1a. approcci tecnologici per lo studio del genoma

8/6/2019 1a. Approcci Tecnologici Per Lo Studio Del Genoma

1/102

Discovering Genomics,

Proteomics And Bioinformatics

By A.Malcolm Campbell& Laurie J.Heyer

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003

Teaching genomics to undergraduate students

is like vaccinating against flu:

Each year the novelties that have come to

dominate the field have to

be evaluated and course materials redesignedto prepare the student

body for the ever-changing

information landscape.


2/102

Medicina Molecolare e Neoplasie

- Genetica - Analisi cromosomi

- Genomica - Analisi DNAgenomico/cDNA

- Proteomica - Analisi RNA

- Epigenetica - Analisi proteine


3/102


4/102


5/102


6/102


7/102

Genetica Molecolare

Struttura e Funzione dei Geni

Genomica

Progetto Genoma - Sequenziamento


8/102

2nm

11nm

30nm

300nm

1400nm

700n

m

Mb (1000 Kb)

Kb (1000 bps)

Nucleotide (1 bp)

Gb

(1000Mb)


9/102


10/102

Human Chromosomes

telomere

p arm

q arm

centromere

Male 46,XY

Female 46,XX


11/102


12/102


13/102

Genome Anatomy

EUCHROMATIN 1,5%Transcribed gene

polymorphisms > 1 protein

98,5% NON CODING

intragenic = introns

Intergenic

repetitive

1 gene 1 protein old dogma!


14/102


15/102

G-BANDING KARYOTYPE


16/102

Gene

Candidato

Cromosoma 12 Cloni/Sonderegione 12q12

Geniregione 12q1

Metodiutilizzati

Cariotipo


17/102


18/102


19/102


20/102


21/102

COSMID 4-1 +COSMID 9-4

Chromosome 5

q33

5

3

PDGFRB

4.1

9.4

5

FISH (PDGFRB 5q33)

DUAL COLOR FISH


22/102

I-FISH

der(12)

der(5)

nl(5)

nl(5) der(5)

der(12)

M-FISH


23/102

I h FISH


24/102

D-FISH, dual colour dual fusion

ABL1

BCR

fusion

fusion

Interphase FISH

ABL1

BCRnormale Ph+


25/102

CROMOSOMA

Braccio corto, p

Braccio lungo, q

banda

sonda monocolore complementare a tutto il gene

gene candidato rottura e separazione (split)gene candidato separazione (break apart)

sonde bicolore fiancheggianti il gene


26/102


27/102


28/102


29/102

RT - PCR

PCR: reazione a catena

della DNA-polimerasi

RT: trascrizione inversa

Le molecole di mRNA (53)

vengono retrotrascritte in

cDNA (filamento antisenso

35)

Sintesi del filamento senso (5

3) e amplificazione del cDNA

------------------------AAAA mRNA5 3

3 5cDNA

53

5 3cDNA

Filamento senso

Filamento antisenso


30/102


31/102

VAL 617F in PVVAL 617F in PV

WT

PV


32/102

WTWT

959

959

W T G A T C T CT G G C A G T G G A G G A A G T C T C T T T A A G A A A A T

B G AT CT C T G C A T G G C A G T G G A G G A AG TC TC TT TA AG A AA AT

D G AT CT C T G C C T G G C A G T G G A G G A AG TC TC TT TA AG A AA AT

965

965

Journal of Molecular Diagnostics,2006

INS 959_960 CATG vs CCTGINS 959_960 CATG vs CCTG


33/102


34/102

Types of genes wich may mutate to cause cancer

Tumour suppressor genes

proto-oncogenes

DNA repair genes

checkpoint genes

food

viruses

tobacco smokeradiation

chemical


35/102

Oncogene ci

che risulta dalproto-oncogene

dopo insulto

genetico e il cuiprodotto ha la

capacit

trasformante

Proto - Oncogene

Un gene il cui

prodotto ha la

capacit di

indurre

trasformazionecellulare a

seguito di insulti

genetici


36/102

Tumour Suppressor Genes

1) The genes normal function is to regulate cell division.

To lose gene activity both alleles need to be mutated

2) The first mutation may be inherited or somatic

3) the second mutation will often be a gross event leadingto loss of heterozygosity in the surronding area (deletion)

es: retinoblastoma gene (13q14)


37/102

Retinoblastoma Gene (13q14)

both copies of gene as to be inactivated

first allele inactivation

hereditysomatic mutation

somatic mutation

second allele inactivation


38/102

p53 Mutant Mice Develop Cancer


39/102

Mutazione dominante negativa

Una mutazione il cui prodotto

interferisce con il prodotto del gene

normale nella stessa cellula


40/102

BER Base Excision Repair

NER Nucleotide Excision Repair

MMR Mismatch Repair (HNPCC)

REPAIR GENES


41/102


42/102

Checkpoints Genes

Sistema cellulare di protezione dallinstabilitgenomica e della tossicit derivata dal danno al

DNA


43/102


44/102

Functional Goals Of Mutations

Induzione di segnali di crescita

Perdita di capacit di sopprimere

Regolazione anormale dellapoptosi

Diminuzione della stabilit genomica

Evasione delle difese immunologiche


45/102


46/102

Proteomica

Caratterizzazione della neoplasia attarverso le

sue proteine

( elettroforesi bidimensionale: gradienti di pH +

peso molecolare - spettrometria di massa )


47/102


48/102

Dogma Della Biologia

DNA

ProteineRNA


49/102

Mi h i


50/102

Microarray showing genes

distinguishing ALL from AML.

