iiidigilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/digital...melanogaster yang diinduksi fes04 andi...

STUDI AKTIVITAS 2,5-BIS(4-HIDROKSI-3-METOKSIBENZILIDIN) SIKLOPENTANON TERHADAP

LEVEL ANTIOKSIDAN ENDOGEN SOD1 DAN SOD2 PADADrosophila melanogaster YANG DIINDUKSI FeSO4

STUDY ON THE ACTIVITY OF 2,5-BIS(4-HYDROXY-3-METHOXYBENZYLIDINE) CYCLOPENTANONE ON THELEVEL OF ENDOGENOUS ANTIOXIDANTS SOD1 AND

SOD2 IN FeSO4-induced Drosophila melanogaster

ANDI NURLINDASARI

N111 14 057

PROGRAM STUDI FARMASIFAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDINMAKASSAR

2018

ii

STUDI AKTIVITAS 2,5-BIS(4-HIDROKSI-3-METOKSIBENZILIDIN) SIKLOPENTANON TERHADAP LEVEL

ANTIOKSIDAN ENDOGEN SOD1 DAN SOD2 PADA Drosophilamelanogaster YANG DIINDUKSI FeSO4

SKRIPSI

Untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhisyarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana

ANDI NURLINDASARIN111 14 057



2018

ii



SKRIPSI





2018

ii



SKRIPSI





2018

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji Syukur penulis panjatkan Kehadirat Allah Subhana Wataala atas

berkah dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini

sebagai persyaratan untuk menyelesaikan studi pada Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan Skripsi ini banyak

hambatan yang dihadapi, namun berkat doa dan bantuan dari berbagai pihak

skripsi ini dapat terealisasikan. Oleh karena itu perkenankanlah penulis

mengungkapkan rasa terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya

kepada:

1. Ibu Dr. Risfah Yulianty, S.Si., M.Si., Apt. selaku pembimbing utama dan

Bapak Firzan Nainu, S.Si., M. Biomed., Ph.D., Apt. selaku pembimbing

pertama yang telah meluangkan waktu dalam memberikan bimbingan,

nasehat, dan motivasi kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan

skripsi ini.

2. Ibu Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt., Bapak Sukamto S. Mamada,

S.Si., M.Sc., Apt., Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt. selaku tim

dosen penguji yang telah memberikan kritik dan saran sehingga

membantu penulis dalam menyempurnakan skripsi ini.

3. Seluruh Dosen dan Staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, yang

telah mendidik dan membagikan ilmunya sehingga penulis dapat

menyelesaikan studi dengan lancar di Fakultas Farmasi.

vii

Ucapan terima kasih penulis kepada laboran terkhusus di Laboratorium

Biofarmaka atas arahan, bantuan dan segala fasilitas yang penulis gunakan

selama melakukan penelitian sehingga dapat menyelsaikan penelitian

penulis. Rudi Ardiansyah, S.Si., Apt. yang telah memberikan bantuan dan

meluangkan waktunya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian.

Terima kasih kepada ayahanda dan ibunda tercinta Abdul Rasid dan

Hamsiah, yang selalu mendoakan, memberikan dukungan materi dan kasih

sayang kepada penulis, serta saudara-saudara penulis Andi Kiki Reski FR.

dan Muhammad Fajri Rasid atas dukungan dan perhatian yang di berikan

kepada penulis.

Terima kasih kepada teman-teman UFRG (Unhas Fly Research Group)

Nutfatun Khasanah, Nur Wahdaniyah, Riski Asngurun, Seprilianti, Muh.

Shoalihin dan Atina Abdullah sekaligus sebagai rekan penelitian penulis atas

kerja sama selama penelitian dan saling memberikan dukungan baik dalam

suka maupun duka sehingga penelitian yang dilakukan dapat selesai dengan

baik.

Ucapan terima kasih setulusnya kepada teman-teman angkatan 2014

“HIOSIAMIN” Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas kebersamaan

selama berada di Fakultas Farmasi baik dalam keadaan suka maupun duka,

semoga tetap semangat dalam menjalani kehidupan ini dan ilmu yang

diperoleh dapat bermanfaat serta cita-cita yang diinginkan dapat tercapai.

ix

ABSTRAK

ANDI NURLINDASARI. Studi Aktivitas 2,5-bis(4-hidroksi-3-metoksibenzilidin) siklopentanon terhadap Level Antioksidan Endogen SOD1dan SOD2 pada Drosophila melanogaster yang Diinduksi FeSO4 (dibimbingoleh Risfah Yulianty, Firzan Nainu)

Analog kurkumin 2,5-bis(4-hidroksi-3-metoksibenzilidin) siklopentanonatau pentagamavunon-0 (PGV-0) mampu mempertahankan hidupDrosophila melanogaster yang mengalami penurunan survival setelahdiberikan FeSO4. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitasPGV-0 terhadap antioksidan endogen SOD1 dan SOD2 pada Drosophilamelanogaster yang diinduksi FeSO4. Pada penelitian ini Drosophilamelanogaster diberikan FeSO4 lalu selanjutnya diberikan pakan yangmengandung. kurkumin 1 mg dan PGV-0 0,25 mg, 0,5 mg dan 1 mg.Selanjutnya pengukuran level mRNA SOD1 dan SOD2 denganmenggunakan metode reverse-transcriptase quantitative PCR (RT-qPCR).Hasil analisis level mRNA SOD1 dan SOD2 dengan menggunakan One WayAnova, menunjukkan bahwa pemberian FeSO4 tidak menyebabkanpeningkatan level antioksidan endogen SOD1 dan SOD2, mengindikasikanbahwa penurunan survival Drosophila melanogaster tidak disebabkan olehpeningkatan radikal bebas yang menjadi substrat SOD1 dan SOD2. Selainitu, pemberian kurkumin dan PGV-0 dapat menurunkan level SOD1 danSOD2 dan memberikan hasil tidak signifikan (P value>0,05) dengankelompok perlakuan FeSO4. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwakematian Drosophila melanogaster akibat pemberian FeSO4 maupun efekpenyelamatan yang diberikan kurkumin dan PGV-0 tidak dipengaruhi olehlevel antioksidan endogen SOD1 dan SOD2.

Kata Kunci : Drosophila melanogaster, FeSO4, Kurkumin, PGV-0, RT-qPCR SOD1, SOD2

x

ABSTRACT

ANDI NURLINDASARI. Study On The Activity Of 2,5-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzylidine) cyclopentanone On The Level Of EndogenousAntioxidants SOD1 and SOD2 In FeSO4-induced Drosophila Melanogaster(supervised by Risfah Yulianty, Firzan Nainu)

Curcumin analogue 2,5-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzylidine)cyclopentanone or pentagamavunon-0 (PGV-0) is able to survive Drosophilamelanogaster which decreases survival after being given FeSO4. Thepurpose of this research was to determine the activity of PGV-0 onendogenous antioxidants SOD1 and SOD2 in Drosophila melanogasterinduced by FeSO4. In this research, Drosophila melanogaster was givenFeSO4 and then given the feed containing curcumin 1 mg and PGV-0 0,25mg, 0,5 mg and 1 mg. Then, measure the level of mRNA SOD1 and SOD2using the reverse-transcriptase quantitative PCR (RT-qPCR) method. Theresults of SOD1 and SOD2 mRNA level analysis using One Way Anova,showed that giving FeSO4 did not cause an increase in endogenousantioxidant levels of SOD1 and SOD2, indicating that the decrease insurvival of Drosophila melanogaster was not caused by an increase in freeradicals being substrates SOD1 and SOD2. In addition, giving curcumin andPGV-0 can reduce the levels of SOD1 and SOD2 and give insignificantresults (P value> 0,05) with the FeSO4 treatment group. Thus, it can beconcluded that the death of Drosophila melanogaster due to given of FeSO4and the effects of salvation given by curcumin and PGV-0 were not affectedby endogenous antioxidant levels of SOD1 and SOD2..Keywords : Drosophila melanogaster, FeSO4, Curcumin, PGV-0, RT-qPCR SOD1, SOD2

xi

DAFTAR ISI

Halaman

UCAPAN TERIMA KASIH vi

ABSTRAK ix

ABSTRACT x

DAFTAR ISI xi

DAFTAR TABEL xiv

DAFTAR GAMBAR xv

DAFTAR LAMPIRAN xvi

BAB I PENDAHULUAN 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 5

II.1 Uraian Senyawa 5

II.1.1 Kurkumin 5

II.1.2 Analog Kurkumin 6

II.2 Radikal Bebas 7

II.2.1 Mekanisme Pembentukan Radikal Bebas 10

II.2.2 Sumber Pembentukan Radikal Bebas 11

II.2.3. FeSO4 (Besi(II)Sulfat)................................................................................................ 13

II.3 Antioksidan .................................................................................... 15

II.4 Drosophila melanogaster 18

II.4.1 Fisiologis Drosophia melanogaster 19

II.4.2 Siklus Hidup Drosophia melanogaster 21

xii

II.4.3 Faktor – faktor Yang Mempengaruhi Perkembangan Drosophila

melanogaster 24

II.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)................................................ 25

II.5.1 Tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR) ............... 26

II.5.2 Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)........ 29

II.5.3 Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR) 30

II.5.4 Jenis-Jenis Polymerase Chain Reaction (PCR) 30

BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN 33

III.1 Penyiapan Alat dan Bahan 33

III.2 Metode Kerja ......................... 33

III.2.1 Penyiapan Sampel ....................... 33

III.2.2 Penyiapan Hewan Uji .............................. 34

III.2.3 Pembuatan Pakan Drosophila .............. 34

III.2.4 Pembuatan Pakan yang Mengandung Kurkumin atau Analog

Kurkumin ............................................................................................. 34

III.2.5 Pembuatan Larutan Glukosa 1 % .............................................. 35

III.2.6 Pembuatan Larutan FeSO4 Konsentrasi 15 mM dengan

Menggunakan Pelarut Glukosa 1% .................................................... 35

III.2.7 Prosedur Percobaan 35

III.2.8 Analisis Level mRNA Gen SOD1 dan SOD2 ............................. 36

III.2.8.1 Isolasi RNA Total .................................................................... 36

III.2.8.2 Analisis menggunakan Real Time reverse transcriptase

quantitative PCR (real time RT-qPCR) ................................................ 36

xiii

III.2.9 Analisis Statistik ......................................................................... 37

