2011_5 transformacion vegetal
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5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
AgrobiotecnologaCurso 2011
Sistemas de transformacin vegetal
Alejandro Mentaberry
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Sistemas de transferencia gentica en plantas
Referencias
Biologa deAgrobacterium tumefaciens
Vectores basados en el plsmidos T
Protocolos de transformacin medianteA. tumefaciens yA. rhizogenes
Sumario
Genes reporteros
Agrobiotecnologa
Sistemasde transformacinvegetal
Transformacin por biobalstica
Transformacin con whiskersde carburo de silicio
Transformacin por microinyeccin
Sistemas de transformacin gentica de plantas portransferencia directa de ADN
Transformacin mediante electroporacin y/omtodos qumicos
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Sistemas de transferencia gentica
en plantas
Agrobiotecnologa
Sistemasde transformacinvegetal
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Cultivo
de tejidos ytransformacin
gentica
No
satisfactorio
No
satis
factorio
Agrobiotecnologa
Sistemasde transformacinvegetal
Adaptado de: Birch, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1997.
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Tipos
de explantosusados para latransformacinde diferentes
especies
Especie Tipo de explanto
Tabaco Cotiledn, hoja, tallo
Petunia Hoja
Tomate Cotiledn, hoja
Lechuga Cotiledn, hoja
Arabidopsis Hoja, raz
Lino Hoja, hipoctilo, cotiledn
Brassica napus Tallo, hipoctilo, cotiledn
Girasol Hipoctilo
Algodn Hipoctilo, cotiledn
Papa Tallo, hoja
Soja cotiledn
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Sistemas de transferencia de ADN basadosen vectores biolgicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciensy Agrobacterium rhizogenes
- Sistemas basados en virus vegetales
Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por biobalstica
- Transferencia mediada por cationes divalentes
y/o electroporacin
- Transferencia con whiskersde carburo de silicio
- Transferencia por microinyeccin
Sistemas de
transformacingenticaen plantas
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Biologa de Agrobacterium tumefaciens
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Agrobacterium
tumefaciens
Tumor de tallo provocado
por Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
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Ciclo de la enfermedad de la agalla de corona
causada por Agrobacterium tumefaciens
Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.
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Procesos
celularesinvolucradosen las etapasde interaccin
entre la bacteriay la planta
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
Procesos celulares Etapas de infeccin
Agrobacteriumse une ala clula hesped
A: Reconocimiento clula-clula
B: Procesamiento del ADN
C: Empaquetamiento del ADN
D: Transporte intercelular
E: Importacin al ncleo
F: Integracin del ADNy expresin de los genes
BI
Hebra T
Formacin del complejo Tinmaduro, compuesto porVirD2 y la hebra T
Formacin del pilus para eltransporte del complejo Tdentro de la clula hesped
Importacin de la hebra T al
ncleo de la clula hesped
Integracin de la hebra T y laformacin del tumor
Formacin del complejo Tmaduro, compuesto porVirD2 y la hebra T cubiertapor VirE2
BD
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Mapa gentico
del plsmido Tide octopina
BI BD
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Regiones homlogas en los plsmidos Ti de octopina
(pTi Ach5) y de nopalina (pTi C58)
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La regin T est
definida por dosrepeticionesdirectas de
25 pb altamente
homlogas
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Estructura de la regin T de un plsmido Ti de octopina
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Mecanismos moleculares implicados enla transformacin por Agrobacterium tumefaciens
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
2
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Agrobacteriumtumefaciensposeeun sistemaregulatorio de doscomponentes parareconocer las
clulas vegetalessusceptibles
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El complejo T esta compuesto de una cadenasimple de ADN-T cubierta por protena VirE2. Una
nica molcula de protena VirD2 se halla unidacovalentemente al extremo 5 del DNA. Se estimaque se requieren 600 molculas de VirE2 para
recubrir los 20 Kbp del ADN-T.
Procesamiento de la hebra T y formacin del complejo T maduro
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Ensamblaje
de las protenasde Agrobacteriuminvolucradasen el transportedel complejo T
Tomado de: Zupan et al., Plant J., 2000.
VirB2
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(1) y (3): digestin de las cadenas desplazadas de ADN de la plantapor endonucleasas. (2): digestin del extremo no apareado
del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes en la cadenadesapareada del ADN de la planta
La integracindel ADN-T algenoma de la clulavegetal involucrael apareamientono homlogo entre
ste y el ADNcromosmico
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Vectores basados en plsmidos Ti
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La capacidadde Agrobacteriumtumefaciensde introducir ADNen el genomade la planta permiti
desarrollar vectoresplasmdicosbasadosen el plsmido Ti
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Ejemplo
de vectorcointegrado:pAP2034
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Ejemplos de vectores binarios
Mapa de restriccinde los plsmidospBIN19; pPZP111;pMON10098;pGreen0029.
Abreviaturas:BI: borde izquierdo;ori: origen dereplicacin;BD: borde derecho.
Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.
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Optimizacin del diseo de los vectores binarios
Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.
