17 chin j appl environ biol=issn 1006-687x 乙酰辅酶a羧化酶:脂肪酸 … · 5 期...

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2011-10-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00753 应用与环境生物学报 2011 17 ( 5 ): 753~758 Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase ACC )(EC 6.4.1.2 )是催化脂肪酸合成代谢第一步反应的限速酶,在 ATP供能、 Mg 2+ 存 在下,以HCO 3 - 为羧基供体,将乙酰辅酶A 羧化生成丙二酰单酰辅酶A,是生物素依赖性酶. 在人类和 其它哺乳动物中该酶属于组织特异性酶,存在两种基因形 ACC1ACC2,其中ACC2具有阻断治疗肥胖症、糖尿病和 其它代谢病的活性位点 [1] ,受到广泛关注. 在禾本科植物中 ACC被发现是几类化学除草剂作用于植物的靶蛋白 [2] ,因此 对植物ACC的研究大多数集中在除草剂筛选和作用机理研 究方面. 此 外, ACC基因在逐渐兴起的转基因油料作物和生 物柴油的研究中也处于重要地位,但由于ACC分布和基因组 织形式的复杂性,目前这方面的研究仍处于瓶颈阶段. 本文 除系统介绍ACC的结构与分类,生物学作用与应用, ACC抑制剂类型与作用机理外,还重点介绍ACC基因克隆与基因 工程应用的最新进展. 1 ACC的结构与分类 ACC存在于大多数生物组织中,包括细菌、古菌、真菌、 酵母、植物、动物和人类. ACC第一大类为多亚基型ACC即异质型,存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植 物的质体中 [3] . Escherichia coliACC是第一类中的典型代 表,由4个亚基组成,即生物素羧化酶(B�ot� carboxylase �ot� carboxylase乙酰辅酶A羧化酶:脂肪酸代谢的关键酶及 其基因克隆研究进展 * 李洁琼 郑世学 ** 喻子牛 张吉斌 (华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室 武汉 430070) Acetyl-coenzyme A Carboxylase: A Key Metabolic Enzyme of Fatty Acid and Progress of Its Gene Clone * LI J�eq�og, ZHENG Sh�xue ** , YU Z��u & ZHANG J�b�g (State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuha 430070, Ch�a) Abstract Acetyl-coe�y�e A carboxylases (ACCs) ha�e cruc�al roles � �atty ac�etabol�s�ost l�g orga�s�s. I Acetyl-coe�y�e A carboxylases (ACCs) ha�e cruc�al roles � �atty ac�etabol�s�ost l�g orga�s�s. I th�s art�cle, structure, types, �uct�os a �h�b�tors o� ACC, as well as research status o� ACC gee cloe are syste�at�cally �scusse. ACC �s a �ult�-subu�t e�y�e �ost prokaryotes, whereas �t �s a large, �ult�-o�a� e�y�e �ost eukaryotes. I a�t�o, there are two spec�al types �ou �roStreptomyces coelicolor a Metallosphaera sedula. All o� these types cotathree key o�a�s: B�ot� carboxylase (BC), b�ot� carboxyl carr�er prote� (BCCP) a carboxyltras�erase (CT). CT o�a�, as a ca�ate target, has bee w�ely use �or scree�g o� plat herb�c�es a rug e�elop�et aga�st obes�ty, �abetes a other symptoms of the metabolic syndrome. The gene encoded ACC is also becoming an important target gene applied in the fields of trasge�c o�l plats a b�o�esel. Pre�ous stu�es showe that β-CT � plat plas� was the l��t �actor o� hetero�er�c ACC, a BCCP was a egat��e regulator o� �atty ac� sythes�s. L�p� sythes�s �etabol�s�s a �ery co�plex etwork, espec�ally �eeback �h�b�t�o �echa�s� ex�sts � �t. As a result, clo�g a express�o o� ACC gee �ay �crease the act��ty o� ACC the host, but ot ecessar�ly coul ob�ously pro�ote the accu�ulat�o o� �atty ac�. F�g 2, Re� 52 Keywords acetyl-coe�y�e A carboxylases; �atty ac�etabol�s�; �uct�o o�a�; �h�b�tor; gee clo�g CLC Q55 + Q78 乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylaseACC )在脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用. 系统介绍 了该酶的结构与分类、生物学作用与应用、抑制剂的类型与作用机理以及基因克隆4个方面的进展. ACC在大多数原 核生物中为多亚基型酶,而在大多数真核生物中为多功能型单亚基酶,在天蓝色链霉菌和古菌勤奋金属球菌中为另 外两种特殊类型;但都具备3个关键的功能域,即生物素羧化酶(BC )、生物素羧基载体蛋白(BCCP )和羧基转移酶 CT . CT功能域作为潜在的靶标广泛应用于植物除草剂的筛选和哺乳动物肥胖、糖尿病等代谢疾病的药物设计中. ACC基因也成为转基因油料作物和生物柴油研究中重要的靶标基因. 研究表明,植物质体中的β-CT亚基是多亚基型 ACC的限制因子,而BCCP是脂肪酸合成的负调控因子. 油脂的合成代谢十分复杂,且存在反馈抑制机制,因此克隆和 表达ACC基因可以提高宿主中ACC的活性,但不一定能显著促进脂肪酸的积累. 2 52 关键 乙酰辅酶A羧化酶;脂肪酸代谢;功能域;抑制剂;基因克隆 CLC Q55 + Q78 收稿日期: 2011-03-22 接受日期: 2011-04-01 *国家转基因生物新品种培育科技重大专项课题(No. 2009ZX08009- 120B )资助 Supporte by the Nat�oal Sc�ece & Techology �ey Pro�ect & Techology �ey Pro�ect o� Ch�a o GMO Cult��at�o �or New Var�et�es (No. 2009ZX08009-120B) **通讯作者 Correspo�g author ( E-�a�l: �hegsx�a�l.h�au.eu.c ) Correspo�g author ( E-�a�l: �hegsx�a�l.h�au.eu.c )

