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1A-020-D by P. Altenhofer

Application Note No. 2

Ready-to-useApplication Notes aus dem Labor, für das Labor

2D-Elektrophorese leicht gemacht

Einleitung:Die 2D-Elektrophorese zur Auftrennung von Proteingemischen ist eine nicht mehr wegzudenkende Technik und Grundlage der Proteomik [1, 2]. Sie bietet die Möglichkeit, das Proteinspektrum eines Organismus oder Gewebes in einem definierten Stadium abzubilden und weiter zu untersuchen. Zwei unterschiedliche Trennprinzipien kommen zum Einsatz: In der ersten Dimension erfolgt die Trennung nach dem isoelektrischen Punkt und anschließend in der zweiten Dimension nach der molekularen Masse der Proteine [2, 3].

Zusammenfassung:

Die erste Dimension wird in IPG-Strips vollzogen, wo-bei IPG für „Immobilized pH-gradient“ steht. Es han-delt sich um schmale Streifen von Polyacrylamidgelen, die zur mechanischen Stabilisierung auf Trägerfolien gegossen werden. Der immobilisierte pH-Gradient ent-steht durch die Verwendung von sauren und basischen Acrylamidderivaten in verschiedenen Mischungen während des Gießens der Gele. Durch die Polymeri-sierung der Monomere zu einer Gelstruktur wird ihre Lage fixiert, also immobilisiert. Diese Gele sind kom-merziell in sehr vielen Varianten erhältlich. Für Über-sichtsgele, die einen großen pH-Gradienten abdecken, eignen sich z. B. Strips von pH 3-10. Damit wird der weitaus größte Teil der Proteine erfasst. Ist man an Ausschnitten aus diesem Spektrum interessiert, so gibt es auch Strips, die engere pH-Bereiche bedienen (z. B. pH 4-7). Damit die Proteine denaturiert werden und die Wasserstoffbrückenbindungen verlieren, werden sie in hochmolaren Harnstoff/Thioharnstoff-Puffern mit nicht-ionischen oder zwitterionischen Detergenzien gelöst. Die Proteine wandern im elektrischen Feld an ihren isoelektrischen Punkt, d. h. bis zu dem Punkt im pH-Gradienten, an dem die Nettoladung 0 beträgt. Für diese erste Trennung der Proteine werden spezielle Elektrophoresekammern genutzt, die mit sehr hohen Spannungen (z. B. 15.000 V) bei geringen Stromstär-ken (z. B. 50 µA) arbeiten können.

Hier bietet die von uns angebotene IPG-IEF-Kammer EWS-1 einen Vorteil gegenüber anderen Anbietern: Sie können eine Trennstrecke von bis zu 40 cm aus-nutzen. Durch die Verwendung von mehreren IPG-Strips mit aufeinanderfolgenden pH-Bereichen können Sie extrem weit gespreizte pH-Gradienten erzielen. Die Elektroden sind frei positionierbar, ganz nach Ihren Er-fordernissen.Nach der ersten Dimension werden die Strips in spe-ziellen Puffern equilibriert und für die anschließende, zweite Dimension vorbereitet. Dithiothreit(ol) (DTT) und Iodacetamid (IAA) verhindern die Ausbildung von Disulfidbrücken, wobei DTT die Brücken aufbricht und IAA durch eine Alkylierung die Rückreaktion verhin-dert. SDS sorgt für die Ladung und damit die Mobilität, indem die Proteine denaturiert und negativ geladen werden. Die nun folgende SDS-PAGE trennt die Pro-teine nach dem Molekulargewicht. Es gibt zwei Mög-

