European RepresentativeMPIESchutweg 13A5145 NP Waalwijk, The Netherlands

See instructionsfor use.

0050

8°C

2°C

Symbols:

Storage Temperature

Sterilized using aseptic processing techniques

(filtration)

Catalog Number

Expiration: Year - Month - Day

Lot Number

Caution: See instructions for use

MPIE Schutweg 13a5145 NP Waalwijk,

The Netherlands

CE Mark0050

Manufacturer

Vitrification Thaw Kit (Vit Kit® - Thaw)

ENGLISH

INTENDED USEVit Kit® - Thaw is intended for use in assisted reproductive procedures for warming and recovery of human oocytes (MII) and embryos (PN to blastocyst) that have been vitrified using Irvine Scientific’s Vitrification Freeze Kit (Catalog No. 90133-HSV, 90133-SO)

PRODUCT DESCRIPTIONThawing Solution-TS is a HEPES buffered solution of Medium-199 containing gentamicin sulfate (35 µg/mL), 1.0 M sucrose and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement.

Dilution Solution-DS is a HEPES buffered solution of Medium-199 containing gentamicin sulfate (35 µg/mL), 0.5M sucrose and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement.

Washing Solution-WS is a HEPES buffered solution of Medium-199 containing gentamicin sulfate (35 µg/mL) and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement *.

These three solutions are to be used in sequence according to the step-wise microdrop warming protocol.

QUALITY ASSURANCEThe solutions in Vit Kit-Thaw are membrane filtered and aseptically processed according to manufacturing procedures which have been validated to meet a sterility assurance level (SAL) of 10-3.Each lot of Vit Kit - Thaw receives the following tests:Solutions: Endotoxin by Limulus Amebocyte Lysate (LAL) methodology Biocompatibility by Mouse Embryo Assay (one-cell) Sterility by the current USP Sterility Test All results are reported on a lot specific Certificate of Analysis which is available upon request.

FOR WARMING CRYOTIP AS THE CARRIER:MATERIALS REQUIRED BUT NOT INCLUDED• Irvine Scientific Connector (Catalog No. 40736) or adaptor• Sterile Petri Dishes (50 X 9 mm, Falcon 351006 or

equivalent)• Disposable gloves• Hamilton GASTIGHT® Syringe (50 µL) catalog #80901• Transfer pipettes (pulled glass pipettes or micropipette tips

with an inner tip diameter of ~200 µm)• Tweezers• Stopwatch or timer• Liquid Nitrogen Reservoir (Dewar or Styrofoam container

with lid, 1-2 L volume)• Liquid Nitrogen (sufficient volume to achieve 4 inch depth

in reservoir)• Sharp scissors (sterile)• 37°C waterbath• Culture Medium (with protein) appropriate for develop mental

stage of specimen to be recovered.• Prepare and pre-equilibrate dish with culture medium to 37°

C in CO2 incubator prior to warming specimens.

DIRECTIONS FOR USEVit Kit-Thaw components (per application):

• 50 µL of Thawing Solution –TS• 50 µL of Dilution Solution-DS• 100 µL of Washing Solution-WS• 1 Connector

WARMING PROTOCOL (FOR OOCYTES AND EMBRYOS):NOTE: Procedures are to be done at room temperature (20-27º C). DO NOT use heated microscope stage for the following procedures. CAUTION: Minimize exposure of specimen to light during manipulations through thawing solutions.1. Bring the quantity to be used of TS, DS and WS to room

temperature (20-27°C) prior to warming vitrified specimens. NOTE: Avoid bringing the entire vials of TS,

DS and WS to room temperature repeatedly when a small quantity of the solution is needed each time. It is better to aliquot the quantity to be used and return the vials to 2-8°C right after aliquoting.

ITALIANO

USO PROGETTATOIl Vit Kit® - Thaw è previsto per l’uso nelle procedure di riproduzione assistita per il riscaldamento e il recupero di ovociti umani (MII) e di embrioni (PN a blastocita) che sono stati vetrificati usando il kit di congelamento per vetrificazione di Irvine Scientific (codice di catalogo 90133-HSV, 90133-SO).

DESCRIZIONE DEL PRODOTTOSoluzione di Disgelo-TS è una soluzione di tampone Medio-199 che contiene solfato di gentamicina (35 µg/mL), 1,0 M di sucrosio e 20% (v/v) di Supplemento di Siero di Dextran*.

Soluzione di Diluzione - DS è una soluzione di tampone Medio-199 che contiene solfato di gentamicina (35 µg/mL), 0,5 M di sucrosio e 20% (v/v) di Supplemento di Siero di Dextran*.

Soluzione di Sciacquata – WS è una soluzione di tampone Medio-199 che contiene solfato di gentamicina (35 µg/mL) e 20% (v/v) di Supplemento di Siero di Dextran*.

Queste tre soluzioni devono essere usate in ordine seguendo il protocollo di riscaldamento graduale a microgocce

ASSICURAZIONE DELLA QUALITÁ DEL PRODOTTOIl Kit di Disgelo di Vit sono filtrati sulle membrane e controllate asetticamente in accordo con le tecniche di fabbricazione che erano state convalidate per assicurare un livello di sterilità (SAL) di 10-3.

Ogni lotto di Kit di Disgelo di Vit riceve i seguenti controlli:Soluzioni: Endotossine via metodologia di LAL Biocompatibilità via assay (test) d’embrione di topo (una cellula) Sterilizzazione via il Test di Sterilità attuale di USP Tutti i risultati sono archiviati su un lotto-specifico Certificato di Analisi, disponibile su richiesta.

PER RISCALDARE CRYOTIP COME PORTATORE:MATERIE RICHIESTE MA NON INCLUSE• Connettore Irvine Scientific (N° di catalogo 40736) o

adattatore• Capsule di Petri Sterilizzati (50 X 9mm, Falcon 351006 o

equivalente)• Guanti usa e getta• Hamilton GASTIGHT® Siringa (50 µL, catalogo #80901)• Pipetta di trasferimento(pipette di vetro tirati o diametro con

punto interiore ~200µm)• Pinzette• Arresto vigilato o timer• Serbatoio di Nitrogeno in Liquido (contenitore di Dewar or

Styrofoam con tappo, volume di 1-2 L)• Nitrogeno di Liquido(volume sufficiente per arrivare ad una

profondità di 4 pollici nella serbatoio)• Forbice affiliate (sterilizzate)• Bagno d’acqua (waterbath) di 37° C• Preparare un piatto equilibrato con mezzo di coltura a

37 °C in incubatrice a CO2 prima di riscaldare i campioni.

ISTRUZIONI PER L’USOComponenti di Kit di Disgelo di Vit (per applicazione):

• 50 µL di Soluzione di Disgelo – TS• 50 µL di Soluzione di Diluizione – DS• 100 µL di Soluzione di Sciacquata – WS• 1 Connettore (re-utilizable)

PROTOCOLLO DI RISCALDAMENTO (per oocite ed embrioni):NOTABENE: I PROCEDIMENTI/TECNICI DEVONO ESSERE FATTI A TEMPERATURA AMBIENTALE (20-27° C). NON UTILIZZARE MICROSCOPI SCALDATI PER LE TECNICHE SEGUENTI. ATTENZIONE: MINIMIZZARE L’ ESPOSIZIONE ALLA LUCE DURANTE LE MANIPOLAZIONI ATTRAVERSO LE SOLUZIONI DI DISGELO.1. Prima di riscaldare i campioni vetrificati, portare la quantità

di TS, DS e WS da usarsi a temperatura ambiente (20-27 °C).

NOTA: evitare di portare ripetutamente a temperatura ambiente intere fiale quando serve solo una piccola quantità di prodotto ogni volta. È meglio prelevare solo la quantità da utilizzare e rimettere le fiale a 2-8 °C subito dopo il prelievo.

ESPAÑOL

APLICACIÓNEl kit Vit Kit® - Thaw se ha desarrollado para el calentamiento y recuperación de oocitos humanos (MII) y embriones (PN a blastocisto) que han sido vitrificados utilizando el kit de congelación por vitrificación (Vit Kit™-Freeze, nº cat. 90133, 90133-HSV, 90133-SO) de Irvine Scientific en procesos de reproducción asistida.

DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTOSolución Descongelante-TS: es una solución de Medio-199 tamponada con HEPES que contiene sulfato de gentamicina (35 µg/mL), 1M de sacarosa y 20% (v/v) de Dextran Serum Supplement*.

Solución Diluyente-DS: es una solución de Medio-199 tamponada con HEPES que contiene sulfato de gentamicina (35 µg/mL), 0.5M de sacarosa y 20% (v/v) de Dextran Serum Supplement*.

Solución de Lavado-WS: es una solución de Medio-199 tamponada con HEPES que contiene sulfato de gentamicina (35 µg/mL y 20% (v/v) de Dextran Serum Supplement*.

Estas tres soluciones deben utilizarse secuencialmente de acuerdo a los pasos del protocolo de calentamiento en micro gotas.

CONTROL DE CALIDADLas soluciones incluidas en el Vit Kit-Thaw están filtradas a través de membrana y procesadas en condiciones de esterilidad de acuerdo a los procesos de manufacturación validados para conseguir un nivel de garantía de esterilidad (SAL) de 10-3.

Cada lote de Vit Kit-Thaw se somete a los siguientes ensayos:Soluciones: Endotoxinas por el método LAL Biocompatibilidad por ensayo en embriones de ratón (1 célula) Esterilidad de acuerdo al ensayo de esterilidad USP vigente Todos los resultados se reflejan en el Certificado de Análisis específico de lote disponible previa solicitud.

PARA CALENTAR LA CRYOTIP COMO PORTADORA:MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO EN EL KIT• Conector de Irvine Scientific (n.º de catálogo 40736) o

adaptador• Placas de Petri estériles (50 x 9 mm, Falcon 351006 o

equivalentes)• Guantes desechables • Hamilton GASTIGHT® jerinuilla (50 µL, nº catálogo 80901)• Pipetas de transferencia (pipetas de cristal estiradas o puntas

de micropipeta con un diámetro interior de aprox. 200 µm).• Pinzas• Cronómetro o reloj• Contenedor de nitrógeno líquido (contenedor Dewar o

Styrofoam con tapa, con capacidad para 1-2 L)• Nitrógeno líquido (volumen suficiente para conseguir una

profundidad en el contenedor de unos 10cm)• Tijeras afiladas estériles • Baño de agua a 37ºC• Prepare y pre-equilibre una placa con medio de cultivo a 37

ºC en incubador de CO2 antes de calentar las muestras.

INSTRUCCIONES DE USOComponentes del Vit Kit-Thaw (por aplicación):

• 50 µL de Solución Descongelante-TS• 50 µL de solución diluyente-DS• 100 µL de solución de lavado-WS• 1 Conector

PROTOCOLO DE CALENTAMIENTO(PARA OOCITOS Y EMBRIONES)NOTA: todo el protocolo debe realizarse a temperatura ambiente (20-27ºC). NO UTILICE la platina calefactora del microscopio. PRECAUCIÓN: Minimice la exposición de la muestra a la luz durante su manipulación a través de las soluciones de descongelación.1. Lleve la cantidad a utilizar de TS, DS y WS a la temperatura

ambiente (20 ºC a 27 ºC) antes de calentar los especimenes vitrificados.

