Masarykova univerzita

Prırodovedecka fakulta

Zadanı 2. serie

6. rocnık (2015/2016)

Korespondencnı seminar ViBuCh probıha pod zastitou Ustavu chemie Prırodovedecke fakultyMasarykovy univerzity a Narodnıho centra pro vyzkum biomolekul.

Recenze uloh:

Tomas Bouchal (B1), Gita Jancarıkova (C1), Marek Necas (A2) a Vendula Roblova (Z4)

c© 2015 Pavla Fialova, Michal Hornı, Petr Lousa, Kamil Marsalek, Daniel Pokorny a PetrStadlbauer

c© 2015 Masarykova univerzita

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Uvodnık

Milı vibusnıci,

tempus fungi. Teple dny jsou pryc, zima se blızı a s nı prichazı druha serie uloh ViBuChu prozahratı, poslednı v tomto kalendarnım roce. V nı se seznamıte se zaklady chemie koordinacnıchsloucenin, poodhalıte rousku metabolismu sacharidu, budete klonovat a vyrabet umelou DNA azaverem budete analyzovat slozenı slivovice (ciste teoreticky samozrejme).

V polovine listopadu probehlo vıkendove setkanı resitelu ViBuChu. Dekujeme vsem za hoj-nou ucast, doufame, ze jste si soustredenı uzili a take jste se neco noveho naucili. Pokud jste takjeste neucinili, fotky si muzete prohlednout a stahnout zde.

I v teto serii na vas ceka bonusovy ukol, ci spıse bonusove ukoly. Nez k nim prikrocıme,dozvıte se spravne resenı ukolu z uvodnıku prvnı serie ViBuChu, v nemz jste meli hledat tajneheslo; a to znelo

”TAJNE HESLO JE VIBUCH“.

Ukoly pro tuto serii jsou nasledujıcı:

1. Je nutne uvest zacatek uvodnıku na pravou mıru. Vzhledem k letosnımu abnormalnesuchemu letu a podzimu

”tempus fungi“, neboli cas hub, podle houbaru rozhodne ne-

byl. Vasım ukolem je opravit uvedene slovnı spojenı tak, jak ma byt, cımz take nabudesmyslu. Mensı vyhodu pri resenı mohou mıt ti, kterı byli nedavno v kine. ,

2. Vystrihnete si puzzle, spravne jej slozte a vysledny obrazek vyfot’te nebo naskenujte aodevzdejte jako soucast resenı. A pripiste, jaky druh oblecenı s vysivkou/potiskem s danymobrazkem byste radi a jaky neradi nasli pod stromeckem.

Prejeme vam prıjemne a pohodove Vanoce a vse nejlepsı do noveho roku.

Za cely tym ViBuChu

Petr Stadlbauer

P.S. Lıbı se vam nas novy maskot (hledejte na str. 22)?

3

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

A2 – Koordinacnı slouceniny

Autor: Michal Hornı (e-mail: michalh@mail.muni.cz) 14 bodu

Vazenı resitele,v minule serii jsme si nadefinovali zakladnı pojmy ze sveta koordinacnı chemie. S lehkostı jsmesi osvojili novou terminologii a naucili se komplexnı slouceniny znazornovat v prostoru. S postu-pujıcım vyvojem serie nahledneme do problematiky hloubeji. Proto na vas cekajı ukoly zamerenena vlastnosti koordinacnıch sloucenin. Odpovıme si naprıklad na otazky, proc jsou barevne, proclumineskujı a co se s nimi stane, kdyz je vlozıme do magnetickeho pole.

Preji mnoho uspechu pri resenı druhe serie!

Vazba v koordinacnıch slouceninach

Objasnenı atomove a elektronove konfigurace komplexnıch castic, jejich reaktivita a vlast-nosti patrı mezı obtızne kapitoly teoreticke chemie. V beznych slouceninach se setkavame s ion-tovymi a kovalentnımi vazbami. Vazebnou situaci v komplexnı castici komplikuje fakt, ze se vazbynavzajem silne ovlivnujı. Pro popis elektronove konfigurace je nutne vnımat castici jako celek.Dnes mluvıme o donor-akceptorove vazbe (z hlediska Lewisovy teorie kyselin a zasad jde o aci-dobazickou reakci mezi ligandem a centralnım atomem v komplexu). Ruzne typy teto interakcejsou vyobrazeny v prıslusnem studijnım materialu. Donor-akceptorova vazba (B na obrazku 1)je v priblızenı ekvivalentnı klasicke kovalentnı vazbe (A na obrazku 1) s tım rozdılem, ze sdıleneelektrony pochazejı pouze od jednoho z reakcnıch partneru – ligandu.

Obr. 1

18elektronove pravidlo u organokovovych sloucenin

Bylo zjisteno, ze organokovove komplexy s atomem kovu v nızkem oxidacnım stavu obsahujıcıπ-akceptorove ligandy se rıdı tzv. 18elektronovym pravidlem. Jejich centralnı atom ma snahudoplnit svou valencnı sferu na 18 elektronu a tım ji zcela zaplnit, podobne jako napr. atomydruhe periody majı tendenci doplnit svou valencnı sferu na elektronovy oktet.