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Page 1: 17 Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 乙酰辅酶A羧化酶:脂肪酸 … · 5 期 李洁琼等:乙酰辅酶A羧化酶:脂肪酸代谢的关键酶及其基因克隆研究进展

2011-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00753

应用与环境生物学报 2011,17 ( 5 ): 753~758Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)(EC 6.4.1.2)是 催化 脂肪酸合成代 谢 第一步反 应的限 速酶,在

ATP供能、Mg2+存在下,以HCO3-为羧基供体,将乙酰辅酶A

羧化生成丙二酰单酰辅酶A,是生物素依赖性酶 . 在人类和

其它哺乳动物中该酶属于组织特异性酶,存在两种基因形

式ACC1和ACC2,其中ACC2具有阻断治疗肥胖症、糖尿病和

其它代谢病的活性位点 [1],受到广泛关注. 在禾本科植物中ACC被发现是几类化学除草剂作用于植物的靶蛋白[2],因此

对植物ACC的研究大多数集中在除草剂筛选和作用机理研

究方面. 此外,ACC基因在逐渐兴起的转基因油料作物和生

物柴油的研究中也处于重要地位,但由于ACC分布和基因组

织形式的复杂性,目前这方面的研究仍处于瓶颈阶段 . 本文

除系统介绍ACC的结构与分类,生物学作用与应用,ACC的

抑制剂类型与作用机理外,还重点介绍ACC基因克隆与基因

工程应用的最新进展.

1 ACC的结构与分类ACC存在于大多数生物组织中,包括细菌、古菌、真菌、

酵母、植物、动物和人类. ACC第一大类为多亚基型ACC,

即异质型,存在于细菌、双子叶植物和非禾 本 科单子叶植

物的质体中 [3]. Escherichia coli的ACC是第一类中的典型代

表,由4个亚基组成,即生物素羧化酶(B�ot��� carboxylase�ot��� carboxylase,

乙酰辅酶A羧化酶:脂肪酸代谢的关键酶及其基因克隆研究进展*

李洁琼 郑世学** 喻子牛 张吉斌 (华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室 武汉 430070)

Acetyl-coenzyme A Carboxylase: A Key Metabolic Enzyme of Fatty Acid and Progress of Its Gene Clone*

LI J�eq�o��g, ZHENG Sh�xue**, YU Z����u & ZHANG J�b���g(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuha�� 430070, Ch���a)

