poult. Res. 16(4):481-493.

OXENBOLL, K. M., K. PONTOPPIDAN, F. FRU-NJI (2011.): Use of a protease in poultry feed offers promising environmental benefits. Int. J. Poult. Sci 10(11):842-848.

PETERSON, D., P. AMAN (1989.): Enzyme supplementation of a poultry diet containing rye and wheat. Br. J. Nutr., 62: 139-149. RAVINDRAN, V. (2003.): Development of digestive function in neonatal poultry: Physiological limitations and potential. Proc. Aust. Poult. Sci. Sym. 2003.

SALAH, H. E. (2012.): Controlling dietary factors to raise healthy birds. World Poult. http://www.worldpoultry.net/Broilers/ Nutrition/2012/4/Controlling-dietary-factors-to-raise-healthy-birds-WP010258W/

SANTOS, A. A. Jr., P. R. FERKET, J. L. GRIMES, F.W. EDENS (2004.): Dietary supplementation of endoxylanases and phospholipase for turkeys fed wheat-based rations. Int. J. Poult Sci. 3(1):20-32.

SANTOS-RICALDE, R., L. SARMIENTO-FRANCO, J. SEGURA-CORREA (2013.): Effect off three protein levels and an enzyme blend on egg quality of laying hens. Pak. J. Biol. Sci. 16:1056-1060.

SENKOYLU N., N. DALE (1999.): Sunflower meal in poultry diets: a review. World's Poult. Sci. J. 55:153-174.

SHIRLEY, Z., H. M. Jr. EDWARDS (2003.): Graded levels of phytase past industry standards improves broiler performance. Poult. Sci. 82(4):671-680.

SLOMINSKI, B. A. (2007.): Recent advances enzymes for poultry diets. http://www.thepoultryfederation.com/public/userfiles/ /files/2-6%20Wed%20-%20Bogdan%20Slominski%20-%20Enzymes%20for%20Poultry.pdf

SVIHUS, B., A. K. ULHEN, O. M. HARSTAD (2005.): Effect of starch granule structure, associated components and procesing on nutritive value of cereal starch. Anim. Feed Sci. Technol. 122:303-320.

SVIHUS, B. (2014.): Starch digestion capacity of poultry. Poult.Sci. 93(9):2375-2379. TAVENARI, F. C., L. F. T. ALBINO, R. L. MORATA, W. M. DURATA-JUNIOR, H. S. ROSTANGO, M. T. S. VIANA (2008.): Inclusion of sunflower meal, with or without enzyme supplementation, in broiler diets. Rev. Bras. Cienic. Avic. Vol. 10, No 4

YÖRÜK, M. A., M. GÜL, A. HAYIRLI, M. KARAOGLU (2006.): Multi-enzyme supplementation to peak producing hens fed corn-soybean meal based diets. Int. J. Poult. Sci. 5(4):374-380.

VIVEROS, A., A. BRENES, I. ARIJA, C. CENTENO (2002): Effects of microbial phytase supplementation on mineral utilization and serum enzyme activities in broiler chicks fed different levels of phosphorus. Poult Sci. 81(8):1172-1183.

WANG, Z. R., S. Y. OIAO, W.O . D. F. LI LU (2005.): Effects of enzyme supplementation on performance nutrient digestibility gastrointestinal morphology and volatile fatty acid profiles in the hindgut of broilers fed wheat-based diets. Poult. Sci. 84:875-881.

ZHOU, Y., Z. JIANG, D. LV, T. WANG (2009.): Improved energy-utilizing efficiency by enzyme preparation supplement in broiler diets with different metabolizable energy levels. Poult. Sci.(2):316-22. doi: 10.3382/ps.2008-00231.

USE OF ENZYME SUPPLEMENTS IN POULTRY DIETS

Summary

In the last two decades, efforts have been invested to enhance utilization of poultry feed and achieve good production and health results in poultry farming, while at the same time reducing its cost. Adding enzyme or multi-enzyme supplements to


poultry diets has been found to contribute to these goals. Many studies have demonstrated that enzyme supplementation in poultry diets results in higher body mass gain, better feed consumption and conversion, as well as in a beneficial effect on poultry health. In laying hens, the addition of various enzyme supplements in diet had favorable effects on laying hen performance, egg and eggshell quality (thicker and firm eggshell, and less soiled eggs). Also, addition of various enzyme supplements to poultry diets reduces environmental contamination (nitrogen, ammonia, and phosphates).