Ausschnitt aus einem 2D-Gel



lichkeiten für SDS-Gele: mit konstanter Stärke oder mit Gradienten, bei denen die Siebwirkung im Laufe der Trennungsrichtung zunimmt. Für die meisten An-wendungen genügen Gele mit konstanter Stärke von 10 oder 12% Polyacrylamid (PAA). Die Trennung er-folgt üblicherweise in vertikalen Kammern mit großem Puffervolumen zur Kühlung des Gels. Die verwendeten Stromstärken liegen im mA-Bereich, je nachdem, wie schnell der Lauf stattfinden soll (z.B. über Nacht bei 15 mA für zwei große Gele von ca. 16 x 17 cm). Nach der Elektrophorese werden die Gele aus den Gießvorrich-tungen genommen und gefärbt. Es können colorimetri-sche oder Fluoreszenz-Färbungen genutzt werden. Bei der SDS-PAGE waren in der Vergangenheit selbst-gegossene vertikale Gele dominierend. Dies beinhaltet immer das Hantieren mit giftigen Acrylamidlösungen, nicht unerheblichen Zeitaufwand und die Gefahr, dass die Gele nicht gelingen. Zudem ist das Hantieren mit den Gelen beim Entfernen aus der Gießvorrichtung und beim Färben immer mit der Gefahr der Zerstörung verbunden. Eine äußerst praktische Alternative zu selbstgegosse-nen vertikalen Gelen stellen wir Ihnen hier vor: Hori-zontale SDS-Fertiggele auf Trägerfolien.Diese Gele sind maschinell gefertigt und von stets gleichbleibender Qualität. Sie werden als Trocken-

gel-Kit mit gebrauchsfertigen Rehydratisierungs- und Elektrodenpuffern geliefert. Die dazu passende Elek-trophoresekammer „Flatbed professional“ ist eine Hori-zontalkammer mit einer wassergekühlten Keramikplat-te. Diese Technik erlaubt es, mit lediglich 25 ml Puffer pro Elektrodenstreifen auszukommen, was eine erheb-liche Ersparnis an Chemikalien gegenüber vertikalen Kammern darstellt, bei denen bis zu 6 Liter Puffer ge-braucht wurden. Die Wasserkühlung kann durch einen Kryostaten/Chiller gewährleistet werden, so dass auch der Kühlwasserverbrauch äußerst gering ist. Diese getrockneten SDS-Gele haben vorgefertigte Slots für die IPG-Strips und Marker-Proteine. Die SDS-Gele für IPG-Strips von 7 bis 11 cm Länge bieten den Vorteil, dass 2 Strips nebeneinander laufen können. Das führt zu einem höheren Probendurchsatz und Sie können zwei IPG-Strips unter den gleichen Bedingun-gen testen. In dem folgenden Arbeitsprotokoll geben wir Ihnen eine erprobte Anleitung, wie Sie zu sicheren 2D-Gelen kom-men. Als Beispiel wurde der Proteinextrakt von Roten Linsen gewählt, der mit 50 mM TRIS-HCl pH 8,3 her-gestellt wurde. Eine Anleitung zur Gewinnung dieser Proteinprobe ist angegeben. Sie können natürlich auch mit Ihren eigenen Proteinproben arbeiten.

Material und Methoden

Notwendige Geräte: • EWS-1:ElektrophoresekammerfürdieIPG-IEF(Art.-Nr.GH21-I1245)• RehydratisierungskammerfürIPG-Strips(Art.-Nr.GH21-I0002)• Tischzentrifuge(Art.-Nr.FSPEK16M)• SchüttlerfürReaktionsgefäßeundAdapter(Art.-Nr.FVORTEXE,FVORSA1)• Magnetrührer• RehydratisierungswannefürSDS-GeleundzumAnfeuchtenderElektrodenstreifen(Art.Nr.GH21-Z2007)• Schüttler(Art.-Nr.GR54-N3030)• Kryostat/Chiller(Art.-Nr.BS146.811)• FlatbedProfessionalKammerinkl.SchläucheundBypass(Art.-Nr.GH21-E0127)• EquilibierungkammerfürIPG-Strips(Art.-Nr.GH21-I0004) oder für Strips bis 11 cm sind auch Zentrifugenröhrchen verwendbar• Netzgerät/PowerSupply(Art.-Nr.EV232)• Färbeschale(Art.-Nr.GH21-Z2012)• ScannerViewPix900(Art.-Nr.BS01-C1630)

Chemikalien und Zubehör: • IPG-Strips,11cmlang,pH3-10,non-linear(Art.-Nr.95-92-102)• Reaktionsgefäße• Harnstoff• Thioharnstoff• Tris-HCl50mM,pH8,3