Ukol 1: K nasledujıcım ligandum prirad’te spravny pocet elektronu na donorovych atomech.

NH3 Ph2PCH2CH2PPh2 cyklopentadienyl benzen

Ukol 2: Jestlize CO je dvouelektronovy a NO trıelektronovy donorovy ligand, uved’te vsechnymoznosti stabilnıch 18 elektronovych sloucenin Cr0 a Fe0, ktere obsahujı pouze NO a/nebo COligandy.

4

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Teorie krystaloveho pole

Teorie krystaloveho pole (CFT, Crystal Field Theory). Je to elektrostaticky model, kteryuvazuje elektrony ligandu pouze jako zdroj elektrostatickeho pole kolem centralnıho atomukovu. Ligandy povazujeme za bodove naboje a mezi atomem kovu a ligandem neuvazujemezadnou kovalentnı interakci. Mluvıme-li o prechodnych kovech, majı k dispozici pet valencnıchd -atomovych orbitalu, ktere lze postupne obsadit maximalne deseti elektrony (obrazek 2). Tytoorbitaly nejsou v prıtomnosti ligandu (ktere tvorı zminovane pole) ovlivnovany stejnou merou, aproto jsou ve vysledku rozstepeny na skupiny o odlisne energii. Pokrocilejsı teoriı je teorie ligan-doveho pole (LFT, Ligand Field Theory), jejız interpretace je vsak znacne slozitejsı a nebudemeji tedy uvazovat.

Obr. 2

Energeticky diagram stepenı d -orbitalu pusobenım krystaloveho pole na oktaedricky a tet-raedricky komplex je uvedeno na obrazku 3. Cım je ligand silneji vazan k centralnımu atomu,tım silnejsı pole vytvarı, a naopak.

Obr. 3

Je-li energie parovanı elektronu nizsı nez energie stepenı, komplex bude nızkospinovy (spa-rovane elektrony); v opacnem prıpade bude vysokospinovy. Tento efekt je silne ovlivnen povahouligandu, ktere jsou serazeny dle intenzity, s nız stepı d -orbitaly, do tzv. spektrochemicke radyligandu (obrazek 4):

Obr. 4

5

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Ukol 3:

1. Napiste elektronovou konfiguraci centralnıho atomu v komplexech [Fe(CN)6]4− a [CoCl6]

3−.

2. Dale nakreslete energeticky diagram (vcetne obsazenı elektronu) stepenı d -orbitalu oboukomplexu.

3. Rozhodnete, ktery z nich je vysokospinovy/nızkospinovy.

Ukol 4: Vysokospinova a nızkospinova usporadanı u oktaedrickych komplexu se mohou proje-vit pouze pri urcitem poctu elektronu v d -orbitalech, v ostatnıch prıpadech sıla ligandoveho/krys-taloveho pole nema na elektronovou konfiguraci vliv. Ktere dn (pocet elektronu ve valencnı sfered -orbitalu) konfigurace iontu prechodnych kovu mohou v oktaedrickem poli ligandu poskytnoutnızkospinove i vysokospinove komplexy?

Magnetismus a barevnost

Barevnost latek je obecne znamkou toho, ze pri interakci latky s viditelnym elektromagne-tickym zarenım dochazı k absorpci tohoto zarenı v jedne nebo vıce oblastech jeho vlnovych delek.Pri absorpci dochazı k preskoku elektronu (pravdepodobnejsı u latek, ktere obsahujı neparoveelektrony) z obsazene hladiny do vyssıch elektronovych stavu (obrazek 5). Typickym nastrojempro studium absorpce komplexnıch sloucenin je UV-VIS spektroskopie.

Studium elektronovych spekter komplexu prechodnych kovu poskytuje informace o jejichstrukture a vazebnem usporadanı. Absorpce vznika pri prechodu elektronu mezi temito hladi-nami:

• Prechody mezi orbitaly soustredenymi na centralnım atomu (”d-d prechody“),

• prechody mezi orbitaly na centralnım atomu a orbitaly ligandu (dochazı k prenosu nabojez atomu kovu na ligand nebo z ligandu na kov).

U koordinacnıch sloucenin d-kovu, ktere se nam jevı jako bezbarve, k takovemu preskokunedochazı – energeticky rozdıl mezi zakladnım a excitovanym stavem je prılis veliky. Svetlebarvy komplexu (napr. [Mn(H2O)6]

2+) svedcı o tom, ze pravdepodobnost techto prechodu jemala.

Prechod excitovane castice zpet do zakladnıho stavu muze probehnout ruznymi zpusoby.Pri tomto procesu muzeme pozorovat jev zvany luminiscence. Luminiscence znamena spontannıemisi zarenı elektronove excitovanymi casticemi a rozlisujeme fluorescenci a fosforescenci. Dobazivota (jak dlouho budeme jev pozorovat po ukoncenı excitace) je u fosforescence obvykle delsı.Dle povahy excitace, pri ktere k luminiscenci dochazı, lze rozlisit nekolik typu: fotoluminiscence,chemiluminiscence, elektroluminiscence atd.

