1 fundamentos de espectrometría de masa biológica matías möller lab. fisicoquímica biológica...
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Fundamentos de Espectrometría de Masa
Biológica
Matías Möller
Lab. Fisicoquímica BiológicaInstituto de Química BiológicaFacultad de CienciasUniversidad de la República
8 de mayo de 2014
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Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed.
Cap. 15.
J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.
Introduction to proteomics, Liebler, 2002.
Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap.
3
3
1- Generalidades
2- MALDI-TOF
3- ESI-Q
4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS
Espectrometría de masa
4
1- Generalidades
Espectrometría de masa
5
Técnica que permite laseparación y determinación de
la relación masa/carga de iones gaseosos
Espectrometría de masa
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Espectrometría de masa
Espectrometría ≠ Espectroscopía(Medición de un rango) (implica absorción o
emisión de energía radiante)
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Espectrometría de masa
Determinación de masa y/o composición:
Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares
Polisacáridos, oligosacáridos
Lípidos Lipidoma
Fragmentos de ácidos nucleicos
Técnica muy sensible:puede analizar mg-ng (y menos) de material
Espectrometría de masa de Biomoléculas
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Espectrometría de masa
Determinación de masa y/o composición
Identificación por comparación con bases de datos
(peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos
Modificaciones postraduccionales
Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínasInteracción con compuestos de bajo PM
Plegamiento
Niveles de expresión/modificación posttraduccional
Espectrometría de masa de Proteínas
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Gel 2D de hígado humano
http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/
Masa (definiciones)
• Se determina m/z
• q = ±ze , e = 1.6022 x 10-19 coulomb
• z siempre es un integral positivo
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Masa• Todas las moléculas tienen una composición química
única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones)
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C13
6 C14
6C12
6C6
12.011
12
Elemento Masa %1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.01512C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02
79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31
Carlos Cerveñansky
Masa
• La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1%
• Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes
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• Ejemplo:
12C (98.9%) y 13C (1.1%)
En Buckminsterfullereno (C60)
La probabilidad que todos los átomos sean 12C:
P = (0.989)60 = 0.515
14
Masa
15
Masa
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Masa
Masa: definiciones• Masa molecular se mide en unidades de masa
atómica unificadas (u)• u = m(12C) /12 = 1.6605402 × 10-27 kg
(u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora -2009- arcaico)
• Peso atómico: promedio por composición isotópica → Peso molecular
• Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero
• Masa más abundante• Masa promedio 17
18
Carlos Cerveñansky
Masa: definiciones
19
Masa: definiciones
20
Una sola carga:Delta = 1.0 amu
Delta = 1.0 amu
520 521 522 523 524 525 526 527 528 5290
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
524.3
525.3
526.2
Delta = 1.0 amu
Determinación del número de cargas (z)
m/z
21
Dos cargas:Delta = 0.5 amu
Delta = 0.5 amu
258 259 260 261 262 263 264 265 266 2670
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
262.6
263.1
263.6
Delta = 0.5 amu
m/z
Determinación del número de cargas (z)
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Espectrometría de masa de proteínas
37 kDa
37136 amu
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Los Iones son importantes
Espectrometría de masa
[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-
De la unión de iones especialmente a moléculas quecontienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)
[M+H]+ o [M-H]-
De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)
En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z:
[M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)
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Espectrometría de masa
M(péptido) = 1162 Da
Modo positivo Modo negativo
m = +1 +23 +39 -1
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Espectrómetro de masa
Espectrometría de masa
Entrada:Volatilización/
Ionización
AltoVacío
Analizadorde masas
Detector
Muestra
MALDIESI
TOFCuadrupolo
Tampa de IonesFTICR
OrbitrapSector Magnético
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¿Cómo volatilizar una proteína?