Abstract Acetyl-coe���y�e A carboxylases (ACCs) ha�e cruc�al roles ��� �atty ac��� �etabol�s� ��� �ost l�����g orga���s�s. I��Acetyl-coe���y�e A carboxylases (ACCs) ha�e cruc�al roles ��� �atty ac��� �etabol�s� ��� �ost l�����g orga���s�s. I�� th�s art�cle, structure, types, �u��ct�o��s a���� ���h�b�tors o� ACC, as well as research status o� ACC ge��e clo��e are syste�at�cally ���scusse��. ACC �s a �ult�-subu���t e���y�e ��� �ost prokaryotes, whereas �t �s a large, �ult�-��o�a��� e���y�e ��� �ost eukaryotes. I�� a�����t�o��, there are two spec�al types �ou���� �ro� Streptomyces coelicolor a���� Metallosphaera sedula. All o� these types co��ta��� three key ��o�a���s: B�ot��� carboxylase (BC), b�ot��� carboxyl carr�er prote��� (BCCP) a���� carboxyltra��s�erase (CT). CT ��o�a���, as a ca�������ate target, has bee�� w���ely use�� �or scree�����g o� pla��t herb�c���es a���� ��rug ��e�elop�e��t aga���st obes�ty, ���abetes a���� other symptoms of the metabolic syndrome. The gene encoded ACC is also becoming an important target gene applied in the fields of tra��sge���c o�l pla��ts a���� b�o���esel. Pre��ous stu���es showe�� that β-CT ��� pla��t plas���� was the l���t �actor o� hetero�er�c ACC, a���� BCCP was a ��egat��e regulator o� �atty ac��� sy��thes�s. L�p��� sy��thes�s �etabol�s� �s a �ery co�plex ��etwork, espec�ally �ee��back ���h�b�t�o�� �echa���s� ex�sts ��� �t. As a result, clo�����g a���� express�o�� o� ACC ge��e �ay ���crease the act���ty o� ACC ��� the host, but ��ot ��ecessar�ly coul�� ob��ously pro�ote the accu�ulat�o�� o� �atty ac���. F�g 2, Re� 52Keywords acetyl-coe���y�e A carboxylases; �atty ac��� �etabol�s�; �u��ct�o�� ��o�a���; ���h�b�tor; ge��e clo�����gCLC Q55 + Q78

摘 要 乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用. 系统介绍

了该酶的结构与分类、生物学作用与应用、抑制剂的类型与作用机理以及基因克隆4个方面的进展. ACC在大多数原

核生物中为多亚基型酶,而在大多数真核生物中为多功能型单亚基酶,在天蓝色链霉菌和古菌勤奋金属球菌中为另

外两种特殊类型;但都具备3个关键的功能域,即生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶

(CT). CT功能域作为潜在的靶标广泛应用于植物除草剂的筛选和哺乳动物肥胖、糖尿病等代谢疾病的药物设计中. ACC基因也成为转基因油料作物和生物柴油研究中重要的靶标基因. 研究表明,植物质体中的β-CT亚基是多亚基型

ACC的限制因子,而BCCP是脂肪酸合成的负调控因子. 油脂的合成代谢十分复杂,且存在反馈抑制机制,因此克隆和

表达ACC基因可以提高宿主中ACC的活性,但不一定能显著促进脂肪酸的积累. 图2 参52关键词� 乙酰辅酶A羧化酶;脂肪酸代谢;功能域;抑制剂;基因克隆CLC Q55 + Q78

收稿日期:2011-03-22 接受日期:2011-04-01 *国家转基因生物新品种培育科 技重大专项课题(No. 2009ZX08009-120B)资助 Supporte�� by the Nat�o��al Sc�e��ce & Tech��ology �ey Pro�ect& Tech��ology �ey Pro�ect o� Ch���a o�� GMO Cult��at�o�� �or New Var�et�es (No. 2009ZX08009-120B)**通讯作者 Correspo�������g author ( E-�a�l: �he��gsx��a�l.h�au.e��u.c�� )Correspo�������g author ( E-�a�l: �he��gsx��a�l.h�au.e��u.c�� )

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BC)、生物素羧基载体蛋白(B�ot��� carboxyl carr�er prote����ot��� carboxyl carr�er prote���,