III.3 Pembahasan Hasil dan Kesimpulan 37

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 38

IV.I Hasil Analisis Level mRNA SOD1 ................................................. 39

IV.2 Hasil Analisis Level mRNA SOD2 ................................................ 40

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 43

V.1 Kesimpulan 43

V.2 Saran 43

DAFTAR PUSTAKA 44

LAMPIRAN I 49

LAMPIRAN II 51

LAMPIRAN III 52

LAMPIRAN IV 53

LAMPIRAN V ....................................................................................... 55

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Jenis-jenis Reactive Oxygen Species (ROS) ................................. 9

2. Sumber Radikal Bebas.................................................................. 13

3. Primer Superoksida Dismutase (SOD1 dan SOD2) dan rp49 ....... 37

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktrur Kurkumin......................................................................... 5

2. Struktur Pentagamavunon-0 (PGV-0)............................................ 7

3. Struktur Besi(II) Sulfat ................................................................... 14

4. Reaksi Pembentukan Superoksida dan aktivitas enzim SOD ...... 18

5. Perbedaan Drosophila melanogaster Jantan dan Betina 21

6. Siklus Hidup Drosophila melanogaster.......................................... 23

7. Alat Real Time-PCR ...................................................................... 26

8. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)................. 28

9. Hasil analisis level mRNA SOD1 ................................................... 39

10. Hasil analisis level mRNA SOD2 ................................................... 40

11. Uji Survival .................................................................................... 53

12. Proses Persiapan Ekstraksi RNA .................................................. 53

13. Penghalusan Sampel .................................................................... 53

14. Proses Heatingblock...................................................................... 53

15. Proses Sentrifuge ......................................................................... 53

16. Proses Penambahan Gen ............................................................. 53

17. Pengukuran Level Ekspresi Gen .................................................. 54

18. Grafik Uji Survival .......................................................................... 55

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema Kerja 49

2. Perhitungan .......... 51

3. Komposisi Pakan 52

4. Gambar Penelitian .... 53

5. Hasil Preliminary Study (Uji Survival) ............................................ 55

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Analog kurkumin adalah senyawa-senyawa yang memiliki struktur

mirip kurkumin yang dibuat untuk memperbaiki ketidakstabilan kurkumin

dari cahaya dan pH (Sharma et al. 2005). Salah satu senyawa analog

kurkumin yaitu 2,5-bis(4-hidroksi-3-metoksibenzilidin) siklopentanon

(pentagamavunon-0). Senyawa ini memiliki struktur rantai tengah

kurkumin yang termodifikasi pada kelompok asetil aseton diganti dengan

siklopentanon (Sardjiman, 2000). Pentagamavunon-0 (PGV-0) mempunyai

aktivitas biologis mirip kurkumin yaitu antifungi, antibakteri, antiinflamasi,

antioksidan dan penghambatan siklooksigenase (Yuniarti et al. 2012).

Pentagamavunon-0 memiliki potensi sebagai antioksidan lebih kuat

dibanding senyawa analog kurkumin lainnya, misalnya heksagamavunon-

0 (HGV-0) dan gamavuton-0 (GVT-0) (Sardjiman, 2000).

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu memperlambat atau

mencegah proses oksidasi dan berfungsi untuk menghentikan kerusakan

sel akibat radikal bebas. Untuk mengatasi bahaya yang timbul akibat

radikal bebas maka tubuh mengembangkan mekanisme perlindungan

dengan cara mengekspresikan antioksidan endogen seperti SOD1, SOD2,

catalase, dan lain-lain (Bourg, 2001). Superoxide dismutase (SOD) terdiri

atas dua jenis yaitu SOD1 dihasilkan di sitosol sel dan SOD2 dihasilkan di

2

mitokondria yang berperan sebagai lini pertama pertahanan antioksidan

yang mengubah radikal superoksida yang sangat reaktif (dismutation)

menjadi hidrogen peroksida dan molekul oksigen (Aguilar et al. 2016).

Beberapa senyawa kimia dapat menyebabkan peningkatan radikal

bebas, salah satunya adalah FeSO4 (Brailovskaya et al. 2001). FeSO4

digunakan sebagai penginduksi yang dapat menyebabkan terjadinya

peningkatan ROS (Reactive Oxygen Species) karena adanya logam

transisi seperti Fe2+/Fe3+ (Imlay et al. 1988). .FeSO4 yang disebabkan

karena ion logam Fe2+, dapat bereaksi dengan oksigen atau hidrogen

peroksida (H2O2), menghasilkan radikal OH yang berbahaya (Young dan

Woodside, 2001; Botman dan Mayes, 2009). Peningkatan yang

berkelanjutan atau berlebihan pada Reactive Oxygen Species (ROS)

dapat menimbulkan kerusakan acak pada protein, lipid, dan asam nukleat

(Ayodele et al. 2017). Berdasarkan penelitian yang dilakukan Joshua

(2017), FeSO4 pada dosis 15 mM dapat menyebabkan penurunan

lokomotor hingga kematian pada Drosophila melanogaster.

Model organisme uji yang saat ini mulai banyak digunakan adalah

lalat buah Drosophila melanogaster. Serangga ini memiliki kesamaan

secara genetik, hampir 75% gen yang berhubungan dengan penyakit

pada manusia, ditemukan pada Drosophila (Panchal dan Tiwari, 2017).

Drosophila melanogaster merupakan serangga dari ordo Diptera dan

famili Drosophilidae. Secara fisik, serangga ini memiliki tubuh yang kecil

dengan panjang rata-rata 3 mm. Drosophila melanogaster mempunyai

3

siklus hidup pendek, tingkat reproduksi yang cepat, biaya perawatan yang

rendah, dan genom yang mudah dimanipulasi secara genetik (Wixon dan

O’Kane, 2000; Husnul dkk. 2017).

Berdasarkan hasil preliminary study untuk uji survival diperoleh

bahwa pemberian FeSO4 dapat menurunkan survival Drosophila

melanogaster dan pemberian diet pentagamavunon-0 (PGV-0) dapat

menyelamatkan dan mempertahankan hidup Drosophila melanogaster

setelah diinduksi dengan FeSO4 dosis 15 mM selama 25 jam.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan Ayodele et al. (2017),

pemberian diet kurkumin pada D. melanogaster meningkatkan level SOD

yang berimplikasi pada meningkatnya kemampuan bertahan hidup D.

melanogaster. Analog kurkumin yang mempunyai aktivitas biologis yang

mirip dengan kurkumin juga diharapkan dapat memberikan efek yang

sama dengan kurkumin. Penelitian terhadap aktivitas biologis analog

kurkumin (pentagamavunon-0) sebagai antioksidan secara in vitro telah

banyak dilakukan sehingga penelitian ini bertujuan untuk menguji efek dari

analog kurkumin (pentagamavunon-0) secara in vivo terhadap level

antioksidan endogen SOD1 dan SOD2 Drosophila melanogaster.

I.2 Rumusan Masalah

Apakah analog kurkumin pentagamavunon-0 (PGV-0) dapat

meningkatkan level antioksidan endogen SOD 1 dan SOD 2 pada

Drosophila melanogaster yang diinduksi FeSO4 ?

4

I.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas analog kurkumin

pentagamavunon-0 (PGV-0) terhadap level antioksidan endogen SOD1

dan SOD2 pada Drosophila melanogaster yang diinduksi FeSO4.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Uraian Senyawa

II.1.1 Kurkumin

Kurkumin adalah senyawa polifenol bioaktif utama yang terdapat di

rimpang tanaman Curcuma longa (kunyit). Kunyit (Curcuma longa L.)

merupakan tanaman dari famili zingiberaceae yang banyak dimanfaatkan

masyarakat sebagai rempah dan obat-obatan. Komposisi utama penyusun

kunyit adalah minyak atsiri, turmerol, sineol, zingiberin, borneol, karvon

dan kurkumin. Kurkumin memiliki potensi sebagai antiinflammasi,

antitumor, penghambat karsinogen-DNA dan antioksidan (Natalina dkk,

2009).

Gambar 1. Struktur Kimia Kurkumin (Saputri dan Nigrum, 2010)

Kurkumin ( 1,7-bis(4′ hidroksi-3 metoksifenil )-1,6 heptadien, 3,5-dion

merupakan komponen penting dari Curcuma longa Linn. yang

memberikan warna kuning yang khas (Saputri dan Nigrum, 2010).

Kurkumin termasuk golongan senyawa polifenol dengan struktur kimia

mirip asam ferulat yang banyak digunakan sebagai penguat rasa pada

6

industri makanan (Saputri dan Nigrum, 2010). Serbuk kering rhizome

(turmeric) mengandung 3-5% kurkumin dan dua senyawa derivatnya

dalam jumlah yang kecil yaitu desmetoksi kurkumin dan

bisdesmetoksikurkumin, yang ketiganya sering disebut sebagai

kurkuminoid (Dandekar dan Gaikar, 2002). Kurkumin tidak larut dalam air

tetapi larut dalam etanol atau dimetilsulfoksida (DMSO). Degradasi

kurkumin tergantung pada pH tetapi lebih cepat pada kondisi netral-basa

(Aggarwal et al. 2003).

Adapun sifat kimia dan fisika kurkumin, yaitu (Saputri dan Nigrum, 2010) :

a. Sifat Kimia

1) Melting Point : 183°C

2) Molar Mass : 368.38 g/mol

3) Tidak larut di dalam air dan eter tetapi larut di dalam alkohol

4) Di dalam alkali warnanya akan menjadi merah kecoklatan dan di

dalam asam akan berwarna kuning terang.

b. Sifat Fisika

1) Bentuk : serbuk

2) Warna : kuning terang atau kuning kemerahan

II.1.2 Analog Kurkumin

Salah satu analog kurkumin yaitu pentagamavunon-0 [2,5-bis(4’-

hidroksi-3’-metoksibenzilidin) siklopentanon] adalah analog kurkumin yang

dikenal dengan PGV-0. PGV-0 memiliki berat molekul 352,130 dibuat

dengan merubah gugus β diketon pada kurkumin menjadi analog gugus

7

monoketon sekaligus menghilangkan gugus metilen aktif sehingga bersifat

lebih stabil terhadap pH dan cahaya (Sharma et al. 2005). Senyawa ini

diharapkan masih tetap memberikan aktivitas dengan spektrum yang

sama dengan aktivitas kurkumin, tetapi dengan kualitas yang lebih baik,

yaitu berefek lebih besar dan aman. PGV-0 juga relatif lebih mudah dalam

sintesisnya, memiliki potensi sebagai antioksidan dan antiinflamasi lebih

kuat disbanding senyawa analog kurkumin lainnya, misalnya

heksagamavunon-0 (HGV-0) dan gamavuton-0 (GVT-0) (Sardjiman,

2000). PGV-0 mempunyai aktivitas biologis mirip kurkumin yaitu aktivitas

antifungi, antibakteri, antiinflamasi, antioksidan dan penghambatan

siklooksigenase. Senyawa ini aktivitas sebagai antioksidan dikarenakan

adanya gugus OH fenolik pada strukturnya (Yuniarti et al. 2012).