Espectrometría de masa
Premio Nobel de Química 2002
Fenn (1988)- ESI: Electrospray IonizationTanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization
Sin Premio:Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)
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Espectrómetros de masa
(configuraciones para grandes biomoléculas)
Espectrometría de masa
MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight
ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole
ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap
FT-MS: ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance
Orbitrap: ESI-orbitrap
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2- MALDI-TOF
Espectrometría de masa
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Ionización por MALDI:
Espectrometría de masa
(Matrix assisted Laser desorption/ionization)(Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz)
Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbeenergía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:
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Ionización por MALDI:
Espectrometría de masa
La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador.
El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.
Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Matriz: acidos aromaticos
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Espectrometría de masa
4HCCA
DHBA
SA
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdoa su “tiempo de vuelo”(t).
t (m/z)1/2
las partículas con menor m/z llegan antes al detector
No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte unaenergía cinética:
Ek = zeEs
donde s es la distancia de la región de la fuente.
Fuente Detector
+
E+ -
s D
+
35
MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo.
Ek = zeEs = ½mv2 v = (2zeEs/m)½
Fuente Detector
Fig. Separación por TOF
+ + +
E+ -
s D
+
Sin E, iones a la deriva
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma Ek,
v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D
m/z = 2eEs(t/D)2
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½
t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2
Fuente
Sin E, iones a la deriva
Detector
Fig. Separación por TOF
+ + +
E+ -
s D
+
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Tubo de vuelo
Detector
4-25 kV
Espectrometría de masa
Carlos Cerveñansky
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Tubo de vuelo
Detector
4-25 kV
Espectrometría de masa
Carlos Cerveñansky
Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Generalmente se observa la especie monocargada (M+H)+
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM
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MALDI-TOF
Espectrometría de masa
Se pueden estudiar masas en un amplio rango
43
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z )
0
3222.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
yVoyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)
1672.92
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z )
0
1.6E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sit
y
Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918
Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)
Resolución en MALDI-TOF
Carlos Cerveñansky
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3- ESI-MS
Espectrometría de masa
N2
45
ESI
Espectrometría de masa
ElectroSpray Ionization
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2
(gas secante).
El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray)
N2
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ESI
Espectrometría de masa
ElectroSpray Ionization
Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador
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ESI-Q
Espectrometría de masa
Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones deun pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados.
Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas
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ESI-Q
Espectrometría de masa
Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral
Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000
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Espectrometría de masa
Trampa de iones
Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”.
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ESI-MS
Espectrometría de masa
La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones
m/z = (M+n)/n
Donde n es el número de protones (masa = 1.0078 u, ~ 1)
ESI y carga
Substance P
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
Da/e0
100
%
674.7
666.1600.4462.8
685.7
693.6 1347.7
[M+2H]2 +
[M+H] +
52
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
10+9+
11+
13+
12+
14+
10+9+
11+
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ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
10+9+
11+
13+
12+
14+
10+9+
11+
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ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x2-1)/(x1-x2)
n = (1084.1-1) / 72.1 = 15M = (1156.2 x 15) -15 = 17328
n+
(n+1)+
55
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo
56
ESI-MS
Espectrometría de masa
Deconvolución del espectro
Bajo PM
Alto PM
57
ESI-MS
Espectrometría de masa
Resolución de varias especies
58
Espectrometría de masa
Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Cyt C
59
Comparación
Espectrometría de masa
MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT)Cargas/ion Pocas, en general
1Muchas
Rango de m/z 50000 3000
Rango de masas
200.000 70.000
Interacciones no covalentes
No Si
MS/MS limitado, PSD Si, CID
Acoplar LC No Si
Tolerancia a contaminantes
Si No
60
Conclusión
Espectrometría de masa
Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución
La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas
Continuará…
61
62
Seroalbúmina humana
+45
+44
+47+46
+49+48
+51+50
+52+54+53
+56+55
Lucía Turell
63
66300 66400 66500 66600
0
2x106
4x106
6x106
8x106
66469
66453
Inte
nsid
ad r
elat
iva
Masa (Da)
66437
Seroalbúmina humana
Lucía Turell