BCCP)以及羧基转移酶(Carboxyltra��s�erasearboxyltra��s�erase,CT)的2个亚

基α-CT 和β-CT. 这些亚基结合在一起形成ACC全酶,可能以(BC)2(BCCP)4(CTα,CTβ)2形式存在,但全酶很不稳定,易解

离成各种不同的形式[4]. 第二大类ACC为多功能型ACC,即同质型,人类和大多

数真核生物的ACC属于这一类. 此类ACC单体的相对分子质

量在200×103以上,BC、BCCP、CT 功能域依次存在于一条多

肽链上 [5],此外在各个功能域之间还存在一些真核生物特有

的肽段,占总肽链长约1/3,功能尚不清楚. 人类有两类ACC:

相对分子质量为265×103的ACC1,存在于大多数脂肪组织(肝

脏、脂肪质)中,催化长链脂肪酸合成的限速反应;相对分子

质量为280×103的ACC2,分布在心脏、肌肉组织中,催化脂肪

酸的氧化. 两类酶由独立的基因编码,ACC1基因位于染色体17q12 上,ACC2基因位于染色体12q23上,ACC1和ACC2总的

氨基酸序列相似性达76%,ACC2比ACC1 在N端多出约140个

氨基酸,这些氨基酸序列促进ACC2锚定在线粒体外膜上 [6]. 植物细胞质中ACC为同质型,但ACC在植物中的分类与定位

存在两种特殊情况,如油菜的叶绿体中同时含有第一类和第

二类ACC [7~8],而禾本科植物的质体和胞质中ACC均属于第二

类 [9]. 此外,在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)[10]和

图1 ACC的分类(A,根据文献[13]修改)及同质型ACC的系统发育树分析(B)Fig. 1 Types of ACC (A, modified according to Ref [13]) and phylogenetic analysis of homomeric ACC(B)

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谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)[11]1]]中发现的ACC由α和β两个亚基组成,α亚基包含BC和BCCP两个功能

域,β亚基包含CT功能域,此为第三类ACC. 第四类ACC从古

细菌Metallosphaera sedula中发现 [12],与异质型ACC不同之处

为CT由一个亚基组成. ACC的结构与分类见图1所示.

2 ACC的生物学作用与应用ACC催化丙二酰单酰辅酶A的生成,产物丙二酰单酰辅

酶A可以用于不同的代谢反应过程. ACC既是脂肪酸合成的

关键酶又是限速酶,对于大多数生物来说它是一个必需酶 . 在酵母中ACC缺失对生物组织是致死的,但缺失脂肪酸合酶

(FAS),只要在培养基中添加必需脂肪酸依然可以存活[14].

2.1 动物组织中ACC的功能与应用动物组织中存在两种类型的ACC,催化两个相反的代谢

反应. ACC1定位于胞质中,催化长链脂肪酸的合成,ACC2定

位于线粒体膜上,催化脂肪酸的氧化,ACC2催化形成的产物

丙二酰单酰辅酶A是脂肪酸氧化的抑制剂 [15]5]],见图2-A. 这一

功能在ACC2缺失的小鼠中获得了证实 [16]. ACC2缺失的小鼠

进食量加大而体重急剧下降,能有效地抵制食物诱导性肥

胖. 同时,这些小鼠也能抵制由高碳水化化合物食物引起的

糖尿病. 因此,ACC2 具有作为治疗肥胖症和糖尿病靶点的

潜在应用价值.

2.2 植物组织中ACC的功能与应用在植物质体中的ACC对于脂肪酸的合成具有重要的作

用. 植物不能长距离运输脂肪酸,因此必须定点合成. 质体中

的ACC为异质型,相反禾本科植物质体中ACC为同质型,针

对这一点可以设计杂草敏感而对其它作物无影响的特异性除

草剂[17~18]. 而植物胞质中的ACC为同质型,其催化产生的丙二

酰单酰辅酶A是长链脂肪酸、黄酮、花青素等次生代谢产物

合成的基本底物[5],见图2-B.2.3 微生物组织中ACC的功能与应用

近年来随着化学燃料的不断减少,利用生物组织合成生

物能源的方法备受关注. 由于很多油脂微生物产油量极高,

人们广泛利用油脂微生物,如酵母、真菌等作为单细胞油脂

加工厂[19~20]. 同时随着基因工程的兴起,人们可以将油脂微生

物中优良的ACC基因克隆到油菜、大豆等油料作物中,从而

提高油料作物油脂的品质和含量[21].