SiColE1pVS1BICloranfenicolSi98909pPZP111
Si
No
Si
No
No
No
Si
LacZ
Kanamicina
Tetraciclina
Gentamicina
Ampicilina
Tetraciclina
Ampicilina,
estreptomicina y
espectinomicina
Kanamicina
Seleccinbacteriana
BI
BI
BI
BD
BD
BD
BD
Marcador
deseleccin
en:
pSa
pRK2
pRi
pRK2
pRK2
pRi
pRK2
Agrobacterium
Origen de replicacin
pUC
pRK2
ColE1
ColE1
ColE1
ColE1
pRK2
E. coli
Si69200pPCV001
Si713200pGA482
Si217500pC22
Si911777pBIN19
Si425700pJJ1881
Si514440pCGN1547
No184632pGreen0029
Mobilizacin
Sitios
nicos derestriccinen ADN-T
Tamao(kb)
Vector
SiColE1pVS1BICloranfenicolSi98909pPZP111
Si
No
Si
No
No
No
Si
LacZ
Kanamicina
Tetraciclina
Gentamicina
Ampicilina
Tetraciclina
Ampicilina,
estreptomicina y
espectinomicina
Kanamicina
Seleccinbacteriana
BI
BI
BI
BD
BD
BD
BD
Marcador
deseleccin
en:
pSa
pRK2
pRi
pRK2
pRK2
pRi
pRK2
Agrobacterium
Origen de replicacin
pUC
pRK2
ColE1
ColE1
ColE1
ColE1
pRK2
E. coli
Si69200pPCV001
Si713200pGA482
Si217500pC22
Si911777pBIN19
Si425700pJJ1881
Si514440pCGN1547
No184632pGreen0029
Movilizacin
Sitios
nicos derestriccinen ADN-T
Tamao(kb)
Vector
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Genes selectores para transformacin de plantas
MetotrexatoPlsmido R67Dihidrofolato reductasadhfr
Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichushindustanus
Resistencia a bleomicinaBle
Kanamicina, G418,paromomicina, neomicina
Tn5Neomicina fosfotransferasanptII
EstreptomicinaTn5Estreptomicinafosfotransferasa
SPT
Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV
CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetiltransferasa
cat
GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa
EPSP
Fosfinotricina, bialofosStreptomiceshygroscopicus
Fosfinotricin acetiltransferasa
bar
GentamicinaSerratia marcescens;Klebsiella pneumoniaeGentamicin-3-N-acetiltransferasaaacC3, aacC4
SeleccinFuenteProducto genticoGen de seleccin
MetotrexatoPlsmido R67Dihidrofolato reductasadhfr
Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichushindustanus
Resistencia a bleomicinaBle
Kanamicina, G418,paromomicina, neomicina
Tn5Neomicina fosfotransferasanptII
EstreptomicinaTn5Estreptomicinafosfotransferasa
SPT
Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV
CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetiltransferasa
cat
GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa
EPSP
Fosfinotricina, bialofosStreptomiceshygroscopicus
Fosfinotricin acetiltransferasa
bar
GentamicinaSerratia marcescens;Klebsiella pneumoniaeGentamicin-3-N-acetiltransferasaaacC3, aacC4
SeleccinFuenteProducto genticoGen de seleccin
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4-metil triptofanoCatharanthus roseusTriptofano decarboxilasatdc
Acido 2,4diclorofenoxiactico
Alcaligenes eutrophus2,4-D monooxigenasatfdA
AtrazinaAmaranthus hybridusProtena QnpsbA
BromoxinilKlebsiella ozaenaeBromoxinil nitrilasabxn
SulfonamidaPlsmido R46Dihidropteroato sintasasul
Alta concentracin de
lisina y treonina
E. coliAspartato kinasaAK
S-aminoetil L-cistenaE. coliDihidroxipicolinato sintasaDHPS
Manosa 6PE. coliManosa 6P-isomerasamanA
Herbicida sulfonilureaArabidopsis thalianaAcetolactato sintasaCsrl-l
SeleccinFuenteProducto genticoGen selector
Genes selectores para transformacin de plantas
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manosa-6P
fructosa-6P
manosa6Pisomerasa
Gen manA de Escherichia coli
Cultivos transformados:Arabidopsis, cebada, meln,tomate, calabaza, girasol,remolacha, nabo, cassava.
Ejemplo de seleccin positiva: manosa-6P isomerasa
Comparacin de frecuencias de transformacin entre manosaisomerasa y gen de resistencia a kanamicina (remolacha)
Comparacin entre mtodos de seleccin basados en manosaisomerasa y resistencia a kanamicina (remolacha)
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Eliminacin de los genes marcadores:
vectores basados en elementos transponibles
Vector de Tipo 1, contiene tanto el gen que codifica para la transposasacomo el gen de seleccin en el mismo vector. En el vector de Tipo 2,
la transposasa es aportada en transpor un vector helper.
Tipo 1
Tipo 2
BI Ds Gen de inters Ds Transposasa Marcador deseleccin
BD
BI Ds Gen marcador Ds Gen de inters BD
Tipo 1
Tipo 2
BI Ds Gen de inters Ds Transposasa Marcador deseleccin
BD
BI Ds Gen marcador Ds Gen de inters BD
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Este sistema permite la delecin de ADN por recombinacin homloga de regionesintracromosmicas (ICR) entre dos secuencias homlogas. El gen tmscodifica la cido
indolcetico hidrolasa que permite convertir naftaleno acetamida (NAM) en cido naftalenactico (ANA), una auxina que evita la formacin de races y promueve la formacin de callos.
Ejemplo 1: Eliminacin de los genes marcadores en
plantas transgnicas por recombinacin gentica
Tomado de: Zubko et al., Nature Biotechnology, 2000.
attP: secuencia del bacteriofago 1
TBS: Transformation booster sequence
Efector: gen de inters
Tms2: cido indolactico hidrolasa (IAAH)
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Seleccin
de plantasde tabacotransgnicaslibres de genes
selectores
A
B
Tomado de: Zubko et al., Nature Biotechnology, 2000.
A: seleccin en kanamicina; B: seleccin en NAM
+ tms2 - tms2
Despus de 3 a 5 meses se observ que varios brotes que sehaban desarrollado mostraban una coloracin blanca debido aque haban perdido el gen de resistencia a NTPII. Debido a que
tambin perdieron el gen tms2, este tejido pudo desarrollar races
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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loxP
XVECre-int
HYG
Pr G10-20
loxPloxP Pr Nos Pr OlexA-46
XVE HYG Gen de inters TnosCre-intPr G10-20
loxPloxP Pr Nos Pr OlexA-46
XVE HYG Gen de inters TnosCre-int
Pr G10-20
loxP
Gen de inters Tnos
8 (LexA RE) Pr 35S (-46)
estradiolDUDLexA
DAVP16
DULRE
Ejemplo 2: Eliminacin de genes selectores
mediante el sistema Cre-lox
Adaptado de: Zuo et al., Nature Biotechnology, 2001.
XVE: activador transcripcionalquimrico constituido por los dominios
DUD LexA, DA VP16, y DUL RE.DUD LexA: dominio de unin al ADN
de la protena LexADA VP16: dominio activador de la
transcripcin VP16 delHuman Herpes Virus;
DUL RE: dominio de unin al ligandodel receptor de estrgenos.
prOlexA-46: promotor constituido por8 copias del operador LexA (LexARE)
fusionadas al promotor mnimo de 35S[pr35S(-46)]
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Protocolos de transformacin mediante
Agrobacterium tumefaciens
Agrobiotecnologa
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Transformacin mediante co-cultivo deAgrobacterium tumefaciens y discos de hojas de tabaco
Explante inicial
(hoja)
Disco foliar
Co-cultivo con unabacteria desarmada
en medio lquido
Co-cultivo en medioslido sin antibiticos
Medio de induccin debrotes con antibitico y
agente de seleccinMedio de enraizamiento con o
sin agente de seleccin
Planta transgnicaaclimatada en
invernadero
A B
C D
E F
A B
C D
E F
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Transformacin
de cotiledonesde sojamedianteco-cultivo con
Agrobacteriumtumefaciens
Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003.