Paramagnetismus (µr > 1) se u latky projevuje tım, ze je urcitou merou vtahovana dovnejsıho magnetickeho pole. Tento jev pozorujeme u komplexnıch sloucenin, ktere majı v d --orbitalech volne, nesparovane elektrony. Naopak u latek diamagnetickych, bez neparovych elek-tronu, zjist’ujeme velmi slabe vypuzovanı z vnejsıho magnetickeho pole.

6

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Obr. 5

Ukol 5: Ktery z nasledujıcıch komplexnıch kationtu bude bezbarvy?

(a.) [Zn(H2O)6]2+

(b.) [Cu(H2O)6]2+

(c.) [Fe(H2O)6]2+

(d.) [Cr(H2O)6]2+

Ukol 6: Komplexnı kation [Cr(H2O)6]3+ absorbuje fotony s vlnovou delkou λ = 585 nm a menı

svoje zbarvenı. Urcete podle vlnove delky absorbovanou cast (barvu) viditelneho spektra, dalevyslednou barvu komplexu, vıte-li, ze energie zarenı, ktera odpovıda vysledne barve, je rovna E= 2,73 eV.

Ukol 7: Dosud jedinym znamym paramagnetickym karbonylem je oktaedricky komplex se

”17elektronovou konfiguracı“ [M(CO)6]. Urcete kov M. Uvazujte pouze prvnı prechodovou radu.

Ukol 8: Prıkladem fotochemicky katalyzovane reakce je prıprava Ru komplexu na obrazku 5.Behem absorpce viditelneho svetla dochazı k reakci a vzniku produktu, ktery vykazuje intenzivnıluminiscenci urciteho zbarvenı.

1. Jake je oxidacnı cıslo centralnıho kovu na obrazku 6?

2. Dale urcete barvu a energii emitovaneho zarenı, je-li emisnı maximum 612 nm.

Ukol 9: Je centralnı kov paramagneticky nebo diamagneticky?

Obr. 6

7

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Ukol 10: Tetraedricky komplex CuI (obrazek 7) vykazuje pod UV svetlem luminiscenci svetlemodreho zbarvenı. Pokud krystaly zacneme drtit, naprıklad kovovou spachtlı, zacne komplex

”svetelkovat“ (triboluminiscence). Podobny efekt lze pozorovat pri drcenı krystalu cukru.

1. Pojmenujte komplex systematickym nazvem.

2. Navrhnete rovnici prıpravy komplexu a vypocıtejte teoreticky vytezek reakce dle vychozıchnavazek.

3. Nakreslete strukturnı izomer pripraveneho komplexu.

Obr. 7

Ukol 11: Rozhodnete, ktery z vyroku je pravdivy/nepravdivy:

(a.) Orbitaly 3d se zaplnujı elektrony az po zaplnenı orbitalu 4s dvema elektrony. Pri vznikukationtu Fe2+ se proto odstepı dva elektrony z orbitalu 3d a ne z orbitalu 4s.

(b.) Jodidove anionty jako ligandy v komplexech zpusobujı silne stepenı d -orbitalu.

(c.) Rozdıl energiı rozstepenych hladin v tetraedrickem poli je vetsı nez u oktaedrickeho pole.

Zdroje obrazku

Obrazek 1: Zumdahl, S. S.; Zumdahl, S. A., Chemistry. 6th ed. Boston: Houghton MifflinCompany, 2003. xxiv, 1102. ISBN 0-618-22156-5Obrazek 2: http://www.ck12.org/user:Physixnut/book/CK-12-Chemistry/section/5.3/Obrazek 3: Introduction to Crystal Field Theory Non-octahedral ComplexesObrazek 5: http://simmonds.wikidot.com/image:absorption-jpg

8

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

B1 – Hydrolyza laktosy

Autori: Petr Lousa (e-mail: 393339@mail.muni.cz) 13 boduKamil Marsalek (e-mail: marsalek.kamil@gmail.com)

I’m often surprised by my lack of familiarity with Leonard. Until recently I had no idea thatdespite his lactose intolerance, he can tolerate small amounts of non-fat ice cream without pro-ducing a noxious gas that I maintain in the right concentration could be weaponised.

Sheldon Cooper

Nejen dıky serialove postave Leonarda Hofstadtera je intolerance laktosy mezi verejnostıpomerne zname onemocnenı. Vedeli jste ovsem, ze existuje take intolerance sacharosy? Tatomnohem vzacnejsı porucha je pomerne bezna mezi puvodnımi obyvateli Gronska, Aljasky aKanady. Obe onemocnenı jsou zpusobena neschopnostı organismu produkovat enzymy, kterekatalyzujı stepenı laktosy ci sacharosy na prıslusne monosacharidy. V prvnı casti tohoto tematuse zamerıme prave na mechanismus teto reakce a enzym, ktery ji katalyzuje.

Obr. 1: Prevalence intolerance laktosy

Drıve, nez se podıvame na samotnou hydrolyzu laktosy, zopakujeme si strucne zaklady chemiesacharidu. Pokud si s nasledujıcımi ulohami nebudete vedet rady, doporucujeme jako vybornystudijnı material kapitolu o sacharidech z ucebnice Organicka chemie od Johna McMurryho.