• AmpholytepH3-10(40%w/v)• Glycerol(=Glycerin)• CHAPS=3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat• BisHED=Bishydroxyethyldisulfide(Aldrich#38,047-4)• DTT=Dithiothreit(ol)• IAA=Iodacetamid• BPB=Bromphenolblau• feingemahleneRoteLinsen• Aquabidestillata• ÖlzumÜberschichten(IPGOverlay,coverfluid)• 12,5%SDS-Fertiggele,250x110x0,5mmaufStandard-Trägerfolie,rehydratisierbarfürdie2.Dimen- sion(Art.-Nr.95-95-101)inkl.Puffer,Folien,Papiere• dickesFilterpapier(Art.-Nr.90-90-607)• Pinzetten• Equilibrierungspuffer,mitgeliefertmitSDS-Trockengel• Gel-Rehydratisierungspuffer,mitgeliefertmitSDS-Trockengel• Proteinaseinhibitor-Mix(Sigma-Aldrich)• Protein-Molekulargewichtsmarkerca.14.000–200.000Da• Methanol• Eisessig• CoomassieG250oderR250• ggf.Kerosin• ProdigySameSpots2D-Auswertesoftware(Art.-Nr.BW02-C0900)

Die erste DimensionPuffer und Lösungen für die erste Dimension

Proteinextrakt aus Roten Linsen:100 mg möglichst fein gemahlene Samen von Roten Linsen + 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 8,3 + 10 µl Protease-inhibitor-Mix 30 min unter starkem Schütteln extrahie-ren (damit möglichst wenig sedimentiert), 10 min bei 9000 rpm abzentrifugieren, Überstand abnehmen,aliquotieren und einfrieren bzw. mit IPG Rehydratisie-rungspuffer versetzen. Das Sediment kann verworfen werden.

Rehydratisierungspuffer für IPG-Strips mit pH 3-10 (Tab. 1, Seite 3): Lösen Sie den Puffer unter Rühren bei Raumtempera-tur, füllen Sie ihn in Aliquote ab und frieren Sie sie ein.

Substanz Menge für 10 ml Puffer Endkonzentration Harnstoff 4,8 g 8 M Thioharnstoff 1,52 g 2 M Ampholyte pH 3-10 50 µl (40% w/v) 0,2% Glycerol(99%) 1,0 ml 10% CHAPS 50 mg 0,5% BisHED 100 mg 100mM Aqua bidest. ad 10 ml

Tab. 1: Substanzen und Mengen für IPG-Rehydratisierungspuffer pH 3-10

Erwärmen Sie den Puffer nicht, wegen der Zersetzung des Harnstoffs. Beachten Sie, dass es lange dauert, bis alles gelöst ist.

Elektrophoresebedingungen in der ersten Dimension:In Tab. 2 (Seite 4) sind die Elektrophoresebedingungen für die erste Dimension angegeben. Während der Zeit bis zur Lösung des Puffers können Sie dieses neue Programm an der IPG-IEF-Kammer EWS-1 erstellen (siehe mitgeliefertes Manual für die EWS-1).

ArbeitsablaufDer oben genannte Rehydratisierungspuffer wird mit der Proteinprobe versetzt und die IPG-Strips werden darin über Nacht rehydratisiert. Pro 11 cm Strip werden 202 µl Rehydratisierungsgemisch gebraucht (5 µl Pro-teinlösungRoteLinse+195µlRehydratisierungspuffer



+ 2 µl 2 % BPB)Das Rehydratisierungsgemisch geben Sie in eine Ver-tiefung der Rehydratisierungskammer. Pipettieren Sie das Gemisch am besten in die Mitte. Notieren Sie sich die Nummern der IPG-Strips und welche Probe Sie dabei verwenden. Nun ziehen Sie den IPG-Strip von der Schutzfolie ab und halten ihn an beiden Enden mit Pinzetten fest. Tauchen Sie erst die Mitte des Strips mit der Gelseite nach unten in das Gemisch und verteilen Sie durch Auf- und Abbewegungen und leichtes, vor-sichtiges Hin- und Hergleiten des Strips das Gemisch gleichmäßig, so dass das Gel vollständig und gleich-mäßig benetzt wird. Luftblasen müssen vermieden werden.DanachwirdvollständigundgründlichmitÖlüberschichtet, um Austrocknung zu verhindern. Schlie-ßen Sie den Deckel der Rehydratisierungskammer. Die Rehydratisierung findet über Nacht bei RT statt.