A B C
D E F
G H I
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
A: explantos obtenidos a partir de plantas de soja de 5 d de edad. B: cotiledones incubados en un medioconteniendo Agrobacterium. C: explantos incubados en medio de induccin de tallos durante 28 d, losprimeros 14 d en ausencia de higromicina, y los segundos 14 d en presencia de higromicina. E, F, G:evolucin de los explantos en medio selectivo conteniendo higromicina durante 4 meses. H: plantas
seleccionadas in vitrode una altura de 4 cm. I: plantas transferidas a tierra en condiciones de invernculo.
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Transformacin
de Arabidopsisthaliana porinfiltracin floralcon
Agrobacteriumtumefaciens
A B
DC
Tomado de: Bent, Plant physiology, 2001.
Las plantas florecidas se sumergen en un cultivode Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas
y se germinan en un medio con agente selector.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Tiempos
estimadospara unprotocolo detransformacin
estndar
Co-cultivar discos de hojas con Agrobacterium
Lavar los discos de hojas
Tratar con antibitico para eliminar alAgrobacteriumy seleccionar las clulas
vegetales transformadas
Transpasar los discos de hojas sobrevivientesa medio fresco de seleccin / regeneracin
Enraizar las plntulas en seleccin
Rusticar las plantas transgnicas
1-2 das
2-4 semanas
6-10 semanas
4-6 semanas
Tiempo total en cultivo: 12-20 semanas
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Rpida: la protena recombinante puedeobtenerse en aproximadamente una semana.
Eficiente: alta eficiencia de transformacin;acumulacin de protena comparable con la deplantas transgnicas (hasta 40 mg/kg de hoja).
Simple: slo se requiere equipamiento bsico.
Flexible: puede utilizarse para producir protenasde membrana, enzimas o virus quimricos, o paraensayar promotores
Evaluacin de
construcciones genticaspor agroinfiltracin al vaco Hoja no infiltrada
Hoja infiltrada
Plantas tabaco
salvajes
Agrobacterium
recombinate
Agroinfiltracin en vaco
Purificacin
E xtraccin de protenas
Extracto
clarificado
Vaquero et al., FASEB J.16:408-410, 2002.
La tcnica es:
Hojas y flores agroinfiltrados con
construcciones del gen reportero uidAdirigidas por promotores tejido-especficos
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Protocolo de transformacin mediante
Agrobacterium rhizogenes
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Agrobacterium
rhizogenes Tumor de races producido por Agrobacteriumrhizogenesen discos de remolacha
Gentileza del Dr. M. Tepfer
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Agrobacterium
rhizogenes
Gentileza del Dr. M. Tepfer
Cultivo de races de tabaco transformadasporAgrobacterium rhizogenes
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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Transformacin va Agrobacterium rhizogenes
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Algunos desafos de la transformacin va Agrobacterium
Uso de Agrobacteriumpara realizar recombinacin homloga. o sitio-especfica: frecuencia de integracin baja.
Expresin no predecible de los transgenes en la planta: efectos. de posicin, cromatnicos y de integracin del ADN-T sobre el. silenciamiento gnico.
Modificacin del genoma de Agrobacterium: alteracin del perfil. de expresin de acuerdo con distintos hospedadores vegetales.
Transformacin de hongos vegetales y animales mediante. Agrobacterium: transformacin de ms especies de hongos.
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Genes reporteros
Agrobiotecnologa
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Genes reporteros usados en transformacin de plantas
Genes reporteros-glucuronidasa
Protena de fluorescencia
verde
Cloranfenicolacetiltransferasa
Luciferasa
Luciferasa
Abreviaturagus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
OrigenE. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
DeteccinFluoromtrico (cuantitativo)
o histoqumico (in situ),no radiactivo
Fluorescencia,
no destructiva
Ensayo radiactivosensitivo, semi cuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
Genes reporteros-glucuronidasa
Protena de fluorescencia
verde
Cloranfenicolacetiltransferasa
Luciferasa
Luciferasa
Abreviaturagus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
OrigenE. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
DeteccinFluoromtrico (cuantitativo)
o histoqumico (in situ),no radiactivo
Fluorescencia,
no destructiva
Ensayo radiactivosensitivo, semi cuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
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A B C D
Expresin
del gen uidAen Arabidopsisthaliana
www.plantphysiol.org
Tincin de vulos, sacos embrionarios y lculos enterosde Arabidopsis thalianamediante la reaccinhistoqumica de la enzima -glucuronidasa
luego de la infiltracin con Agrobacterium tumefaciens
A: fotografa de una flor completa donde se observan varios vulos teidos.B: Fotografa ampliada de un segmento floral donde se pueden ver vuloscompletamente teidos y vulos no teidos. C: Tincin del embrin o saco
embrionario, en vez del vulo entero. D: Cavidad del lculo completamente teido.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Expresin
tejido-especfica
del gen uidAen Arabidopsis
thalianay Nicotianatabacum
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal Panel Superior: 1) Expresin en flores, 2) Expresin confinada a la porcin entre
la silicua y el pecolo. 3 y 4): Cortes histolgicos del fruto. Panel inferior: (5) y (6):races completamente teidas. (7): Corte transversal de raz.
Tomadode:Karth
ikeyanetal.,PlantPhysiolog
y,2002.
1 2 3 4
5 6 7
Expresin del gen uidA en flores y frutos de Arabidopsis thaliana
Expresin del gen uidA en races de Nicotiana tabacum
Cortes histolgicos de raz
Flores Pecolos Cortes histolgicos de fruto
E i
-
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Expresin
del gen uidAen plantasde maz
Tomado de: Frame et al., Plant physiology, 2002.
Seguimiento de la transformacin de embriones de maz
y regeneracin de una planta transgnica mediante
la reaccin histoqumica de la enzima -glucuronidasa.
B
DC
A
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal A: expresin transitoria en embriones cigticos. B: expresin estable en callos obtenidos de un nico
embrin. C: hojas aisladas de plantas transgnicas y control. D: plantas transgnicas.