Ukol 1: Nakreslete vzorec libovolneho sestiuhlıkateho sacharidu v acyklicke i cyklicke forme.Ocıslujte atomy uhlıku dle pouzıvane konvence. Pojmenujte cyklickou formu sacharidu syste-matickym i trivialnım nazvem. Je vami vytvoreny sacharid tzv. redukujıcı cukr (reaguje s Feh-lingovym cinidlem)? Jedna se o d- ci l- sacharid? A aby to nebylo tak jednoduche, glukosa afruktosa jsou zakazane.

Ukol 2: I pres vyloucenı dvou nejznamejsıch monosacharidu jste v predchazejıcım ukolu melipomerne mnoho moznostı. Dokazete spocıtat kolik?

Tım vsak zabava teprve zacına. Jednotlive monosacharidy se mohou pomocı glykosidovychvazeb (na obrazku cervene) spojovat a tvorit celou skalu disacharidu, trisacharidu, a tak dale.

9

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Glykosidove vazby v prırode nejcasteji spojujı monosacharidove jednotky v usporadanı (1→4)a (1→1).

Obr. 2: Disacharid s 1→4 glykosidovou vazbou

Ukol 3: Jak se nazyva (trivialne i systematicky) disacharid na obrazku 2? Nakreslete vzorecdisacharidu s 1→1 glykosidovou vazbou. Pouzijte pri tom monosacharidove jednotky z obrazku2.

Ukol 4: Jak bylo naznaceno v uvodu, disacharidy v kyselem prostredı hydrolyzujı na prıslusnemonosacharidy. Podle nıze popsaneho sledu reakcı nakreslete pomocı sipek mechanismus hyd-rolyzy laktosy. Pripomıname, ze sipky musı vzdy naznacovat smer pohybu elektronu, zacınajıtedy vzdy na volnem elektronovem paru, nebo vazbe.

(a.) Kyslık spojujıcı obe sacharidove jednotky je protonovan hydroxoniovym kationtem.

(b.) Glykosidova vazba zanika a vznika molekula d-glukosy a karbokationt.

(c.) Karbokationt reaguje s molekulou vody, vznika molekula protonovane galaktosy.

(d.) Proton je z molekuly galaktosy odtrzen molekulou vody.

Obr. 3: Laktosa

Vyse uvedena reakce muze dobre probıhat ve vode. Ovsem nenı zcela prakticke ji stejnymzpusobem provadet v zive bunce. V te potrebujeme, aby takova reakce byla dobre regulovana aprobıhala za podmınek beznych v prostredı bunky. Presne k tomu slouzı enzymy, tedy ohromnemolekuly, tvorene dlouhym retezcem aminokyselin spojenych peptidovymi vazbami.

Enzymy katalyzujı samotnou reakci v tzv. aktivnım mıste, tedy ve zvlastnım prostoru (kavite)uvnitr, nebo na povrchu enzymu. Toto mısto ma vhodne prostorove usporadanı – takove, abysubstrat (v nasem prıpade laktosu) rozpoznalo a pote provedlo reakci.

K provedenı reakce je potrebna prıtomnost dvou molekul:

• nukleofil – molekula obsahujıcı volny elektronovy par

• kyselina (Brønstedova) – molekula obsahujıcı snadno odstupujıcı proton

Ve vodnem prostredı plnı tyto role molekuly H2O (krok 3) a H3O+ (krok 1). V prostredı

aktivnıho mısta enzymu vsak jako nukleofil a kyselina vystupujı postrannı retezce aminokyselin.

10

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Ukol 5: Kolik celkem aminokyselin se v zive prırode bezne vyskytuje? Navrhnete, ktere z nichmohou slouzit jako atakujıcı nukleofilnı skupina a ktere jako kyselina v aktivnım mıste laktasy,tedy enzymu, ktery katalyzuje hydrolyzu laktosy. Nakreslete jejich strukturu a napiste nam jejichtroj- a jednopısmenne zkratky.

Ukol 6: V laktase jako nukleofil vystupuje glutamat a jako kyselina zbytek kyseliny glutamove.Nakreslete mechanismus hydrolyzy pomocı techto molekul.

Jednım ze zpusobu, jak muzeme studovat strukturu aktivnıho mısta enzymu, je prıpravaderivatu substratu a sledovanı aktivity enzymu. V prıpade laktosy muzeme naprıklad nahrazovatjednotlive hydroxylove skupiny jinymi funkcnımi skupinami, napr. methoxy skupinou ci atomemvodıku. Podle toho, zda dany derivat s enzymem tvorı ci netvorı komplex, muzeme usuzovat,zda se v danem mıste aktivnıho centra nachazı napr. interakce vodıkovou vazbou.