Rehydratisierung des getrockneten SDS-Fertiggels für die zweite Dimension: Geben Sie 50 ml des mitgelieferten Gel-Rehydratisie-rungspuffers in die große, graue Rehydratisierungs-wanne und entfernen Sie nun die äußere Kunststoff-folie (nicht wegwerfen) vom Gel. Markieren Sie auf der Rückseite des Gels die Positionen der Slots (rechts und links lange Slots für die IPG-Strips, in der Mitte ein kleiner Slot für die Molekulargewichtsmarker), dies er-leichtert die Orientierung und das Auflegen der Strips.Legen Sie das Gel mit der Gelseite nach unten vorsich-tig in den Puffer. Achten Sie darauf, dass keine Luftbla-sen eingeschlossen werden und stellen Sie das Ganze auf einen Schüttler. Lassen Sie das Gel bei mäßiger Bewegung 2 - 3 Stunden quellen und bewegen Sie es zum Verdrängen sich bildender Luftblasen öfters auf und ab. Nach 2 - 3 Stunden entnehmen Sie das Gel und streifen es oberflächlich trocken. Nehmen Sie dazu das mitgelieferte Filterpapier. Bedecken Sie das Gel mit einer der mitgelieferten Schutzfolien und legen Sie es wieder in die Kunststofffolie. Lagern Sie das Gel bis zur Nutzung im Kühlschrank. Derartige Gele können bis zu 2 Wochen im Kühlschrank gelagert werden.

Elektrophoresebedingungen in der ersten Dimension Temperatur: 20°C, Stromstärke pro Strip: max. 50 µA Schritt Spannungsverlauf Endspannung Zeitdauer S1 Gradient 300 V 1 min S2 Step/hold 300 V 30 min S3 Gradient 5000 V 1 h S4 Step/hold 12 000 V 2 h S5 Step/hold 0 V 0 min Ende

Tab. 2: Programm an der EWS-1 für die erste Dimension.

Start der ersten Dimension:Am nächsten Morgen spülen Sie die Laufkammer mit Aqua bidest. und trocknen sie gründlich. Schneiden Sie sich dicke Filterpapierstückchen zurecht, die als Elek-trodenstreifenverwendetwerden.ÖffnenSiedieRehy-dratisierungskammer und entnehmen Sie die Strips mit einer Pinzette. Legen Sie die Strips nun mit der Gel-seite nach oben in die Vertiefungen der Laufkammer. Das +-Ende des Strips muss an der Anode (rot) liegen. Wischen Sie mit trockenen Filterpapierstreifchen et-wasdasÖlandenGelendenab.BefeuchtenSieneueFilterpapierstückchen mit Aqua bidest. und legen Sie sie auf die Gelenden der Strips. Pressen Sie sie gut an, damit ausreichend Kontakt entsteht und legen Sie möglicherweise mehrere Filterpapierstreifchen überei-nander, so dass die Platindrähte der Elektroden, die Sie nun auflegen, in gutem Kontakt mit den Filterpa-pierstreifchen sind. Pressen Sie die Elektroden noch einmal gut an. Überschichten Sie nun die Strips voll-ständigmitÖl.SchließenSiedenDeckel.Schalten Sie die EWS-1 ein und wählen Sie das ge-speicherte Programm. Geben Sie die Anzahl der Strips

ein, die Sie benutzen. Dann drücken Sie lange die Start-Taste und das Programm startet. Die Trennung erfolgt bis ca. 24.000 Vh angesammelt sind, d.h. mit dem genannten Protokoll 3,5 h (Tab. 2, Seite 4). Wäh-rend dieser Zeit kann das SDS-Fertiggel rehy-dratisiert werden. Falls es sich nach der 2. Dimension im ge-färbten Gel zeigen sollte, dass die Proteinspots etwas waagerecht verschmiert sind, handelt es sich um das sogenannte „overfocusing“ oder „underfocusing“ und es ist empfehlenswert, die Voltstundenzahl in der IPG-Elektrophorese zu verringern oder zu erhöhen. Gerade wenn Sie Ihre eigenen Proben nutzen, ist eine empiri-sche Testung der besten Elektrophoresebedingungen unumgänglich. Die angegebenen 24.000 Vh sind aber eine gute Ausgangsbasis, die evtl. nach oben oder un-ten korrigiert werden kann.