L t
-
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Los puntosluminiscentes en la
medusa Aequoreavictoria se debena la presenciade la protena GFP
que emite energacomo luz verde
Aequorina
Ca2+-apo-aequorin-coelenteramida
Luz verde in vivomax = 509 nm
Luz azul in vitromax = 469 nm
+ Ca2+
+ GFP
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
E i
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A B
C D E
Expresin
del gen GFPen tejidosvegetales
Tomado de: Prof Chris Hawes, Research School of Biological & Molecular Sciences,OxfordBrookes University, Oxford, OX3 0BP, UK
Expresin del gen GFPen polen
de Nicotiana tabacum cv. Xanthi
Expresin del gen GFPen plantas transgnicas
de Arabidopsis thaliana y clulas BY2
Tomado de: Hudson et al., Molecular Ecology Note, 2001.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
La expresin del
-
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50/106
A B C D E F
A B C
D E F
La expresin delgen gfppermite
identificar in vivolos patronesde crecimientodel floema en
hojas de tabacoen diferentesestadiosdel desarrollo
Tomado de: Wright et al., Mechanisms and Processes, 1999.
Desarrollo de la vena mayor en cotiledones
Desarrollo de la vena central y venas secundarias
en hojas inmaduras
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Expresin
-
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Expresin
del gen GFPen plantastransgnicasde Nicotiana
benthamiana
A B
C
La expresin del gen GFP produce color verde o amarillo bajoiluminacin ultravioleta. En ausencia de GFP el tejido
se observa de color rojo debido a la fluorescencia de la clorofila.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Expresin
-
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Expresin
del gen Lucen plantastransgnicasde Nicotiana
tabacum
Gen de luciferasa expresado en
plantas transgnicas de tabaco
Tomado de: Ow et al., Science, 1986.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
-
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Sistemas de transferencia directa de ADN
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Sistemas de
-
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Sistemas detransferenciadirectade ADN
Ventajas
- Son considerados sistemas universales porque, al no
depender de organismos vectores, pueden aplicarsea cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las clulas del organismo vectorde los tejidos o plantas transgnicas
- Requieren construcciones ms simples y pequeas
- Son apropiados para estudios de expresin transitoria
Desventajas
- Pueden resultar en un alto nmero de copias y/o copias
truncas del transgn y del vector en varios sitios delgenoma de las clulas transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparicin dere-arreglos en los transgenes
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
-
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Transformacin por biobalstica o
bombardeo de micropartculas
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Las tcnicas
-
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56/106
de biobalstica
fuerondesarrolladasen los aos 80
Bombardeo de micropartculas
1984. Sandford et al., describen la tcnica debombardeo de micropartculas para la transferenciadirecta de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).
Diseo del primer acelerador de micropartculasimpulsadas por explosin de plvora
Adaptado de: Morrishet al.,Transgenic Plants. Fundamentals and Applications, 1993.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
La biobalstica
-
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es aplicadacon xitoen diferentestipos de
organismos
Bombardeo de micropartculas1987. Klein et al. demuestran la utilidaddel mtodo al observar expresintransitoria en clulas epidrmicas deAllium cepa usando un dispositivo deimpulsin a plvora y micropartculas
de tungsteno recubiertas de ADN.Microscopa de Normansky de clulasepidrmicas de Allium cepa luego de unbombardeo. Se observan 8 proyectiles(flecha) en el interior de una clula viva.
Barra: 20 m
1988. Christou et al. demuestran la utilidad del mtodo paratransferir ADN biolgicamente activo en clulas vivas y obtenertransformantes estables.
1988. Johnston et al. logran transformar por primera vezmicroorganismos y organelas.
1988. Wang et al., Mc Cabe et al., Christou et al. obtienen plantassuperiores transgnicas.
1991. Williams et al. demuestran la transformacin de animalesin vitroe in vivo.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
La
-
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transformacinpor biobalsticadepende defactores fsicos,
qumicosy biolgicos
Parmetros fsicos y qumicos que influyen
en la transferencia del ADN- Mtodo de aceleracin de las micropartculas
- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen
de las micropartculas
- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracindel ADN
- Vaco y distancias de bombardeo
- Dimetro de apertura de la placa de retencin
- Nmero de bombardeos
Parmetros relacionados con la construccin
gentica utilizada- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
genes marcadores de seleccin
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
La
-
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transformacin
por biobalsticadepende defactores fsicos,
qumicosy biolgicos
Parmetros relacionados con el tejido o clulasblanco
- Tipo y capacidad de regeneracin in vitrode los explantos
- Preparacin y condiciones de cultivo de los explantos
pre- y post-bombardeo
- Requerimientos de temperatura, fotoperodo y humedad
de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Existen La aceleracin de las micropartculas puede
-
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diferentes
sistemasde impulsinde micro-
partculas
La aceleracin de las micropartculas puedegenerarse por:
- Explosin qumica de plvora seca
- Descarga de helio a alta presin
- Descarga de aire, CO2 o N2 comprimido
- Descarga elctrica de alto voltaje y baja capacitanciao bajo voltaje y alta capacitancia
- Flujo de partculas o flujo de helio a baja presin por aspersin
- Flujo de helio con can de precisin
Acelerador de micropartculasideado por Sandfordet al.
(New York University, 1984)
Tomado de: http://www.smithsonianlegacies.si.edu/ objectdescription.cfm?ID=132
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas
-
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Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas
Diagrama esquemtico del cana explosin de plvora PDS 1000
A: Antes de disparar
B: Despus de disparar
1: Ensamblaje del iniciador conun percutor activado por
solenoide.
2: Iniciador (carga de plvora).
3: Macroproyectil (bala de Nylon)portando microproyectiles.
4: Tubo de aceleracin (can).
5: Retn con placa de retencin.
6: Placa de retencin con el
macroproyectil deformado.7: Microproyectiles acelerados.
Adaptado de: Kleinet al., Bio/technology, 1992.
Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas
-
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p
Modelo comercial actual
Medidor de presin de helio
Tubo de aceleracin de gas
Interruptores de control
Medidor de vaco
Portador del discode ruptura
Portador delmacroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cmara debombardeo
Controles del flujode aire y de vaco
Clulas blanco
Soporte del blanco
Vlvula de medicinde helio
Modelo comercial actual
Medidor de presin de helio
Tubo de aceleracin de gas
Interruptores de control
Medidor de vaco
Portador del discode ruptura
Portador delmacroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cmara debombardeo
Controles del flujode aire y de vaco
Clulas blanco
Soporte del blanco
Vlvula de medicinde helio
Medidor de presin de helio
Tubo de aceleracin de gas
Interruptores de control
Medidor de vaco
Portador del discode ruptura
Portador delmacroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cmara debombardeo
Controles del flujode aire y de vaco
Clulas blanco
Soporte del blanco
Vlvula de medicinde helio
Acelerador de micropartculas PDS 1000/Hepor descarga de helio a alta presin
Soporte del tejido blanco
Acelerador
d l
-
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de partculas
por descargade helio
a alta presin
PDS 1000/He
Preparacin de las muestras
1. Remocin del soporte e insercin del disco de ruptura
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Aceleradord l
Preparacin de las muestras
-
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de partculas
por descargade helio
a alta presin
PDS 1000/He
p
2. Cargado de la muestra de micropartculas recubiertas de ADN
Micropartculasde oro
Micropartculasde tungsteno
3. Ensamblaje del lanzador de microproyectiles
0,6-3 m 0,2-3 m
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Mecanismo de disparo de un can impulsado S
-
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por He a alta presin (PDS 1000/He)
Estado del disco de ruptura,macroproyectily malla de retencin luego del bombardeo
Distancias
d b b d
-
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de bombardeocrticas en uncan de Hea alta presin
PDS 1000/He
A: Distancia entre la membrana de ruptura y la membrana transportadora (macroproyectil)B: Distancia entre la membrana transportadora (macroproyectil) y la malla de retencinC: Distancia entre la malla de retencin y el tejido blanco
Adaptado de: Hagio, JARQ,1994.
ControlPresin de ruptura
Distancia A
Distancia B
Distancia C
EfectoA > presin > velocidad
A < distancia > velocidad
A > distancia > velocidad
A > distancia < velocidad
ControlPresin de ruptura
Distancia A
Distancia B
Distancia C
EfectoA > presin > velocidad
A < distancia > velocidad
A > distancia > velocidad
A > distancia < velocidad
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas
-
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p
Adaptado de: Rech y Aragao. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, Embrapa-SPI-Cenargen, 1998.
Acelerador de micropartculas
que utiliza helio a alta presin(EMBRAPA, 1998)
Sistemas alternativos de aceleracin de micropartculas
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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Acelerador de partculas Geneboosterimpulsado por alta presin de N2 comprimido
Pistola Gnica HeliosSistemasalternativos
-
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alternativos
de aceleracinde
micropartculas
A
B
C
Agrobiotecnologa
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Transformacin gentica de plantas in vivoLa pistolagnica Helios
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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g p
usando una pistola gnica Helios
gnica Helios
permite latransformacinde tejidos
in vivo
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Expresin transitoria del gen reportero uidAen explantos bombardeados con micropartculas
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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Expresin transitoria en hojas de Arabidopsis bombardeadas con unapistola Helios con y sin malla de difusin de micropartculas
Expresin transitoria en embriones inmaduros de centeno bombardeados con un can PDS1000 He usando diferentes concentraciones de micropartculas. A: 200 g, B: 100 g y C: 30 g
e e p a tos bo ba deados co c opa t cu as
Tomado de: Helenius et al., Plant Molecular Biology Reporter, 2000..
Tomado de: http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/2002/pub/agrar/02H059/prom.pdf
A B C
A B
Sistemas
alternativos deAcelerador de partculas impulsado
-
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alternativos de
aceleracin delas partculas
por un arco voltaico (can elctrico Accell
)
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Tejidos blanco, genes reporteros y marcadores usadosen transformacin de monocotiledneas por biobalstica
-
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en transformacin de monocotiledneas por biobalstica
Hordeum vulgareL. Suspensin celular uidA/cat nptII
Embriones/Callo uidA/cat nptII/barEmbriognico
Callos de microsporas uidA
Zea mays Suspensin celular uidA/cat nptII/bar
Suspensin celular cat/luc/uidA als/barCallo uidA barEmbriones uidA nptII/bar
Oryza sativa Suspensin celular cat/uidA nptII/csr-1
Callo uidA nptIIEmbriones nptII /hpt
Triticum aestivum Suspensin celular cat/uidA nptII /bar Base de hoja uidA nptII
Hoja uidA nptII
Callo uidA nptIIEmbriones/callo uidA nptII /bar
embriognico
Saccharum officinarum Suspensin celular uidA hpt/bar
Callo embriognico uidA nptII
Especie Tejido blanco Gen reportero Gen marcador
uid A:gen de -glucuronidasa de E. coli. cat:gen de cloranfenicol acetiltransferasa de E. coli. luc: gen deluciferasa de Photinus pyralis. bar: gen de fosfinotricina acetiltransferasa de S. hygroscopicus
csr-1/als: gen mutante de acetolactasa sintasa de Arabidopsis thaliana. hpt: gen de higromicina fosfotransferasade E. coli. npt II: gen de neomicina fosfotransferasa II de E. coli.
Promotores constitutivos usados en transformacinde inters agronmico por biobalstica
-
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de inters agronmico por biobalstica
Uso en cerealestransgnicos
Actividad relativa enclulas de cereales
Ubi1-Ubi1intrn 1
TrigoCebada
Arroz
Caa deazcar
Arroz
MazAvenaTrigo
Arroz
MazPasturas
Alta
Moderada
Baja
Baja
Emu
35S-Adh1intrn 1
35S
ArrozModeradaAct1-Act1
intrn 1
Promotor
35S: Promotor de 35S de CaMV35S-Adh1 intron 1: Promotor de 35S
de CaMV e intrn de alcoholdeshidrogenasa de mazEmu: Promotor modificado de alcoholdeshidrogenasa de mazAct1-Act1 intrn1: Promotor e intron deactina de arrozUbi1-Ubi1 intrn: Promotor e intrn deubiquitina de maz
Tejidos blanco, genes reporteros y marcadores usados entransformacin de dicotiledneas por biobalstica
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
75/106
Especie
Carica papaya
Glycine max
Nicotiana tabacum
Helianthus annuus
Liriodendrontulipifera
Gosypiumhirsutum
Tejido blanco
Suspensin celular
Meristemas
Callos embriognicos
Polen
Suspensiones
Hoja / cloroplasto
Hoja
Meristemas
Suspensin celular
Suspensin celular
Gen reportero
uidA
uidA
uidA / gfp
uidAuidAuidA/gfpuidA/gfp
uidA
uidA
uidA
Gen marcador
nptII
nptII
hpt / nptIIbar
nptIIbarnptIInptII
nptII
nptII
nptII/bar
Especie
Carica papaya
Glycine max
Nicotiana tabacum
Helianthus annuus
Liriodendrontulipifera
Gosypiumhirsutum
Tejido blanco
Suspensin celular
Meristemas
Callos embriognicos
Polen
Suspensiones
Hoja / cloroplasto
Hoja
Meristemas
Suspensin celular
Suspensin celular
Gen reportero
uidA
uidA
uidA / gfp
uidAuidAuidA/gfpuidA/gfp
uidA
uidA
uidA
Gen marcador
nptII
nptII
hpt / nptIIbarcsr-1nptIIbarnptIInptII
nptII
nptII
nptII/bar
uid A: gen de la enzima -glucuronidasa de Escherichia coli; gfp: gen de la protena de fluorescencia verde de Aequorea victoria; bar:gen de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus; hpt: gen de la enzima higromicina fosfotransferasa deEscherichia coli; npt II: gen de la enzima neomicina fosfotransferasa II de Escherichia coli; csr-1: gen de una forma alterada de la enzimasintasa del cido acetohidroxil, tambin conocida como acetolactasa sintasa, de mutantes de Arabidopsis thaliana.