Gambar 2. Struktur Kimia PGV-0 (Saputri dan Nigrum, 2010)

II.2 Radikal Bebas

Radikal bebas dapat didefinisikan sebagai suatu molekul, atom, atau

beberapa atom yang mempunyai satu atau lebih elektron tidak

berpasangan pada orbit luarnya sehingga bersifat sangat reaktif. Suatu

molekul bersifat stabil bila elektronnya berpasangan, tetapi bila tidak

berpasangan (single) molekul tersebut menjadi tidak stabil dan memiliki

8

potensi untuk merusak. Bila molekul tidak stabil ini mengambil satu

elektron dari senyawa lain maka molekul tersebut menjadi stabil

sedangkan molekul yang diambil elektronnya menjadi tidak stabil berubah

menjadi radikal dan memicu reaksi pembentukan radikal bebas berikutnya

(reaksi berantai) (Yuniastuti, 2008). Radikal dalam tubuh berasal dari

dalam (endogen) atau dari luar tubuh (eksogen). Secara endogen, radikal

bebas terbentuk sebagai respon normal dari rantai peristiwa biokimia

dalam tubuh. Secara alamiah radikal bebas dibentuk dalam tubuh

makhluk hidup termasuk manusia, binatang dan tumbuhan. Dalam kondisi

normal jumlah radikal tersebut berada dalam keseimbangan atau

terkendali. Sumber radikal bebas endogen tersebut berasal dari proses

otooksidasi, oksidasi enzimatik, respiratory burst, reaksi yang dikatalisis

ion logam transisi, dan ischemia reperfusion injury (Khachik, 2002).

Radikal terpenting yang terdapat dalam tubuh merupakan derivat

oksigen atau oksi-radikal yang sering disebut Reactive Oxygen Species

(ROS). Radikal tersebut terdapat dalam bentuk singlet oxygen (1O2*),

anion superoksida (O2*), radikal hidroksil (OH*), nitrogen oksida (NO*),

peroksinitrit (ONOO-), asam hipoklor (HOCl), hydrogen peroksida (H2O2),

radikal alkoksil (LO*) dan radikal peroksil (LO2*) (Helliwell dan Gutteridge,

1999).

Berbagai jenis Reactive Oxygen Species (ROS) dalam tubuh

diperlihatkan pada Tabel 1, dari tabel tersebut terlihat bahwa diantara

berbagai ROS terdapat molekul yang bukan radikal bebas, yaitu 1O2 dan

9

H2O2, namun karena sifatnya yang sangat reaktif maka dimasukkan ke

dalam kelompok ini (Kurnani, 2001).

Tabel 1. Jenis-jenis Reactive Oxygen Species (ROS)

ROS KeteranganAnion superoksida O2* Tidak terlalu merusak,

tetapi dapat membentukhidrogen peroksida,yang merupakanreduktan logam transisidalam pembentukanradikal hidroksil

Radikal hidroksil OH* Radikal pengoksidasiyang sangat reaktif dandapat bereaksi denganhampir seluruhbiomolekul

Radikal peroksil LO2* Dihasilkan antara lainpada proses peroksidasilipid

Hydrogen peroksida H2O2. Hidrogen peroksidabukan radikal bebastetapi dikategorikansebagai ROS. Molekulini merupakan sumberradikal hidroksil dalamkondisi jenuh ion logamtransisi, juga terlibatdalam pembentukanHOCl

Oksigen singlet 1O2 Meskipun bukan radikalbebas, tetapimerupakanpengoksidasi yang kuat

Nitrogen oksida NO* Radikal bebas dalambentuk gas

Peroksinitrit ONOO- Terbentuk dari reaksiNO* dengan O2*

Asam hipoklor HOCl Dihasilkan oleh netrofilpada proses inflamasiterbentuk dari H2O2 danCl- yang dikatalisis olehmieloperoksidase.

10

Sumber : Kurnani TB. Radikal Bebas Dalam Polutan Lingkungan. Dalam SeminarNasional Dan Lokakarya Penelitian Konsep Radikal Bebas Dan Peran Antioksidan DalamMeningkatkan Kesehata Menuju Indonesia Sehat 2010. 2001

II.2.1 Mekanisme Pembentukan Radikal Bebas

Mekanisme terbentuknya radikal bebas dapat dimulai oleh banyak hal,

baik yang bersifat endogen maupun eksogen. Reaksi selanjutnya adalah

peroksidasi lipid membran dan sitosol yang mengakibatkan terjadinya

serangkaian reduksi asam lemak sehingga terjadi kerusakan membran

dan organel sel (Dawn, 2000). Peroksidasi (otooksidasi) lipid bertanggung

jawab tidak hanya pada kerusakan makanan, tapi juga menyebabkan

kerusakan jaringan in vivo karena dapat menyebabkan kanker, penyakit

inflamasi, aterosklerosis, dan penuaan. Efek merusak tersebut akibat

produksi radikal bebas (ROO•, RO•, OH•) pada proses pembentukan

peroksida dari asam lemak. Peroksidasi lipid merupakan reaksi berantai

yang memberikan pasokan radikal bebas secara terus-menerus yang

menginisiasi peroksidasi lebih lanjut. Proses secara keseluruhan dapat

digambarkan sebagai berikut (Esti, 2002) :

a. Inisiasi

ROOH + logam(n) ROO• + Logam(n-1) + H+

X• + RH R• + XH

b. Propagasi

R• + O2 ROO•

ROO• + RH ROOH + R•

11

c. Terminasi

ROO• + ROO• ROOR + O2

ROO• + R• ROOR

R• + R• RR

Dalam kimia organik, peroksida adalah suatu gugus fungsional dari

sebuah molekul organik yang mengandung ikatan tunggal oksigen-

oksigen (R-O-O-R'). Jika salah satu dari R atau R' merupakan atom

hidrogen, maka senyawa itu disebut hidroperoksida (R-O-O-H) (Esti,

2002).

Karena prekursor molekuler dari proses inisiasi adalah produk

hidroksiperoksida (ROOH), peroksidasi lipid merupakan reaksi berantai

yang sangat berpotensi memiliki efek menghancurkan. Untuk mengontrol

dan mengurangi peroksidasi lipid, digunakan senyawa yang bersifat

antioksidan (Dawn, 2000).

II.2.2 Sumber Pembentukan Radikal Bebas

Radikal bebas dapat dibentuk dari dalam sel oleh absorpsi tenaga

radiasi (misalnya sinar ultra violet, sinar X) atau dalam reaksi reduksi

oksidasi yang selama proses fisiologi normal atau mungkin berasal dari

metabolisme enzimatik bahan-bahan kimia eksogen. Tenaga radiasi dapat

melisiskan air dan melepaskan radikal seperti ion hidroksil dan H+. Radikal

bebas lain ialah superoksida yang berasal dari reduksi molekul oksigen.

Oksigen secara normal direduksi menjadi air, tetapi pada beberapa reaksi

12

terutama yang menyangkut xantin oksidase, O2- dapat terbentuk (Dawn,

2000).

Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan representasi katagori

molekul yang luas yang merupakan derivate oksigen radikal dan non-

radikal. Derivate oksigen radikal meliputi ion OH, superoksida, nitric oxide,

dan peroxyl, sedangkan derivate oksigen yang non-radikal meliputi ozone,

singlet oksigen, lipid peroksida, dan hydrogen peroksida. Derivate oksigen

non-radikal selanjutnya akan mengambil bagian dalam kaskade reaksi

yang menghasilkan radikal bebas (Varhliou, 2010; Botham, 2009).

Selain derivate oksigen, radikal bebas juga dapat berasal dari

derivate nitrogen seperti nitrit oksida, peroksi nitrit, dan ion nitroksil yang

juga merupakan subklas dari ROS (Makker, 2009). Berbagai macam ROS

tersebut dapat bersumber dari dalam tubuh (intrinsik) atau dari luar tubuh

(extrinsik).

Radiasi sinar rontgen maupun sinar ultraviolet merupakan sumber

pembentukan ROS yang cukup penting, mengingat kedua sinar tersebut

dapat melisiskan air menjadi radikal OH. Selain itu ion logam seperti Fe2+,

Co2+ dan Cu+ juga dapat bereaksi dengan oksigen atau hydrogen

peroksida (H2O2), menghasilkan radikal OH (Makker, 2009). Nitrit oksida,

suatu senyawa yang penting untuk relaksasi pembuluh darah, selain

merupakan senyawa radikal bebas, juga dapat bereaksi dengan

superoksida menghasilkan peroksinitrit, yang kemudian dapat membentuk

radikal OH (Makker, 2009).

13

Sumber ROS yang lain adalah berasal dari respiratory burst dari

makrofag yang teraktifkan. Aktivasi makrofag ini menyebabkan

peningkatan penggunaan glukosa melalui lintasan pentose fosfat yang

dipakai untuk mereduksi NADP menjadi NADPH, dan peningkatan

penggunaan oksigen yang dipakai untuk mengoksidasi NADPH guna

menghasilkan superoksida dan halogen radikal sebagai agen yang

sitotoksik untuk membunuh mikroorganisme yang telah difagosit (Makker,

2009).

Tabel.2 Sumber Radikal Bebas

Sumber Internal Sumber EksternalMitokondria

FagositXantine oksidase

Reaksi yang melibatkan besi dan logamtransisi lainnya

Arachidonat pathwayPeroksisomOlah raga

PeradanganIskemia/reperfusi

RokokPolutan lingkungan

RadiasiObat-obatan tertentu, pestisida dan

anestesi dan larutan industriOzon

Sumber : Varhliou. Reactive Oxygen Species In Cancer. Free Radical Research. 44 (5):479–496. 2010

II.2.3 FeSO4 (Besi(II)Sulfat)

Ferrous sulfate dikenal juga sebagai Green Vitriol yang merupakan

sintetis asal dan termasuk kelompok farmakologis yang disebut agen

hematologi dan garam besi. Obat ini adalah suplemen zat besi yang

digunakan untuk mengobati atau mencegah kadar besi darah rendah

(misalnya, untuk anemia atau selama kehamilan) (Alleyne et al. 2008).