Key words: enzymes, NSP, viscosity, phytates, broilers, laying hens


IMPORTANT FACTORS IN THE EVALUATION OF CORN NUTRIENT VALUE FOR POULTRY

Mohammad Vadiei

Bio Pharm Vet d.o.o. , Zagreb, Hrvatska

Summary

Corn is the most important cereal feed ingredient in poultry nutrition. Different types of corn are produced depending on the specific country and multiple factors have to be taken into account when evaluating the feeding value of corn in order to achieve optimum utilization of this important cereal. Selection of appropriate corn type at the sowing time targeted for animalfeed or other industrial processing is highly important. Physical properties, nutrient profile (affected by plant breeding), cultivation practices, production soil and climate conditions are influencing not only the corn feed value, but poultry performance results as well. Corn is one of the main energy sources for poultry, with corn starch being the primary supply of energy. Corn starch structure, starch digestibility and anti nutritional factors are of primary importance. In these regards, resistance starch, amylase inhibitors, anti-nutritional factors of protein structure, effect of different exogenous enzymes andenzymatic digestion, and absorption capacity of small intestine must be considered. Generally, harvest is performed during the season of cool and rainy weather, which implies the grain humidity level of 30%-40%. Therefore, drying process and storage conditions have important effects on corn nutrient value. The drying degree particularly affects the corn amino acid content andTME (True Metabolic Energy) value due to Maillard reaction. Also, the effect of mycotoxins is reported to decrease the starch and fat content, digestible energy value and feed flavor while increasing the cellulose rate.

Key words: corn, nutrient value, poultry nutrition

Introduction

Feed is the most important factor in economic animal production sector, due to feed consumption volume and feed cost during the production period. It is clear that for good quality of feed we need good quality of feed ingredients. Corn is the main cereal used in most parts of the world for poultry nutrition. Corn as the main cereal and energy source in poultry feed can provide approximately 65% of metabolic energy and 20% of crude protein in poultry feed. In comparison to wheat and barley, corn has lower protein (80 g/kg) and higher energy level. The energy level of corn stems from high starch level (>600 g/kg) (Weurding et al., 2001). Nutrient values of different feed ingredients are the most important factor in feed formulation. Nutrient value can be affected by different factors in poultry corn based diets. These factors are the variety, growing condition, drying temperature, starch structure, anti-nutritional factors, hectoliter weight, genetic modification, physical properties and mycotoxin effects. This review is trying to focus on the factors that have the most important effect on poultry performance.


VarietyNormal and waxy corn are two different corn varieties. Normal corn contains about 73% of amylopectin and 27% of amylase, while waxy corn is composed of amylopectin (>90%) and a higher amount of oil ( 4.9%) in comparison to conventional corn ( 4%). Actually, waxy corn was developed for industrial purposes and is named 'wet milling'. Corn starch, corn gluten meal, corn gluten feed and corn oil are products of this process. According to Ertl and Dale (1997), there were differences in the True Metabolic Energy (TMEn) value (tested in Hy-line W-36) between normal and waxy corn of different hybrids, but no significant difference was observed in TMEn of normal and waxy corn of the same hybrid. Also, they showed that differentiations between conventional and waxy corn of the same hybrids are the results of single gene mutation (wx) that alters starch composition. Furthermore, from a crop science point of view we can find high oil, high amylase and high lysine content corn varieties. High oil corn contains approximately 7 to 8 percent oil, also

Mohammad Vadiei, Bio Pharm Vet d.o.o, Medvedgradska 1c, 10000 Zagreb, Croatia; e-mail: [email protected]

IMPORTANT FACTORS IN THE EVALUATION OF CORN NUTRIENT VALUE FOR POULTRY 167

protein quality and quantity are increased in high oil variety because the germ size is larger and protein content of germ has higher quality than endosperm. Research shows that high oil corn can support better performance, lower abdominal fat and capability of providing higher energy diets without increasing the supplemental fat or oil level in broilers (Adams et al., 1994; Benitez et al., 1999; Han et al.,1987). Also, Han et al. (1987) report that layers fed with high oil corn have better feed to gain ratio than hens fed the same diets containing conventional corn, while egg production and egg yield tend to be improved (P<0.1) in hens fed diets with high oil corn.