NOTA: Evite llevar repetidamente la totalidad de los viales de las soluciones TS, DS y WS a la temperatura ambiente cuando sólo se necesita una pequeña cantidad de solución en cada caso. Es mejor sacar la parte alícuota que se

2. Fill the liquid nitrogen reservoir with liquid nitrogen (~80 % full) and place close to the LN2 freezer containing the specimens to be thawed.

3. Remove the canes with goblets containing the CryoTips with vitrified specimens from liquid nitrogen storage and transfer them into the liquid nitrogen filled reservoir.

CAUTION: Make sure that CryoTips remain submerged in LN2 (in goblet) during transfer from storage to LN2 reservior to prevent uncontrolled thawing of specimens.

Place the reservoir close to the microscope for rapid manipulation.

4. Label a sterile petri dish (or lid) with necessary information.5. Gently invert each vial of TS, DS and WS twice to mix

contents before use.6. Prepare the dish with droplets of solutions for warming

protocol as follows:

Aseptically dispense a sequence of 2 microdrops on an inverted lid of sterile Petri dish as shown in Figure 1, and place the dish on the microscope stage: • one-50 µL drop of TS • one-50 µL drop of DS • (Two drops of WS will be set up later at step 13)

7. Place the 37°C waterbath close to the microscope. Have the following nearby: a transfer pipet and tips, sterile sharp scissors, Hamilton syringe and sterile wipes.

8. Using tweezers (or tongs), retrieve the specific CryoTip from the cane in liquid nitrogen, quickly immerse the CryoTip into the 37°C waterbath (> 500 mL) and swirl gently for 3 seconds to warm (see Figure 2) at + 24,000°C/min.

9. Quickly dispense contents of CryoTip as follows (see Figure 3):• Quickly wipe the CryoTip dry with a sterile wipe• Remove metal cover sleeve• Cut the seal on the wide end of the CryoTip at Mark #4• Attach wide end of the CryoTip securely to Hamilton

syringe or appropriate aspiration tool using a connector or adaptor.

NOTE: Lift up the plunger of the syringe about 0.5 inches before attaching the syringe to the Connector and the CryoTip.

• Gently wipe the fine tip dry with a sterile wipe. • With the CryoTip positioned over the prepared thawing

dish, quickly cut the seal on the Mark #2 of the fine tip end and dispense the contents of the CryoTip as a small drop (~ 1 µL) onto a dry region of the dish above the TS drop (see Figure 4).

NOTE: AVOID BUBBLES WHILE DISPENSING THE CONTENTS.

10. Merge the TS drop with the CryoTip content and allow gradual mixing for 1 minute (see Figure 4).

Note: the specimens will shrink and float to the top of the drop.

NOTE: After each transfer of the specimen(s), blow out any remaining fluid in the transfer pipet and draw up some solution from the next drop prior to the next manipulation. Avoid creating bubbles during the transfers.

11. Draw up some DS into the transfer pipet and transfer the specimen(s) from the drop of TS with minimal volume to the drop of DS for 4 minutes.

NOTE: The specimen will remain shrunken during exposure to DS.)

DURING THIS TIME SET UP THE TWO-50 µL DROPS OF WS (WS1, WS2), AS SHOWN IN FIGURE 4.

12. Transfer the specimen(s) to the drop of WS (WS1) for 4 minutes.

NOTE: The specimen(s) should re-expand to the original size within 2-3 minutes in WS.

13. Then transfer the specimen(s) to the second drop of WS (WS2) for 4 minutes.

14. Finally, transfer the specimen to a pre-equilibrated culture dish containing the appropriate culture medium (with protein). Incubate the specimens accordingly in a 37ºC incubator with CO2 for 3-4 hours to complete recovery prior to further manipulations (e.g. fertilization of oocytes, transfer or extended culture of embryos).

2. Riempire il serbatoio con nitrogeno liquido (~80% pieno e metterlo vicino al congelatore LN2 che contiene campioni che devono essere disgelati.

3. Rimuovere le canne con goblets che contengono i CryoTips con i campioni vetrificati dallo stoccaggio di nitrogeno liquido e trasferendoli nel serbatoio riempito di nitrogeno liquido.

ATTENZIONE : Assicuratevi che Il Kit di Disgelo di Vit rimangano sottomessi nel LN2 (goblet) durante il trasferimento dallo stoccaggio al serbatoio LN2 per prevenire disgelo non-controllato del campione.

Mettere il serbatoio vicino al microscopio per una rapida manipolazione.

4. Mettere l’ etichetta sul piatto di Petri sterilizzato (o tappo) con i dati necessari.

5. Invertire accuratamente ogni fialetta di TS, DS a WS due volte per mescolare il contenuto prima dell’uso.

6. Preparare nel modo seguente il piatto con goccioline di soluzione per il protocollo di riscaldamento:

Disporre asetticamente una sequenza di 2 microgocce su una tappa invertita nel piatto di Petri sterilizzato come mostrato in Figura 1, mettere il piatto sul microscopio:• una goccia di 50 µL di TS• una goccia di 50 µL di DS• (Due gocce di WS verranno messe dopo nel passo 13)

7. PMettere in acqua a temperatura di 37° C vicino al microscopio. Mantienile vicine: una pipetta di trasferimento, forbice, Hamilton siringa e wipes sterilizzate.

8. Utilizzando le pinzette( o tongs), prendi il CryoTip specificato dalla cana in nitrogeno liquido, immergere il CryoTip velocemente nell’ acqua a 37° C (>500 mL) e mescolare accuratamente per 3 secondi aspettare il caldo (vedi Figure 2) a + 24,000° C/min.

9. Dispensare velocemente i contenenti del CrypTip cosi(vedi Figure 3):• Pulire velocemente lo CryoTip con un fazzoletto

sterilizzato.• Togliere la copertura metallica• Tagliare il sello sulla parte grande dello CryoTip al marchio

#4.• Unire saldamente l’estremità svasata di CryoTip alla siringa

Hamilton o ad uno strumento di aspirazione adeguato utilizzando un connettore o un adattatore.

NOTA: Alzi il nucleo mobile della siringa circa 0.5 pollici prima del fissaggio al connettore ed al CryoTip.

• Con il CryoTip in posizione sulla capsula pronto per il disgelo, tagliare velocemente il sigillo e dispensare i contenenti dello CryoTip come una goccia piccola(~1µL) su una porzione asciutta sulla goccia di TS (vedi Figure 4).

NOTABENE: EVITARE LE BOLLE D’ARIA QUANDO SI DISPENSA I CONTENENTI.

10. Mescolare la goccia TS con il contenuto di CryoTip e consentire una miscelazione graduale per 1 minuto (vedere Figura 4).

NOTABENE: i campioni diminuiscono e galleggiano al superficie della goccia.

NOTABENE: Dopo il trasferimento dei campioni, togliere qualsiasi rimanenze di fluido nella pipetta di trasferimento e portare una quantità di soluzione dalla goccia successive prima della prossima manipolazione. Evitare di creare le bolle d’aria tramite i trasferimenti.

11. Portare qualche quantità di DS nella pipetta e trasferire il campione dalla goccia di TS con un volume minimo al goccia di DS Per 4 minuti.

NOTABENE: Il campione rimane piccolo/diminuito durante l’ esposizione al DS. DURANTE QUESTO PERIODO, PREPARARE LE DUE GOCCE DI 50µL DI WS(WS1, WS2), COME MOSTRATA NELLA FIGURA 4.

12. Trasferire il campione (s) alla prima goccia di WS (WS1) per 4 minuti.

NOTABENE: I CAMPIONI DEVONO TORNARE ALLA LARGHEZZA ORIGINALE IN MENO DI 2-3 MINUTI IN WS.

13. Poi trasferire il campione (s) alla seconda goccia di WS (WS2) per 4 minuti.

14. Trasferire finalmente il campione a un piatto pre-equilibrato che contiene la sostanza di coltura appropriata (con proteina). Incubare i campioni in accordo in una incubatrice di 37° C con CO2 per 3 o 4 ore per completare il ricupero prima di ulteriori manipolazioni (per esempio: la fertilizzazione di oocite, il trasferimento o la coltura estesa degli embrioni).

va a utilizar y devolver los viales a la gama de temperatura de 2 a 8 °C inmediatamente después de hacerlo.

2. Llene el contenedor de N2 líquido con N2 líquido (~ 80% lleno) y colóquelo cerca del congelador de N2 que contiene las muestras a descongelar.

3. Saque del tanque de N2 líquido las cestas con los goblets que contienen los CryoTips con las muestras vitrificadas a descongelar y transfiéralas al contenedor que ha rellenado con N2 líquido.

PRECAUCIÓN: Asegúrese que los CryoTips permanecen sumergidos en el N2 líquido (en la cesta) durante la transferencia para evitar la descongelación descontrolada de las muestras.

Coloque el contenedor cerca del microscopio para una rápida manipulación.

4. Etiquete una placa de Petri estéril (o tapa) con la información necesaria.

5. Suavemente invierta 2 veces cada vial de TS, DS y WS antes de usarlos para mezclar su contenido.

6. Prepare la placa con gotas de soluciones para el protocolo de calentamiento de la siguiente manera:

En condiciones de esterilidad dispense una serie de 2 microgotas sobre la tapa invertida de una placa de Petri como se muestra en la Figura 1, y coloque la placa en la platina del microscopio:

• 1 gota de 50 µL de TS• 1 gota de 50 µL de DS• (más tarde, en el paso 13, se dispensarán 2 gotas de WS)

7. Sitúe el baño de agua a 37ºC cerca del microscopio. Tenga cerca el siguiente material: una pipeta de transferencia y puntas, tijeras afiladas estériles, la Hamilton GASTIGHT® jerinuilla, y toallitas estériles.

8. Utilizando pinzas recupere el CryoTip específico de la cesta en nitrógeno líquido, sumérjalo rápidamente en el baño de agua a 37ºC (>500 mL) y agite suavemente durante 3 segundos para calentamiento (ver Figura 2) a +24000ºC/min.

9. Dispense rápidamente el contenido del CryoTip de la siguiente manera (ver Figura 3):• Seque rápidamente el CryoTip con un papel estéril• Quite la cubierta de metal.• Corte el sello en el extremo ancho del CryoTip en la Marca

# 4.• Fije el extremo ancho del CryoTip a la jeringa Hamilton o

a una herramienta apropiada de aspiración mediante un conector o adaptador.

NOTA: Levante el émbolo de la jeringuilla aproximadamente 0.5 pulgada antes de unir al conectador y al CryoTip.

• Con delicadeza, seque el CryoTip con una toallita estéril• Con el CryoTip situado sobre la placa de descongelación

preparada, corte el sellado sobre la Marca # 2 del extremo fino de la punta y dispense el contenido del CryoTip como un pequeña gota sobre una zona seca de la placa por encima de la gota de TS (ver Figura 4).

NOTA: EVITE LA FORMACIÓN DE BURBUJAS AL DISPENSAR EL CONTENIDO.

10. Combine la gota de TS con el contenido de la CryoTip y permita la mezcla gradual durante un (1) minuto (véase la Figura 4).

NOTA: las muestras sufrirán un pérdida de volumen y flotarán hacia la superficie de la gota.

NOTA: después de cada transferencia de la muestra, expela el contenido de la pipeta de transferencia y aspire un poco de la solución de la siguiente gota antes de la siguiente manipulación. Evite la formación de burbujas durante las transferencias.

11. Aspire un poco de DS con la pipeta de transferencia y transfiera la muestra/s de la gota de TS con el mínimo volumen al de la gota de DS (DS1) dejándola 4 minutos.