Farmakodinamik dari sulfat besi dapat diringkas sebagai berikut:

transportasi dan penyimpanan oksigen, transpor elektron dan

14

metabolisme energi, antioksidan dan fungsi pro-oksidan yang

menguntungkan, penginderaan oksigen, dan replikasi DNA dan perbaikan

(Geisser dan Burckhardt, 2011).

Besi biasanaya ada pada keadaan besi (Fe2+) atau besi (Fe3+), tetapi

karena Fe2+ mudah teroksidasi menjadi Fe3+ yang dalam larutan berair

netral dengan cepat akan terhidrolisis menjadi besi yang tidak larut (III)-

hidroksida, besi diangkut dan disimpan terikat dengan protein plasma.

Pengikatan zat besi yang efektif sangat penting tidak hanya untuk

memastikan bahwa penyimpanan tersedia ketika diperlukan tetapi juga

karena fakta bahwa Fe2+ dapat mengkatalisis pembentukan spesies

oksigen reaktif, yang menyebabkan stres oksidatif, merusak konstituen

seluler (Geisser dan Burckhardt, 2011). Berikut adalah uraian bahan dari

FeSO4, yaitu :

Nama : Besi(II)Sulfat/Ferrosi Sulfat

Nama lain : Besi (2+) sulfat (1:1) heptahidrat; besi sulfat anhidrat

Berat molekul : FeSO4.7H2O BM 273,01

Anhidrat BM 151,90

Rumus struktur :

Gambar 3. Struktur Besi(II)Sulfat (Dirjen POM, 1995)

14













FeSO4, yaitu :




Anhidrat BM 151,90

Rumus struktur :


14













FeSO4, yaitu :




Anhidrat BM 151,90

Rumus struktur :


15

Pemerian : Hablur atau granul warna hijau kebiruan, pucat, tidak

berbau dan rasa seperti garam. Merekah di udara

kering. Segera teroksidasi di udara lembab,

berbentuk besi(III)sulfat berwarna kuning kecoklatan.

Kelarutan : Mudah larut dalam air; tidak larut dalam etanol;

sangat mudah larut dalam air mendidih.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat (Dirjen POM, 1995).

II.3 Antioksidan

Antioksidan adalah suatu molekul atau senyawa yang dapat

menangkap radikal bebas. Antioksidan dalam makanan dapat mencegah

atau memperlambat proses makanan menjadi tengik ataupun rusak dan

mengalami perubahan warna. Molekul-molekul antioksidan di dalam tubuh

bertugas untuk melindungi sel-sel tubuh dan komponen tubuh lainnya dari

radikal bebas, baik yang berasal dari metabolisme tubuh ataupun yang

berasal dari lingkungan (Kumar dan Kumar, 2009).

Berdasarkan reaksinya dengan radikal bebas atau oksidan dalam

sistem pertahanan tubuh, antioksidan dikelompokkan menjadi tiga, yaitu :

1. Antioksidan primer bekerja dengan memutus rantai reaksi menjadi

senyawa nonradikal atau radikal yang lebih stabil. Antioksidan jenis ini

dapat menetralisasi radikal bebas dengan menyumbangkan salah satu

elektronnya. Antioksidan yang termasuk dalam kelompok ini adalah

tokoferol dan asam askorbat (Christyaningsih dkk. 2003).

16

2. Antioksidan sekunder bekerja dengan cara mencegah tahapan inisiasi

dalam reaksi berantai radikal bebas. Antioksidan yang tergolong dalam

kelompok ini adalah superoksida dismutase dan glutation peroksidase

(Tandon et al. 2005).

3. Antioksidan tersier merupakan antioksidan yang bertugas untuk

memperbaiki molekul-molekul yang telah mengalami kerusakan akibat

radikal bebas. Antioksidan tersier juga berperan dalam membuang

berbagai molekul yang telah rusak akibat teroksidasi sebelum molekul-

molekul tersebut terakumulasi dalam tubuh dan mengganggu berbagai

proses di dalam sel tubuh (Tandon et al. 2005).

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dalam tubuh manusia dapat

dikelompokkan menjadi dua, yaitu :

1. Antioksidan endogen merupakan antioksidan yang dihasilkan oleh

tubuh, berupa enzim yang dapat mengubah radikal bebas menjadi

radikal bebas lain atau senyawa lainnya yang lebih tidak berbahaya

bagi tubuh (Ming et al. 2009). Beberapa contoh enzim antioksidan

endogen, yaitu :

1) Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan

terbanyak di dalam tubuh, yang sebagian besar dari enzim ini

terletak di organ hati. Enzim ini termasuk dalam golongan

metaloenzim. SOD mengkatalisis dismutasi anion superoksida yang

sangat reaktif menjadi oksigen (O2) dan senyawa yang tidak terlalu

reaktif seperti hidrogen peroksida (H2O2). Berdasarkan kofaktor

17

dan distribusinya didalam tubuh, enzim superoksida dismutase

dibagi menjadi copper, zinc superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD)

yang terdapat dalam sitoplasma eukariot, manganese superoxide

dismutase (Mn-SOD) yang terdapat pada mitokondria organisme

aerobik, iron superoxide dismutase (Fe-SOD) yang terdapat pada

prokariot dan ekstra selular superoksida dismutase (ec-SOD) yang

banyak ditemukan pada cairan ekstraselular mamalia (Choi, 1999).

2) Katalase adalah enzim yang mengkatalisis perubahan hidrogen

peroksida menjadi air dan oksigen dan mampu mencegah formasi

atau pembentukan gelembung CO2 dalam darah (Yunanto, 2009).

3) Glutation Peroksidase (GSH Prx) yang mengandung ion selenium

(Se). GSH Prx adalah enzim yang berperan aktif dalam memecah

H2O2 di dalam tubuh dan mempergunakannya untuk merubah

glutation (GSH) menjadi glutation teroksidasi (GSSH). Enzim

tersebut mendukung aktivitas enzim SOD bersama-sama dengan

enzim katalase dan menjaga konsentrasi oksigen akhir agar stabil

dan tidak berubah menjadi pro-oksigen (Yunanto, 2009).

18

2. Antioksidan eksogen adalah senyawa-senyawa yang memiliki daya

antioksidan yang berasal dari luar tubuh, contohnya adalah vitamin A,

asam askorbat, tokoferol, dan beberapa polifenol (Ming et al. 2009).

Gambar 4. Reaksi Pembentukan Superoksida dan aktivitas enzim SOD (Kumar danKumar, 2009)

II.4 Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster memiliki klasifikasi phylum Arthropoda, kelas

Insecta, ordo Diptera, Sub Ordo Cyclorrhapha, series Acalyptrata, Familia

Drosophilidae dan Genus Drosophila (Strickberger, 1962). Drosophila

melanogaster (lalat buah) adalah suatu serangga kecil dengan panjang

dua sampai lima milimeter dan komunitasnya sering kita temukan di

sekitar buah yang rusak/busuk. Drosophila melanogaster seringkali

19

digunakan dalam penelitian biologi terutama dalam perkembangan ilmu

genetika (Aini, 2008).

Ada beberapa alasan Drosophila melanogaster dijadikan sebagai

model organisme yaitu karena D. melanogaster ukuran tubuhnya kecil,

mudah ditangani dan mudah dipahami, praktis, siklus hidup singkat yaitu

hanya dua minggu, murah dan mudah dipelihara dalam jumlah besar

(Aini, 2008), mudah berkembangbiak dengan jumlah anak banyak,

beberapa mutan mudah diuraikan (King, 1962), memiliki empat pasang

kromosom raksasa yang terdapat pada kelenjar saliva pada fase larva

(Strickberger, 1962).

II.4.1 Fisiologis Drosophila melanogaster

Lalat buah ini memiliki sifat dimorfisme. Tubuh lalat jantan lebih

kecil dibandingkan betina dengan tanda-tanda secara makroskopis

adanya warna gelap pada ujung abdomen, pada kaki depannya dilengkapi

dengan sisir kelamin yang terdiri dari gigi hitam mengkilap (Shorrock,

1972). Banyak mutan-mutan Drosophila melanogaster yang dapat diamati

dengan mata biasa, dalam artian tidak memerlukan alat khusus.

Drosophila melanogaster tipe liar mempunyai mata merah, tipe sepia

mempunyai mata coklat tua dan tipe ebony mempunyai tubuh berwarna

hitam mengkilap (Aini, 2008).

Drosophila melanogaster tergolong serangga, pada umumnya

ringan dan memiliki eksoskeleton atau integumen yang kuat. Jaringan otot

dan organ-organ terdapat di dalamnya. Di seluruh permukaan tubuhnya,

20

integumen serangga memiliki berbagai syaraf penerima rangsang cahaya,

tekanan, bunyi, temperatur, angin dan bau (Aini, 2008). Pada umumnya

serangga memiliki 3 bagian tubuh yaitu kepala, toraks dan abdomen.

Kepala berfungsi sebagai tempat dan alat masukan makanan dan

rangsangan syaraf, serta untuk memproses informasi (otak). Lalat memiliki

tipe mulut spons pengisap. Toraks yang terdiri atas tiga ruas memberikan

tumpuan bagi tiga pasang kaki (sepasang pada setiap ruas), dan jika

terdapat sayap, dua pasang pada ruas kedua dan ketiga. Fungsi utama

abdomen adalah untuk menampung saluran pencernaan dan alat

reproduksi (Aini, 2008).

Ada beberapa tanda yang dapat digunakan untuk membedakan

lalat jantan dan betina, yaitu bentuk abdomen pada lalat betina kecil dan

runcing, sedangkan pada jantan agak membulat (Gambar 4). Tanda hitam

pada ujung abdomen juga bisa menjadi ciri dalam menentukan jenis

kelamin lalat ini tanpa bantuan mikroskop. Ujung abdomen lalat jantan

berwarna gelap, sedang pada betina tidak. Jumlah segmen pada lalat

jantan hanya 5, sedang pada betina ada 7. Lalat jantan memiliki sex

comb, berjumlah 10, terdapat pada sisi paling atas kaki depan, berupa

bulu rambut kaku dan pendek (Demerec dan Kaufmann, 1961). Lalat

betina memiliki 5 garis hitam pada permukaan atas abdomen, sedangkan

pada lalat jantan hanya 3 garis hitam (Wiyono, 1986).