Obr. 4: Komplex enzymu s derivatem laktosy

Tab. 1: Vysledky studia derivatu laktosy

OCH3 H

R2’ O O

R3’ X X

R4’ X O

R6’ X O

R1 O O

R2 O O

R3 X O

R5 X X

Vysledky jedne takove studie jsou shrnuty v tabulce vyse. Kazdy radek tabulky odpovıdasubstituci jedne hydroxylove skupiny na pozici dle obrazku 4. Ve sloupcıch jsou uvedene typysubstituentu. Celkem tedy bylo studovano 16 derivatu. Znak

”O“ znacı, ze dany derivat je

enzymem rozpoznan a tvorı s nım komplex. Znak”X“ znamena, ze derivat s enzymem nijak

neinteraguje.1

Ukol 7: S pomocı dat z tabulky se pokuste do obrazku 4 naznacit, kde se mezi laktosou aenzymem nachazı vodıkove vazby a kde je rozpoznavanı rızeno jinymi interakcemi. Jakymi?

1Pro ucely ulohy je problematika podstatne zjednodusena.

11

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

C1 – Klonovanı

Autor: Daniel Pokorny (e-mail: pokec@mail.muni.cz) 16 bodu

O klonovanı jste uz urcite neco cetli nebo videli, treba v nejakem sci-fi filmu. V teto uloze sevsak nestaneme sılenymi vedci, kterı se snazı privest na svet ruzna hybridnı monstra. Staneme sesılenymi vedci s ukolem vytvorit syntetickou molekulu DNA, ktera nese gen pro protein nasehozajmu. Takto pripravenou DNA pozdeji vneseme do bakteriı E. coli, ve kterych bude probıhatexprese. V prvnım kroku se budeme snazit prenest gen pro nas protein z klonovacıho plasmidudo plasmidu urceneho pro expresi. O rozdılech mezi klonovacım a expresnım plasmidem se dozvıteve studijnım materialu k teto uloze, kde najdete take informace o restrikcnıch endonukleasachnutnych pro tento prenos.

Stepenı restrikcnımi endonukleasami

Klonovacı plasmid nese nazev pMK-RQ, zde je jeho diagram:

Gen kodujıcı protein naseho zajmu je vyznacen oranzove (delka genu je 1753 bp), cervenevyznaceny gen koduje rezistenci ke kanamycinu. V rameccıch jsou vyznacena rozpoznavacı mıstapro restrikcnı endonukleasy.

12

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Cılovym vektorem je plasmid s nazvem pET-25b(+), jeho diagram je zde:

Ukol 1: Vyberte dvojici restrikcnıch endonukleas, kterymi budete oba plasmidy stepit. Mejtena pameti, ze stepenım nesmı dojıt ke ztrate regulacnıch elementu ani selekcnıch faktoru.

Ukol 2: Na strankach NEB najdete sekvence, ktere tyto dva enzymy rozpoznavajı a stepı.Mısto stepenı vyznacte hvezdickou (napr. 5’GGTAC*C3‘ pro KpnI).

Ukol 3: Dochazı pri stepenı temito enzymy ke vzniku”tupych“ (blunt) nebo

”lepivych“

(sticky) koncu?

Ukol 4: Pomocı nastroje Double Digest Finder zjistete, ve kterem pufru bude stepenı vy-branymi restrikcnımi endonukleasami probıhat nejrychleji.

Ukol 5: Pripravili jste si tuto reakcnı smes:44 µl DNA (c = 100 ng/µl)5 µl pufru 2.11 µl HindIII (c = 1000 U/ml)

Stepenı probıhalo po dobu 2 hodin pri 37 ◦C. Je mnozstvı enzymu dostatecne pro uplnyprubeh reakce? Definici jednotky aktivity U naleznete v popisu prıslusnych enzymu zde.

13

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Agarosova gelova elektroforeza

Jednotlive fragmenty DNA zıskane stepenım klonovacıho a expresnıho plasmidu je dalepotreba od sebe oddelit. K tomu vyuzijeme elektroforezu v agarosovem gelu, ktera fragmentyrozdelı podle velikosti. DNA z gelu pote izolujeme a pouzijeme dal. Strucny popis principuelektroforezy najdete ve studijnım materialu.

Ukol 6: Z techto elektroforegramu vyberte ten, ktery odpovıda stepenı plasmidu pMK-RQz prvnı casti ulohy enzymy HindIII a NdeI.

a) b) c)

Ligace

Gen, ktery jsme”vystrihli“ z plasmidu pMK-RQ nynı vlozıme do linearizovaneho (stepeneho)

expresnıho vektoru pET-25b. Vıme, ze na vlaknech DNA vznikly previsy a ze previsy vzniklestepenım dvou ruznych molekul jednou endonukleasou jsou navzajem komplementarnı. Fosfo-diesterovou vazbu, kterou restrikcnı endonukleasy hydrolyzovaly, nynı musıme opet nasyntetizo-vat pomocı enzymu T4 DNA ligasy. Touto reakcı zıskame velke mnozstvı produktu a doufame,ze se mezi nimi vyskytuje i ten, o ktery usilujeme – expresnı plasmid, ktery ve svem multi-klonovacım mıste nese gen pro protein naseho zajmu. Tımto produktem budeme v prıstı ulozetransformovat bunky E. coli.