The 50 genes most highly

correlated with the ALL-AMLclass distinction are shown. Each

row corresponds to a gene, with

the columns corresponding to

expression levels in different

samples. Expression levels for

each gene are normalized across

the samples such that the mean is

0 and the SD is 1. expression

levels greater than the mean areshaded in red, and those below

the mean are shaded in blue. The

scales indicated SDs above or

below the mean.


51/102

Epigenetica:

( Espressione Genica )

Metilazione

De-acetilazioneRNA interferents

Epigenetica:


52/102

p gMetilazione

Sequenze di DNA di 200-2000 basi conuna pi alta frequenza di CG rispetto alresto del genoma.

Circa 30000 nel genoma, il 50-60%

localizzato allinterno dei promotorigenici.

La metilazione del promotore a livellodelle CpG associata a silenziamento

trascrizionale e deacetilazione degli

*CpGIsland:

-3

* * *

Promoter exon 15-

ATG

exon 2 exon 3


53/102

Copia inattiva

del gene (imprinted)

acetilazione istonica

metilazione

Copia attiva

del gene

acetilazione istonica

metilazione

attivit deacetilasica

attivit acetilasica

repressione della trascrizione

attivazione della trascrizione


54/102


55/102

INIBITORIINIBITORI

Azacitidina, Decitabina, Zebularina

Acido Valproico, Tricostatina A,SAHA, Fenil-butirrato, MGCD0103

Substrati non-IstoniciSubstrati non-Istonici

Fattori di trascrizioneFattori di trascrizione


56/102


57/102


58/102

BCR/ABL1 + loss 5'ABL1/3'BCR

normal BCR/ABL1

BCR/ABL1 + loss 5'ABL1

der(9)

t(9;22)(q34;q11) D-FISH


59/102


60/102


61/102


62/102


63/102


64/102

HYBRIDIZATION

+DNA target DNA probe+apten

DENATURATION DETECTION

Ab

anti-apten

Ab

I)

II)


65/102


66/102


67/102


68/102


69/102


70/102

Mutations can be

induced by

chemical

modification

of a base


71/102

B G 138/00


72/102

B.G. 138/00


73/102

Tecniche di Citogenetica e di Biologia Molecolare


74/102

Epigenetica:

( Espressione Genica )

Metilazione

AcetilazioneRNA interferents


75/102


76/102


77/102


78/102

Gene

Expression

is

a multistage

process


79/102

WHO Integrated Classifications


80/102

WHO Integrated Classifications

Morphology:Cytology

Histopathology

Molecular

GeneticsCytogenetic

Immunology:Immuno-cyto-

histochemistry


81/102

The New England Journal of Medicine. Jan 4, Vol 356, No. 1, 79-81


82/102


83/102


84/102


85/102

Eredit di tipo Mendeliano

Dominante

Recessiva

Penetranza


86/102


87/102

Selected SyndromesCancers


88/102

Selected human

cancers

associated

withMendelian

syndromes


89/102


90/102

Oncogeni


91/102

Oncogeni

Proto - Oncogeni (c-onc)Mutazioni

OncogeneVirus RNA

tumorali

(v-onc)

spliced RNA copies

of the c-onc

no introns

Domande


92/102

Domande

Che cos la citogenetica molecolare ?

Che cos un oncogene ?

Che cos un gene checkpoint ?

Che cosa studia lepigenetica ? Quale la differenza tra DNA genomico e cDNA ?

Strumenti di analisi dellespressione genica

Che cos un gene soppressore? A cosa servono i telomeri?

B G 138/00


93/102

B.G. 138/00


94/102

E h d M t i S t


95/102

Enhanced Mutagenesis Spontaneous

biosynthetic errors induced byendogenous/exogenous agents

Inefficient repair

Clonal selection

REPAIR GENES


96/102

REPAIR GENES

BER Base Excision Repair

NER Nucleotide Excision repair

MMR Mismatch repair (HNPCC)


97/102


98/102

GEL ELETTROFORETICO IN AGAROSIO


99/102

GEL ELETTROFORETICO IN AGAROSIO

123 bp ladder /HindIII

Migrazione Elettroforesi

I-FISH


100/102

-NUMERICAL ABERRATIONS

Monosomy / Trisomy

Amplification

-STRUCTURAL ABERRATIONS

Deletion / Duplication

Translocation / Inversion


101/102

Methylation Specific PCR (MSP)

U Primer:

Epigenetica:Metilazione


102/102

Trattamento con Sodio Bisulfito

O

NH2

NH

N

CITOSINACITOSINA

Deaminazione

URACILE

O

ONH

NH

GCGTAATGGCGATCG

CACATTACCACTAAC

5. .3

DNA metilato:

CACATTACCACTAAC

GUGTAATGGUGATUG5. .3

DNA NON metilato:

M Primer:

U Primer:

CGCATTACCGCTAGC

DNA metilato:

CGCATTACCGCTAGC

GUGTAATGGUGATUG5. .3

DNA NON metilato:

5 metilcitosina

O

NH2

NH

N

5 metilcitosina

O

NH2

NH

N

CH3

Deaminazione

CH3

Sequenze di DNA di 200-2000 basi conuna pi alta frequenza di CG rispetto alresto del genoma.

Circa 30000 nel genoma, il 50-60%

localizzato allinterno dei promotorigenici.

La metilazione del promotore a livello

*CpGIsland:

-3

* * *

Promoter exon 15-

ATG

exon 2 exon 3

1a. approcci tecnologici per lo studio del genoma

Documents