Stellen Sie den Kryostaten/Chiller auf 15 °C ein und den Durchfluss an der Kühlplatte der Flatbed Profess-ional Kammer auf „Bypass“, so dass das Wasser noch nicht durch die Kühlplatte fließt. Damit wird die Bildung von Kondenswasser verhindert. Während der anderen Schritte hat der Kryostat nun Zeit, das Wasser abzu-kühlen. Nach Abschluss der ersten Dimension sollten Sie sich die Werte der aufgelaufenen Voltstunden notieren, um zu sehen, ob der gewünschte Wert von ca. 24.000 Vh erreicht wurde. Ferner können Sie nach der 2. Dimen-sion einschätzen, ob mehr oder weniger Voltstunden angebracht sind und dies zur Optimierung der Ergeb-nisse austesten.IPG-Strips, die nicht sofort weiter verarbeitet werden können, kann man direkt ohne weitere Behandlung bei -20 °C einfrieren. Legen Sie diese dazu auf Klarsicht-folie und geben Sie etwas Glycerol darauf. Wickeln Sie die Strips darin ein und dann zur Stabilisierung noch einmal in Alufolie und kleben Sie ein Etikett darauf mit allen notwendigen Daten.

Die zweite DimensionEquilibrierung und Positionierung

Entnehmen Sie die Strips und equilibrieren Sie diese für die 2. Dimension. Dazu verwenden Sie den mit den SDS-Fertiggelen mitgelieferten Equilibrierungs- bzw. Gel-Rehydratisierungspuffer und setzen Sie damit pro Strip die drei in Tab. 3 (Seite 5) genannten Lösungen

an. Bereiten Sie die Lösungen unter Rühren, was eine Zeit lang dauert (kann schon zum Ende der ersten Di-mension bereitet werden). Für 11 cm lange IPG-Strips können Sie Zentrifugenröhrchen zum Equilibrieren ver-wenden oder die Equilibrierungskammer. Die Strips werden nacheinander ohne Zwischenspülschritte in den drei Lösungen equilibriert. Falls es nach der 2. Di-mension im gefärbten Gel zu starker vertikaler Strei-fenbildung kommen sollte, ist es empfehlenswert, den Thioharnstoff bei den Equilibrierungslösungen wegzu-lassen. Auch hier gilt, dass Sie bei der Verwendung Ihrer eigenen Proben testen müssen, ob Thioharnstoff angebracht ist oder nicht.

Nehmen Sie das (evtl. am Vortag) gequollene SDS-Fertiggel aus dem Kühlschrank oder aus der Rehy- dratisierungswanne. Geben Sie auf die Kühlplatte et-was Wasser oder spezielle Kühlflüssigkeit (Kerosin) und legen Sie das Gel vorsichtig von der Mitte her ohne Luftblasen auf die Kühlplatte, die Folienseite nach un-ten. Positionieren Sie die Platte in der Mitte und saugen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Zellulosetuch weg. Nehmen Sie die graue Gel-Rehydratisierungswanne und drehen Sie sie, dass die beiden Vertiefungen für das Anfeuchten der Elektrodenstreifen sichtbar sind. Legen Sie je einen trockenen Streifen mit der gewölb-ten Seite nach oben in eine Vertiefung und geben Sie 25 ml des Anodenpuffers (blau) bzw. des Kathodenpuf-fers darauf und verteilen Sie die Lösungen gleichmäßig

Schritt Harnstoff Thioharnstoff DTT IAA Puffer Zeit 1 1,5 g 760 mg 40 mg - 4,2 ml Equilibrierung. 15 min 2 1,5 g 760 mg - 105mg 4,2 ml Equilibrierung. 13 min 3 1,5 g 760 mg - - 4,2 ml Gel-Rehydrat. 2 min Tab. 3: Equilibrierungslösungen zur Vorbereitung der zweiten Dimension

Kathode

Anode

Abb.1: Schematische Anordnung der Elektroden und IPG-Strips auf dem SDS-Gel. Erläuterung siehe Text.

Abb.1: Schematische Anordnung der Elektroden und IPG-Strips auf dem SDS-Gel. Erläuterungen siehe Text.



durch sanftes Drücken. Nehmen Sie mit 2 Pinzetten die Elektrodenstreifen he-raus und tippen Sie die lange Seite etwas auf Küchen-papier auf, damit der Überschuss aufgesaugt wird. Achten Sie darauf, dass der Streifen nicht über die kur-ze Kante gekippt wird, da sich dadurch eine ungleich-mäßige Verteilung ergeben kann, die das Laufergebnis negativ beeinflussen kann. Legen Sie die Elektroden-streifen mit etwa 5 mm Überlappung auf das Gel, der blaue Streifen an die Anode, der farblose an die Katho-de Die Wölbung muss nach oben zeigen. Drücken Sie die Streifen gut an.