Ukol 7: Pod tımto ukolem je sekvence vznikla prelozenım genu, se kterym pracujeme, dopolypeptidoveho retezce (sekvenci najdete rovnez ve studijnıch materialech). Pomocı nastrojeBLAST se pokuste protein identifikovat a uvest jeho nazev (pouze vlozte sekvenci, nastavenınenı treba nijak menit. Berte v uvahu pouze vysledek se 100% sekvencnı identitou).

MSIQENISSLQLRSWVSKSQRDLAKSILIGAPGGPAGYLRRASVAQLTQELGTAFFQQQQLPAAMADTFLEHLCLLDI

DSEPVAARSTSIIATIGPASRSVERLKEMIKAGMNIARLNFSHGSHEYHAESIANVREAVESFAGSPLSYRPVAIALD

TKGPEIRTGILQGGPESEVELVKGSQVLVTVDPAFRTRGNANTVWVDYPNIVRVVPVGGRIYIDDGLISLVVQKIGPE

GLVTQVENGGVLGSRKGVNLPGAQVDLPGLSEQDVRDLRFGVEHGVDIVFASFVRKASDVAAVRAALGPEGHGIKIIS

14

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

KIENHEGVKRFDEILEVSDGIMVARGDLGIEIPAEKVFLAQKMMIGRCNLAGKPVVCATQMLESMITKPRPTRAETSD

VANAVLDGADCIMLSGETAKGNFPVEAVKMQHAIAREAEAAVYHRQLFEELRRAAPLSRDPTEVTAIGAVEAAFKCCA

AAIIVLTTTGRSAQLLSRYRPRAAVIAVTRSAQAARQVHLCRGVFPLLYREPPEAIWADDVDRRVQFGIESGKLRGFL

RVGDLVIVVTGWRPGSGYTNIMRVLSIS

Ukol 8: Vyse uvedeny protein je enzym ucastnıcı se dulezite metabolicke drahy. Uved’te nazevdrahy a napiste, jakou chemickou reakci tento enzym katalyzuje.

15

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Z4 – Jak zatocit s methanolem (ctvrta doplnkova uloha)

Autorka: Pavla Fialova (e-mail: 423538@mail.muni.cz) 11 bodu

V teto uloze se podıvame na zoubek methanolu. V prvnı casti se zamerıme na to, co se deje, kdyzse methanol dostane do lidskeho organismu, a take na to, co se s tım da delat. V casti druhe sepak budeme venovat samotnemu stanovenı methanolu pomocı plynove chromatografie.

Puvodem methanolu v ovocnych palenkach jsou pektiny, coz jsou v ovoci prirozene se vy-skytujıcı polysacharidy slozene z jednotek kyseliny d-galakturonove, ktere jsou esterifikovanymethanolem. Pri jejich hydrolyze se tedy uvolnuje methanol a v zavislosti na obsahu pektinuv ovoci, ho destilat obsahuje vıce ci mene. Mezi ovoce, ktere obsahuje vetsı mnozstvı pektinu(1–1,5 %), patrı hrusky, jablka, merunky a svestky. Mensı mnozstvı pektinu (kolem 0,5 %) pakobsahujı tresne a hrozny.

Vsichni jste jiste slyseli o methanolove afere, kdy doslo k serii otrav methanolem pozitımpancovaneho alkoholu, coz hned po snezenı ovoce nejbeznejsı zpusob, jakym se methanol dostavado lidskeho organismu. Avsak methanol se do tela muze dostavat i jinym zpusobem.

Ukol 1: Napiste, jakymi dalsımi dvema cestami se muze methanol do tela dostavat.

Pokud chceme vedet, proc je methanol pro cloveka tak nebezpecny, musıme nejdrıve vedet, cose s nım v tele deje. Metabolismus methanolu je dost podobny metabolismu ethanolu. Methanolsam o sobe toxicky nenı, jeho toxicitu zpusobujı az jeho metabolity.

Ukol 2: Napiste metabolismus methanolu a ethanolu. (Doplnte nazvy enzymu, ktere zpros-tredkovavajı biochemicke reakce, napiste nazvy i vzorce vznikajıcıch metabolitu.)

CH3CH2OH

CH3OH

enzym

enzym

metabolitenzym

metabolit

metabolitenzym

metabolit

Ukol 3: Ktery konkretnı metabolit methanolu je pro lidsky organismus nejskodlivejsı a cozpusobuje?

Ukol 4: Jaky je nejucinnejsı zpusob, jak pomoci osobe, ktera ma podezrenı na otravu meth-anolem? Napiste, ktera konkretnı latka se uzıva jako antidotum, a take popiste, jak ucinkuje.

Plynova chromatografie

Chromatografie je separacnı metoda, ktera je zalozena na rovnovazne distribuci slozek vzorkumezi dve faze – mobilnı fazi (MF), ktera je pohybliva, a stacionarnı fazi (SF), ktera je nepo-hybliva. Tyto dve faze jsou vzajemne nemısitelne. Vzorek se vnası na zacatek stacionarnı fazea pohybem mobilnı faze je unasen skrze stacionarnı fazi, se kterou mohou slozky vzorku inter-agovat. Rozdelenı jednotlivych slozek smesi je dano silou jejich interakcı se SF. Slozky, kterejsou stacionarnı fazı vıce zadrzovany, se budou v systemu zdrzovat delsı dobu a ty ktere se SFinteragujı mene ci vubec, projdou systemem rychleji. Tım dojde k separaci slozek vzorku a na

16

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

konec stacionarnı faze se tak nejdrıve dostavajı slozky, ktere jsou stacionarnı fazı zadrzovanynejmene.