NOTA: la muestra permanecerá encogida durante la exposición a DS.

DURANTE ESTE INTERVALO DISPENSE 2 GOTAS DE 50µL DE WS (WS1, WS2) COMO SE MUESTRA EN LA FIGURA 4.

12. Transfiera la muestra/s al de la gota de WS (WS1) para 4 minutos.

(Nota: la muestra/s debe reexpanderse hasta su volumen original en los 2-3 minutos en WS).

13. Transfiera la(s) muestra(s) a la segunda gota de WS (WS2) por 4 minutos.

14. Finalmente, transfiera la muestra a una placa pre-equilibrada con el medio de cultivo adecuado (con suplemento proteico).

2511 Daimler Street, Santa Ana, California 92705-5588Telephone: 1 949 261 7800 • 1 800 437 5706

Fax: 1 949 261 6522 • www.irvinesci.comPN 40696 Rev.17

For assisted reproductive procedures.

Für betreute fortpflanzungsverfahren.

Per tecniche di riproduzione assistita.

Para utilización en técnicas de reproducción asistida.

Pour les techniques de procréation médicalement assistée.

Para utilização em técnicas de reprodução assistida.

Για διαδικασίες επιβοηθούμενης αναπαραγωγής.

Pro technologie asistované reprodukce.

Til brug ved assisteret reproduktion.

Avusteisiin lisääntymismenettelyihin.

Ar palīglīdzekļiem veicamām reproduktīvām procedūrām.

Voor geassisteerde voortplantingsprocedures.

Dla procedur wspomagających rozrodczość.

Pentru asistenţă privind procedurile de reproducere.

För procedurer för assisterad reproduktion.

Kasutamiseks reproduktiivse abi protseduurides.

Asszisztált reprodukciós eljárásokhoz.

Skirta pagalbinio apvaisinimo procedūroms.

Yardımla üreme prosedürleri için.

GASTIGHT® is a Registered Trademark of Hamilton Co.

Catalog No. 90137-SO Includes: • Thawing Solution - TS (yellow cap) 4 x 1 mL Vials • Dilution Solution - DS (orange cap) 1 x 1 mL Vials • Washing Solution - WS (red cap) 1 x 2 mL Vials

TS

DS

50 µLDrops

Figure 1:

Figure 2:

Seal #1

Seal #2Mark #4

Mark #1

Mark #2

Mark #3

Cut #2

Cut #1

37°C

AfterWarming

Figure 3:

4 min each

1 min

Transfer to Culture Mediumwith 20% (v/v) protein for Recovery

WS1 WS2

TS

DS

50 µLDrops

4 min

CryoTipContents(~1 µL)

Figure 4:

HSV Device Diagram:

TS = Thawing SolutionDS = Dilution SolutionWS = Washing Solution

FOR WARMING HSV DEVICE AS THE CARRIER:MATERIAL REQUIRED BUT NOT INCLUDED

• Sterile 4-well dish (Nunc 179830, 144444 or equivalent), or organ culture dish (BD Falcon 353037)

• Disposable gloves• Transfer pipettes• Tweezers• Stopwatch or timer• Liquid nitrogen resevoir• Liquid Nitrogen• Scissors• Culture Medium with protein, pre-equilibrated to 37°C

in CO2 incubator prior to thawing procedure.• 37°C incubator without CO2, or heating stage

DIRECTIONS FOR USEVit Kit – Thaw components (per application)

• 250 µl of Thawing Solution –TS• 50µL of Dilution Solution - DS• 100 µL of Washing Solution – WS

WARMING PROTOCOL (for oocytes and embryos):

NOTE: The warming steps include plunging the device into the 37°C TS and subsequent diluting and washing in DS and WS at room temperature

1. Set up warming dishes (as shown in HSV device diagram):• At 37°C: Aseptically dispense 250 µl of TS into a

sterile 4-well dish or an organ culture dish and place it in a 37°C incubator without CO2 or on a heating stage at least 30 minutes prior to warming procedure

2. Identify HSV Straw(s) to be warmed from LN2 storage and quickly transfer to LN2 filled reservoir in preparation for thawing procedure.

3. Place LN2 reservoir close to microscope for subsequent rapid manipulation.

4. Remove TS dish from 37°C incubator or heating stage and place it under focus on top of the microscope stage.

5. Lift the straw enough to expose the colored handling rod. Make sure the end with the specimen(s) remains immersed in the LN2.

6. Hold the HSV Straw firmly between fingers, place the scissors around the center of the colored rod and carefully score the outer straw by pressing the scissors repetitively while rotating the straw to perform successive incisions around the external straw.

7. Use the scissors as tweezers to grab the capillary rod and extract it out of the straw.

8. Immediately plunge the gutter into the 37°C TS and gently swirl to detach specimens from device and leave it for 1 minute.

Steps 9-12 must be performed at room temperature (22-27°C).

• At room temperature: Aseptically dispense one (1) 50 µL drop of DS on a sterile Petri dish

9. Draw up some DS into the transfer pipette and transfer the specimen(s) from the TS dish with minimal volume to the drop of DS for 4 minutes.

NOTE: The specimen will remain shrunken during exposure to DS.

DURING THIS TIME SET UP THE TWO-50 µL DROPS OF WS (WS1, WS2), AS SHOWN IN HSV DEVICE DIAGRAM.

10. Transfer the specimen(s) to the drop of WS (WS1) for 4 minutes.

NOTE: The specimen(s) should re-expand to the original size within 2-3 minutes in WS.

11. Then transfer the specimen(s) to the second drop of WS (WS2) for 4 minutes.

12. Finally, transfer the specimen to a pre-equilibrated culture dish containing the appropriate culture medium (with protein). Incubate the specimens accordingly in a 37ºC incubator with CO2 for 3-4 hours to complete recovery prior to further manipulations (e.g. fertilization of oocytes, transfer or extended culture of embryos).

NOTE: Recovered oocytes must be fertilized using ICSI for optimal fertilization after

vitrification.

For additional details on the use of these products, each laboratory should consult its own laboratory procedures and protocols which have been specifically developed and optimized for your individual medical program.

STORAGE INSTRUCTIONS AND STABILITYStore the unopened vials refrigerated at 2°C to 8°C. When stored as directed, Vitrification Freeze Kit Solutions are stable until the expiration date shown on the vial labels.

Do not use media for more than eight (8) weeks once containers have been opened.

As human source material is present in the product it may develop some particulate matter during storage. This type of particulate matter is not known to have an effect on product performance.

PRECAUTIONS AND WARNINGSThis device is intended to be used by staff trained in assisted reproductive procedures that include the indicated application for which the device is intended.

Do not use any vial of solution that shows evidence of particulate matter or cloudiness.

To avoid problems with contamination, handle using aseptic techniques.

Vitrification Thaw Kit Solutions contain the antibiotic gentamicin sulfate. Appropriate precautions should be taken to ensure that the patient is not sensitized to this antibiotic.

Currently, research literature indicates the long-term effects of vitrification on embryos remains unknown.

*Human blood derivatives used in the manufacture of this product has been tested by FDA licensed kits, and found to be non-reactive for the Hepatitis B surface antigen (HBsAg), antibodies to Hepatitis C (HCV) and antibodies to Human Immunodeficiency Virus (HIV). However, no test method offers complete assurance that products derived from human sources are noninfectious. Handle all Human blood derivatives as if it were capable of transmitting infection, using universal precautions. Donors of the source material have also been screened for risk of exposure to Cruetzfeldt-Jakob Disease (CJD).

Do not use any bottle in which the sterile packaging has been compromised.

Caution: Federal (U.S.) law restricts this device to sale by or on the order of a physician.

DEUTSCH

BESTIMMUNGSZWECKVit Kit® - Thaw ist für Anwendungsverfahren zur assistierten Reproduktion vorgesehen, die die Erwärmung und Gewinnung menschlicher Oozyten (MII) und Embryos (PN bis zum Blastozysten) betrifft, die mit dem Vitrification Freeze Kit von Irvine Scientific vitrifiziert wurden (Katalognummer 90133-HSV, 90133-SO).PRODUKTBESCHREIBUNGThawing Solution-TS ist eine HEPES-gepufferte Lösung von Medium-199. Die Lösung beinhaltet Gentamicinsulfat (35 µg/ml), 1,0 M Saccharose, und 20% (v/v) Dextran Serum Supplement*.Dilution Solution-DS ist eine HEPES-gepufferte Lösung von Medium-199. Die Lösung beinhaltet Gentamicinsulfat (35 µg/ml), 0,5 M Saccharose, und 20% (v/v) Dextran Serum Supplement*.Washing Solution-WS ist eine HEPES-gepufferte Lösung von Medium-199. Die Lösung beinhaltet Gentamicinsulfat (35 µg/ml) und 20% (v/v) Dextran Serum Supplement*.Diese drei Lösungen sollten nach dem schrittweisen Erwärmungsprotokoll für Mikrotropfen der Reihe nach verwendet werden.QUALITÄTSSICHERUNGDie Lösungen in Vit Kit-Thaw werden durch Membranfilter und aseptische Methoden veredelt. Diese Fertigungsverfahren sind bestätigt worden, ein Sterility Assurance Level (SAL) von 10-3 zu erfüllen.Jedes Los von Vit Kit-Thaw wird durch Folgendes erprobt:Lösungen: Endotoxin (durch LAL-Methoden) Biokompatibilität (durch Mouse Embryo Assay [eine Zelle]) Sterilität (durch aktuellen USP Sterility Test [71])

Alle Ergebnisse werden auf einem Los-spezif ischen Analysenzeugnis berichtet, das auf Antrag erhältlich ist

ERWÄRMUNG DES CRYOTIP ALS TRÄGER:• Irvine Scientific Konnektor (Katalog-Nr. 40736) oder Adapter• Sterile Petrischalen (50 x 9 mm, Falcon 351006 oder Äquivalent)• Wegwerfbare Handschuhe• Hamilton GASTIGHT® Spritze(50 µL) Katalog #80901`• Transferpipetten (Pipetten aus gezogenem Glas oder Micropipette-Düsen, dessen inneren Durchmesser 200 µm ist)• Pinzette• Stoppuhr oder Zeitgeber• Behälter für flüssigen Stickstoff (Dewar- oder Styropor-Behälter mit Deckel, Volumen von 1-2 l) • Reservoir für Flüssigen Stickstoff (mit ausreichendem Volumen, eine Tiefe von 4 Zoll im Reservoir zu erreichen)• Scharfe Schere (steril)• 37°C Wasserbad• Culture Medium (Kulturnährboden) [mit Protein], der für die Entwicklungsphase des Musters, das wiederherzustellen ist, passend ist. Bevor Sie die Muster tauen• Petrischale mit dem Kulturmedium vorbereiten und in einem CO2-Inkubator auf 37°C präequilibrieren, bevor die Proben erwärmt werden.GEBRAUCHSHINWEISEVit Kit-Thaw Komponenten (pro Einsatz):• 50 µl Thawing Solution-TS• 50 µl Dilution Solution-DS• 100 µl Washing Solution-WS• 1 AnschlussstückERWÄRMUNGS PROTOKOLL (FÜR OOZYTEN UND EMBRYOS):HINWEIS: Verfahren sollen bei Raumtemperatur (20-27°C) ausgeführt werden. Gebrauchen Sie KEINEN erhitzten Objektträger für die folgenden Verfahren. VORSICHT: Minimieren Sie Kontakt (des Musters) mit Licht während Bedienung durch Taulösungen.1. Die erforderlichen Mengen TS, DS und WS vor Erwärmung de r v i t r i f i z ie r ten Proben au f Raumtempera tu r bringen (20-27°C). Hinweis: Es sollte nicht der gesamte Inhalt der TS-, DS- und WS-Ampullen wiederholt auf Raumtemperatur gebracht werden, wenn jedes Mal nur eine kleine Menge der Lösung benötigt wird. Es ist besser, nur die benötigte Menge abzunehmen und die Ampullen dann unverzüglich wieder auf 2-8°C zu kühlen. 2. Füllen Sie den Stickstoffbehälter mit flüssigem Stickstoff (~80 % voll) und stellen Sie ihn beim LN2-Tiefkühlschrank, der die Muster beinhaltet, die zu tauen sind.