Legen Sie nun die equilibrierten IPG-Strips in die lan-gen Slots (siehe Abb. 1, Seite 5), tupfen Sie sie auf der Folienseite trocken, dass keine Pfütze entsteht. Das Anodenende (+, sauer, rot) liegt links im Slot, das kathodische Ende (-, schwarz, basisch) liegt rechts. Der kleine mittlere Slot (grün) ist für die Molekularge-wichtsmarkerproteine (5 µl). Achten Sie darauf, dass Sie die IPG-Strips mit der Gelseite nach unten auf das SDS-Gel legen und dass es im Slot fest am unteren Rand (der zur Anode zeigt) anliegt. Ein guter Kontakt zwischen IPG-Strip und SDS-Gel ist notwendig, damit die Proteine vollständig eluiert werden (siehe Abb.1, Seite 5). Wenn Sie die Markerproteine aufgetragen ha-ben, legen sie die Elektroden auf und stecken Sie sie fest(Anode=rot,Kathode=schwarz).PressenSiesiegut an und legen Sie die Glasplatte zur Beschwerung darauf. Schließen Sie den Deckel und verbinden Sie die Stecker mit den Buchsen des Netzgerätes/Power Supply. Das Programm in Tab.4 soll ablaufen. Sehr praktisch ist ein programmierbares Gerät (EV 232).

Elektrophoresebedingungen für die 2. Dimension

Die blau unterlegten Werte in Tab. 4 (Seite 6) sind maßgeblich und sollten konstant sein. Stellen Sie an

Phase Spannung Stromstärke Zeit Kommentar

1 120 V konst. 7 mA 35 min

2 200 V konst. 10 mA 35 min

3 300 V konst. 16 mA 15 min Entfernen Sie die Strips nach dieser Phase

4 850 V 24 mA konst 165 min BPB SDS-Zone in der Anode

Tab. 4 Elektrophoresebedingungen für die 2. Dimension

dem Netzgerät sicher, dass diese Werte erreicht wer-den können. Starten Sie den Lauf und stellen Sie die Kühlung der Platte an. Die Lauffront aus BPB und dem roten Farbstoff soll waagerecht sein. Nach Phase 3 entfernen Sie die IPG-Strips und ziehen Sie sie dabei über den anodischen Rand des Slots, um ihn etwas zu befeuchten. Dies hilft dabei, waagerechte Lauffronten zu erhalten.

Nach 4 h 10 min ist die Elektrophorese abgeschlossen und die Farbstofffronten sind im anodischen Elektro-denstreifen. Schalten Sie das Netzgerät aus und trennen Sie die Verbindung zur Kammer. Entfernen Sie Deckel, Glas-platte, Elektroden und Elektrodenstreifen. Entnehmen Sie das Gel und legen Sie es in die Färbeschale.Folgende Färbelösung hat sich bewährt:

2,5 g Coomassie R250 oder G250450 ml Methanol, das Coomassie erst darin unter Rüh-ren lösen, dann 100 ml Eisessig und 450 ml Aq. bidest. zugeben

Mischen Sie gut und färben Sie das Gel in der Färbe-wanne darin mindestens 1,5 Stunden unter Schütteln. Das Gel sollte von der Färbelösung bedeckt sein. Es kann auch über Nacht in der Färbelösung bleiben. Ent-färben Sie anschließend mit folgender Entfärbelösung:

30 % Methanol10 % Essigsäure, unter Schütteln entfärben

Erneuern Sie öfters die Entfärbelösung. Wenn der Hintergrund ausreichend entfärbt ist, wird das Gel am besten in Aq. bidest geschüttelt, um die Entfärbung zu beenden. Das Gel kann mit dem ViewPix-Scanner ein-gelesen werden. Hier ist es praktikabel, etwas Wasser



Beide Dimensionen führten zu sehr gut getrennten Spots. Vertikales Streaking durch unzureichende Tren-nung in der zweiten Dimension (SDS-PAGE) wurde kaum beobachtet. Dies bedeutet, dass die eingesetzte Proteinmenge von 5 µl Rohextrakt/Strip und die Elek-trophoresebedingungen optimal waren. Es wurden mit Prodigy SameSpots 555 Proteinspots gezählt (Abb. 3, Seite 7). Wenn die Proteinproben bereits existieren, so kann

ausgewertet werden. Zur dauerhaften Lagerung empfiehlt es sich, die Gele für mindestens 10 min in 10 %igem Glycerol zu schüt-teln. Anschließend können die Gele an der Luft ge-trocknet und einlaminiert werden.