V plynove chromatografii (GC z angl. Gas Chromatography) je nutne, aby po nadavkovanıvzorku doslo k premene separovanych latek na plyn. Touto technikou je mozne separovat pouzelatky, ktere majı dostatecny tlak syte pary a jsou tepelne stale. Plynova chromatografie seobecne pouzıva k delenı a stanovenı plynu, tekavych kapalin, pevnych organickych nebo takeorganokovovych latek. Nenı vsak dobre pouzitelna pro separaci organickych a anorganickych solınebo makromolekul.

Obr. 1: Schema plynoveho chromatografu

Jako mobilnı faze je pouzıvan plyn, jehoz ukolem je unaset vzorek kolonou a nazyva se tedynosny plyn. Jako nosny plyn se nejcasteji pouzıvajı inertnı plyny, ktere neinteragujı se slozkamivzorku.

Ukol 5: Napiste alespon tri plyny, ktere lze pouzıt jako nosny plyn.

Davkovac slouzı k zavedenı vzorku do proudu nosneho plynu. Vzorek se davkuje do vyh-rateho davkovacıho prostoru, kde dochazı k jeho odparenı, a odtud ho nosny plyn odnası dokolony.

Kolona je cast chromatografu, ve ktere je umıstena stacionarnı faze a dochazı zde k separacislozek vzorku. Nejcasteji se pouzıvajı kapilarnı kolony, jejichz vnitrnı povrch je potazen tenkymfilmem stacionarnı faze. Aby nedochazelo k jejımu vymyvanı, byva SF zakotvena na nosici,coz je nejcasteji vnitrnı stena kapilary. Bezne jsou pouzıvany kapilary s vnitrnım prumeremkapilary v intervalu 0,1–0,6 mm, tloust’ka filmu stacionarnı faze je mezi 0,1–10 µm a obvykladelka 15–100 m.

Z kolony mırı jiz separovane slozky do detektoru, kde jsou jednotlive slozky detekovany.Mezi nejcasteji pouzıvane detektory se radı plamenovy ionizacnı detektor, tepelne-vodivostnıdetektor a detektor elektronoveho zachytu. V poslednı dobe se plynova chromatografie spojujetake s hmotnostnım spektrometrem, a to hlavne tam, kde se provadejı identifikace neznamychlatek ve vzorku.

Ukol 6: Vyberte si jeden detektor a strucne popiste jeho princip.

Jako rıdıcı a vyhodnocovacı zarızenı se v dnesnı dobe pouzıva pocıtac s prıslusnym soft-warem, kde se zobrazuje vysledek chromatograficke separace – chromatogram, ktery vyjadrujezavislost odezvy detektoru na case.

17

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Obr. 2: Chromatogram s charakteristikami

Charakteristickou velicinou pro kazdou latku na zaznamu je jejı retencnı cas tR, coz je doba,ktera uplyne od nastriku vzorku do dosazenı maxima elucnı krivky (pıku). Mrtvy retencnı castM je retencnı cas latky, ktera nenı stacionarnı fazı zadrzovana. Retencnı cas latek se pouzıvapro kvalitativnı analyzu.

Dalsımi charakteristikami jsou sırka pıku pri zakladne w a sırka pıku v polovine vysky w1/2.Tyto charakteristiky udavajı, jak moc dochazı k rozmyvanı slozek vzorku pri transportu kolonou.Pouzıvajı se napr. pro vypocet ucinnosti kolony a mıry separace dvou pıku.

Pro stanovenı obsahu latek ve vzorku, tedy pro kvantitativnı analyzu se pouzıva plocha pıkuA, prıpadne jeho vyska h.

Jelikoz plynova chromatografie nenı metodou absolutnı, tedy nelze prımo stanovit obsahanalytu ve vzorku, ale metodou relativnı, je nutne pro vypocet obsahu latky ve vzorku pouzıtjednu z nıze popsanych metod.

Metoda kalibracnı krivky

Tato metoda je zalozena na sestrojenı graficke zavislosti merene veliciny na zvysujıcı sekoncentraci kalibracnıch roztoku y = f(c). Kalibracnı zavislost by mela byt linearnı.

Obecna rovnice prımky: y = a+ b · cHodnota hledane veliciny pro neznamy vzorek se zjistı odectenım z teto zavislosti. Tato

metoda se pouzıva v prıpade, ze jsou vlastnosti vzorku a kalibracnıch roztoku rovnocenne. Nelzetedy zanedbat vliv matrice vzorku.