Physical properties The nutrient profile and physical characteristics of corn dents are the results of environmental conditions, agri-cultural practices, selective plant breeding and production location (Leonard and Martin, 1963). Grain nutrient profile can be understood rapidly with new technology methods such as NIR (Near Infrared Spectroscopy) for diet formulation. In addition, physical characteristics of kernel dents are of utmost importance for commercial poultry production. Collins and Moran (2001) showed the effect of different kernel physical characteristics with the same nutrient value on broiler performance. In this experiment, they used 2 different corn kernels, specifically corn A had smaller and harder kernels than corn B, which had a bigger

test weight (larger and softer kernels) while nutrient profile of each was similar (Table 1). Also, this similarity extended to the complete feed. Besides difference in final body weight in cool season, according to the authors, “formulating practical broiler diets to account for physical differences between these grain sources, given all other potential sources of variation, appears to be of minor importance”.

Particle size in mash and pellet feeds Optimum particle size of different feed is important for efficient poultry production. The use of highly processed feed in current feed production industry is a standard. In processed feeds, pellet or crumble size has the main role in particle size effects on poultry but some research suggests that maybe the feed ingredients particle size effect on performance is kept up even after pelleting (Amerah et al.,2007). However, research data show that corn particle size in mash diets is more important than in processed diets. There are different research reports about the optimum corn particle size in broiler chickens. Some of them show that decreasing of corn particle size from 1298 μm to 987 μm (Reece et al., 1986), from 1173 μm to 710 μm (Lott et al.,1992) and from 900 μm to 300 μm (Healy et al., 1992) improved broiler performance. In contrast, Nir et al. (1994) demonstrated that increasing the corn particle size from 525 μm to 897 μm and uniformity of the particle size had positive effects on broiler performance.

Table 1. General grain characteristics of yellow dent corn hybrid (with the same nutrient value) used in experimentation (Collins and Moran, 2001)

Corn A Corn B Kernel size Small Large Kernel hardness Hard Soft Kernel density (g/cc) 1.29 1.27 Test weight Higher Lower Total protein Similar Similar Total oil Lower Higher Total starch Similar Similar

Table 2. Performance data (0-7 weeks) in broilers fed diets containing yellow dent corn hybrid of similar nutrient composition but differing in kernel characteristics (Collins and Moran, 2001)

Trail Contrast Gain (g) Feed consumption (g) Feed:Gain (g:g) Winter Corn * *** NS A 2970 5819 1.96 B 2902 5603 1.94 Summer Corn NS NS NS A 2546 4970 1.95 B 2530 4956 1.96 SEM 17.5 33.5 0.009 *difference significant at P 0.05; ***difference significant at P 0.001; NS, nonsignificant


On the other hand, Jurgens et al. (1993) have shown that decreasing of corn particle size has enhancing effect on the surface area, so that not only digestive enzymes can be more effective on the substrate, but also the energy requirements for digestion decrease. Other benefits of particle size reduction can be easier handling and mixing of ingredients and better pellet quality. But, there are limitations in particle size reduction especially in mash feed because birds may encounter difficulties with very fine or coarse particles. Also, particle size is important in gizzard development and gut motility. However, there seems to be general concurrence in corn based diets for broilers, optimum particle size should be between 600 and 900 μm, especially in mash form diets (Amerah et al., 2007).

Hectoliter weight Hectoliter weight is one of the easy and most rapid ways to have an idea about grain quality and nutrient value. Hectoliter weight of corn can be influenced by factors such as harvest time, environmental conditions, season, diseases, insect damages and foreign materials. Lesson et al. (1977) have shown that 1% increase in moisture can reduce metabolic energy of corn by 12 kcal/kg. Also, according to Dale and Williams (1993), decreasing 100 g/L in hectoliter weight of corn reduces 40.66 kcal/kg of TME.

Starch type and starch digestibility Starch provides approximately 60% of the apparent metabolic energy (AME) content of poultry feed (Weurding et al., 2001b), so a small difference in starch digestibility can have significant impact on dietary AME for poultry. The most important and effective factor in starch energy value is the starch granule size. Researches show that starch granule size for corn ranges between 2 and 30 μm (Franco et al.,1998; Tester et al., 2004) and also small granules have a larger surface area, thereby providing a big potential for hydrolysis by endogenous amylase (Carre, 2004). Starch gelatinization is the result of thermal processing in feed that can increase the digestibility of starch and energy value of feed. Gelatinization is dependent on granule size, heat, time, moisture content and amylase:amylopectin ratio of starch in the processing period (Tester et al., 2004). Starch digestion is hydrolysis of starch into glucose monomers and subsequent absorption of glucose by epithelial cells of the villi. Digestion of starch in poultry is characterized by enzymatic potential (Cowinenson, 2004b) of the three enzyme activities, -amylase, maltase and isomaltase that are primary in the digestion of starch (Carre, 2004; Tester et al., 2004). The main starch hydrolysis takes place in the duodenum via pancreatic -amylase in the poultry gastrointestinal tract (Moran, 1982; Tester et al.,2004), but considering endogenous enzyme activities there are limitations for starch digestion in poultry, especially in young birds. Besides limitation in the -amylase activity in crop and proventiculus (Tester et al., 2004) or initial hydrolysis of water insoluble starch by amylase (Carre, 2004), the production and restricted locality of endogenous