3. Nehmen Sie die Cryocanes mit Bechern, die die CryoTips mit verglasten Mustern beinhalten, aus dem flüssigen Stickstoff- Lager. Versetzen Sie sie in das mit flüssigem Stickstoff gefüllte Reservoir. VORSICHT: Sichern Sie, dass die CryoTips in LN2 (im Becher) während Versetzung vom Lager bis in den LN2 Behälter untergetaucht bleiben, um unbeschränktes Tauen der Muster zu verhindern. Stellen Sie das Reservoir beim Mikroskop für schnelle Bedienung.4. Etikettieren Sie eine sterile Petrischale (oder Deckel) mit nötigen Informationen.5. Kehren Sie behutsam jedes Fläschchen von TS, DS, und WS zweimal um, um den Inhalt vor dem Gebrauch zu mischen.6. Petrischale mit den Tropfen der Lösungen für das Erwärmungsprotokoll wie folgt vorbereiten:Tröpfeln Sie aseptisch eine Folge von 2 Microtröpfen auf einen umgekehrten Deckel einer sterilen Petrischale, wie in Figur 1 gezeigt. Stellen Sie die Schale auf den Objektträger:• Ein-50 µl Tropfen von TS• Ein-50 µl Tropfen von DS• (Zwei Tropfen von WS werden später bei Schritt 13 vorbereitet werden)7. Stellen Sie das 37°C Wasserbad beim Mikroskop. Haben Sie Folgendes bereit: eine Transferpipette und Düsen, eine sterile scharfe Schere (oder wegwerfbares Skalpell), Hamilton spritze, und sterile Wischtücher.8. Gebrauchen Sie eine Pinzette (oder Zange), um die spezifische CryoTip aus dem Cryocane im flüssigen Stickstoff auszunehmen. Tauchen Sie die CryoTip schnell ins 37°C Wasserbad (> 500 mL) ein und wirbeln Sie das Wasserbad behutsam für 3 Sekunden, um bei + 24.000°C/Min zu wärmen (sehen Sie Figur 2).9. Verteilen Sie schnell den Inhalt der CryoTip wie hier angewiesen (sehen Sie Figur 3):• Wischen Sie schnell die CryoTip mit einem sterilen Wischtuch trocken• Metallschutzhülse entfernen• Schneiden Sie das Verschluss auf dem weiten Ende der Cryotip (bei Zeichen #4)• Das weite Ende des CryoTip mit einem Konnektor oder Adapter sicher an die Hamilton-Spritze oder ein angemessenes Aspirationswerkzeug anschließen. ANMERKUNG: Vor der Befestigung zum Stecker und zum CryoTip heben Sie den Spulenkern der Spritze ungefähr 0.5 Zoll an.• Wischen Sie behutsam die CryoTip mit einem sterilen Wischtuch trocken.• Mit der CryoTip in Stellung über der vorbereiteten Tauschale, schneiden Sie schnell den Verschluss auf Zeichen #2 des Endes mit der feinen Düse. Verteilen Sie den Inhalt der CryoTip als ein kleiner Tropfen (~1 µl) auf einen trockenen Teil der Schale über dem TS Tropfen (sehen Sie Figur 4). HINWEIS: VERMEIDEN SIE BLASEN BEIM VERTEILEN DES INHALTS.10. TS-Tropfen mit dem Inhalt des CryoTip vereinigen und 1 Minute warten, damit eine allmähliche Vermischung erfolgen kann (siehe Abbildung 4) Hinweis: die Muster werden schrumpfen und sich zum oberen Teil des Tropfens schweben. Hinweis: nach jeder Versetzung des Musters, blasen Sie den Inhalt der Transferpipette und ziehen Sie ein Bisschen Lösung vom nächsten Tropfen vor der nächsten Bedienung. Vermeiden Sie die Schaffung von Blasen während der Versetzungen.11. Ziehen Sie ein Bisschen DS in die Transferpipette und versetzen Sie für 4 Minute mit minimalem Volumen das (die) Muster vom Tropfen TS zum des ersten Tropfens von DS. (Hinweis: das Muster wird während Kontakt mit DS geschrumpft bleiben). WÄHREND DIESER ZEIT DIE BEIDEN TROPFEN (50 μL) VON WS (WS1, WS2) AUFSETZEN (SIEHE ABBILDUNG 4).12. Übertragen Sie die Probe (n) auf dem ersten Tropfen von WS (WS1) für 4 Minuten. (Hinweis: das (die) Muster soll (ensich innerhalb von 2-3 Minuten zurück zur ursprünglichen Größe in der WS wieder vergrößern.)13. Übertragen Sie anschließend die Probe (n) auf den zweiten Tropfen WS (WS2) für 4 Minuten.14. Zum Schluss, versetzen Sie das Muster in eine voräquilibrierte Kulturschale mit passendem Kulturnährboden (mit Protein). Bebrüten Sie in einer entsprechenden Weise, für 3-4 Stunden, die

Muster in einem 37°C Brutschrank mit CO2, um die Wiederherstellung zu beenden, vor weiteren Bedienungen (z.B. Befrüchtung von Oozyten, Versetzung, oder erweiterte Kultivierung von Embryos).HSV-VORRICHTUNG ALS TRÄGER BEIM ERWÄRMUNGS: BENÖTIGTE, ABER NICHT MITGELIEFERTE ARTIKEL• Sterile 4-Loch-Schale (Nunc 179830, 144444 oder Äquivalent) oder Organkulturschale (BD Falcon 353037)• Einmalhandschuhe• Übertragungspipetten• Pinzette• Stoppuhr oder Schaltuhr• Behälter für Flüssigstickstoff• Flüssigstickstoff (LN2)• Schere• Proteinhaltiges Kulturmedium--vor dem Auftauprozess in einem CO2 –Inkubator auf 37°C vorgewärmt.• 37°C –Inkubator ohne CO2 oder Heizplatte GEBRAUCHSANWEISUNGENVit Kit – Auftaukomponenten (pro Anwendung)• 250 µl Auftaulösung –TS• 50µL Verdünnungslösung - DS• 100 µL Waschlösung – WSERWÄRMUNGS PROTOKOLL (für Oozyten und Embryos): HINWEIS: Die Auftauschritte beinhalten das Eintauchen der Vorrichtung in die 37°C warme TS und die nachfolgende Verdünnung und das Waschen in DS bzw. WS bei Raumtemperatur1. Vorbereitung der Auftauschalen (wie in dem Diagramm mit der HSV-Vorrichtung dargestellt):• Bei 37°C: Aseptisches Einfüllen von 250 µl TS in eine sterile 4-Loch-Schale oder Organkulturschale und Platzierung in einen 37°C - Inkubator ohne CO2 oder auf eine Heizplatte für mindestens 30 Minuten vor dem Erwärmungs.2. Den (die) in LN2 gelagerten HSV-Straw(s) auswählen, der (die) aufgetaut werden soll (sollen) und als Vorbereitung für den Auftauprozess schnell in einen LN2 –gefüllten Behälter geben. 3. Den LN2 –Behälter dicht neben das Mikroskop stellen, damit nachfolgende Schritte schnell ausgeführt werden können. 4. Die Schale mit der TS aus dem 37°C -Inkubator oder von der Heizplatte nehmen und unter den Fokus auf den Objekttisch des Mikroskops stellen.5. Den Straw so weit anheben, dass der farbige Bedienstab sichtbar wird. Gewährleisten, dass das Ende mit der (den) Probe(n) in LN2 eingetaucht bleibt. 6. Den HSV-Straw fest zwischen den Fingern halten, mit der Schere um die Mitte des farbigen Stabs greifen und die Außenseite des Straws durch wiederholtes Andrücken der Schere unter Drehen des Straws sorgfältig einritzen, um ein sukzessives Einritzen der Straw-Außenseite zu gewährleisten. 7. Die Schere als Pinzette verwenden, um das Kapillarröhrchen zu greifen und aus dem Straw herauszuziehen. 8. Die Ablaufrinne sofort in die 37°C warme TS tauchen und vorsichtig schwenken, um die Proben von der Vorrichtung zu lösen und 1 Minute in der Lösung belassen.Schritte 9-12 müssen bei Raumtemperatur durchgeführt werden (22-27°C).• Bei Raumtemperatur: Einen (1) Tropfen DS (50 µL) mit Hilfe aseptischer Technik auf eine sterile Petrischale bringen.9. Etwas DS in die Übertragungspipette ziehen und die Probe(n) aus der TS-Schale mit minimalem Volumen für 4 Minuten auf den DS-Tropfens übertragen. HINWEIS: Die Proben bleiben während des Kontakts mit der DS eingefallen.) WÄHREND DIESER ZEIT DIE ZWEI WS- TROPFEN (JEWEILS 50 µL) (WS1, WS2) AUFTRAGEN, WIE ES IM DIAGRAMM MIT DER HSV-VORRICHTUNG DARGESTELLT IST.10. Übertragen Sie die Probe (n) auf dem ersten Tropfen von WS (WS1) für 4 Minuten. (Hinweis: das (die) Muster soll(en) sich innerhalb von 2-3 Minuten zurück zur ursprünglichen Größe in der WS wieder vergrößern.)11. Übertragen Sie anschließend die Probe (n) auf den zweiten Tropfen WS (WS2) für 4 Minuten.12. Zum Schluss, versetzen Sie das Muster in eine voräquilibrierte Kulturschale mit passendem Kulturnährboden (mit Protein). Bebrüten Sie in einer entsprechenden Weise, für 3-4 Stunden, die

Muster in einem 37°C Brutschrank mit CO2, um die Wiederherstellung zu beenden, vor weiteren Bedienungen (z.B. Befrüchtung von Oozyten, Versetzung, oder erweiterte Kultivierung von Embryos). H INWEIS: Nach Verg lasung müssen wiederhergestellte Oozyten für optimale Befrüchtung mit ICSI befrüchtet werden.Fuer weitere Einzelheiten zum Gebrauch diesen Produkten soll das Labor in seinen eigenen Protokollen nachschlagen, die für die spezifische medizinische Einstellung spezifisch entwickelt und optimiert worden sind.

AUFBEWAHRUNGSANWEISUNGEN UND STABILITÄTDie ungeöffneten Ampullen im Kühlschrank bei 2°C bis 8°C aufbewahren. Bei Aufbewahrung unter diesen Bedingungen sind die Vitrification Freeze Kit -Lösungen bis zum Haltbarkeitsdatum, das auf den Ampullen-Etiketten angegeben ist, haltbar.

Die Medien nach dem Öffnen der Behälter nicht länger als acht (8) Wochen verwenden.

Weil das Produkt menschliches Ursprungsmaterial enthält, können während der Aufbewahrung Schwebstoffe entstehen. Diese Art Schwebstoffe haben vermutlich keine Auswirkung auf die Produkt-Performance.

VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGENDiese Vorrichtung ist für die Anwendung durch Personal vorgesehen, das in Verfahren ausgebildet wurde, welche die für diese Vorrichtung angegebene zugelassene Anwendung beinhalten.

Gebrauchen Sie kein Lösung-Fläschchen, das Zeichen von Schwebstoff oder Trübheit zeigt.

Behandeln Sie das Produkt mit aseptischen Methoden, um Kontaminierungsprobleme zu meiden.

Vitrification Thaw Kit Lösungen beinhalten das Antibiotikum Gentamicinsulfat. Passende Vorsichtsmassnahmen sollen getroffen werden, um zu sichern, dass Patienten keine Reaktion gegen dieses Antibiotikum haben werden.

Zurzeit zeigt Forschungsliteratur, dass die langfristigen Auswirkungen von Verglasung auf Embryos unbekannt bleibt.

*Die zur Herstellung dieses Produkts verwendeten menschlichen Blutderivate wurden mit FDA-lizenzierten Kits getestet und waren in Bezug auf das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), Antikörper gegen Hepatitis C (HCV) und Antikörper gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV) nicht reaktiv. Keine Testmethode liefert jedoch eine hundertprozentige Garantie, dass aus menschlicher Quelle gewonnene Produkte nicht infektiös sind. Alle menschlichen Blutderivate sollten mit universellen Vorsichtsmaßnahmen so gehandhabt werden, als könnten sie eine Infektion übertragen. Die Spender dieser Quellenmaterialien wurden auch hinsichtlich des Risikos für Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) gescreent.

Keine Flaschen verwenden, deren sterile Verpackung beschädigt wurde.

ORSICHT: Nach US-Bundesgesetz darf dieses Gerät nur von oder auf Antrag von einem Arzt verkauft werden.

PER RISCALDARE IL DISPOSITIVO VETRIFICAZIONE DI ALTA SICUREZZA HSV COME PORTATORE:ARTICOLI RICHIESTI MA NON INCLUSI• Piattino sterile a 4 pozzetti (Nunc 179830, 144444 o

equivalente) o piattino di coltura per organismi (BD Falcon 353037)

• Guanti monouso• Pipette di trasferimento• Pinzette• Cronografo o timer• Serbatoio dell’azoto liquido• Azoto liquido• Forbici• Mezzo di coltura con proteina, equilibrato a 37 °C in incubatrice

del CO2 prima di eseguire la procedura di scongelamento• Incubatrice a 37 °C senza CO2 o piatto portaoggetti di

riscaldamento

ISTRUZIONI PER L’USOComponenti del kit di scongelamento Vit-Kit (per applicazione)• 250 µl di soluzione di scongelamento - TS• 50µL di soluzione di diluizione - DS• 100 µL di soluzione di lavaggio – WS

PROTOCOLLO DI RISCALDAMENTO (per ovociti ed embrioni) NOTA: le fasi di riscaldamento comprendono l’immersione

del dispositivo nella TS a 37 °C e quindi in diluizione in DS e lavaggio in WS a temperatura ambiente

1. Approntare dei piattini di scongelamento (come mostrato nello schema del dispositivo HSV:• A 37 °C: preparare in modo asettico un piattino sterile a 4

pozzetti, o un piattino di coltura per organismi, con 250 µl di TS in e posarlo in incubatrice a 37 °C senza CO2, o su di un piatto portaoggetti di riscaldamento, per una durata di 30 minuti, prima di iniziare la procedura di riscaldamento.

2. Individuare la cannula (o le cannule) HSW da scongelare nel contenitore di LN2 (azoto liquido) e trasferirla (le) rapidamente al serbatoio riempito dell’ LN2 (azoto liquido) in preparazione per la procedura di scongelamento.3. Sistemare il serbatoio dell’ LN2 (azoto liquido) in vicinanza

del microscopio per poterlo manipolare susseguentemente in modo rapido.

4. Togliere il piattino con la TS dall’incubatrice a 37 °C, o dal piatto portaoggetti di riscaldamento, e sistemarlo sotto fuoco sul piatto portaoggetti del microscopio.

5. Sollevare la cannuccia quanto basta per esporre l’asta di maneggio colorata. Accertarsi che l’estremità con il campione (o i campioni) rimanga immersa nell’ LN2 (azoto liquido).

6. Tenere la cannuccia HSV in modo fermo tra le dita, mettere le forbici attorno alla parte centrale dell’asta colorata e marcare con attenzione l’esterno della cannuccia premendo ripetutamente le forbici mentre si ruota la cannuccia in modo da eseguire incisioni successive attorno alla parte esterna della cannuccia.

7. Usare le forbici come una pinzetta per afferrare l’asta capillare ed estrarla dalla cannuccia.

8. Immergere immediatamente l’estremità porta-campione nella TS a 37 °C e agitare delicatamente per distaccare i campioni dal dispositivo, quindi lasciare riposare per 1 minuto.

I punti 9-12 devono essere eseguiti a temperaturaambiente (22-27 °C).• A temperature ambiente: distribuire in modo asettico

una (1) goccia di 50 μL di DS in un piatto sterile Petri.9. Mettere un po’ di DS nella pipetta di trasferimento e trasferire

il campione (o i campioni) dal piattino della TS con un minimo volume al della prima goccia di DS (DS1) per 4 minuti.

NOTA: il campione rimane contratto durante l’esposizione alla DS.)

NEL FRATTEMPIO APPRONTARE DUE GOCCE DI 50 µL DI WS (WS1, WS2) COME INDICATO NELLO SCHEMA DEL DISPOSITIVO HSV.

10. Trasferire i campioni nel della prima goccia di WS (WS1) per 4 minuti.

NOTABENE: I CAMPIONI DEVONO TORNARE ALLA LARGHEZZA ORIGINALE IN MENO DI 2-3 MINUTI IN WS.

11. Poi il trasferimento goccia seconda WS campioni (WS2) per 4 minuti.

12. Trasferire finalmente il campione a un piatto pre-equilibrato che contiene la sostanza di coltura appropriata (con proteina). Incubare i campioni in accordo in una incubatrice di 37° C con CO2 per 3 o 4 ore per completare il ricupero prima di ulteriori manipolazioni (per esempio: la fertilizzazione di oocite, il

Incube las muestras en un incubador a 37ºC con CO2 durante 3-4 horas para completar su recuperación antes de proceder a otras manipulaciones (fertilización de oocitos, transferencia o continuación del cultivo de embriones).

PARA CALENTAR EL D ISPOSIT IVO DE VITRIFICACIÓN DE GRAN SEGURIDAD (HSV) COMO PORTADOR: MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO EN EL KIT• Placa estéril de 4 cavidades (Nunc 179830, 144444 o

equivalente) o placa de cultivo de organismos (BD Falcon 353037)

• Guantes desechables• Pipetas de transferencia• Pinzas• Cronómetro o temporizador• Recipiente de nitrógeno líquido• Nitrógeno líquido• Tijeras• Medio de cultivo con proteína, preequilibrado a 37

°C en incubador de CO2 antes del procedimiento de descongelación.

• Incubador de 37°C sin CO2, o platina calefactora.

INSTRUCCIONES DE USOComponentes del Vit Kit-Thaw (por aplicación)• 250 µl de Solución descongelante –TS• 50µL de Solución diluyente - DS• 100 µL de Solución de lavado – WS

PROTOCOLO DE CALENTAMIENTO (para oocitos y embriones) NOTA: El procedimiento de calentamiento

incluye sumergir el dispositivo dentro de la solución descongelante TS a 37 °C y la dilución y lavado posteriores en DS y WS a temperatura ambiente.

1. Prepare las placas de descongelación (tal como se ilustra en el diagrama del dispositivo HSV):• A 37 °C: En condiciones de esterilidad dispense 250 µl

de solución TS en una placa estéril de 4 cavidades o en una placa de cultivo de organismos en un incubador sin CO2 a 37 oC o sobre una platina calefactora durante por lo menos 30 minutos antes de iniciar el procedimiento de calentamiento.

2. Identifique las pajuelas del HSV a descongelar del tanque de N2 líquido y páselas rápidamente al recipiente lleno con N2 líquido en preparación para el procedimiento de descongelación.

3. Coloque el recipiente de N2 líquido cerca del microscopio para agilizar la manipulación subsiguiente.

4. Saque la placa con la solución TS del incubador a 37 °C o de la platina calefactora y colóquela bajo el objetivo sobre la platina del microscopio.

5. Saque la pajuela lo suficiente para dejar expuesto el vástago de color para manipulación. Asegúrese que el extremo con el espécimen (o los especímenes) permanezca sumergido en el N2 líquido.

6. Sostenga la pajuela del HSV firmemente entre los dedos, posicione las tijeras aproximadamente en la mitad del vástago de color y marque con cuidado la pajuela externa presionando repetidamente las tijeras mientras la gira para realizar incisiones consecutivas alrededor de ella.

7. Utilice las tijeras como si fueran pinzas para agarrar el capilar y sacarlo de la pajuela.

8. Sumerja inmediatamente el extremo portador de los especimenes dentro de la solución TS a 37 °C y agítelo suavemente para desprender los especimenes del capilar y déjelo durante 1 minuto.

Los pasos 9 a 12 se deben realizar a temperaturaambiente (de 22 a 27 ºC).• A temperatura ambiente: En condiciones de

esterilidad dispense una (1) gota de 50 μL de DS sobre una placa de Petri estéril.

9. Aspire un poco de solución DS con la pipeta de transferencia y transfiera el espécimen (o los especimenes) de la placa de solución TS con el mínimo volumen al gota de el solución DS para 4 minutos.

NOTA: El espécimen (o los especimenes) permanecerá(n) contraído(s) durante la exposición a la solución DS.

DURANTE ESTE INTERVALO DISPENSE 2 GOTAS DE 50 µL DE SOLUCIÓN WS (WS1, WS2) COMO SE ILUSTRA EN EL DIAGRAMA DEL DISPOSITIVO HSV.

10. Transfiera la muestra/s al de la primera gota de WS (WS1) para 4 minutos.

trasferimento o la coltura estesa degli embrioni).NOTABENE: Oocite ricuperati devono essere recuperate utilizzando ICSI per la fertilizzazione ottima dopo vetrificazione.

Per ulteriori dettagl sull’uso de queste prodotti, il laboratorio dovrebbe consultare le sue protocolli/tecniche standard che sono statti specificamente fatti ed ottimizzatti per la sua impianto.

ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE E STABILITÀConservare i flaconi chiusi refrigerati a temperatura tra 2 °C e 8 °C. Quando sono conservate nel modo indicato, le soluzioni del kit di congelamento per vetrificazione sono stabili sino alla scadenza indicata sulle loro etichette.

Una volta aperti i contenitori, non utilizzare il mezzo per un periodo superiore a otto (8) settimane.

Nel prodotto è presente materiale di origine umana e si possono sviluppare sostanze particellari durante la conservazione. Per quanto noto, questo tipo di sostanze particellari non ha nessun effetto sulle prestazioni del prodotto.

PRECAUZIONI ED AVVERTIMENTTIQuesto dispositivo è previsto per l’uso da parte di personale addestrato nelle procedure che comprendono le applicazioni indicate per le quali il dispositivo è previsto.

Non utilizzare fiale di soluzione che evidenzi qualsiasi torbidezza o particelle di materiale

Per evitare i problemi di contaminazione, maneggiare utilizzando tecniche in asepsi.