Metoda prıdavku standardu

Metoda prıdavku standardu se pouzıva zejmena k eliminaci vlivu matrice vzorku a predpok-lada se, ze zavislost merene veliciny je linearne zavisla na koncentraci stanovovane latky. Nejprvese promerı roztok vzorku o nezname koncentraci stanovovane latky. K dalsımu roztoku vzorkuse stejnym obsahem stanovovane latky pridame pred doplnenım odmerne banky na pozadovanyobjem znamy objem standardnıho roztoku vzorku stanovovane latky o zname koncentraci.

Koncentraci standardu v roztoku vzorku s prıdavkem standardu spocıtame dle vzorce:

cst,1 =Vst,1 · cst

V

kdeVst,1 je objem pridaneho standarducst je koncentrace standarduV je celkovy objem pripraveneho roztoku

18

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Koncentraci stanovovane slozky v roztoku potom vypocıtame ze vztahu:

cvz =yvz · cst,1

yvz+st − yvzkdeyvz je namerena hodnota veliciny pro roztok vzorkuyvz+st je namerena hodnota veliciny po roztok vzorku s prıdavkem standardu

Pri grafickem vyhodnocenı, sestrojıme zavislost merene veliciny na koncentraci standarduv roztoku vzorku bez prıdavku a s prıdavkem standardu y = f(cst,i). (Koncentrace standarduv roztoku vzorku bez prıdavku standardu cst,0 = 0) Neznama koncentrace stanovovane latky vevzorku je pak vzdalenost mezi pocatkem soustavy souradnic a bodem, ktery protına sestrojenazavislost na zaporne casti osy x.

Stanovenı obsahu methanolu ve slivovici

Bylo pripraveno 6 kalibracnıch roztoku methanolu o koncentraci 0,025, 0,035, 0,045, 0,055,0,065 a 0,075 obj. %. Tyto roztoky byly analyzovany za stejnych podmınek plynovym chroma-tografem s temito vysledky retencnıch casu a ploch pıku.

Tab. 1: Namerene retencnı casy a plochy pıku kalibracnıch roztoku methanolu

ϕ(MeOH) / obj. % tR / min A / (mV s)

0,025 3,710 49,365

0,035 3,737 81,843

0,045 3,700 109,249

0,055 3,713 130,981

0,065 3,713 157,776

0,075 3,713 182,083

Ukol 7: Sestrojte v libovolnem tabulkovem editoru bodovy graf zavislosti plochy pıku naobjemovem zlomku methanolu A = f(ϕ(MeOH)). Tuto zavislost prolozte prımkou a zjisteterovnici teto prımky.

Roztok vzorku byl pripraven tak, ze byl do odmerne banky o objemu 10 cm3 pipetovan1 cm3 slivovice a banka byla doplnena destilovanou vodou po rysku. Takto pripraveny vzorekbyl za stejnych podmınek jako kalibracnı zavislost analyzovan plynovym chromatografem a propık methanolu s retencnım casem tR = 3,720 min byla zjistena plocha pıku Avz = 107,794 mV s.

Ukol 8: Z rovnice prımky zjistene z kalibracnı zavislosti vypocıtejte obsah methanolu ve vzorkuv obj. %. (Nezapomente na redenı vzorku.)

Ukol 9: Odhadnete, ktere latce odpovıda pık v retencnım case tR = 4,31 min na obrazku 3,pokud vıte, ze se jedna o vzorek slivovice, a ze velikost plochy pıku je umerna obsahu latky vevzorku.

Dale byl pripraven roztok vzorku s prıdavkem standardu. Do odmerne banky o objemu 10 cm3

byl pipetovan 1 cm3 slivovice a 50 µl standardu methanolu (ϕst = 100 obj. %) a pote byla bankadoplnena destilovanou vodou po rysku. Takto pripraveny vzorek byl opet za stejnych podmınekanalyzovan plynovym chromatografem a pro methanol s retencnım casem tR = 3,700 min bylanamerena plocha pıku Avz+st = 1168,708 mV s.

19

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Ukol 10: Zjistete obsah methanolu ve slivovici metodou prıdavku standardu vypoctem i gra-ficky.

(a.) Vypocıtejte koncentraci standardu methanolu v roztoku vzorku s prıdavkem standardumethanolu v obj. %.

(b.) Vypocıtejte koncentraci methanolu ve slivovici v obj. %.

(c.) Sestrojte graf zavislosti plochy pıku na koncentraci standardu A = f(ϕst,i), body prolozteprımkou a zjistete rovnici prımky.

Tab. 2: Objemovy zlomek standardu methanolu a plochy pıku

ϕst,i / obj. % A / (mV s)

vzorek 0 107,794

vzorek + standard ϕst,1 1168,708

(d.) Z rovnice prımky spocıtejte obsah methanolu v roztoku vzorku, z ktereho pak dopocıtejteobsah methanolu ve slivovici.

Pokud se vam vsechno podarilo spocıtat, zjistıte, ze obsah methanolu stanoveny metodoukalibracnı krivky a metodou prıdavku standardu se nepatrne lisı.

Ukol 11: Ktera metoda by mela pri tomto stanovenı byt presnejsı a proc?

Obr. 3: Chromatogram vzorku slivovice

20

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

Obr. 4: Chromatogram vzorku slivovice s prıdavkem standardu methanolu

21

Zadanı 2. serie (6. rocnık)

22