maltase and isomaltase (only 5% of maltase and isomaltase activity found in lumen) may also limit the energy from starch, especially in young chicks (Noy and Skaln, 1995; Batal and Parsons, 2002). On the other hand, even with glucose produced from starch, limitation in the absorption capacity in young chicks depends on increasing the feed passage rate in the gastrointestinal tract, which can reduce the available energy from starch (Carre, 2004). This is also present when sodium is the limiting factor for active transport in gut or when available carbohydrase such as xylose in the chyme competes with glucose during active transport (Graham et al., 2003), or due to inhibition of the sodium-dependent uptake of glucose into the brush-border membrane by flavonoids such as quercetin (Cermak et al.,2004). These events decrease the energy value of poultry diets. Generally, factors that have negative effects on corn starch digestion in poultry include feed endogenous enzyme production, feed passage rate, active transport limitations, amylase inhibitors (Moran, 1982), processing damage (Tester et al., 2004), protein/lipid/starch matrices (Tester etal., 2004), inositol hexaphosphate (Cowinson et al., 2004a), NSP (Socorro et al., 1989) and resistant starch in corn (Brown, 1996; Tester et al., 2004; Cowinson, 2004b).

Exogenous enzymes Exogenous enzymes are used to reduce anti-nutritional factors of feed ingredients to achieve better digestion, increase nutrient value and gut health in poultry diets. Phytate is the main storage form of phosphorus ( 70%) in a plant (Eeckhout and De Paepe, 1994). This form of phosphorus (Phytate or IP6) is not available for monogastric animals because of deficiency of endogenous enzymes for hydrolysis of phytate. In addition, IP6 is a strong anti-nutrient that can reduce the digestibility of carbohydrates, amino acids, proteins and minerals (Ravindran et al., 1999). Cowienson et al. (2004a) showed that the presence of IP6 had negative effect on digestibility of corn starch in the intestine. They suggest that this is probably the result of formation of mineral/IP6/starch complexes in the gastrointestinal tract that decrease the solubility and digestibility of starch. Also, it is possible that IP6 chelate mineral co-factors such as calcium are required for optimal function of amylase or other enzymes (Cowienson, 2004b). With the possible exception of phytase in corn-based diets, there are no high concentration main carbohydrate-based anti-nutrients (water soluble NSP is less than 1g/kg) in corn or corn-soy diets that have adverse effect on poultry performance (Choct, 1997). However, researches demons-trated that the use of exogenous enzyme preparation improved performance in poultry with corn-soy based diets (Pack and Bedford, 1997; Zanella et al., 1999; Jin, 2001; Kidd et al., 2001; Iji et al., 2003; Kocher et al., 2003). There are some mechanisms in the enzyme developmental process for corn-soy based diets. These mechanism are the possibility of hydrolysis of polysaccharides that are not accessible to endogenous enzymes (Bedford, 1996), hydrolysis of anti-nutrients such as phytin (Cowienson et al.,


2004b), enzyme inhibitors or lectins (Huo et al., 1993), increasing the efficiency of endogenous enzymes and improving the net energy of corn. Furthermore, exogenous enzymes can improve the nutritional value of feed by reducing the loss of endogenous material (Danicke et al., 2000; Sell et al., 2000; Cowienson et al., 2003). Also, they can reduce the number of bacteria in distal gut, so absorption of nutrients in the proximal gut may be improved (Apajalahti et al., 2004). On the other hand, there is a potential deficiency in digestion (digestive enzymes) and absorption capacity of young

chickens (Nitsan et al., 1991; Noy and Sklan, 1995; Jin et al., 1998; Parson, 2004). Researches show that specific activities of lipase, amylase, trypsin and chymotrypsin increase up to 2 weeks post hatch. Jin et al. (1998) have suggested that the immaturity of digestive system in the post hatch period may result in poor utilization of nutrients. Also, Parson (2004) showed that nutrient absorption capacity of small intestine could be the primary limiting factor in young chickens. Therefore, besides novel nutritional methods (in-ovo nutrition) and different early nutrition programs and pre-starter diets in young chickens, supplementation of exogenous enzymes to increase digestibility may help improve digestion in the post hatch period.

