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[ APPLICATION NOTE ]

ウォーターズのソリューションタンパク質およびペプチド用 Waters™ BioAccord™ システム

キーワードBioAccord、ACQUITY UPLC、I-Class PLUS、TUV、ACQUITY RDa 検出器、SmartMS、UNIFI、インタクト質量分析、サブユニット分析、ヒト化 mAb 質量チェックスタンダード、mAb サブユニットスタンダード

アプリケーションのメリットコンパクトな高性能 LC-MS プラットホームである BioAccord™ システムで、インタクト 質量分析におけるデータ取得、解析、レポート作成を合理化する方法をご紹介します。これはワークフローの自動化、ユーザーアクセシビ リティの向上、性能の標準化によって実現し ます。これらのすべてにより、より多くのラボが情報に富んだ結果を生成し、より的確な分析上の意思決定をより効率的に下すことができ ます。

データインテグリティに対応した 再現性の高いルーチンインタクト質量分析Henry Shion、Ying Qing Yu、Weibin ChenWaters Corporation, Milford, MA, USA

はじめにインタクトおよびサブユニットレベルでのバイオ医薬品タンパク質の質量分析（MS）は、製品開発のライフサイクル全体を通じて実施されています。これらの分析は、シーケンスの完全性や製品のバラつきを確認するための情報を提供します。このテクノロジーは、インタクト質量分析における有用性およびアク セシビリティの向上によって、先発品およびバイオシミラーの規制当局への 申請のサポートにおいて幅広く利用されるようになりました。1 一方、イン タクト質量分析が幅広く行われるようになったにもかかわらず、熟練 MS ユーザーには依然として、装置の操作、データ解析および解釈を管理することが 求められています。インタクト質量分析の機能を拡張し、後期開発や最終的な QC における役割を担うためには、MS の専門家以外のユーザーのアクセシ ビリティを更に向上させ、熟練した分析者が日常的に取得している高品質な 結果を生成できるようにならなければなりません。

規制環境のラボにおけるパワフルな MS 機能のメリットは、多くの企業によって実現されてきました。2-3 光学的検出方法に精通している分析者による MS の 採用を遅らせる（想像上および現実上の）課題は、MS テクノロジーに固有の複雑さが原因として挙げられる一方、質量分析の生データを製品の品質特性 結果へと変換できる規制準拠のインフォマティクスプラットホームが最近まで利用できなかったことにも起因します。

バイオ医薬品の後期開発や品質保証において堅牢なシステムを求める業界の 要望に応えて、BioAccord システム（図 1）は、タンパク質、ペプチド、糖鎖の正確で再現性の高い自動質量測定を提供する、シンプルで最適化された操作モードを実現することを目的に設計されました。

高性能を損なわない 真のベンチトップシステム

使いやすい内蔵型スマート自己診断トラブルシューティングツール

ワークフロー主導型の自動データ取得、 データ解析、レポート作成

コンプライアンス対応

BioAccord システム

図 1. ACQUITY UPLC I-Class PLUS、 ACQUITY RDa 質量検出器および光学検出器（TUV/FLR）によって構成されるBioAccord システム。

データインテグリティに対応した再現性の高いルーチンインタクト質量分析

[ APPLICATION NOTE ]

2

実験方法

サンプル前処理本研究では、ヒト化 mAb 質量チェックスタンダード（製品番号 186009152）および mAb サブユニットスタンダード（製品番号 186008927）を使用しました。インタクト質量分析では、400 µL の LC-MS グレード水を、80 µg のインタクト mAb が入ったサンプルバイアルに加えて 0.2 µg/µL 溶液を作成し、2 µL を注入に使用しました。サブユニット分析では、250 µL の水を、25 µg のサブユニット mAb が入ったサンプルバイアルに加えて 0.1 µg/µL 溶液を作成し、2 µL を注入に使用しました。

インタクト質量分析：LC-MS メソッドセットアップカラム： ACQUITY UPLC Protein BEH C4

300Å、1.7 µm、2.1 mm × 50 mm （製品番号 186004495）

カラム温度： 80 °C

移動相 A： 0.1％ギ酸水溶液 （または 0.1％ TFA、データは図 6 参照）

移動相 B： 0.1％ギ酸含有アセトニトリル （または 0.1％ TFA、データは図 6 参照）

光学検出： UV 280 nm

インタクト mAb 分析用の LC グラジエントテーブル： 時間 流量 組成 A 組成 B 曲線 （分） （mL/分） （%） （%） 1 0.00 0.40 95.0 5.0 開始時 2 1.00 0.40 95.0 5.0 6 3 3.50 0.40 15.0 85.0 6 4 3.70 0.40 15.0 85.0 6 5 4.00 0.40 5.0 95.0 6 6 4.50 0.40 15.0 85.0 6 7 5.00 0.40 95.0 5.0 6 8 5.50 0.40 95.0 5.0 6 9 7.00 0.40 95.0 5.0 6