3 ACC抑制剂及机理3.1 动物ACC抑制剂及作用机理

哺乳动物脂肪酸合成过程中产生的长链酰基辅酶A不

能直接穿过线粒体膜进行脂肪酸的氧化,必须先转变为酰

基肉毒碱从而转运到线粒体中进行β氧化 [22],催化此反应的

酶为肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPT-Ⅰ),由),由ACC2产生的丙二

酰单酰辅酶A是 CPT-1的抑制剂,从而可以有效抑制β氧化[13]. 化合物CP-640186能降低组织中丙二酰单酰辅酶A的水平,从而抑制了脂肪酸的合成同时促进了脂肪酸的氧化 . 在兔子、老鼠等被试的动物中CP-640186可以降低脂肪酸总量和体重,并提高胰岛素的敏感性,因此这类抑制剂可以用来治疗肥胖、糖尿病及其他代谢病. 抑制ACC2催进脂肪酸氧化

图2 动物(A)和植物(B)乙酰辅酶A羧化酶功能代谢图F�g. 2 Metabol�c �u��ct�o�� o� a����al ACC (A) a���� pla��t ACC (B)

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是成功治疗这些代谢疾病的关键,近年来并未研究清楚是否同时抑制ACC1也是治疗这些疾病所必须的条件. 化合物CP-640186对两类酶没有选择特异性,证明非选择性抑制剂

是可行的[23 ]. 3.2 植物除草剂及作用机理

芳氧苯氧基丙酸类(APPs)和环己烯酮类(CHDs)化合物是禾本科植物质体ACC的两类可逆抑制剂,两类化合物主要作用于禾本科植物质体ACC的CT功能域,通过抑制CT的活性从而阻断脂肪酸的合成导致杂草的死亡 [24]. Zha��g等通过对酵母CT晶体结构的研究表明CT功能域结构包括N、C两个亚功能区,酵母CT功能域在溶液中以二聚体形式存在,两个单体以头-尾形式排列,CT功能域活性位点位于二聚体的分界面[25~26]. APPs类除草剂Haloxy�op结合在二聚体分界面,动力学研究表明Haloxy�op是酵母CT功能域底物丙二酰单酰辅酶A的一个竞争性抑制剂,而CHDs类除草剂与酵母CT功能域的作用模式的研究尚未获得成功. 随着除草剂的长期使用,很多杂草产生了耐药性. 目前已经发现一些位点的氨基酸与除草剂的敏感性有关 [27~29],如定点突变 Ile→Leu(相当于酵母ACC第1 705个残基处)或Asp→Gly(相当于酵母ACC第2 004个残基处)能使杂草同时获得上述两类除草剂的抗性,定点突变Ile→Asn(相当于酵母ACC第1 967个残基处)或同时发生Trp→Cys 和Gly→Ala(相当于酵母ACC第1 953和2 022个残基处)突变只能使杂草获得APPs抗性而对CHDs依旧

敏感. 3.3 其它类型ACC抑制剂及作用机理

大环内酯类化合物Soraphe�� A是在土壤中存在的粘细菌Sorangium cellulosum分泌的一种天然杀真菌剂. 它是真核ACC BC功能域的有效抑制剂但对原核BC亚基没有作用 [30]. 研究表明Soraphe�� A主要是通过阻碍BC形成二聚体或多聚体形式来抑制ACC的活性,She��等人提出了Soraphe�� A作用的另一种机制:Soraphe�� A与BC功能域结合后可能会抑制它与多功能ACC的其它亚基相互作用[31]. 在大肠杆菌中BC亚基晶体结构上没有Soraphe�� A的结合位点,因此大肠杆菌ACC的BC亚基不受Soraphe�� A抑制. 在细菌中,可以通过抑制脂肪酸的生物合成的方法发现新的抗生素. 最近报道了一种新的细菌ACC CT亚基的抑制剂Mo�ra����e B [32]. 它是一种与底物乙酰辅酶A竞争的天然产物,只对异质型ACC起作用.