21

II.4.2 Siklus Hidup Drosophila melanogaster

1) Telur

Telur Drosophila memiliki panjang kira-kira setengah millimeter. Bagian

struktur punggung telur ini lebih datar dibandingkan dengan bagian perut.

Telur lalat akan nampak di permukaan media makanan setelah 24 jam

dari perkawinan (Wiyono, 1986). Perkembangan embrio, yang mengikuti

pembuahan dan bentuk zigot, terjadi dalam membran telur (Demerec dan

Kaufmann, 1961). Lensa tangan akan mempermudah untuk mengamati

telur-telur lalat. Setelah fertilisasi acak telur berkembang kurang lebih satu

hari, kemudian menetas menjadi larva (Wiyono, 1986).

2) Larva

Sekitar satu hari setelah fertilisasi, embrio berkembang dan menetas

menjadi larva (Aini, 2008). Larva yang baru menetas disebut sebagai larva

fase (instar) pertama dan hanya nampak jelas bila diamati dengan

menggunakan alat pembesar. Larva makan dan tumbuh dengan cepat

(Demerec dan Kaufmann, 1961) kemudian berganti kulit mejadi larva fase

kedua dan ketiga. Larva fase ketiga, dua sampai tiga hari kemudian

Gambar 5. Jantan (Kiri) dan Betina ( Kanan) (Wiyono, 1986)

22

berubah menjadi pupa (Wiyono, 1986). Setelah penetasan dari telur, larva

mengalami dua kali molting (ganti kulit) (Demerec dan Kaufmann, 1961),

memakan waktu kurang lebih empat hari untuk selanjutnya menjadi pupa

(Wiyono, 1986). Fase terakhir dapat mencapai panjang sekitar 4,5

milimeter. Larva sangat aktif dan termasuk rakus dalam makan, sehingga

larva tersebut bergerak pelan pada media biakan. Saat larva siap menjadi

pupa, mereka berjalan perlahan dan menempel dinpermukaan relatif

kering, seperti sisi botol atau di bagian kertas kering yang diselipkan ke

pakannya (Demerec dan Kaufmann, 1961).

3) Pupa

Pupa yang baru terbentuk awalnya bertekstur lembut dan putih seperti

kulit larva tahap akhir, tetapi secara perlahan akan mengeras dan

warnanya gelap (Demerec dan Kaufmann, 1961). Diatas dari empat hari,

tubuh pupa tersebut sudah siap dirubah bentuk dan diberi sayap dewasa,

dan akan tumbuh menjadi individu baru setelah 12 jam (waktu perubahan

fase diatas berlaku untuk suhu 25 °C) (Aini, 2008). Tahap akhir fase ini

ditunjukkan dengan perkembangan dalam pupa seperti mulai terlihatnya

bentuk tubuh dan organ dewasa (imago). Ketika perkembangan tubuh

sudah mencapai sempurna maka Drosophila melanogaster dewasa akan

muncul melalui anterior end dari pembungkus pupa. Lalat dewasa yang

baru muncul ini berukuran sangat panjang dengan sayap yang belum

berkembang. Waktu yang singkat, sayap mulai berkembang dan tubuhnya

berangsur menjadi bulat (Demerec dan Kaufmann, 1961). Hari kelima

23

pupa terbentuk dan pada hari kesembilan keluarlah imago dari selubung

pupa (puparium) (Wiyono, 1986).

4) Imago

Perkawinan biasanya terjadi setelah imago berumur 10 jam, tetapi

meskipun demikian lalat betina biasanya tidak segera meletakkan telur

sampai hari kedua. Lalat buah Drosophila pada suhu 25°C, dua hari

setelah keluar dari pupa mulai dapat bertelur kurang lebih 50 sampai 75

butir per hari sampai jumlah maksimum kurang lebih 400-500 dalam 10

hari, tetapi pada suhu 20°C mencapai kira-kira 15 hari (Aini, 2008).

Jumlah telur tersebut dipengaruhi oleh faktor genetik, temperatur

lingkungan dan volume tabung yang digunakan (Mulyati,1985). Siklus

hidup total terhitung dari telur sampai telur kembali berkisar antara 10-14

hari. Siklus hidup Drosophila melanogaster selengkapnya adalah sebagai

berikut :

Gambar 6. Siklus hidup Drosophila melanogaster (Aini, 2008)

24

II.4.3 Faktor – faktor Yang Mempengaruhi Perkembangan Drosophilamelanogaster

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan pada siklus hidup

lalat buah (Drosophila melanogaster) diantaranya sebagai berikut yaitu :

a. Suhu Lingkungan

Lalat buah (Drosophila melanogaster) mengalami siklus selama 8-

11 hari dalam kondisi ideal. Kondisi ideal yang dimaksud adalah suhu

sekitar 25-28°C. Pada suhu ini lalat akan mengalami satu putaran siklus

secara optimal. Sedangkan pada suhu rendah atau sekitar 180C, waktu

yang diperlukan untuk menyelesaikan siklus hidupnya relatif lebih lama

dan lambat yaitu sekitar 18-20 hari. Pada suhu 30°C, lalat dewasa yang

tumbuh akan steril (Oktary, 2015).

b. Ketersediaan Media Makanan

Jumlah telur lalat buah (Drosophila melanogaster) yang dikeluarkan

akan menurun apabila kekurangan makanan. Lalat buah dewasa yang

kekurangan makanan akan menghasilkan larva berukuran kecil. Larva ini

mampu membentuk pupa berukuran kecil, namun sering kali gagal

berkembang menjadi individu dewasa. Beberapa dapat menjadi dewasa

yang hanya dapat menghasilkan sedikit telur. Viabilitas dari telur-telur ini

juga dipengaruhi oleh jenis dan jumlah makanan yang dimakan oleh larva

betina (Oktary, 2015).

c. Tingkat Kepadatan Botol Pemeliharaan

Botol medium sebaiknya diisi dengan medium buah yang cukup

dan tidak terlalu padat. Selain itu, lalat buah yang dikembangbiakan di

25

dalam botol pun sebaiknya tidak terlalu banyak, cukup beberapa pasang

saja. Pada lalat buah (Drosophila melanogaster) dengan kondisi ideal

dimana tersedia cukup ruang (tidak terlalu padat) individu dewasa dapat

hidup sampai kurang lebih 40 hari. Namun apabila kondisi botol medium

terlalu padat akan menyebabkan menurunnya produksi telur dan

meningkatnya jumlah kematian pada individu dewasa (Oktary, 2015).

d. Intensitas Cahaya

Lalat buah (Drosophila melanogaster) lebih menyukai cahaya

remang-remang dan akan mengalami pertumbuhan yang lambat selama

berada di tempat yang gelap (Oktary, 2015).

II.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan

amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh

Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk

mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam

beberapa jam. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga

teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains

dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran

forensik dan evolusi molekular (Hasibuan, 2015 ; Yusuf, 2010).

26

Gambar 7. Alat Real Time-PCR (Yusuf, 2010)

II.5.1 Tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat,

penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.

Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua

utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat

penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan

pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit

(Hasibuan, 2015). Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR

adalah sebagai berikut:

1). Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka

menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi

yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa

yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan,

misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi

biasanya dilakukan antara suhu 900C – 950C (Hasibuan, 2015).

2). Penempelan Primer

27

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju

daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada

proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan

urutan komplemen pada templat (Hasibuan, 2015).

Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 500C – 600C. Selanjutnya,

DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan

menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan

reaksi polimerisasi selanjutnya misalnya pada 720C (Hasibuan, 2015).

3). Reaksi Polimerisasi (Extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi

pada suhu 720C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami

perpanjangan pada sisi 3‟nya dengan penambahan dNTP yang

komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan

berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di

amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai

ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan

(2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul

DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung,

setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi

4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga

perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan

menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus

akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3‟ dari

28

potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat

di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T

pada ujung-ujung 5‟-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat

yang disebut thermocycler (Hasibuan, 2015).

Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan

diakhiri oleh tahapan berikut :

a). Pradenaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan

kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-

start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu) (Hasibuan, 2015).

b). Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-

15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah

diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR

terakhir (Hasibuan, 2015)

Gambar 8. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Hasibuan, 2015)

28







a). Pradenaturasi




b). Final Elongasi






28







a). Pradenaturasi




b). Final Elongasi






29

II.5.2 Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah :

a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA

cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul.

Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas

(Yusuf, 2010).

b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18

– 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai

DNA. Dan mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60% (Yusuf,

2010).

c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP, dGTP,

dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi

efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi polimerasi (Yusuf, 2010).

d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi

sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut

Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada

tahun 1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan

berulang-ulang yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang

tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder

(Yusuf, 2010).

e. Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Larutan buffer PCR

umumnya mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 200C);

50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20

30

sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak

0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2 (Yusuf, 2010).

II.5.3 Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaction (PCR Polymerase Chain) dapat digunakan untuk (Hasibuan,

2015) :

a. Amplifikasi urutan nukleotida.

b. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami

mutasi.

c. Bidang kedokteran forensik.

d. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

II.5.4 Jenis-Jenis Polymerase Chain Reaction (PCR)

Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya:

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode ini

digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model

derifat dari perbedaan DNA (Yusuf, 2010).

2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal

yang diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang

memotong bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen

restriksi yang dihasilkan ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi

dengan menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang

memiliki jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal

31

yang telah tergabung. Metode ini khusus digunakan untuk

mengidentifikasi ”sekuen antara” dari beragam gen (Yusuf, 2010).

3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi

pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak

diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini,

set kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama

berlangsung. Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut

primer inner disimpan di antara sekuens target set kedua dari primer

yang disebut sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama

dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan

dengan inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari

produk reaksi yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer

akan menyatu dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan

produk yang lebih pendek daripada produk yang pertama.

4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil

produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk

mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil

dari metode ini juga menampilkan copy dari sampel (Yusuf, 2010).

5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk

amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.

Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi

cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen

diekspresikan (Yusuf, 2010).

32

6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) bertujuan untuk

mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan

oleh Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan

teknik PCR menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk

keperluan amplifikasi lokus acak dari genom (Yusuf, 2010).

33

BAB III

PELAKSANAAN PENELITIAN

III.1 Penyiapan Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf

(Hirayama), alat-alat gelas, BSC kelas II (Faster), timbangan analitik

(Sartorius), CO2Pad (Flystuff), pinset (Taiyo electric), inkubator

(HerathermTM), mikrosentrifuge (Tomy), mikropipet (Dragonlab),

micropestle (Geneaid), Treff tube (TreffLab), Real-Time PCR (Rotor-Gene

Q (Qiagen)), oven (Memmert), vial Drosophila (Biologix) dan Zoom Stereo

Microscope (Motic).

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Drosophila

melanogaster Oregon-R (Laboratory Host Defense and Responses,

Kanazawa University, Japan), aquadest, etanol 96% (OneMed), pakan

Drosophila, kertas saring, glukosa, satu set primer SOD1 dan SOD2,

reagen SV Total RNA Isolation System (Promega), FeSO4 (EMSURE®),

gas CO2 (Samator), mikrotube (genfollower), filter tips mikropipet (Rainin),

dan kit GoTaq® 1-Step RT-qPCR System (Promega).

III.2 Metode Kerja

III.2.1 Penyiapan Sampel

Sampel kurkumin dan analog kurkumin diperoleh dari Dr. Risfah

Yulianty S.Si., M.Si., Apt.

34

III.2.2 Penyiapan Hewan Uji

Drosophila melanogaster Oregon-R (wild type) betina dewasa

merupakan model hewan uji yang digunakan, dengan umur 4 sampai 7

hari yang berada dalam sebuah botol yang berfungsi sebagai kandang,

berisi pakan Drosophila. Sistem pencahayaan 12 jam gelap dan 12 jam

terang dan suhu tetap dijaga pada 25ºC.

III.2.3 Pembuatan Pakan Drosophila

Pakan dibuat dengan menimbang masing-masing bahan yaitu agar,

aquadest steril, glukosa, tepung jagung, dan yeast lalu dicampurkan ke

dalam gelas kimia dan di tambahkan 1000 ml aquadest steril, dan diaduk

hingga homogen. Panaskan campuran, kemudian ditambahkan metil

paraben 15 % dan asam propionat sambil diaduk selama ± 1 jam. Jika

telah mencapai suhu 80-90ºC, campuran akan mengental. Selanjutnya,

pakan yang sudah siap dituang ke dalam botol kultur kemudian ditunggu

hingga memadat (± 2 hari, suhu 25ºC). Setelah itu, pakan siap digunakan.

III.2.4 Pembuatan Pakan yang Mengandung Kurkumin atau AnalogKurkumin

Pakan yang mengandung kurkumin 1 mg/g dan analog kurkumin

0,25 mg, 0,5 mg/g dan 1 mg/g, dibuat dengan menimbang pakan

Drosophila dalam vial sebanyak 2 g kemudian ditambahkan dengan

kurkumin atau analog kurkumin.

35

III.2.5 Pembuatan Larutan Glukosa 1 % b/v

Sebanyak 1 gram glukosa ditimbang lalu dimasukkan ke dalam gelas

kimia kemudian ditambahkan air hingga 100 ml, diaduk hingga larutan

homogen.

III.2.6 Pembuatan Larutan FeSO4 Konsentrasi 15 mM denganMenggunakan Pelarut Glukosa 1%

Larutan FeSO4 dengan konsentrasi 15 mM dibuat dengan

menimbang FeSO4 sebanyak 113,5 mg lalu dilarutkan dengan 50 ml

glukosa 1%.

III.2.7 Prosedur Percobaan

Lalat betina dewasa sebanyak 75 ekor dipuasakan selama 2 jam

kemudian dibagi menjadi 5 kelompok yang masing-masing terdiri atas 15

ekor lalat pada vial yang berbeda. Vial pertama sebagai kontrol negatif

berisi kertas saring yang mengandung 200 µl FeSO4 15 mM, setelah 25

jam lalat dipindahkan kedalam pakan lalat. Vial kedua sebagai kontrol

positif berisi kertas saring yang mengandung 200 µl FeSO4 15 mM,

setelah 25 jam lalat dipindahkan kedalam pakan lalat yang mengandung

kurkumin 1 mg/g. Vial ketiga, vial kempat dan vial kelima masing-masing

berisi kertas saring yang mengandung 200 µl FeSO4 15 mM, setelah 25

jam lalat di pindahkan kedalam masing-masing vial yang berisi pakan

yang mengandung analog kurkumin dengan konsentrasi 0,25 mg/g, 0,5

36

mg/g, dan 1 mg/g. Setelah itu, dilakukan analisis level mRNA gen SOD1

dan SOD2 pada Drosophila melanogaster sebanyak 3 kali replikasi.

III.2.8 Analisis Level mRNA Gen SOD1 dan SOD2

III.2.8.1 Isolasi RNA Total

Isolasi RNA total dilakukan dari lima ekor Drosophila melanogaster

yang masih hidup, dimasukkan ke dalam Treff tube kemudian dihaluskan

menggunakan micropestle. Selanjutnya, diekstraksi menggunakan reagen

SV Total RNA Isolation System (Promega).

III.2.8.2 Analisis menggunakan Real time reverse transcriptasequantitative PCR (real time RT-qPCR)

Level ekspresi gen superoksida dismutase (SOD1 dan SOD2) diukur

dengan menggunakan real-time PCR dengan kit GoTaq® 1-Step RT-qPCR

System (Promega). Real-time PCR dijalankan menggunakan satu set

primer SOD1 (SOD1 F dan SOD1 R) dan SOD2 (SOD2 F dan SOD2 R),

di dalam tube PCR dengan volume 20 µl. Rangkaian siklus sebagai

berikut : 1 siklus pada suhu 95ºC selama 10 menit, 40 siklus pada suhu

95ºC selama 15 detik, 55ºC selama 45 detik dan 60ºC selama 30 detik.

Digunakan protein ribosom gen rp49 sebagai kontrol internal (Nolan et al.

2006).

37

Tabel 3. Primer superoksida dismutase (SOD1 dan SOD2) dan rp49

Namagen

Sekuens PrimerKondisi PCR

Forward Reverse

SOD15’AGGTCAACATCACCGACTCC3’

5’GTTGACTTGCTCAGCTCGTH 3’

Siklus PCR : 40 siklusInisiasi : 95ºC, 10 menitDenaturasi : 95ºC, 15 detikAnnealing : 55ºC, 45 detikElongasi : 72ºC, 30 detik

SOD25’TGGCCACATCAACCACAC 3’

5’TTCCACTGCGACTOGATG3’


rp49

5’GACGCTTCAAGGGACAGTATC3’

5’AAACGCGGTCTGCATGAG 3’


Sumber : Cassar M. A dopamine receptor contributes to paraquat-induced neurotoxicityin Drosophila. Human Molecular Genetics. 24. (1): 197-212. hal. 209

III.2.9 Analisa Statistik

Data level ekspresi gen superoksida dismutase (SOD1 dan SOD2)

dianalisis dengan metode perhitungan level ekspresi komparatif

(comparative quantification) menggunakan aplikasi Rotor-Gene Q

(Qiagen). Analisis statistik dengan metode One Way Anova menggunakan

Graph Pad Prism®7.

III.3 Pembahasan Hasil dan Kesimpulan

Pembahasan hasil dilakukan berdasarkan hasil pengamatan dan

analisis data yang diperoleh kemudian diambil kesimpulan berdasarkan

hasil pembahasan.

38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini, dilakukan analisis level antioksidan endogen

SOD1 dan SOD2 dengan menggunakan model hewan uji Drosophila

melanogaster untuk mengetahui aktivitas dari analog kurkumin yakni

pentagamavunon-0 (PGV-0) sebagai antioksidan. Penginduksian dengan

FeSO4 dilakukan untuk menyebabkan terjadinya peningkatan ROS

(Reactive Oxygen Species) karena adanya ion logam Fe2+, yang dapat

bereaksi dengan O2 atau H2O2, menghasilkan radikal OH (Young dan

Woodside, 2001; Botman dan Mayes, 2009). FeSO4 bagi manusia

berfungsi sebagai pencegahan dan pengobatan anemia defisiensi besi.

Akan tetapi, besi (Fe2+) yang tidak diserap, dapat meningkatkan produksi

radikal bebas dalam usus besar ke konsentrasi yang dapat menyebabkan

kerusakan sel mukosa atau peningkatan produksi karsinogen (Lunk et al.

2003; Carrier et al. 2001). Peningkatan radikal bebas dapat dilawan

dengan antioksidan endogen SOD1 dan SOD2 yang akan mengubah

radikal bebas menjadi radikal bebas lainnya atau senyawa lainnya yang

lebih tidak berbahaya bagi tubuh (Ming, et al. 2009).

Tujuan dari analisis level mRNA SOD1 dan SOD2 adalah untuk

mengetahui pengaruh ekspresi gen antioksidan endogen SOD1 dan

SOD2 terhadap kemampuan hidup Drosophila melanogaster. Pada

penelitian Ayodele et al. (2017), pemberian kurkumin pada Drosophila

39

melanogaster akan meningkatkan level mRNA SOD, tanpa penginduksian

FeSO4.

IV.I Hasil Analisis Level mRNA SOD1

Superoksida dismutase (SOD1) yang dikode oleh gen sod1 dihasilkan

di sitosol dan berperan sebagai faktor pertahanan utama yang bertugas

melindungi sel dari radikal superoksida yang sangat reaktif (Costa et al.

1997). Pada Drosophila, rusaknya gen sod1 menyebabkan penurunan

masa hidup, infertilitas, dan hipersensitivitas terhadap stres oksidatif

(Woodruff et al. 2004). Dibawah ini adalah gambar hasil analisis level

mRNA SOD1.

Keterangan : ns=tidak signifikan

Gambar 9. Grafik hasil analisis level mRNA SOD1 pada Drosophila melanogaster

Pada gambar diatas, menunjukkan level mRNA SOD1, analisis yang

dilakukan dengan metode One Way Anova, menunjukkan pemberian

FeSO4, kurkumin dan PGV-0 memberikan hasil tidak signifikan (P>0.05)

artinya tidak terdapat perbedaan level SOD1 dengan pemberian FeSO4

dan pemberian kurkumin maupun PGV-0 setelah diinduksi FeSO4. Pada

40

perlakuan kelompok kurkumin dan PGV-0 level SOD1 mengalami

penurunan yang tidak signifikan dibandingkan dengan kelompok FeSO4.