合計分析時間： 7.0 分

MS 条件：インタクト質量分析

取り込み設定

モード： フルスキャン

質量範囲： 高（400～7000 m/z）

極性： (+)

スキャンレート： 2 Hz

コーン電圧： カスタム（70 V）（または 0.1％ TFA の 移動相の場合は 150 V）

キャピラリー電圧： カスタム（1.50 kV）

脱溶媒温度： カスタム（550 °C）

サブユニット質量分析：LC-MS メソッドセットアップカラム： BioResolve™ RP mAb Polyphenyl

450Å、2.7 µm、2.1 mm × 50 mm （製品番号 186008944）

カラム温度： 80 °C

移動相 A： 0.1％ギ酸水溶液

移動相 B： 0.1％ギ酸含有アセトニトリル

光学検出： UV 280 nm

*Waters ヒト化 mAb 質量チェックスタンダード（製品番号 186009152）は、NIST 標準物質 8671（NIST mAb）を安定化および凍結乾燥したものです。

BioAccord システムは、ACQUITY RDa 検出器および ACQUITY UPLC I-Class PLUS を、UNIFI 科学情報システムによる制御下で統合したコンパクトな高性能 LC-MS プラットホームです。UNIFI 制御による統合型システムで、メソッドベースおよびワークフロー型のプロセスを使用して、データ取得、解析、レポート 作成を合理化します。自動装置キャリブレーション用の内蔵型 質量キャリブレーションリファレンススタンダードと、装置およびメソッドのガイド付きセットアップの組み合わせにより、ワーク フローの自動化、ユーザーアクセシビリティの向上、性能の標準化を実現します。

本アプリケーションノートでは、インタクトのモノクローナル 抗体や IdeS 消化サブユニットの質量分析における BioAccord システムの性能特性を紹介します。BioAccord システムにより、高品質で再現性のあるインタクト質量分析データが生成されるため、ユーザーにとってのデータ解析や管理の負担が 軽減され、より多くのラボが情報に富んだ結果を生成し、より 的確な分析上の意思決定をより効率的に下すことができます。

[ APPLICATION NOTE ]

3データインテグリティに対応した再現性の高いルーチンインタクト質量分析

サブユニット mAb 分析用の LC グラジエントテーブル： 時間 流量 組成 A 組成 B 曲線 （分） （mL/分） （%） （%） 1 0.00 0.30 80 20 6 2 10.00 0.30 60 40 6 3 10.30 0.30 20 80 6 4 11.30 0.30 20 80 6 5 11.60 0.30 80 20 6 6 15.00 0.30 80 20 6

合計分析時間： 15.0 分

結果および考察

BioAccord システム内のインタクト質量分析ワークフローのセットアップUNIFI ソフトウェアプラットホームによって制御される BioAccord システムは、一般的な分析ワークフローの自動化および標準化によって、取り込み メソッドの作成からデータ解析や最終的なレポート 作成まで、完全なインタクトタンパク質の質量分析 プロセスを合理化します（図 2）。ACQUITY RDa 検出器の装置操作を以下の 4 つの標準化モードに 分けることで、複雑性を軽減するように尽力し ました。

1. ポジティブ低質量分析 （m/z = 2000 までのデータ取得、ペプチドマッピングに最適）

2. ポジティブ高質量分析 （m/z = 7000 まで、インタクト質量分析およびサブユニット分析に最適）

3. ネガティブ低質量分析 （m/z = 2000 まで）

4. ネガティブ高質量分析 （m/z = 5000 まで）

この操作モードの標準化と、シンプルで直観的なユーザーインターフェース、詳細なチューニング パラメーターの自動最適化、事前にプログラム されたキャリブレーションチェックにより、標準 操作手順へのシステムの統合を促進し、異なるオペレーターやラボ間での一貫性を保証します。図 3 は ACQUITY RDa 検出器の装置コントロールウィン ドウのスクリーンショットです。ここでは、イン タクトデータ取得における一般的な設定が表示されています。

UN

IFI ワークフロー

1. 分析メソッドの作成 データ取得メソッド、データ解析メソッド およびレポートフォーマットを含む、 全体的な UNIFI メソッドを作成します。

2. 分析の実行 UNIFI メソッドに従って分析を実行し、 自動データ取得、データ解析、 レポート作成を行います。

3. レビューおよびレポート 実験結果をレビューおよびレポートし、 カスタム計算とフィルターによって 全体的な知見を効率的にまとめます。

図 2. 自動化および標準化されたインタクト質量分析ワークフロー

MS 条件：サブユニット分析

取り込み設定

モード： フルスキャン

質量範囲： 高（400～7000 m/z）

極性： (+)