4 ACC基因的克隆及基因工程研究进展ACC主要分为多亚基型和多功能型两大类,由此造成

ACC两类基因的巨大差异. 目前克隆获得的ACC基因大多数

为多亚基型ACC的亚基基因,而克隆获得的多功能型ACC基因资源有限,主要原因是多功能型ACC基因编码序列长7 kb 左右,由于PCR技术或构建cDNA文库的方法都受到Taq酶和反转录酶 合成性能的限制,很 难一次性扩增获得它的全 长cDNA序列. M�yah�sa等从C. glutamicum中克隆获得了第三类ACC的两个亚基基因,并在大肠杆菌中实现了重组表达,证

明过表达异源的ACC基因可以提高ACC活性,从而提高胞内丙二酰单酰辅酶A含量,促进次级代谢产物类黄酮的积累[33]. 4.1 异质型ACC基因克隆及基因工程研究进展

已报道大肠杆菌(BC、BCCP、α-CT、β-CT Ge��eBa��k ID依次为:M80458;M80458;D83436;M68934)、拟南芥

(Ge��eBa��k ID:U90874;U62029;AF056970;AB029556)、大 豆(Ge��eBa��k ID:AF007100、AF068249;U40666;U34392、U40979;AF056971)、麻风树[34]这4个物种多亚基型ACC的4个亚基全部被克隆出来,而且很多研究者也从其它

植物和细菌中克隆得到了ACC部分亚基的基因信息,包括棉花 [35]、棕榈 [36]、古硫化嗜热菌[37]、深海泉古菌[38]、分枝杆菌[39]

等. 由于多亚基型ACC在脂肪酸合成中发挥着重要作用,许多研究者利用基因工程手段对该酶及各个亚基在脂肪酸合成中的作用展开了深入的研究. Da��s等 [21]构建了一个细菌多顺反子,即把噬菌体T7强启动子和大肠杆菌ACC的4个亚基编码基因accB、accC、accD和accA连接,转化大肠杆菌后,脂肪酸含量增长了6倍. Me��g等从Acinetobacter calcoaceticus中克隆了ACC的4个亚 基编码 基因在大 肠杆菌中实现共表达,重组菌株的脂肪酸含量较野生型提高了5.6倍 [20]. Ma��oka等 [40]、�o��e等 [41]及Al�sa等 [36]分别采用超量表达和基因敲除等技术方法研究了accD基因的功能,证明了accD 基因编码的β-CT亚基是多亚基型ACC的限制因子,在植物质体ACC活性和植物种子含油量中起着重要的作用. Fer�a Bourrell�er等证明过表达的BCCP蛋白通过与PⅡ的相互作用抑制ACC活性 [42]. 由于对植物异质型ACC基因进行基因工程操作时需要使4个亚基编码基因同时表达、定位于质体再组装成活性蛋白,难度很大,因此目前还没有4个亚基基因同时在植物中进行转化的报道. 4.2 同质型ACC基因克隆及基因工程研究进展

同质型ACC基因的编码区长约7 kb,且表达丰度不高. 因此很难一次性扩增获得它的全长序列. 目前采用的克隆方法主要有4种:染色体步移、RACE、重叠PCR和SOE-PCR. 前两种方法主要针对序列未发表的基因的克隆,后两种方法应用于序列已知的基因克隆. 胡亚平等采用重叠PCR技术成功克隆了拟南芥同质型ACC基因,并构建了植物表达载体 [43]. 目前植物中已有拟南芥(Ge��eBa��k登录号L27074、D34630)、苜蓿(Ge��eBa��k登录号L25042)、大 豆(Ge��eBa��k登录号L42814)、油菜(Ge��eBa��k登录号X77576)、玉米(Ge��eBa��k登 录 号 U19183)、小 麦(G e ��eBa �� k登 录 号A F029895、U10187)、野生燕麦(Ge��eBa��k登录号AF231336)、意大利

黑麦草(Ge��eBa��k登录号AF325710)等的同质型ACC基因全长序列获得了克隆. 在哺乳动物中人类的两类ACC研究得比较清楚 . Che��g等成功克隆、表达了人类的ACC1和ACC2 [44],�aush�k 等研究了人类ACC2重组蛋白的动力学性质[45],Ca�pa研究小组最新研究证明脂肪酸合成代谢中的限速酶ACC及脂肪酸合酶的上调作用可能会促使前列腺癌的发生[46].