Le Soluzioni di Disgelo di Vetrificazione contengono l’antibiotico solfato di gentamicina. Le precauzioni appropriate devono essere pressi per assicurare che il paziente non è allergico a questo antibiotico.

Attualmente, gli studi di ricerca indicano che gli effetti lungo termine di vetrificazione sull’embrione rimangono sconosciute.

*I derivati da sangue umano usati nella fabbricazione di questo prodotto sono stati testati tramite kit autorizzati dalla FDA e hanno mostrato di essere non reattivi verso l’antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg), gli anticorpi per l’epatite C (HCV) e gli anticorpi per il virus dell’immunodeficienza umana (HIV). Tuttavia, nessun metodo di analisi offre una garanzia completa che i prodotti derivati da fonti umane siano non infettivi. Manipolare tutti i derivati da sangue umano come se fossero in grado di trasmettere infezioni, adottando le precauzioni universali. I donatori del materiale d’origine sono stati sottoposti anche ad analisi per il rischio di esposizione alla malattia di Creutzfeldt-Jacob (CJD, Creutzfeldt-Jacob disease).

Non usare flaconi in cui la confezione sterile sia stata compromessa.

CAUTELA: La legge federale (U.S.) se limita questo meccanismo/prodotto a la vendita da o sull’ordine di un medico o dottore.

(Nota: la muestra/s debe reexpanderse hasta su volumen original en los 2-3 minutos en WS).

11. Transfiera la muestra/s a la de la segunda gota de WS (WS2) para 4 minutos.

12. Finalmente, transfiera la muestra a una placa pre-equilibrada con el medio de cultivo adecuado (con suplemento proteico). Incube las muestras en un incubador a 37ºC con CO2 durante 3-4 horas para completar su recuperación antes de proceder a otras manipulaciones (fertilización de oocitos, transferencia o continuación del cultivo de embriones).

NOTA: los oocitos recuperados deben fertilizarse con la técnica ICSI para obtener ferti l izaciones óptimas después de la vitrificación.

Para más detalles sobre la utilización de estos productos, consulte los protocolos de trabajo de su propio laboratorio, los cuales han sido desarrollados y especialmente optimizados de acuerdo a su programa médico particular.

INSTRUCCIONES DE CONSERVACIÓN Y ESTABILIDADConserve los envases no abiertos refrigerados a una temperatura de 2 º a 8 ºC. Si se conservan según lo indicado, las soluciones del kit de Congelación post Vitrificación son estables hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas de los envases.

No utilice el medio durante más de ocho (8) semanas después que los recipientes hayan sido abiertos.

Ya que el producto contiene sustancia de origen humano puede desarrollar partículas durante el almacenaje. No hay evidencia que partículas de esta clase tengan un efecto sobre el funcionamiento del producto.

PRECAUCIONES Y ADVERTENCIASEste dispositivo debe ser utilizado por personal capacitado en procedimientos que incluyan la aplicación prevista para el mismo.

No utilice ningún vial cuya solución muestre evidencias de material precipitado o turbio.

Para evitar problemas de contaminación, utilice técnicas asépticas de manipulación.

Las Soluciones del Kit Descongelante de Vitrificación contienen el antibiótico sulfato de gentamicina. Debe tomar las precauciones adecuadas para asegurar que la paciente no es sensible a dicho antibiótico.

En la actualidad, la bibliografía indica que los efectos a largo plazo de la vitrificación de embriones son aún desconocidos.

*Los hemoderivados humanos utilizados en la fabricación de este producto han sido probados mediante kits autorizados por la FDA y se ha determinado que no son reactivos para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), los anticuerpos frente a la hepatitis C (VHC) ni los anticuerpos frente al virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Sin embargo, ningún método analítico ofrece garantías absolutas de que los productos derivados de fuentes humanas no sean infecciosos. Manipule todos los hemoderivados humanos como si fueran capaces de transmitir infecciones, utilizando precauciones universales. Los donantes del material fuente también se han sometido a pruebas de detección del riesgo de exposición a la enfermedad de Cruetzfeldt-Jakob (ECJ).

No usar frascos en los que el envase estéril esté dañado.

PRECAUCIÓN: Las leyes federales (U.S.) restringen la venta de este producto a la prescripción de un facultativo.

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13. Van den Abbeel E, Camus M, Van Waesberghe L, Devroey P, Van Steirteghem AC. A randomized comparison of the cryopreservation of one-cell human embryos with a slow controlled-rate cooling procedure or a rapid cooling procedure by direct plunging into liquid nitrogen. Hum. Reprod. 12:1554-1560, 1997.

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15. Kasai M. Vitrification: a refined strategy for the preservation of mammalian embryos. [Review] J. Mamm. Ova Res., 14:17-28, 1997.

16. Ohta N, Nohara M and Kojimahara T. Ultrarapid freezing of human embryos by vitrification method, A case of delivery. Jpn. J. Fertil. Steril. 41:276-279, 1996.

17. Feichtinger W, Hochfellner C, and Ferst C. Clinical experience with ultra-rapid freezing of embryos. Hum. Reprod., 6:735-736, 1991.

18. Rall WF. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification. Cryobiology 24:387-402, 1987.

19. Rall WF, Fahy GM. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at –196°C by vitrification. Nature 313:573-575,1985.

37°C H20+24000°C/min

(3 sec)LN2

Waterbath > 500 mL

TS1 min250 µL

37°C

Transfer to Culturemedium with 20% (v/v)

protein for Recovery

WS1

DS

WS2

(4 min)

4 min each

50 µL Drops

European RepresentativeMPIESchutweg 13A5145 NP Waalwijk, The Netherlands

See instructionsfor use.

0050

8°C

2°C

Symbols:

Storage Temperature

Sterilized using aseptic processing techniques

(filtration)

Catalog Number

Expiration: Year - Month - Day

Lot Number

Caution: See instructions for use

MPIE Schutweg 13a5145 NP Waalwijk,

The Netherlands

CE Mark0050

Manufacturer

Vitrification Thaw Kit (Vit Kit® - Thaw)

ENGLISH

INTENDED USEVit Kit® - Thaw is intended for use in assisted reproductive procedures for warming and recovery of human oocytes (MII) and embryos (PN to blastocyst) that have been vitrified using Irvine Scientific’s Vitrification Freeze Kit (Catalog No. 90133-HSV, 90133-SO)

PRODUCT DESCRIPTIONThawing Solution-TS is a HEPES buffered solution of Medium-199 containing gentamicin sulfate (35 µg/mL), 1.0 M sucrose and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement.

Dilution Solution-DS is a HEPES buffered solution of Medium-199 containing gentamicin sulfate (35 µg/mL), 0.5M sucrose and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement.

Washing Solution-WS is a HEPES buffered solution of Medium-199 containing gentamicin sulfate (35 µg/mL) and 20% (v/v) Dextran Serum Supplement *.

These three solutions are to be used in sequence according to the step-wise microdrop warming protocol.

QUALITY ASSURANCEThe solutions in Vit Kit-Thaw are membrane filtered and aseptically processed according to manufacturing procedures which have been validated to meet a sterility assurance level (SAL) of 10-3.Each lot of Vit Kit - Thaw receives the following tests:Solutions: Endotoxin by Limulus Amebocyte Lysate (LAL) methodology Biocompatibility by Mouse Embryo Assay (one-cell) Sterility by the current USP Sterility Test All results are reported on a lot specific Certificate of Analysis which is available upon request.

FOR WARMING CRYOTIP AS THE CARRIER:MATERIALS REQUIRED BUT NOT INCLUDED• Irvine Scientific Connector (Catalog No. 40736) or adaptor• Sterile Petri Dishes (50 X 9 mm, Falcon 351006 or

equivalent)• Disposable gloves• Hamilton GASTIGHT® Syringe (50 µL) catalog #80901• Transfer pipettes (pulled glass pipettes or micropipette tips

with an inner tip diameter of ~200 µm)• Tweezers• Stopwatch or timer• Liquid Nitrogen Reservoir (Dewar or Styrofoam container

with lid, 1-2 L volume)• Liquid Nitrogen (sufficient volume to achieve 4 inch depth

in reservoir)• Sharp scissors (sterile)• 37°C waterbath• Culture Medium (with protein) appropriate for develop mental

stage of specimen to be recovered.• Prepare and pre-equilibrate dish with culture medium to 37°

C in CO2 incubator prior to warming specimens.

DIRECTIONS FOR USEVit Kit-Thaw components (per application):

• 50 µL of Thawing Solution –TS• 50 µL of Dilution Solution-DS• 100 µL of Washing Solution-WS• 1 Connector

WARMING PROTOCOL (FOR OOCYTES AND EMBRYOS):NOTE: Procedures are to be done at room temperature (20-27º C). DO NOT use heated microscope stage for the following procedures. CAUTION: Minimize exposure of specimen to light during manipulations through thawing solutions.1. Bring the quantity to be used of TS, DS and WS to room

temperature (20-27°C) prior to warming vitrified specimens. NOTE: Avoid bringing the entire vials of TS,

DS and WS to room temperature repeatedly when a small quantity of the solution is needed each time. It is better to aliquot the quantity to be used and return the vials to 2-8°C right after aliquoting.

ITALIANO

USO PROGETTATOIl Vit Kit® - Thaw è previsto per l’uso nelle procedure di riproduzione assistita per il riscaldamento e il recupero di ovociti umani (MII) e di embrioni (PN a blastocita) che sono stati vetrificati usando il kit di congelamento per vetrificazione di Irvine Scientific (codice di catalogo 90133-HSV, 90133-SO).

DESCRIZIONE DEL PRODOTTOSoluzione di Disgelo-TS è una soluzione di tampone Medio-199 che contiene solfato di gentamicina (35 µg/mL), 1,0 M di sucrosio e 20% (v/v) di Supplemento di Siero di Dextran*.

Soluzione di Diluzione - DS è una soluzione di tampone Medio-199 che contiene solfato di gentamicina (35 µg/mL), 0,5 M di sucrosio e 20% (v/v) di Supplemento di Siero di Dextran*.

Soluzione di Sciacquata – WS è una soluzione di tampone Medio-199 che contiene solfato di gentamicina (35 µg/mL) e 20% (v/v) di Supplemento di Siero di Dextran*.

Queste tre soluzioni devono essere usate in ordine seguendo il protocollo di riscaldamento graduale a microgocce

ASSICURAZIONE DELLA QUALITÁ DEL PRODOTTOIl Kit di Disgelo di Vit sono filtrati sulle membrane e controllate asetticamente in accordo con le tecniche di fabbricazione che erano state convalidate per assicurare un livello di sterilità (SAL) di 10-3.

Ogni lotto di Kit di Disgelo di Vit riceve i seguenti controlli:Soluzioni: Endotossine via metodologia di LAL Biocompatibilità via assay (test) d’embrione di topo (una cellula) Sterilizzazione via il Test di Sterilità attuale di USP Tutti i risultati sono archiviati su un lotto-specifico Certificato di Analisi, disponibile su richiesta.