Mycotoxin effects Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi, which are capable of causing diseases and death in humans and all animals. Mycotoxins are metabolized in the liver, kidneys, and also by microorganisms in the digestive tract. Therefore, the chemical structure of mycotoxin residues excreted by animals or found in their tissues is different from parent molecule (Ratcliff, 2002). The economic losses in animal production are primarily due to decreased growth rate, FCR, carcass yield, carcass quality and increased sensitivity to diseases because of their immunosuppressive

effects (Patil et al., 2003). Apart from pathological effects on animal, mycotoxins have negative effect on starch and oil rate and increase the cellulose amount in grains. Also, decrease in palatability and digestible energy value of feed are additional negative effects of mycotoxins (Blaney et al.,1991). Out of more than 350 mycotoxins identified in nature, aflatoxins (AF), citrinins (CIT), fumonisins (F), ochratoxins (OT) and tricothecenes are most common and important for poultry production. Aflatoxins, zearalenone and deoxynivalenol are most harmful when present in corn grains. For example, deoxynivalenol (DON) decreases glucose absorption in the proximal jejunum of laying hens with inhibition of sodium D-glucose co-transporter (Awad et

Table 3. Summary of effects of exogenous enzymes on broiler performance fed corn-soy based diets (Cowienson, 2004c)

Reference Enzyme(s)* FCR % improvement over control Body weight gain % improvement over control

Zanella et al., 1999 Xylanase Amylase Protease

2.2 1.90

Jin, 2001 Xylanase Amylase Protease

3.65 5.02

Jackson, 2001 -mannanse 2.76 4.66

Kidd et al., 2001 -Galactosidase 0.88 2.22

Iji et al., 2003 Xylanase Amylase Protease

10.5 10.3

Pack and Bedford, 1998 Xylanase Amylase Protease

0.78 3.6

Pack and Bedford, 1997 Xylanase Amylase Protease

5.7 6.9

Cowienson, 2002 Pectinase 2.5 0.5

Cowienson, 2002 Phytase Protease 8.7 10.9

Piao et al., 1999 Phytase 0.8 3.5 *Where more than one enzyme activity is listed in column 2, the enzymes were added as a cocktail.


al., 2005). O'Keeffe (2003) showed the negative effects of moulds on corn nutrient value (Table 4).

Drying temperature

Corn kernel moisture was reduced by 27%-40% in mature spike corn. Safe storage moisture is around 14%, and it is achieved by heated air under forced draft at temperatures of 49-115 ºC during 4 to 49 hours (Hathaway et al., 1952). Because of overheating, protein properties of corn are damaged and new chemical bonds that are resistant to digestive enzymes appear (Maillard reaction). This reaction decreases the amino acid digestibility, particularly lysine. Barrier et al. (1992) demonstrated that increasing of drying temperature to more than 120 ºC had negative effects on TME and TDAA (total digestible amino acid) levels in broiler chickens (P<0.05). This research showed that the negative effect of drying overheating on lysine digestibility is around 12.5%. Also aspartic acid, threonine, alanine, isoleucine, tyrosine, cystine and methionine are affected by high drying temperature or too long drying period.

Conclusion

Corn is a common feed ingredient in poultry nutrition. In contrast to general ideas, there are indeed more factors that impact the nutritional corn value than it is usually perceived by common evaluation. Corn variety, physical properties, starch type, anti-nutritional factors, mycotoxins, etc. have strong effects on corn nutrient value in poultry nutrition. It is obvious that consideration of all aspects of feed ingredients in feed formulation has significant effects on performance of poultry and economic production.

References

ADAMS, M. H., S. E. WATKINS, A. L. WALDROUP, P. W. WALDROUP, D. L. Fletcher (1994): Utilization of high-oil corn in diets for broiler chickens. J Appl Poult Res. 3, 2, 146-156.

AMERAH, A. M., V. RAVINDRAN, R. G. LENTLE, D.G. THOMAS (2007): Feed particle size: implications on the digestion and performance of poultry. World Poult Sci J. 63, 3, 439-455.

APAJALAHTI, J., A. KETTUNEN, H. GRAHAM (2004): Characteristics of the gastrointestinal microbial communities, with special reference to the chicken. World Poult Sci J. 52, 223-232.

AWAD, W. A., H. REHMAN, J. BOHM, E. RAZZAZI-FAZELI, J. ZENTEK (2005): Effects of luminal deoxynivalenol and L-proline on electrophysiological parameters in the jejunums of laying hens. Poult Sci. 84, 928-932.