Dari hasil tersebut, diperoleh bahwa kurkumin lebih kuat daripada PGV-0

dalam menurunkan level SOD1. Semakin tinggi dosis PGV-0 yang

diberikan maka terjadi peningkatan level SOD1. Hal ini kemungkinan

karena SOD1 aktivitasnya mengalami kejenuhan sehingga tidak mampu

menetralisir radikal bebas yang terbentuk sehingga SOD1 diproduksi lebih

banyak.

IV.II Hasil Analisis Level mRNA SOD2

Superoksida dismutase (SOD2) yang dikode oleh gen sod2

dihasilkan di mitokondria yang berperan dalam pertahanan sel dalam

menghadapi stres oksidatif dengan pemberian etanol (Costa et al. 1997).

Dibawah ini adalah hasil analisis level mRNA SOD2.

Keterangan : ns=tidak signifikan

Gambar 10. Grafik hasil analisis level mRNA SOD2 pada Drosophila melanogaster

41

Gambar diatas, menunjukkan hasil analisis level mRNA SOD2,

analisis statistik menggunakan One Way Anova, menunjukkan bahwa

pemberian FeSO4, kurkumin dan PGV-0 memberikan hasil tidak signifikan

(P>0.05) artinya tidak terdapat perbedaan level SOD2 dengan pemberian

FeSO4 dan pemberian kurkumin maupun PGV-0 setelah diinduksi FeSO4.

Pada perlakuan kelompok kurkumin dan PGV-0 level SOD2 mengalami

penurunan yang tidak signifikan dibandingkan dengan kelompok FeSO4.

Pada grafik tersebut juga menunjukkan bahwa kurkumin lebih kuat

daripada PGV-0 dalam menurunkan level SOD2 dan dari ketiga dosis

PGV-0 yang digunakan, menunjukkan level SOD2 yang hampir sama

sehingga peningkatan dosis PGV-0 tidak meningkatkan level SOD2.

Superoksida dismutase (SOD) adalah salah satu antioksidan

enzimatik yang dimiliki tubuh manusia untuk melindungi sel dari Reactive

Oxygen Spesie (ROS), yaitu superoksida (Murray et al. 2008).

Kurkumin sebagai antioksidan dipengaruhi oleh adanya 2 gugus hidroksi

fenolik dan adanya gugus β diketon (Da’i, 2011). Begitupun dengan PGV-

0 yang memiliki gugus OH fenolik pada strukturnya dalam penangkapan

radikal pertama kali pada senyawa antioksidan fenolik (Yuniarti et al.

2012). Berdasarkan hasil preliminary study yang dilakukan pemberian

FeSO4 dapat menurunkan survival Drosophila melanogaster yang

berujung pada kematian dan pemberian kurkumin dan PGV-0 dapat

menyelamatkan dan mempertahankan hidup Drosophila melanogaster.

Akan tetapi, kematian Drosophila melanogaster akibat pemberian FeSO4

42

kelihatannya tidak terjadi melalui jalur sinyal yang berhubungan dengan

SOD1 dan SOD2. Pemberian kurkumin dan PGV-0 dapat menurunkan

level SOD1 dan SOD2 setelah diinduksi FeSO4. Hal ini kemungkinan

karena kurkumin dan PGV-0 memiliki peran sebagai antioksidan eksogen

yang dapat menurunkan jumlah substrat yang ada pada sel dibawah dari

kadar basal (base line) sehingga SOD1 dan SOD2 tidak perlu diproduksi

dalam jumlah besar.

Kurkumin memberikan efek melalui chelating dengan besi bebas

karena berdasarkan hasil kuantifikasi spektrofotometri kurkumin terhadap

besi menunjukkan afinitas Fe2+ setidaknya mengikat dua molekul

kurkumin (Jiao et al. 2006). Hal ini kemungkinan yang dapat menyebakan

berkurangnya kadar ion Fe2+ sehingga jumlah radikal bebas mengalami

penurunan. Jumlah radikal bebas menurun akibat pemberian kurkumin

dan PGV-0 sehingga menyebabkan pula penurunan level SOD1 dan

SOD2. Apabila terjadi peningkatan SOD1 ataupun SOD2 maka dapat

diasumsikan bahwa terjadi pula peningkatan radikal bebas. Pemberian

kurkumin dan PGV-0 tidak memiliki pengaruh terhadap peningkatan SOD1

dan SOD2. Bahkan, justru cenderung menurunkan level kedua SOD.

Berdasarkan hasil yang diperoleh bahwa, survival Drosophila

melanogaster terlihat pada kelompok yang mengalami penurunan SOD1

dan SOD2 sehingga mengimplikasikan bahwa level SOD1 dan SOD2

yang rendah bermanfaat untuk peningkatan survival Drosphila

melanogaste

43

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa pemberian

analog kurkumin yakni pentagamavunon-0 (PGV-0) dengan dosis 0,25;

0,5; dan 1 mg tidak memberikan pengaruh terhadap level antioksidan

endogen SOD1 dan SOD2 pada Drosophila melanogaster yang diinduksi

FeSO4.

V.2 Saran

Adapun saran untuk penelitian ini, sebaiknya isolasi RNA dilakukan

pada hari ke-2 dan disarankan untuk dilakukan penelitian terhadap kadar

radikal superoksida. Penulis menyarankan agar dilakukan penelitian

lanjutan untuk mengetahui penyebab kematian Drosophila melanogaster

yang melalui jalur lain.

44

DAFTAR PUSTAKA

Aini, N. 2008. Kajian Awal Kebutuhan Nutrisi Drosophila melanogaster.Skripsi tidak diterbitkan. Bogor. Fakultas Peternakan. InstitutPertanian Bogor.

Aggarwal, BB, Kumar, A dan Bharti, AC. 2003. Anticancer potential ofcurcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23.(1A) : 98-100.

Aguilar, T.A.F., Navarro, B.C.H., and Perez., J.A.M. 2016. EndogenousAntioxidants: A Review of their Role in Oxidative Stress. Intech. p. 8-9.

Alleyne M., McDonald K. Horne MD. K., and Miller J.L. 2008. IndividualizedTreatment for Iron Deficiency Anemia in Adults. Am J Med. 121.(11): 943-948

Ayodele, J.A. Ganiyu, O., Opeyemi, O., Amos, O.A., Adetutu, U. 2017.Curcumin Supplemented Diets Improve Antioxidant Enzymes andAlter Acetylcholinesterase Genes Expression Level in Drosophilamelanogaster Model. Springer Science Business Media.

Bourg, E. Le. 2001. Oxidative Stress, Aging and Logevity in Drosophilamelanogaster. FEBS Letters. 498. (2-3): 183

Botham, K.M. and Mayes, P.A. 2009. The Repiratory Chain & OxidativePhosphorilation. In: Murray K, Bender DA, Botham KM. et.al.Harper’s Illustrated Biochemistry, Ed 28th. Mc Graw Hill Lange p.12-103.

Brailovskaya, I. V., Starkov A. A., and Mokhova, E. N. 2001. Ascorbateand Low Concentrations of FeSO4 Induce the Ca2+-Dependent Porein Rat Liver Mitochondria. Biochemistry (Moscow). 66. (8): 909-912

Carrier J., Aghdassi E., Platt I., Cullen J., and Allard J.P. 2001. Effect ofOral Iron Supplementation on Oxidative Stress and Colonicinflammation in Rats with Induced Colitis. Aliment Pharmacol Ther. 15:1989-1999.

Cassar M, Issa A, Riemensperger T, Petitgas C. Rival T, Coulom H,Iche-Torres M, Han K and Birman S. 2015. A dopamine receptorcontributes to paraquat-induced neurotoxicity in Drosophila. HumanMolecular Genetics. 24. (1): 197-212.

45

Choi J, Roche E, Caquet T. 1999. Characterization of superoxidedismutase activity in Chironomus riparius Mg. (Diptera,Chironomidae) larvae – a potential biomarker. ComparativeBiochemistry and Physiology Part C. 124:73–81.

Christyaningsih J, Suwandito, Purnomo SU. 2003. PengaruhSuplementasi Vitamin E Dan C Terhadap Aktivitas EnzimSuperoksida Dismutase (SOD) Dalam Eritrosit Tikus Yang TerpaparAsap Rokok Kretek. JBP. 5: 87-91.

Costa, V., Amorim, M.A., Reis, E., Quintanilha, A., and Moradas-Ferreira,P. 1997. Mithocondrial Superoxide Dismutase is Essential of EthanolTolerance of Saccharomyces cerevisiae in The Post Diauxic Phase.Microbiol.143:1649 – 1956.

Da’i M., Wulandari R.R., dan Utami W. 2011. Uji Aktivitas Penagkap RadikalDPPH Analog Kurkumin Siklik dan N-Heterosiklik Monoketon.Pharmacon.12. (1): 22

Dandekar, Deepak V dan Gaikar V.G. 2002. Microwave AssistedExtraction Of Curcuminoids From Curcuma Longa. SeparationScience And Technology. 37. (11) : 2670.

Dawn B.M., Allan D.M., dan Colleen M.S. 2000. Metabolisme Oksigen danToksisitas Oksigen. In: Joko S, Vivi S, Lydia IM (editors). BiokimiaKedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis. Jakarta: EGC. Hal. 9-321.

Demerec and Kaufmann. 1961. Drosophila Guide. Introduction to theGenetics and Cytology of Drosophila melanogaster. CarnegieInstitution of Washington, Washington D.C. Available as HTML helpfile.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 1995. FarmakopeIndonesia Edisi 4. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta. Hal. 381-382.

Esti S. 2002. Introduksi Reaksi Sel Terhadap Jejas. Dalam: Sudarto P,Sutisna H, Achmad T (editors). Buku Ajar Patologi I (Umum).Jakarta. Sagung Seto. Hal. 3-21.

Geisser P. and Burckhardt S. 2011. The Pharmacokinetics andPharmacodynamics of Iron Preparations. Pharmaceutics. 3. (1): 12-33.