PER RISCALDARE CRYOTIP COME PORTATORE:MATERIE RICHIESTE MA NON INCLUSE• Connettore Irvine Scientific (N° di catalogo 40736) o

adattatore• Capsule di Petri Sterilizzati (50 X 9mm, Falcon 351006 o

equivalente)• Guanti usa e getta• Hamilton GASTIGHT® Siringa (50 µL, catalogo #80901)• Pipetta di trasferimento(pipette di vetro tirati o diametro con

punto interiore ~200µm)• Pinzette• Arresto vigilato o timer• Serbatoio di Nitrogeno in Liquido (contenitore di Dewar or

Styrofoam con tappo, volume di 1-2 L)• Nitrogeno di Liquido(volume sufficiente per arrivare ad una

profondità di 4 pollici nella serbatoio)• Forbice affiliate (sterilizzate)• Bagno d’acqua (waterbath) di 37° C• Preparare un piatto equilibrato con mezzo di coltura a

37 °C in incubatrice a CO2 prima di riscaldare i campioni.

ISTRUZIONI PER L’USOComponenti di Kit di Disgelo di Vit (per applicazione):

• 50 µL di Soluzione di Disgelo – TS• 50 µL di Soluzione di Diluizione – DS• 100 µL di Soluzione di Sciacquata – WS• 1 Connettore (re-utilizable)

PROTOCOLLO DI RISCALDAMENTO (per oocite ed embrioni):NOTABENE: I PROCEDIMENTI/TECNICI DEVONO ESSERE FATTI A TEMPERATURA AMBIENTALE (20-27° C). NON UTILIZZARE MICROSCOPI SCALDATI PER LE TECNICHE SEGUENTI. ATTENZIONE: MINIMIZZARE L’ ESPOSIZIONE ALLA LUCE DURANTE LE MANIPOLAZIONI ATTRAVERSO LE SOLUZIONI DI DISGELO.1. Prima di riscaldare i campioni vetrificati, portare la quantità

di TS, DS e WS da usarsi a temperatura ambiente (20-27 °C).

NOTA: evitare di portare ripetutamente a temperatura ambiente intere fiale quando serve solo una piccola quantità di prodotto ogni volta. È meglio prelevare solo la quantità da utilizzare e rimettere le fiale a 2-8 °C subito dopo il prelievo.

ESPAÑOL

APLICACIÓNEl kit Vit Kit® - Thaw se ha desarrollado para el calentamiento y recuperación de oocitos humanos (MII) y embriones (PN a blastocisto) que han sido vitrificados utilizando el kit de congelación por vitrificación (Vit Kit™-Freeze, nº cat. 90133, 90133-HSV, 90133-SO) de Irvine Scientific en procesos de reproducción asistida.

DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTOSolución Descongelante-TS: es una solución de Medio-199 tamponada con HEPES que contiene sulfato de gentamicina (35 µg/mL), 1M de sacarosa y 20% (v/v) de Dextran Serum Supplement*.

Solución Diluyente-DS: es una solución de Medio-199 tamponada con HEPES que contiene sulfato de gentamicina (35 µg/mL), 0.5M de sacarosa y 20% (v/v) de Dextran Serum Supplement*.

Solución de Lavado-WS: es una solución de Medio-199 tamponada con HEPES que contiene sulfato de gentamicina (35 µg/mL y 20% (v/v) de Dextran Serum Supplement*.

Estas tres soluciones deben utilizarse secuencialmente de acuerdo a los pasos del protocolo de calentamiento en micro gotas.

CONTROL DE CALIDADLas soluciones incluidas en el Vit Kit-Thaw están filtradas a través de membrana y procesadas en condiciones de esterilidad de acuerdo a los procesos de manufacturación validados para conseguir un nivel de garantía de esterilidad (SAL) de 10-3.

Cada lote de Vit Kit-Thaw se somete a los siguientes ensayos:Soluciones: Endotoxinas por el método LAL Biocompatibilidad por ensayo en embriones de ratón (1 célula) Esterilidad de acuerdo al ensayo de esterilidad USP vigente Todos los resultados se reflejan en el Certificado de Análisis específico de lote disponible previa solicitud.

PARA CALENTAR LA CRYOTIP COMO PORTADORA:MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO EN EL KIT• Conector de Irvine Scientific (n.º de catálogo 40736) o

adaptador• Placas de Petri estériles (50 x 9 mm, Falcon 351006 o

equivalentes)• Guantes desechables • Hamilton GASTIGHT® jerinuilla (50 µL, nº catálogo 80901)• Pipetas de transferencia (pipetas de cristal estiradas o puntas

de micropipeta con un diámetro interior de aprox. 200 µm).• Pinzas• Cronómetro o reloj• Contenedor de nitrógeno líquido (contenedor Dewar o

Styrofoam con tapa, con capacidad para 1-2 L)• Nitrógeno líquido (volumen suficiente para conseguir una

profundidad en el contenedor de unos 10cm)• Tijeras afiladas estériles • Baño de agua a 37ºC• Prepare y pre-equilibre una placa con medio de cultivo a 37

ºC en incubador de CO2 antes de calentar las muestras.

INSTRUCCIONES DE USOComponentes del Vit Kit-Thaw (por aplicación):

• 50 µL de Solución Descongelante-TS• 50 µL de solución diluyente-DS• 100 µL de solución de lavado-WS• 1 Conector

PROTOCOLO DE CALENTAMIENTO(PARA OOCITOS Y EMBRIONES)NOTA: todo el protocolo debe realizarse a temperatura ambiente (20-27ºC). NO UTILICE la platina calefactora del microscopio. PRECAUCIÓN: Minimice la exposición de la muestra a la luz durante su manipulación a través de las soluciones de descongelación.1. Lleve la cantidad a utilizar de TS, DS y WS a la temperatura

ambiente (20 ºC a 27 ºC) antes de calentar los especimenes vitrificados.

NOTA: Evite llevar repetidamente la totalidad de los viales de las soluciones TS, DS y WS a la temperatura ambiente cuando sólo se necesita una pequeña cantidad de solución en cada caso. Es mejor sacar la parte alícuota que se

2. Fill the liquid nitrogen reservoir with liquid nitrogen (~80 % full) and place close to the LN2 freezer containing the specimens to be thawed.

3. Remove the canes with goblets containing the CryoTips with vitrified specimens from liquid nitrogen storage and transfer them into the liquid nitrogen filled reservoir.

CAUTION: Make sure that CryoTips remain submerged in LN2 (in goblet) during transfer from storage to LN2 reservior to prevent uncontrolled thawing of specimens.

Place the reservoir close to the microscope for rapid manipulation.

4. Label a sterile petri dish (or lid) with necessary information.5. Gently invert each vial of TS, DS and WS twice to mix

contents before use.6. Prepare the dish with droplets of solutions for warming

protocol as follows:

Aseptically dispense a sequence of 2 microdrops on an inverted lid of sterile Petri dish as shown in Figure 1, and place the dish on the microscope stage: • one-50 µL drop of TS • one-50 µL drop of DS • (Two drops of WS will be set up later at step 13)

7. Place the 37°C waterbath close to the microscope. Have the following nearby: a transfer pipet and tips, sterile sharp scissors, Hamilton syringe and sterile wipes.

8. Using tweezers (or tongs), retrieve the specific CryoTip from the cane in liquid nitrogen, quickly immerse the CryoTip into the 37°C waterbath (> 500 mL) and swirl gently for 3 seconds to warm (see Figure 2) at + 24,000°C/min.

9. Quickly dispense contents of CryoTip as follows (see Figure 3):• Quickly wipe the CryoTip dry with a sterile wipe• Remove metal cover sleeve• Cut the seal on the wide end of the CryoTip at Mark #4• Attach wide end of the CryoTip securely to Hamilton

syringe or appropriate aspiration tool using a connector or adaptor.

NOTE: Lift up the plunger of the syringe about 0.5 inches before attaching the syringe to the Connector and the CryoTip.

• Gently wipe the fine tip dry with a sterile wipe. • With the CryoTip positioned over the prepared thawing

dish, quickly cut the seal on the Mark #2 of the fine tip end and dispense the contents of the CryoTip as a small drop (~ 1 µL) onto a dry region of the dish above the TS drop (see Figure 4).

NOTE: AVOID BUBBLES WHILE DISPENSING THE CONTENTS.

10. Merge the TS drop with the CryoTip content and allow gradual mixing for 1 minute (see Figure 4).

Note: the specimens will shrink and float to the top of the drop.

NOTE: After each transfer of the specimen(s), blow out any remaining fluid in the transfer pipet and draw up some solution from the next drop prior to the next manipulation. Avoid creating bubbles during the transfers.

11. Draw up some DS into the transfer pipet and transfer the specimen(s) from the drop of TS with minimal volume to the drop of DS for 4 minutes.

NOTE: The specimen will remain shrunken during exposure to DS.)

DURING THIS TIME SET UP THE TWO-50 µL DROPS OF WS (WS1, WS2), AS SHOWN IN FIGURE 4.

12. Transfer the specimen(s) to the drop of WS (WS1) for 4 minutes.

NOTE: The specimen(s) should re-expand to the original size within 2-3 minutes in WS.

13. Then transfer the specimen(s) to the second drop of WS (WS2) for 4 minutes.

14. Finally, transfer the specimen to a pre-equilibrated culture dish containing the appropriate culture medium (with protein). Incubate the specimens accordingly in a 37ºC incubator with CO2 for 3-4 hours to complete recovery prior to further manipulations (e.g. fertilization of oocytes, transfer or extended culture of embryos).

2. Riempire il serbatoio con nitrogeno liquido (~80% pieno e metterlo vicino al congelatore LN2 che contiene campioni che devono essere disgelati.

3. Rimuovere le canne con goblets che contengono i CryoTips con i campioni vetrificati dallo stoccaggio di nitrogeno liquido e trasferendoli nel serbatoio riempito di nitrogeno liquido.

ATTENZIONE : Assicuratevi che Il Kit di Disgelo di Vit rimangano sottomessi nel LN2 (goblet) durante il trasferimento dallo stoccaggio al serbatoio LN2 per prevenire disgelo non-controllato del campione.

Mettere il serbatoio vicino al microscopio per una rapida manipolazione.

4. Mettere l’ etichetta sul piatto di Petri sterilizzato (o tappo) con i dati necessari.

5. Invertire accuratamente ogni fialetta di TS, DS a WS due volte per mescolare il contenuto prima dell’uso.

6. Preparare nel modo seguente il piatto con goccioline di soluzione per il protocollo di riscaldamento:

Disporre asetticamente una sequenza di 2 microgocce su una tappa invertita nel piatto di Petri sterilizzato come mostrato in Figura 1, mettere il piatto sul microscopio:• una goccia di 50 µL di TS• una goccia di 50 µL di DS• (Due gocce di WS verranno messe dopo nel passo 13)

7. PMettere in acqua a temperatura di 37° C vicino al microscopio. Mantienile vicine: una pipetta di trasferimento, forbice, Hamilton siringa e wipes sterilizzate.

8. Utilizzando le pinzette( o tongs), prendi il CryoTip specificato dalla cana in nitrogeno liquido, immergere il CryoTip velocemente nell’ acqua a 37° C (>500 mL) e mescolare accuratamente per 3 secondi aspettare il caldo (vedi Figure 2) a + 24,000° C/min.

9. Dispensare velocemente i contenenti del CrypTip cosi(vedi Figure 3):• Pulire velocemente lo CryoTip con un fazzoletto

sterilizzato.• Togliere la copertura metallica• Tagliare il sello sulla parte grande dello CryoTip al marchio

#4.• Unire saldamente l’estremità svasata di CryoTip alla siringa

Hamilton o ad uno strumento di aspirazione adeguato utilizzando un connettore o un adattatore.

NOTA: Alzi il nucleo mobile della siringa circa 0.5 pollici prima del fissaggio al connettore ed al CryoTip.