BARRIER G., B. ZUPRIZAL, C. JONDREVILLE (1992): Effect of heat drying temperature on the nutrient value of corn in chickens and pigs. Anim Feed Sci Technol. 41, 2, 149-159.

BATAL, A. B., C. M. PARSONS (2002): Effects of age on nutrient digestibility in chicks fed different diets. Poult Sci. 81, 400-407.

BEDFORD, M. R., A. J. MORGAN (1996): The use of enzymes in poultry diets. World Poult Sci J. 52, 61-68.

BEDFORD, M. R. (1996): The effects of enzymes on digestion. J Appl Poult Res. 5, 370-378.

BENITEZ, A., A. G. GERNAT, J. G. MURILLO, M. ARABA (1999): The use of high oil corn in broiler chicken. Poult Sci. 78, 861-865.

BLANEY, B. J., K. C. WILLIAMS (1991): Effective use in livestock feedstuff moldy and weather damaged grain containing mycotoxins: case histories and economic assessments pertaining to pig and poultry industries of Queensland. Aust J Agricult Res. 42, 6, 933-1012.

BROWN, I. (1996): Complex carbohydrates and resistant starch. Nutr Rev. 54, 115-119.

CARRE, B. (2004): Causes for variation in digestibility of starch among feedstuffs. World Poult Sci J. 60, 76-89.

CERMAK, R., S. LANDGRAF, S. WOLFFRAM (2004): Quercetin glucosides inhibit glucose uptake into brush-border membrane vesicles of porcine jejunum. Br J Nutr. 91, 849-855.

CHOCT, M. (1997): Feed non-starch polysaccharides: chemical structures and nutritional significance. Feed Milling Int., 13-26.

COLLINS, N. E., J. R. Moran, (2001): Influence of yellow dent maize hybrids having different kernel characteristics yet similar nutrient composition on broiler production. J Appl Anim Res 10, 228-235.

COWIESON, A. J. (2004c): Factors that affect the nutritional value of maize in broilers. Anim Feed Sci Technol. 119, 293-305.

COWIESON, A. J. (2002): The effect of exogenous enzymes on the nutritive value of camelina, lunaria, pea and lupin meals for broilers. Ph.D. thesis, University of Aberdeen, 2002.

COWIESON, A. J., T. ACAMOVIC, M. R. BEDFORD (2003): Supplementation of diets containing pea meal with exogenous enzymes: effects on weight gain, feed conversion, nutrient digestibility and gross morphology of the gastrointestinal tract of growing broiler chicks. Br Poult Sci. 44, 427-437.

COWIESON, A. J., T. ACAMOVIC, M. R. BEDFORD (2004a): The effect of phytic acid and phytase on the digestibility of maize starch for growing chickens. In: Proceedings of the

Table 4. Effects of moulds on the corn nutrient value (O'Keeffe, 2003)

Metabolic energy kcal/kg Crude protein % Oil % Good corn 3410 8.9 4.0 Mouldy corn 3252 8.3 1.5 Reduction value (kcal/kg) 158 0.6 2.5 Reduction rate (%) 4.6 6.7 62.5


International Poultry Scientific Forum, Atlanta, Georgia, USA, p. 31.

COWIESON, A. J., T. ACAMOVIC, M. R. BEDFORD (2004b): The effects of phytase and phytic acid on the loss of endogenous amino acids and minerals from broiler chickens. Br Poult Sci. 45, 101-108.

DALE, N., W. P. WILLIAMS (1993): Value of low test weight corn. Feedstuffs. 65, 15, 17.

DANICKE, S., H. JEROCH, O. SIMON (2000): Endogenous N-losses in broilers estimated by a [N-15]-isotope dilution technique: effect of dietary fat type and xylanase addition. Arch Anim Nutr. 53, 75-97.

ECKOUT, W., M. De PAEPE (1994): Total phosphorus, phytate-phosphorus and phytase activity in plant feedstuffs. Anim Feed Sci Technol. 47, 19-29.

ERTL, D., N. DALE (1997): The metabolizable energy of waxy versus normal maize for poultry. J Appl Poult Res. 6, 432-435.

FRANCO, C. M. L., C. F. CIACCO, D. Q. TAVARES (1998): The structure of waxy maize starch-effect of granule size. Starch. 50, 193-198.

GRAHAM, H., J. APAJALAHTI, S. PEURANEN (2003): Xylo-oligosaccharides alter metabolism of gut microbes and blood xylose levels in chicks. In: Proceedings of Dietary Fibre 2003, Noordwijkerhout, The Netherlands, pp. 47-49.