スキャンレート： 2 Hz

コーン電圧： カスタム（30 V）

キャピラリー電圧： カスタム（1.00 kV）

脱溶媒温度： カスタム（450 °C）

図 3. （A）ACQUITY RDa 検出器の MS ソース制御パラメーターおよびインタクト質量分析のメソッド セットアップ。（B）0. 1％ギ酸を 含む移動相を使用したインタクト質量分析のための ACQUITY RDa 検出器 MS データ取り込みパラメーター。

3A.

3B.

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4データインテグリティに対応した再現性の高いルーチンインタクト質量分析

生スペクトル デコンボリューション後のスペクトル

G1F/G1F G0F/G0F

G0F/G1F

G1F/G2F

G2F/G2F

拡大した領域

4A.

4C.

4B. 51+ 52+

53+ 54+

図 4. 0.1％ギ酸を含む移動相によるインタクト質量スペクトル

BioAccord システムによるインタクト mAb 分析400 ng のヒト化 mAb 質量チェックスタンダード（製品番号 186009152）、2.1 mm × 50 mm ACQUITY BEH カラムを使用して得られたフル MS スペクトルを図 4 に示します。m/z 400～7000 にわたって取り込まれたこの質量スペクトルは、大きなタンパク質において観測される典型的な 電荷分布を示しています。m/z 2730～2950 で 観測された 4 種類の存在量の多い多価イオン（51+ ～ 54+）を拡大表示したスペクトル（図 4B）は、インタクト抗体において最も存在量の多い 5 種類のグリコフォームを示しています。グリコフォームの相対存在量は、異なる多価イオン間で一貫していました。

これらの最も存在量の多い 5 つのグリコフォーム と、存在量の少ない他の複数のグリコフォームの インタクト質量を、フル MS スペクトルのデコン ボリューションによって得ました（図 4C）。ピーク の割り当ては、ヒト化 mAb に一般的である二分岐 糖鎖構造を含むタンパク質配列からの in-silico 計算に基づいています。デコンボリューション後のスペクトル（図 4C）は、生スペクトルと比較して、主要グリコフォームの相対存在量パターンが 非常によく似ています。

ヒト化 mAb 質量チェックスタンダードを自動 LC-MS 分析によって 13 回注入し、データを 取得、解析し、レポートしました（図 5）。データはシンプルなメソッド開発セットの代表的な例で あり、製品の糖鎖バリエーションの程度と分析の再現性の評価に使用しました。13 回の注入において、ソフトウェアによって同定された 5 つの主要グリコフォームの平均相対量を、トレンドプロット に示しました（図 5A）。ここで見られる 2.5％ 未満の低い％RSD 値は、MaxEnt1 解析データが、熟練した LC-MS プラットホームユーザーによって生成されたデータと同等の品質であることを示しています。

図 5A. スペクトルの品質とデータの一貫性が、インタクト質量分析の成功における 2 つの重要な 要素です。ここでは、ヒト化 mAb スタンダードの主要なグリコフォームの相対定量を示しています。 13 回の注入にわたって、グリコフォームの一貫した相対的割合を得ることができました。赤で示した ように、RSD％は 2.5％未満です。5B. UNIFI レビューパネル内に表示された、自動計算後のヒト化 mAb スタンダード実験結果。個々の注入ならびにデータセット全体において、良好な質量精度が達成されています。

G1F/G1F

G0F/G0F

G0F/G1F

G1F/G2F G2F/G2F

5B.

5A.

[ APPLICATION NOTE ]

5データインテグリティに対応した再現性の高いルーチンインタクト質量分析

ヒト化 mAb 質量チェックスタンダードのインタクト質量分析（図 5B）では、MS レスポンス、実測質量および理論質量、計算された質量誤差（ppm）、各注入におけるそれぞれのグリコフォームの相対量による、上位 5 つの主要グリコフォームの成分テーブルが含まれます。下のサマリープロットは、13 回の注入において同定された 5 つの主要グリコフォームの質量誤差を 1 つのシンプルな画面に 表示しています。