Tipos de explantos utilizados paraParmetros
relacionados
-
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76/106
A y B: callos de maz. C: brotes primordiales de maz.D y E: callos y brotes de soja. F: pice de una plntula de
algodn de 4 das (M: meristema apical y P: primordio foliar).
experimentos de transformacincon el tejidoo clulasblanco
Adaptado de: Hansen and Wright, Trends in Plant Science, 1999.
A B C
D E F
P
M
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Transformacin de Oryza sativaa partir de embriones inmaduros
Plantas
transgnicas
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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A, B, C: expresin transitoria del gen uidA en embriones inmaduros
24 h post-bombardeo. D y E: embriones inmaduros bajo seleccin enhigromicina. F: regeneracin de los callos transgnicos bajo seleccin.
Tomado de: Christou, Trends in Plant Science, 1996.
g
obtenidas porbombardeo demicropartculas
AA
DD
BB
EE
CC
FFFF
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Transformacin de Festuca arundinaceaa partir de suspensiones celulares
Plantas
transgnicas
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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A: suspensin de clulas de Festuca arundinaceasobre papel de filtro
antes del bombardeo. B: seleccin de clulas transformadas en mediode seleccin conteniendo higromicina. C y D: plntulas transgnicasde Festuca arundinacearegeneradas a partir de callos resistentes.
Tomado de: http://www.noble.org/ForgBiot/GeneticTransformation/
g
obtenidas porbombardeo demicropartculas
DC
A B
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Plantas transgnicas obtenidas por bombardeode micropartculas
-
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79/106
p
A: tejido embriognico. B: expresin transitoria del gen uidA en tejido embriognico bombardeado. Cy D: tejido embriognico en seleccin post-bombardeo. E: germinacin de embriones somticos. F:
plantas transgnicas completas.
Transformacin de Glycine maxa partir de tejido embriognico
Adaptado de: http://www.cropsoil.uga.edu/homesoybean/somprot.htm
A B
ED
C
E F
AA BB
ED ED
C
EE F
Plantas transgnicas obtenidas por bombardeode micropartculas
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
80/106
A: Ensayo histoqumico de gusde cotiledones bombardeados. B y C: Formacin de yemas a partir
de cotiledones en medio de seleccin. D y E: Enraizamiento de yemas transgnicas en seleccincon higromicina. F: Ensayo histoqumico de gusen hojas de Cassava spp. no transgnicas y
transgnicas.
Transformacin de Cassavaspp. a partir de cotiledones
Tomado de: Zhang et al., Plant Cell Reports, 2000.
A B C
D E F
Expresin de GFP en hojas de petunia y embriones de trigo y sojabombardeados con acelerador de flujo de micropartculas
Expresin
transitoria
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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A y B: Embriones de soja. C,D y E: Embriones de trigo. F: Hoja de petunia.
Adaptado de: http:/ /www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/gfp.htm
en explantosbombardeados
conmicropartculas
A
B
C
E
F
D
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
La biobalsticapuede utilizarse
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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- Transferencia de genes a clulas, tejidos. y rganos vegetales
- Transferencia de genes a microorganismos
y organelas (cloroplastos)
- Estudio de expresin transitoria
- Anlisis de promotores y de deleccin de genes
- Estudio de mecanismos de expresin. y regulacin de genes
- Transferencia de ARN viral
con diversosfines
experimentales
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
83/106
Transferencia de ADN mediadapor electroporacin y/o mtodos qumicos
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Aislamientoy purificacin
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
84/106
de protoplastosde Nicotianatabacum
Adaptado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, 1998.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Electroporacin de protoplastos
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
85/106
Adaptado de Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, 1998.
Pulsador deelectroporacin
Cubetas deelectroporacin
Cultivo y regeneracin de protoplastos de tabaco
A B
Electroporaciny regeneracin
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
86/106
C D
E F
de plantasa partir deprotoplastos
Tomado de: Gomes Barros y Campos Carneiro. Manual de Transformacin Gentica de Plantas, 1998.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Protocolo detransformacin
d l
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
87/106
de protoplastosde Oryzasativaporelectroporacin
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Protocolo de co-transformacin de protoplastos de Oryza
ti d l id di ti t di t l t i
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
88/106
sativa con dos plsmidos distintos mediante electroporacin
Aislamiento y electroporacin de protoplastosde Citrus sinensis(naranjo dulce) con el gen gfp
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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Adaptado de: www.ushrl.saa.ars.usda.gov/hb/niedz/gfp/
Lnea celular embriognicausada como fuente
de protoplastos
Protoplasto fluorescentea las 24 h de la electroporacin
Protoplastos luego dela electroporacin
Callos embriognicos de 4semanas derivados de protoplastos
Callos embriognicos GFPpositivos a los 6meses de la transformacin
Planta regenerada a partir decallos en seleccin positiva
Lnea celular embriognicausada como fuente
de protoplastos
Protoplasto fluorescentea las 24 h de la electroporacin
Protoplastos luego dela electroporacin
Callos embriognicos de 4semanas derivados de protoplastos
Callos embriognicos GFPpositivos a los 6meses de la transformacin
Planta regenerada a partir decallos en seleccin positiva
Callos embriognicos GFPpositivos a los 6meses de la transformacin
Planta regenerada a partir decallos en seleccin positiva
Expresin estable de genes transferidos a protoplastosde plantas por mtodos qumicos y/o electroporacin
-
5/24/2018 2011_5 Transformacion Vegetal
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Adaptado de: Bilang et al. Plant Molecular Biology Manual, 1994.