HAN, Y., C. M. PARSON (1987): Nutritive value of high oil corn for poultry. Poult Sci. 66, (1), 103-111.

HATHAWAY, I. L., F. D. YUNG, T. A. KIESSELBACH (1952): The effect of drying temperature upon the nutritive value and commercial grade of corn. J Anim Sci. 11, 2, 430-440.

HEALY, B. J. (1992): Nutritional value of selected sorghum grain for swine and poultry and effect of particle size on performance and intestinal morphology in young pigs and broiler chicks. M.S. Thesis. Kansas State University, Manhattan.

HUO, G. C., V. R. FOWLER, J. INBORR, M. R. BEDFORD (1993): The use of enzymes to denature antinutritive factors in soybean. In: Proceedings of the Second International Workshop on Antinutritional Factors in Legume Seed, Wageningen, The Netherlands, p. 90.

IJI, P. A., K. KHUMALO, S. SLIPPERS, R. M. GOUS (2003): Intestinal function and body growth of broiler chickens fed on diets based on maize dried at different temperatures and supplemented with a microbial enzyme. Report. Nutr Dev. 43, 77-90.

JACKSON, M. E. (2001): Improving soya utilisation in monogastrics: maize-soya diets with beta-mannanase. Feed Intern. 22-26.

JIN, G. (2001): Enzymes improve performance of broilers fed maize-soy diets. Asian Poult. 5, 26-30.

JIN, S-H., A. CORLESS, J. L. SELL (1998): Digestive system development in post-hatch poultry. World Poult Sci J. 54, 335-345.

JURGENS, M. H. (1993): Methods of feedstuff preparation. In: Animal Feeding and Nutrition. 7th ed., Kendall/Hunt Publ. Co., Dubuque, IA, pp. 220-225.

KIDD, M. T., G. W. MORGAN, C. D. ZUMWALT (2001): Galactosidase enzyme supplementation to maize and soybean meal broiler diets. J Appl Poult Res. 10, 186-193.

KOCHER, A., M. CHOCT, G. ROSS, J. BROZ, T. K. CHUNG (2003): Effects of enzyme combinations on apparent

metabolisable energy of maize-soybean meal-based diets in broilers. J Appl Poult Res. 12, 275-283.

LEONARD, W. H., J. H. MARTIN (1963): Corn, composition, processed product and utilization. Cereal pro-duct. The Macmillan Company, New York, NY, 202-218.

LESSON, S., J. D. SUMMER, T. B. DAYNARD (1977): Effect of kernel maturity at harvest as measured by moisture content on metabolizable energy value of corn. Poult Sci. 56, 154-156.

LOTT, B. D., E. J. DAY, J. W. DEATON, J. D. MAY (1992): The effect of temperature, dietary energy level and corn particle size on broiler performance. Poult Sci. 71, 618-624.

MORAN, E. T. (1982): Starch digestion in fowl. Poult Sci. 61, 1257-1267.

NIR, I., R. HILLEL, G. SHEFET, Z. NITSAN (1994): Effect of grain particle size on performance. 2. Grain texture interactions. Poult Sci. 73, 781-791.

NITSAN, Z., E. A. DUNTINGTON, P. B. SIEGEL (1991): Organ growth and digestive enzyme levels to fifteen days of age in lines of chickens differing in body weight. Poult Sci. 70, 2040-2048.

NOY, Y., D. SKLAN (1995): Digestion and absorption in young chicks. Poult Sci. 74, 366-373.

O'Keeffe, M. (2003): Mycotoxin in foods and feeds. [http://www.teagasc.ie/faol/foodHazards/mouldsAndMycotoxins/mycotoxinsAndFood.asp]

PACK, M., M.R. BEDFORD. (1997): Feed enzymes for maize-soybean broiler diets: a new concept to improve nutritional value and economics. AFMA Matrix 12, 18-21.

PACK, M., M. R. BEDFORD (1998): Feed enzymes may improve corn and sorghum diets. Feedstuffs. 18-19.

PARSONS, C. M. (2004): Gastrointestinal development and nutrient digestion in chicks. In: Proceedings of the 25th Western Nutrition Conference, Saskatoon, Canada, 169-176.

PATIL R. D., R. SHARMAN, R. K. ASRANI (2014): Mycotoxicosis and its control in poultry: a review. J Poult Sci Technol. 2, 1, 1-10.