トリフルオロ酢酸（TFA）は、タンパク質やペプチドの逆相 LC（RP-LC）分離における移動相添加剤として一般的に使用されます。TFA はイオンペア剤として機能し、タンパク質の官能基とシリカ LC 粒子上の残留シラノール基との相互作用を最小限に抑えることで、タンパク質のクロマトグラフィーピーク形状を改善します。TFA はイオン干渉により MS シグナルを減少させ、分析における MS の感度を低下させますが、UV 検出による定量においてはプラスの効果をもたらします。そのため、将来的な LC-MS メソッドの基礎となるような光学検出ベースのアッセイに関わってきたラボにおいて、TFA は添加剤として幅広く使用されてきました。

0.1％ TFA を含む移動相を使用した、ヒト化 mAb 質量チェックスタンダードのインタクト LC-MS スペクトルは、0.1％ギ酸を含む 移動相の場合と比較すると、m/z 2000～6500 でより広いチャージ分布を示しました。エレクトロスプレーイオン化プロセスにおいて一般的に観測される TFA のイオン抑制効果に対しては、サンプル消費量を高める（約 5 倍）ことで、ギ酸ベースの分析と同等のデータを得ることができました。より高いコーン電圧（60 V に対して 150 V）は、TFA 付加イオンのデクラスタリングに効果的であり、0.1％ギ酸のデータ（図 4B）と同等の高品質スペクトルデータ（図 6B）を BioAccord システムによって得ることができています。

生スペクトル

拡大した領域

デコンボリューション後のスペクトル

G1F/G1F

G0F/G0F

G0F/G1F

G1F/G2F

G2F/G2F

6C.

6A.

6B. 46+ 47+

48+ 49+

図 6. 0.1％ TFA を含む移動相によるインタクト質量スペクトル

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6データインテグリティに対応した再現性の高いルーチンインタクト質量分析

BioAccord システムによる mAb サブユニットスタンダード（scFc、LC、および Fd）の分析サブユニット分析（図 7A-B）は、mAb サブユニットスタンダード（製品番号 186008927）を使用して実施しました。TIC クロマト グラム（図 7A）は、分離された 3 つのクロマトグラフィーピーク（scFc、LC、および Fd）を含み、レポートされた保持時間は それぞれ 4.06 分、5.39 分、7.93 分でした。生データスペクトル（図 7B）は、ヒト化 mAb 質量チェックスタンダード（200 ng を カラムに適用）の各サブユニット（scFc、LC および Fd）のピークに対応しており、高い S/N 比を示し、デコンボリューションされた結果に自動解析されたサブユニットの多価イオンスペクトル包絡線を示しました。成分サマリーテーブルには同定された LC、scFc、および Fd サブユニットが示され、それぞれの MS レスポンス、デコンボリューション後の質量、計算された質量誤差、保持時間、サブユニット上の修飾のパーセンテージも示されました（図 7C）。また、レビューパネルには、成分プロットにおけるデコンボリューション後に自動同定され、標識された scFc 由来の主要グリコフォームが示されました。

scFc

LC

Fd

7C.

7A. 7B.

図 7. TIC、生スペクトル、およびヒト化 mAb スタンダード（200 ng をカラムに適用）の IdeS 消化サブユニット scFc、LC、Fd の主要な ピーク。

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Waters、The Science of What’s Possible、BioAccord、ACQUITY、UPLC、UNIFI、RDa、および BioResolve は、 Waters Corporation の商標です。その他すべての商標はそれぞれの所有者に帰属します。

©2019 Waters Corporation. Produced in the U.S.A. 2019 年 3 月 720006472JA AG-PDF

結論本アプリケーションノートにおいて、新しいコンパクト設計の質量検出器、ワークフローの自動化、UNIFI インフォマティクスプラットホームにより簡素化されたシステム操作機能によって、BioAccord システムが優れた性能を持っていることが証明されました。本システムによって生成されるインタクトおよび サブユニット mAb 質量分析データにより、メソッドバリデーションやサンプル セットのルーチン分析でよく使用される、ヒト化 mAb 自動ピーク割り当てや グリコフォームの相対量測定が簡単に行えます。本システムは規制および非規制 環境の両方で使用でき、メソッド開発を加速し、それらのメソッドのダウン ストリームへの移管を簡素化し、後期開発および品質保証において、より豊富な情報による分析上の意思決定が迅速に行えるようになります。

参考文献1. Rogstad, S., Faustino, A., Ruth, A., Keire, D.,

Boyne, M., and Park, J. J Am Soc Mass Spectrom.2017, Vol 28(5):786–794. doi: 10.1007/s13361-016-1531-9.

2. Sokolowska, I., Mo J., Dong, J., Lewis, M. J. and Hu, P. MAbs.2017, Vol 9, 498–505.

3. Xu, W., Jimenez, B. R., Mowery, R., Luo, H., Cao, M., Agarwal, N., Ramos, I., Wang, X. and Wang, J. MAbs.2017, 9, 1186–1196.