• Con il CryoTip in posizione sulla capsula pronto per il disgelo, tagliare velocemente il sigillo e dispensare i contenenti dello CryoTip come una goccia piccola(~1µL) su una porzione asciutta sulla goccia di TS (vedi Figure 4).

NOTABENE: EVITARE LE BOLLE D’ARIA QUANDO SI DISPENSA I CONTENENTI.

10. Mescolare la goccia TS con il contenuto di CryoTip e consentire una miscelazione graduale per 1 minuto (vedere Figura 4).

NOTABENE: i campioni diminuiscono e galleggiano al superficie della goccia.

NOTABENE: Dopo il trasferimento dei campioni, togliere qualsiasi rimanenze di fluido nella pipetta di trasferimento e portare una quantità di soluzione dalla goccia successive prima della prossima manipolazione. Evitare di creare le bolle d’aria tramite i trasferimenti.

11. Portare qualche quantità di DS nella pipetta e trasferire il campione dalla goccia di TS con un volume minimo al goccia di DS Per 4 minuti.

NOTABENE: Il campione rimane piccolo/diminuito durante l’ esposizione al DS. DURANTE QUESTO PERIODO, PREPARARE LE DUE GOCCE DI 50µL DI WS(WS1, WS2), COME MOSTRATA NELLA FIGURA 4.

12. Trasferire il campione (s) alla prima goccia di WS (WS1) per 4 minuti.

NOTABENE: I CAMPIONI DEVONO TORNARE ALLA LARGHEZZA ORIGINALE IN MENO DI 2-3 MINUTI IN WS.

13. Poi trasferire il campione (s) alla seconda goccia di WS (WS2) per 4 minuti.

14. Trasferire finalmente il campione a un piatto pre-equilibrato che contiene la sostanza di coltura appropriata (con proteina). Incubare i campioni in accordo in una incubatrice di 37° C con CO2 per 3 o 4 ore per completare il ricupero prima di ulteriori manipolazioni (per esempio: la fertilizzazione di oocite, il trasferimento o la coltura estesa degli embrioni).

va a utilizar y devolver los viales a la gama de temperatura de 2 a 8 °C inmediatamente después de hacerlo.

2. Llene el contenedor de N2 líquido con N2 líquido (~ 80% lleno) y colóquelo cerca del congelador de N2 que contiene las muestras a descongelar.

3. Saque del tanque de N2 líquido las cestas con los goblets que contienen los CryoTips con las muestras vitrificadas a descongelar y transfiéralas al contenedor que ha rellenado con N2 líquido.

PRECAUCIÓN: Asegúrese que los CryoTips permanecen sumergidos en el N2 líquido (en la cesta) durante la transferencia para evitar la descongelación descontrolada de las muestras.

Coloque el contenedor cerca del microscopio para una rápida manipulación.

4. Etiquete una placa de Petri estéril (o tapa) con la información necesaria.

5. Suavemente invierta 2 veces cada vial de TS, DS y WS antes de usarlos para mezclar su contenido.

6. Prepare la placa con gotas de soluciones para el protocolo de calentamiento de la siguiente manera:

En condiciones de esterilidad dispense una serie de 2 microgotas sobre la tapa invertida de una placa de Petri como se muestra en la Figura 1, y coloque la placa en la platina del microscopio:

• 1 gota de 50 µL de TS• 1 gota de 50 µL de DS• (más tarde, en el paso 13, se dispensarán 2 gotas de WS)

7. Sitúe el baño de agua a 37ºC cerca del microscopio. Tenga cerca el siguiente material: una pipeta de transferencia y puntas, tijeras afiladas estériles, la Hamilton GASTIGHT® jerinuilla, y toallitas estériles.

8. Utilizando pinzas recupere el CryoTip específico de la cesta en nitrógeno líquido, sumérjalo rápidamente en el baño de agua a 37ºC (>500 mL) y agite suavemente durante 3 segundos para calentamiento (ver Figura 2) a +24000ºC/min.

9. Dispense rápidamente el contenido del CryoTip de la siguiente manera (ver Figura 3):• Seque rápidamente el CryoTip con un papel estéril• Quite la cubierta de metal.• Corte el sello en el extremo ancho del CryoTip en la Marca

# 4.• Fije el extremo ancho del CryoTip a la jeringa Hamilton o

a una herramienta apropiada de aspiración mediante un conector o adaptador.

NOTA: Levante el émbolo de la jeringuilla aproximadamente 0.5 pulgada antes de unir al conectador y al CryoTip.

• Con delicadeza, seque el CryoTip con una toallita estéril• Con el CryoTip situado sobre la placa de descongelación

preparada, corte el sellado sobre la Marca # 2 del extremo fino de la punta y dispense el contenido del CryoTip como un pequeña gota sobre una zona seca de la placa por encima de la gota de TS (ver Figura 4).

NOTA: EVITE LA FORMACIÓN DE BURBUJAS AL DISPENSAR EL CONTENIDO.

10. Combine la gota de TS con el contenido de la CryoTip y permita la mezcla gradual durante un (1) minuto (véase la Figura 4).

NOTA: las muestras sufrirán un pérdida de volumen y flotarán hacia la superficie de la gota.

NOTA: después de cada transferencia de la muestra, expela el contenido de la pipeta de transferencia y aspire un poco de la solución de la siguiente gota antes de la siguiente manipulación. Evite la formación de burbujas durante las transferencias.

11. Aspire un poco de DS con la pipeta de transferencia y transfiera la muestra/s de la gota de TS con el mínimo volumen al de la gota de DS (DS1) dejándola 4 minutos.

NOTA: la muestra permanecerá encogida durante la exposición a DS.

DURANTE ESTE INTERVALO DISPENSE 2 GOTAS DE 50µL DE WS (WS1, WS2) COMO SE MUESTRA EN LA FIGURA 4.

12. Transfiera la muestra/s al de la gota de WS (WS1) para 4 minutos.

(Nota: la muestra/s debe reexpanderse hasta su volumen original en los 2-3 minutos en WS).

13. Transfiera la(s) muestra(s) a la segunda gota de WS (WS2) por 4 minutos.

14. Finalmente, transfiera la muestra a una placa pre-equilibrada con el medio de cultivo adecuado (con suplemento proteico).

2511 Daimler Street, Santa Ana, California 92705-5588Telephone: 1 949 261 7800 • 1 800 437 5706

Fax: 1 949 261 6522 • www.irvinesci.comPN 40696 Rev.17

For assisted reproductive procedures.

Für betreute fortpflanzungsverfahren.

Per tecniche di riproduzione assistita.

Para utilización en técnicas de reproducción asistida.

Pour les techniques de procréation médicalement assistée.

Para utilização em técnicas de reprodução assistida.

Για διαδικασίες επιβοηθούμενης αναπαραγωγής.

Pro technologie asistované reprodukce.

Til brug ved assisteret reproduktion.

Avusteisiin lisääntymismenettelyihin.

Ar palīglīdzekļiem veicamām reproduktīvām procedūrām.

Voor geassisteerde voortplantingsprocedures.

Dla procedur wspomagających rozrodczość.

Pentru asistenţă privind procedurile de reproducere.

För procedurer för assisterad reproduktion.

Kasutamiseks reproduktiivse abi protseduurides.

Asszisztált reprodukciós eljárásokhoz.

Skirta pagalbinio apvaisinimo procedūroms.

Yardımla üreme prosedürleri için.

GASTIGHT® is a Registered Trademark of Hamilton Co.

Catalog No. 90137-SO Includes: • Thawing Solution - TS (yellow cap) 4 x 1 mL Vials • Dilution Solution - DS (orange cap) 1 x 1 mL Vials • Washing Solution - WS (red cap) 1 x 2 mL Vials

TS

DS

50 µLDrops

Figure 1:

Figure 2:

Seal #1

Seal #2Mark #4

Mark #1

Mark #2

Mark #3

Cut #2

Cut #1

37°C

AfterWarming

Figure 3:

4 min each

1 min

Transfer to Culture Mediumwith 20% (v/v) protein for Recovery

WS1 WS2

TS

DS

50 µLDrops

4 min

CryoTipContents(~1 µL)

Figure 4:

HSV Device Diagram:

TS = Thawing SolutionDS = Dilution SolutionWS = Washing Solution

FOR WARMING HSV DEVICE AS THE CARRIER:MATERIAL REQUIRED BUT NOT INCLUDED

• Sterile 4-well dish (Nunc 179830, 144444 or equivalent), or organ culture dish (BD Falcon 353037)

• Disposable gloves• Transfer pipettes• Tweezers• Stopwatch or timer• Liquid nitrogen resevoir• Liquid Nitrogen• Scissors• Culture Medium with protein, pre-equilibrated to 37°C

in CO2 incubator prior to thawing procedure.• 37°C incubator without CO2, or heating stage

DIRECTIONS FOR USEVit Kit – Thaw components (per application)

• 250 µl of Thawing Solution –TS• 50µL of Dilution Solution - DS• 100 µL of Washing Solution – WS

WARMING PROTOCOL (for oocytes and embryos):

NOTE: The warming steps include plunging the device into the 37°C TS and subsequent diluting and washing in DS and WS at room temperature

1. Set up warming dishes (as shown in HSV device diagram):• At 37°C: Aseptically dispense 250 µl of TS into a

sterile 4-well dish or an organ culture dish and place it in a 37°C incubator without CO2 or on a heating stage at least 30 minutes prior to warming procedure

2. Identify HSV Straw(s) to be warmed from LN2 storage and quickly transfer to LN2 filled reservoir in preparation for thawing procedure.

3. Place LN2 reservoir close to microscope for subsequent rapid manipulation.

4. Remove TS dish from 37°C incubator or heating stage and place it under focus on top of the microscope stage.

5. Lift the straw enough to expose the colored handling rod. Make sure the end with the specimen(s) remains immersed in the LN2.

6. Hold the HSV Straw firmly between fingers, place the scissors around the center of the colored rod and carefully score the outer straw by pressing the scissors repetitively while rotating the straw to perform successive incisions around the external straw.

7. Use the scissors as tweezers to grab the capillary rod and extract it out of the straw.

8. Immediately plunge the gutter into the 37°C TS and gently swirl to detach specimens from device and leave it for 1 minute.

Steps 9-12 must be performed at room temperature (22-27°C).

• At room temperature: Aseptically dispense one (1) 50 µL drop of DS on a sterile Petri dish

9. Draw up some DS into the transfer pipette and transfer the specimen(s) from the TS dish with minimal volume to the drop of DS for 4 minutes.

NOTE: The specimen will remain shrunken during exposure to DS.

DURING THIS TIME SET UP THE TWO-50 µL DROPS OF WS (WS1, WS2), AS SHOWN IN HSV DEVICE DIAGRAM.

10. Transfer the specimen(s) to the drop of WS (WS1) for 4 minutes.

NOTE: The specimen(s) should re-expand to the original size within 2-3 minutes in WS.

11. Then transfer the specimen(s) to the second drop of WS (WS2) for 4 minutes.

12. Finally, transfer the specimen to a pre-equilibrated culture dish containing the appropriate culture medium (with protein). Incubate the specimens accordingly in a 37ºC incubator with CO2 for 3-4 hours to complete recovery prior to further manipulations (e.g. fertilization of oocytes, transfer or extended culture of embryos).

NOTE: Recovered oocytes must be fertilized using ICSI for optimal fertilization after

vitrification.

For additional details on the use of these products, each laboratory should consult its own laboratory procedures and protocols