PIAO, X. S., I. K. HAN, J. H. KIM, W. T. CHO, Y. H. KIM, C. LIANG (1999): Effects of kemzyme, phytase and yeast supplementation on the growth performance and pollution reduction of broiler chicks. Asian J Anim Sci. 12, 36-41.

RATCLIFF, J. (2002): The role of mycotoxins in food and feed safety. Presented at AFMA (Animal Feed Manufacturers Association) on 16 August, 2002 [http://www.facs.org.uk]

RAVINDRAN, V., S. CABAHUG, G. RAVINDRAN, W.L. BRYDEN (1999): Influence of microbial phytase on apparent ileal amino acid digestibility of feedstuffs for broilers. Poult Sci. 78, 699-706.

REECE. F. N., B. D. LOTT, J. W. DEATON (1986): The effect of hammer mill screen size on ground corn particle size, pellet durability and broiler performance. Poult Sci. 65, 1257-1261.

SELLE, P. H., V. RAVINDRAN, R. A. CALDWELL, W. L. BRYDEN (2000): Phytate and phytase: consequences for protein utilization. Nutr Res Rev. 13, 255-278.

SOCORRO, M., A. LEVY-BENSHIMOL, J. TOVAR (1989): In vitro digestibility of cereal and legume (Phaseolus vulgaris) starches by bovine, porcine and human pancreatic amylases. Starch 2, 69-71.

TESTER, R. F., I. KARKALAS, X. QI (2004): Starch structure and digestibility: enzyme-substrate relationship. World Poult Sci J. 60, 186-195.


WEURDING, R. E., A. VELDMAN, W. A. VEEN, P. J. VAN DER AAR, M. W. VERSTEGEN (2001a). Starch digestion rate in the small intestine of the chicken differs among feedstuffs. J Nutr. 131, 2329-2335.

WEURDING, R. E., A. VELDMAN, W. A. VEEN, P. J. VAN DER AAR, M. W. VERSTEGEN (2001b): In vitro starch

digestion correlates well with the rate and extent of starch digestion in broiler chickens. J Nutr. 131, 2336-2342.

ZANELLA, I., N. K. SAKOMURA, F. G. SILVERSIDE, A. FIQUEIRDO, M. PACK (1999): Effect of enzyme supplementation of broiler diets based on maize and soybeans. Poult Sci 78, 561-568.

VAŽNI IMBENICI U PROCJENI NUTRITIVNE VRIJEDNOSTI KUKURUZA ZA PERAD

Sažetak

Kukuruz je najvažnija žitarica u hrani za perad. Proizvode se razli ite vrste kukuruza ovisno o specifi nostima pojedine zemlje pa treba u obzir uzeti mnoge imbenike kad se procjenjuje prehrambena vrijednost kukuruza kako bi se postigla optimalna iskorištenost ove važne žitarice. Od velike je važnosti odabir odgovaraju e vrste kukuruza u vrijeme sjetve namijenjene za prehranu životinja ili za drugu industrijsku preradu. Fizikalna svojstva, profil nutrijenata (na što utje euzgojna vrsta), uzgojna praksa, vrsta tla i klimatski uvjeti utje u ne samo na vrijednost kukuruzne hrane nego i na proizvodne rezultate kod peradi. Kukuruz je jedan od glavnih izvora energije za perad, pri em je kukuruzni škrob primarni izvor energije. Stoga su struktura kukuruznog škroba, probavljivost škroba i anti-nutritivni imbenici od najve e važnosti. S tim u vezi treba voditi ra una o škrobnoj rezistenciji, inhibitorima amilaze, anti-nutritivnim imbenicima proteinske strukture, u inku razli itih egzogenih enzima i enzimatske digestije te o apsorptivnoj sposobnosti tankog crijeva. Žetva se uglavnom obavlja tijekom hladnog i kišnog vremena, što podrazumijeva vlagu zrnja od 30%-40%. Zato proces sušenja i uvjeti skladištenja imaju znatan u inak na nutritivnu vrijednost kukuruza. Stupanj sušenja naro ito utje e na kukuruzni sadržaj aminokiselina i vrijednost TME (true metabolic energy) zbog Maillardove reakcije. Isto tako, objavljeno je da u inak mikotoksina smanjuje sadržaj škroba i masti, vrijednost probavljive energije i okus hrane, dok pove ava udio celuloze.

Klju ne rije i: kukuruz, nutritivna vrijednost, prehrana peradi

xi. simpozij peradarski dani€¦ · luka jurinovi , fani krstulovi , darko majnari , milivoj...

Documents