nptII / kanamicinaPlantasMtodos qumicosPetunia hybrida
nptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosBrassica campestrisnptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosTriticum monococcum
hpt / higromicinaPlantas frtilesElectroporacinOryza sativa (Japonica)
dhfr/ metotrexatoCallosElectroporacinPanicum maximum
nptII / kanamicinaCallosElectroporacinBrassica napus
hpt / higromicinaPlantas frtilesMtodos qumicosArabidopsis thaliana
nptII/ kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron
Plantas frtilesElectroporacinSolanum tuberosum
hpt / higromicinaPlantasMtodos qumicos / ElectroporacinDactylis glomerata
Zea mays
Festuca arundinacea
Oryza sativa (Indica)
Lolium multiflorum
Nicotiana tabacum
Especie
nptII / kanamicina
pat / fosfinotricina
Plantas frtilesMtodos qumicos
hpt / higromicina
pat / fosfinotricina
hpt / higromicina
nptII / kanamicina
nptII / kanamicina
Gen marcador deseleccin / agente deseleccin
Plantas frtiles
Plantas frtiles
Callos
Plantas frtiles
Tipo detransgnico
Mtodos qumicos
Mtodos qumicos
Mtodos qumicos
Mtodos qumicos
Tcnica de transformacin
nptII / kanamicinaPlantasMtodos qumicosPetunia hybrida
nptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosBrassica campestrisnptII / kanamicinaCallosMtodos qumicosTriticum monococcum
hpt / higromicinaPlantas frtilesElectroporacinOryza sativa (Japonica)
dhfr/ metotrexatoCallosElectroporacinPanicum maximum
nptII / kanamicinaCallosElectroporacinBrassica napus
hpt / higromicinaPlantas frtilesMtodos qumicosArabidopsis thaliana
nptII/ kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron
Plantas frtilesElectroporacinSolanum tuberosum
hpt / higromicinaPlantasMtodos qumicos / ElectroporacinDactylis glomerata
Zea mays
Festuca arundinacea
Oryza sativa (Indica)
Lolium multiflorum
Nicotiana tabacum
Especie
nptII / kanamicina
pat / fosfinotricina
Plantas frtilesMtodos qumicos
hpt / higromicina
pat / fosfinotricina
hpt / higromicina
nptII / kanamicina
nptII / kanamicina
Gen marcador deseleccin / agente deseleccin
Plantas frtiles
Plantas frtiles
Callos
Plantas frtiles
Tipo detransgnico
Mtodos qumicos
Mtodos qumicos
Mtodos qumicos
Mtodos qumicos
Tcnica de transformacin
Electroporacin
de tejidos
organizados
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A: diseo de la cmara de electroporacin B y C: preparacin de las muestras
para la electroporacin D: cmara dispuesta para la electroporacin
organizados
Adaptado de: Bilang et al. Plant Molecular Biology Manual, 1994.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Electroporacin de tejidos intactos de caf
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Expresin del gen uidA en tejidos de caf electroporados sin (A-B) y con (C-F) tratamiento enzimtico
A-B: clulas de callo embriognico C: callo embriognico. D: embrin en estado globular
E: embrin en estado de torpedo F: seccin de hoja de una planta in vitro
A B C
D E F
Adaptado de: Fernandez-Da Silva, Plant Biotechnology, 2003.
Produccin de plantas transgnicas por electroporacinde pro-embriones intactos de Nicotiana tabacum
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A-E: expresin delgen uidA en clulasde pro-embrionesde Nicotianatabacum
electroporados
F: expresin del gengfpen pro-embrinelectroporado
A
DE
C
B
F
Tomado de: Shitao et al., Chinese Science Bulletin , 2000.
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Transformacin con whiskersde carburo de silicio
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Transformacin de maz mediantewhiskersde carburo de silicio
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A: suspensionescelulares de mazpenetradas por fibrasde carburo de silicio (0,3-
0,6 m por 10-100 m)
recubiertas de ADN(transformacin)
B: expresin transitoriadel gen uidA luego dela transformacin
C: callos resistentesa fosfinotricina
D y E: inflorescenciay fruto de una plantatransgnica R0
F: ensayos de resistenciaa fosfinotricina con plantasR1 dos semanas despusdel tratamiento
Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant Cell Reports, 2000.
A B C
D E F
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Transferencia de ADN por microinyeccin
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Transformacin de clulas vegetales por microinyeccin
Se transformaron
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Clula vegetal microinyectada
Micromanipulador
plantas deNicotiana tabacum,Petunia sp.,Brassica napusy Hordeum vulgare
A: Punta de un microelectrodo
Microinyeccin de ADN con microjeringa GEF
C
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convencional (0.7 m).
B: Punta de un microinyector GEF(0.1 m).
C: Diagrama de la fentojeringade expansin por galistan (GEF).
1: DNA o fluorforo; 2: galistan(galio, indio y estao);3: aceite de silicona; 4: Tapade vidrio rellena con epoxi.
D: Diagrama del sosten/calentadorde la fentojeringa (GEF).1: Aire impulsado por una bomba;2: microjeringa GEF; 3: tubo
de plstico; 4: capilar; 5: resistenciade alambre; 6: fuente de poder
E: Inyeccin de Lucifer Yellowen una cianobacteria, F: en uncloroplasto simple de clula deparnquima de Vicia fava. G y H:
en ncleo de clulas de Xenopusdistal.
Adaptado de Knoblauch et al., Biotechnology, 1999.
A C
B
A
B
E
HG
F
D
C
Expresin de GFP
Microinyeccin de ADN con microjeringa GEF
A B C
-
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pen cloroplastos luegode la inyeccin de ADN
A, D y G: Imagen
de cloroplastos pormicroscopia confocal.
B, E y H: Fluorescenciade GFP.
C, F e I: Fluorescenciacombinada de GFP y clorofila.
Adaptado de Knoblauch et al., Biotechnology, 1999
A-C:Fluorescencia de GFP en un cloroplasto a las 24 h de la inyeccin del ADNplasmdico.