Halliwel B dan Gutteridge JM. 1999. Free Radicals, Reactive Species AndToxicology. Dalam: Free Radicals In Biology And Medicine Third

46

edition. New York: Oxford University Press: 547-550.

Hasibuan, L. 2015. Peranan teknik polymerase chain reaction (pcr)terhadap perkembangan ilmu pengetahuan. Fakultas KedokteranUniversitas Sumatera Utara.

Husnul H., Purwatiningsih dan Kartika S. 2017. Deskripsi MorfologiDrosophila melanogaster Normal (Diptera:Drosophilidae Strain Sepiadan Plum. Jurnal Ilmu Dasar. 18. (1): 55-56.

Imlay, J.A., Chin S.M., Linn S. 1988. Toxic DNA Damage by HydrogenPeroxide Through the Fenton Reaction In Vivo and In Vitro. Science.240. (4852): 640-642.

Jiao Y., Wilkinson Jt., Christine Pietsch E., Buss JL., Wang W. 2006. Ironchelation in the biological activity of curcumin. Free Radic Biol Med40: 1152–1160.

Jimenez-Del-Rio M., Gusman-Martinez C., Velez-Pardo C. 2010. TheEffect of Polyphenols on Survival and Locomotor ActivityinDrosophila melanogaster Exposed to Iron and Paraquat. NeurochemRes 35: 227-238.

Joshua, C.P. 2017. Pengaruh FeSO4 Terhadap Lokomotor, Survival, danLevel mRNA SOD1 Drosophila melanogaster Sebagai PengembangModel In Vivo Untuk Penyakit Parkinson. Skripsi tidak diterbitkan.Makassar. Fakultas Farmasi. Universitas Hasanudin.

Khachik F, Carvalho L, Bernstein PS, Muir GJ, Da-You Zhao, Katz NB.2002. Chemistry, distribution and metabolism of tomato carotenoidsand their impact on human health. EBM. 227 (10) : 845-851.

King, R.C. 1962. Genetics. 2nd Edition. Oxford University Press, NewYork. Available as HTML help file.

Kurnani TB. 2001. Radikal Bebas Dalam Polutan Lingkungan. DalamSeminar Nasional Dan Lokakarya Penelitian Konsep Radikal BebasDan Peran Antioksidan Dalam Meningkatkan Kesehata MenujuIndonesia Sehat 2010. Bandung: pusat penelitian kesehatanlembaga penelitian UNPAD.

Kumar S. dan Kumar D. 2009. Antioxidant and radical scavengingactivities of edible weeds. African Journal of Food AgricultureNutrition and Development 9 : 1174-1190.

Lund E.K., Wharf S.G., Fairweather-Tait S.J., and Johnson I.T. 1999. Oralferrous sulfate supplements increase the free radical-generating

47

capacity of feces from healthy volunteers. The American Journal ofClinical Nutrition. 69. (2): 250–255.

Makker K, Agarwal A, and Sharma R. 2009. Oxidative Stress And MaleInfertility. Indian J Med Res. 129: 357-367.

Ming M, Guanhua L, Zhanhai Y, Guang C, Xuan Z. 2009. Effect of theLycium barbarum polysaccharides administration on blood lipidmetabolism and oxidative stress of mice fed high-fat diet in vivo.Food Chemistry. 113: 872–877.

Mulyati, M.A.S. 1985. Pengaruh Silang Dalam Terhadap Heritabilitas DanKeragaman Lebar Thorax, Jumlah Bulu Sternopleural Dan JumlahAnak Pada Lalat Buah. Skripsi tidak diterbitkan. Bogor. FakultasPeternakan Institut Pertanian Bogor.

Murray R.K., Granner D.K., and Rodwell V. W. 2008. Harpers IlustratedBiochemistry 27th ed. USA. McGraw-Hill Companies.

Natalina, Elly, Puji Rahayu, Sulistyowati dan Leenawaty L. 2009.Fotoproteksi Kurkumin terhadap β-Karoten pada Berbagai NisbahMolar serta Aktivitas Antioksidannya. Jurnal Natur Indonesia. 12. (1) :1.

Nolan, T., Hans, R.E., and Bustin., R.A. 2006. Quantification of mRNAUsing Real Time RT-PCR. Nature Protocol. 1. (3): 1559-1582.

Oktary A.P., Ridhwan M., dan Armi. 2015. Ekstrak Daun Kirinyuh(Eupatorium odoratum) dan Lalat Buah (Drosophila melanogaster).Serambi Akademica. 3. (2): 430

Panchal K. dan Tiwari, A.K. 2017. Drosophila melanogaster “a potentialmodel organism” for identification of pharmacological properties ofplants/plant-derived components. Biomedicine & Pharmacotherapy.89 : 1332

Saputri, A. Dan Nigrum, S.D.K., 2010. Pengeringan Kunyit MenggunakanMicrowave dan Oven. Skripsi tidak diterbitkan. Semarang. JurusanTeknik Kimia Fakultas Teknik.

Sardjiman. 2000. Synthesis of Some New Series of Curcumin Analogues,Anti-oxidative, anti-inflamatory, Antibacterial Activities andQualitative-Structure Activity Relationship. Disertasi tidak diterbitkan.Yogyakarta. Gadjah Mada University.

Sharma, R.A., Gescher, A.J., and Steward, W.P. 2005. Curcumin: Thestory so far. Eur. J. of Cancer. 41. (13): 1955–1968.

48

Shorrocks, B. 1972. Drosophila, Ginn and Company Limited. London. p.31-48; 71-76; 103-116. Available as HTML help file.

Strickberger, M.W. 1962. Experiments in Genetic with Drosophila. JohnWiley and Sons Inc, New York. Available as HTML help file.

Tandon VR, Verma S, Singh JB, Mahajan A. 2005. Antioxidants andcardiovascular health. JK Science. 7: 61-64.

Varhliou G and Storz P. 2010. Reactive Oxygen Species In Cancer. FreeRadical Research. 44 (5): 479–496

Wixon, J. dan O’Kane C. 2000. Featured Organism Drosophilamelanogaster. Yeast. 17: I46-147

Woodruff, R C., Phillips, J P., Hilliker, A J. 2004. Increased SpontaneousDNA Damage in Cu/Zn Superoxide Dismutase (SOD1) DeficientDrosophila. Genom. 47. (6):1029-1035

Yuniarti, N., Nugroho, P.A., Asyhar, A., Sardjiman, S., Ikawati, Z.,Istyastono, E.P. 2012. In vitro and in Silico Studies on Curcumin andits Analogues as Dual Inhibitors for Cyclooxygenase-1 (COX-1) andCyclooxygenase-2 (COX-2). Journal of Mathematic and FundamentalScience. 44. (1): 51-66

Yuniastuti, A., 2008. Gizi dan Kesehatan. Cetakan I. Graha Ilmu.Yogyakarta.

Yusuf, ZK. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek. 5 (6): 1-4

Yunanto A, Bambang S, dan Eko S. 2009. Kapita Selekta Biokimia : PeranRadikal Bebas Pada Intoksikasi dan Patobiologi Penyakit..Banjarmasin. Cetakan I. Pustaka Banua. Banjarmasin. p. 18-19.Available as PDF file.

Young, I.S. and Woodside, J.V. 2001. Antioxidants in Health and Disease.J Clin Pathol. 54 : 176-186

49

Lampiran 1. Skema Kerja

1. Skema Kerja Secara Umum

Drosophilamelanogaster

Pengumpulan & Analisis Data

Pembahasan Hasil

Pengambilan Kesimpulan

Uji level mRNA genSOD1

Uji level mRNA genSOD2

Analog Kurkumin

50

2. Analisis Level mRNA Superoksida Dismutase (SOD1 dan SOD2)

Time Point ditentukan dari hasil uji survival

5 ekor Drosophila melanogaster yang masihhidup dimasukkan ke dalam Treff tube

Haluskan dengan micropestle

RNA total dari 5 ekor lalat buah diekstraksimenggunakan reagen SV Total RNA

Isolation System

Mengukur level ekspresi gen SOD1 danSOD2 menggunakan real-time PCR

Analisis data dengan metode ComparativeQuantification menggunakan aplikasi Rotor

Gene Q (Qiagen)

Klp 2 Kontrol PositifDrosophila melanogasterKertas saring (FeSO415

mM), 25 jam pakan lalat +1 mg/g kurkumin

1 mg/g

Klp 1 Kontrol NegatifDrosophila melanogasterKertas saring (FeSO415

mM), 25 jam pindahkan kepakan lalat

Klp 5 Perlakuan 3Drosophila melanogasterKertas saring (FeSO415

mM), 25 jam pakan lalat +1 mg/g analog kurkumin


mM), 25 jam pakan lalat +0,5 mg/g analog kurkumin


mM), 25 jam pakan lalat +0,25 mg/g analog kurkumin

Analisis statistik dengan metode One WayAnova menggunakan aplikasi Graph Pad

Prism®7

51

Lampiran 2. Perhitungan

Pembuatan larutan FeSO4 15 mM (BM FeSO4 = 151,9)

mM = mg = × ×FeSO4 = 15 × 151,9 × 0,05

= 114 mg (di ad dengan larutan glukosa 1 % hingga 50 ml)

52

Lampiran 3. Komposisi Flyfood (Pakan) Drosophila melanogaster

Komposisi pakan Drosophila melanogaster untuk 1 liter:

1. Corn meal : 75 g

2. Gula Pasir : 45 g

3. Yeast (ragi) : 25 g

4. Agar : 9 g

5. Air steril : ad 1 liter

6. Metil Paraben : 4,3 ml (15 % dalam 5 ml = x 5 = 0,75 g)

7. Asam propionat : 3,8 ml

53

Lampiran 4. Gambar Penelitian

Gambar 11. Uji survivalGambar 12. Proses persiapan

ekstraksi RNA

Gambar 14. Proses Heatingblocksuhu 70oC selama 3 menitGambar 13. Penghalusan Drosophila

menggunakan micropastle

Gambar 15. Proses sentrifugeselama 10 menit dengan kecepatan

14.000 G, 4 oC

Gambar 16. Proses penambahangen

54

Gambar 17. Pengukuran levelekspresi gen menggunakan RT- PCR

55

Lampiran 5. Hasil Preliminary Study (Uji Survival)

Gambar 18. Grafik hasil pengujian survival Drosophila melanogaster

iiidigilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/digital...melanogaster yang diinduksi fes04 andi...

Documents