Ergebnisse

Auf beiden Seiten des SDS-Gels wurden nahezu iden-tische 2D-Spotmuster erzielt (Abb. 2, Seite 7). Sie kön-nen also auf einem Gel zwei Proben unter identischen Bedingungen trennen.

auf die Scanneroberfläche zu geben und das Gel mit der Folienseite nach unten luftblasenfrei aufzulegen.Dann geben Sie etwas Wasser auf das Gel und legen-eine klare Folie luftblasenfrei darüber. Nun kann das Gel wahlweise im Durchlicht- oder Auflichtmodus ge-scannt werden.

Dietiff-BilddateienderargusX1Softwarekönnenvom2D-Programm Prodigy SameSpots verarbeitet und

mit dieser schnellen Methode bereits nach 48 Stun-den das fertig entwickelte Gel zur Auswertung vorlie-gen. Selbstverständlich können Sie den Arbeitsablauf auch zeitlich entzerren und die zweite Dimension am Folgetag zur IEF-Trennung machen. Dieses Protokoll ist auch auf größere Gele übertragbar, wobei die Elek-trophoresebedingungen methodisch anzupassen sind. DiemitderargusX1SoftwaregescanntenAufnahmenlassen sich mit Prodigy SameSpots auswerten und die Spots können zur massenspektrometrischen Analyse abgeschabt werden. Dadurch, dass die Gele auf eine Trägerfolie gegossen

Abb. 2: 2D-Trennung eines hydrophilen Extraktes von Roten Linsen. Rechts und links wurde die gleiche Probe verwendet, die Auftrennungen sind nahezu identisch. MW = Roti-Mark Standard Molekulargewichtsmarker

Abb.3: Auswertung der zweidimensionalen Trennung eines hydrophilen Extraktes von Roten Linsen mit der Software Prodigy SameSpots.

Abb. 2: 2D-Trennung eines hydrophilen Extraktes von Roten Linsen. Rechts und links wurde die gleiche Probe verwendet, die Auftrennungen sind nahezu identisch. MW = Roti-Mark Standard Molekulargewichtsmarker


Abb.2: 2D-Trennung eines hydrophilen Extraktes von Roten Linsen. Rechts und links wurde die gleiche Probe verwendet, die Auftrennungen sind nahezu identisch. MW = Rot-Mark Standard Molekulargewichtsmarker




sind, sind sie sehr gut handhabbar. Sie sind leicht auf dem Scanner positionierbar und wieder zu entfernen, wohingegen Gele ohne Trägerfolie schwerer zu behan-deln sind und leicht einreißen. Nach dem Scannen und einer kurzen Vorbehandlung in 10 % Glycerol (ca. 15 min) lassen sie sich problemlos an der Luft trocknen. Dadurch entfällt die aufwändige Trocknungsprozedur von selbstgegossenen Gelen mit Geltrocknungsrah-men, Cellophanfolien und Geltrocknungsofen.

Zusammenfassung

Die hydrophilen Proteine der Roten Linse sind ein sehr gutes Modell, um diese neue Arbeitstechnik vorzu-stellen. Es handelt sich um eine klare Verbesserung gegenüber der Methode mit selbstgegossenen Gelen, da das Problem der leichten Zerstörbarkeit umgangen wird. Weiterhin lassen sich hier unter gleichen Laufbe-

dingungen zwei Proben trennen und vergleichen. Dies ist eine Methode, die zu schnellen und zuverlässigen Ergebnissen führt.

Literatur

[1] O'Farrell PH.: High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 1975 May25;250(10): 4007-21.

[2] Görg A, Drews O, Lück C, Weiland F, Weiss W.: 2-DEwithIPGs.Electrophoresis.2009Jun30;Suppl1: 122-32.

[3] Laemmli UK.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970Aug15;227:680-5.

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