D-F:Fluorescencia de GFP en tres cloroplastos a las 30 h de inyectar unode ellos con ADN
G-I:Fluorescencia de GFP en varios cloroplastos de la misma clula a los 3 dde inyectar uno de ellos con ADN
A B C
D E F
G H I
Transferenciadirecta de ADN
versus
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versusAgrobacteriumtumefaciens?
A
vs.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
ReferenciasAgrobacterium
1. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformationof plants: biology and biotechnology.Current Opinion inBiotechnology, 17:147-154, 2006.
2. Gelvin, S.B. Improving plant genetic engineering by manipulatingthe host Trends in Biotechnology 21:95 98 2003
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the host. Trends in Biotechnology, 21:95-98, 2003.
2. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: thebiology behind the Gene-Jockeying tool. Microbiology andMolecular Biology Reviews, 67:16-37, 2003.
3. Tzfira, T. and Citovsky, V. Partners-in-infection: host proteinsinvolved in the transformation of plant cells by Agrobacterium.Trends in Cell Biology, 12: 121-129, 2002.
4. Bent, A.F. Arabidopsisin planta transformation. Uses, mechanisms,and prospects for transformation of other species. Plant Physiology,124:1540-1547, 2000.
5. Gelvin, S.B. Agrobacteriumand plant genes involved in T-DNAtransfer and integration. Annual Review of Plant Physiology andPlant Molecular Biology, 51:223-256, 2000.
6. Tzfira, T. and Citovsky, V. From host recognition to T-DNAintegration: the funtion of bacterial and plant genes in the
Agrobacterium-plant cell interaction. Molecular Plant Pathology,1:201-212, 2000.
7. Zupan, J., Muth, T.R., Draper, O. and Zambryski, P. The transfer ofDNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast offundamental insights. The Plant Journal, 23: 11-28. 2000.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
1. Christou, P. Genetic transformation of crop plants usingmicroprojectile development. The Plant Journal, 2:275-281, 1992.
2. Christou, P. Transformation technology. Trends in Plant Science,
1:423-431, 1996.
ReferenciasBiobalstica
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3. Hunold, R., Bronner, R. and Hahne, G. Early events inmicroprojectile development: cell viability and particle location. ThePlant Journal, 5:593-604, 1994.
4. Klein, T.M, Wolf, E.D,, Wu, R, and Sandford J.C, High velocitymicroprojectiles for delivering nucleic acid into living cells. Nature,327:70-73, 1987.
5. McElroy, D. and Brettell, R.I.S. Foreign gene expression intransgenic cereals. Trends in Biotechnology, 12:62-68, 1994.
6. Potrykus, I., Bilang, R., Futterer, J., Sautter, C. and Schrott, M.Genetic engineering of crop plants. In: Agricultural Biotechnology.Altman, A. (ed.) pp. 119-159. Marcel Dekker, 1998.
7. Potrikus, I. Gene transfer methods. Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology, 42:205-225, 1991.
8. Taylor, N.J. and Fauquet, C.M. Microprojectile bombardment astool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and CellBiology, 21:963-977, 2002.
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
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Anexo. Biologa molecular de Agrobacterium
Agrobiotecnologa
Sistemas detransformacinvegetal
Eventos que ocurren en el espacio extracelular
Los eventos moleculares mediados por Agrobacterium tumefacienspueden agruparse segn el espacio en donde ocurren
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Eventos que ocurren en el espacio extracelular
Vector Control
Control CAX2Vector cnb
CAX2 cnb
Concentracin de Mn2+ (mM)
Densidadptica(6
50nm)
Vector
ControlControlCAX2Vector cnb
CAX2cnb
Densidadptica(650nm)
Sensores de Agrobacterium
CHvE
Seales de la planta
fenoles
P10 P21 VirA
Autofosforilacin de Vir A
VirG
Fosforilacin de VirG
Receptores de la
superficie celularde la planta
Protenas tipo vitronectina
Receptores de Agrobacterium
CHvA, CHvB, PscA, Att
Unin ala clulahesped
Genes de virulencia (vir) deAgrobacterium
1) Agrobacterium reconoce y se une a la clula husped.
azcares
2) El sistema de traduccin de seales de Agrobacterium reconoce seales especficas
de la planta.
3) La protena virG media la traduccin de seales y la activacin de los genes vir.
Eventos que ocurren dentro de Agrobacterium tumefaciens
4) Formacin de la cadena de ADN-T, complejo T inmaduro.5) Formacin del complejo T maduro.6) F i d l l j d t t t l t i B l t i D4
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Induccin de la expresin de los genes vir
Genes de virulencia (vir) deAgrobacterium
Induccin de la expresin de los genes vir
VirB1, VirB3VirB4, VirB6VirB7, VirB8
VirB9, VirB10VirB11, VirD4
Ensamblajedel
complejo detrasporte
Ensamblajedel pilus
VirD1VirD2 VirC1
VirE2
VirE1
VirB2,VirB5
ComplejoVirE1/VirE2
Complejo endonucleasasVirD1/D2
Nicks enlos bordesdel ADN-T
Generacindel complejoT inmaduro
Hebra T/VirD2
Formacin del complejo Tmaduro
Hebra T/VirD2/VirE2
Disociacindel complejoVirE1/VirE2
Fosforilacin deVirG
Transporte del complejo Tmaduro dentro del citoplsma
de la planta
6) Formacin del complejo de transporte compuesto las protenas virB y la protena virD4.
Bordes del ADN-T
Canal entreclula vegetal yAgrobacterium
Eventos que ocurren dentro de la clula vegetal
7) El complejo T maduro es importado al ncleo.8) Integracin de la hebra de ADN-T al genoma de la planta
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Sistemas detransformacinvegetal:Agrobacteriumtumefaciens
Transporte del complejo T maduro
dentro delcitoplsma de la planta
VirD2/Hebra T/
VirE2
VIP1, VIP2AtKAPaPP2C
RocA, Roc4, CypA
Estabilizacin del complejo Te importacin al ncleoVirD2/Hebra T/VirE2
VIP1, VIP2AtKAPaPP2C
RocA, Roc4, CypA
Estabilizacin del complejo Te importacin al ncleo
VirD2/Hebra T/VirE2VIP1VIP2
Complejo TTransportedentro del
ncleo
VirD2
Hebra T
VirE2
=
Factoresnucleares
y ADNcromosmico
Integracin ytransformacin
gentica
8) Integracin de la hebra de ADN T al genoma de la planta.
NCLEO
CITOPLASMA