ACC作为脂肪酸合成的限速酶而成为转基因油料作物

工程的研究重点. 在酵母、霉菌、藻类中,某些产油种属能积累占其生物总量70% 以上的油脂,其中主要为甘油三酯,约占80%以上,磷脂约占10%以上 [19 ]. 因此,除了上述对植物质体ACC与产油量的关系进行的大量研究外,很多研究者也对产油微生物和藻类的ACC进行了研究. Rue��wa�等成功克隆了Mucor rouxii的ACC基因,将其转化到非油脂酵母Hansenula polymorpha中,总油脂含量提高了40% [47]. 而微藻脂类代谢

中有关 ACC的调控研究主要在美国进行. 美国再 生能源国家实验室(Nat�o��al Re��ewable E��ergy Laboratory,NREL)于1991年开展了有关基因工程构建高油微藻的工作. Roessler和

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7575 期 李洁琼等:乙酰辅酶A羧化酶:脂肪酸代谢的关键酶及其基因克隆研究进展

Ohlrogge首先从硅藻中克隆了ACC基因,该基因经修饰后转化到硅藻中,使ACC基因过量表达,以期增加ACC活性,促进油脂积累[48 ]. ACC活性虽然提高了,但可能由于反馈抑制等原因,脂质含量未见明显增加 [49]. 后来美国能源部因为经费问题停止资助这一项目. 近年来微藻ACC与脂肪酸合成调控的研究进展缓慢. 宋东辉研究小组成功克隆了蓝藻脂肪酸合成途径中的ACC基因,构建了穿梭表达载体,正在进行ACC 调控微藻脂肪酸合成能力的研究,目前正在筛选转化ACC基因的丝状体微藻 [50].

5 讨 论ACC作为脂肪酸合成中重要的限速酶,在农业中获得了

广泛的研究和应用. 利用禾本科植物质体中ACC的CT功能域设计筛选特异性除草剂的研究已经十分系统和深入. 然而在运用基因工程技术提高油料作物含油量的研究方面进展有限,主要存在3方面的原因:第一,原核型ACC有4个亚基,对这些亚基同时进行表达定位于质体并组装成一种有活性的结构难度很大 . 第二,真核型ACC虽然由单亚基组成,但编码区域序列普遍在7 kb左右,增加了基因克隆的难度,而且外源基因片段越大,转化植物成功的概率越低. 目前克隆同质型ACC基因最为有效的方法是将长片段分为几个小段分别扩增,再利用重叠PCR逐个拼接起来. 第三,反馈抑制作用的影响. 油脂的合成是一个复杂的代谢过程,由多个基因协同控制,而且脂肪酸合成代谢还与其它代谢网络之间密切关联. Da��s等提出磷脂合成和脂肪酸合成是共调节的,当磷脂合成速率低于脂肪酸合成的速率时,由此导致的酰基 -酰基载体蛋白(Acyl-ACPs)的累积会反馈抑制ACC [51]. 此外,脂肪酸的合成还和蛋白质的合成相关联,两个代谢过程利用同一底物,即糖酵解产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEG). PEG在丙酮酸激酶作用下转化为丙酮酸,丙酮酸生成乙酰辅酶A后在ACCase作用下进入脂肪酸合成途径,而PEPCase催化丙酮酸合成草酰乙酸进入蛋白质代谢. �ub�s等第一次通过体外试验证明PEP来源的碳源占油菜质体中合成脂肪酸的碳积累量的1/3 [52]. 因此这2种酶的相对活性也是油脂合成途径的一个关键调控点.

哺乳动物ACC2被证实可以作为治疗肥胖、糖尿病等代谢疾病的活性靶标,但是利用ACC抑制剂治疗人类疾病仍需要克服一些潜在的难关 [13]. 首先,高等动物脑部在维持能量平衡中发挥了重要的作用,下丘脑中的丙二酰单酰辅酶A是控制进食行为的负调控因子. ACC2缺失的动物体内丙二酰单酰辅酶A的水平下降,虽然有利于脂肪酸β氧化,但可能会打破脑部的能量平衡. 其次,直接利用ACC抑制剂降低丙二酰单酰辅酶A含量会刺激胰腺中胰岛素的分泌,这种影响可能是不利的. 综上所述,ACC2是我们寻找治疗人类肥胖、糖尿病等代谢疾病方法的一个重要突破口,但寻找合适的ACC抑制剂需要综合考虑其它代谢途径.

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