5 molaspbiolkom apoptoza.ppt - tryb zgodnoÅ...
TRANSCRIPT
2018-06-07
1
NOBEL 2002 – odkrywcy PCD
Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston
United Kingdom USA United KingdomThe Molecular
Sciences Institute Berkeley, CA, USA
Massachusetts Institute of
Technology (MIT) Cambridge, MA,
USA
The Wellcome Trust Sanger Institute
Cambridge, United Kingdom
1927(in Union of South
Africa)
1947 1942
PCDNEKROZA
Zachodzi dzięki specyficznym procesom
biochemicznym
Proces ATP-zależny
Śmierć pasywna, wywołana głębokim
uszkodzeniem komórki
Proces ATP-niezależny
2018-06-07
2
ROŻNICE POMIĘDZY APOPTOZĄ A MARTWICĄ
Apoptoza jest procesem zaprogramowanym
Apoptoza zachodzi z udziałem energii – nie zachodzi w 4oC
Komórki apoptotyczne usuwane przez fagocyty – brak procesu zapalnego
Nekroza - wylanie zawartości do przestrzeni międzykomórkowej –indukcja stanu zapalnego
Elektroforeza kometkowa(SCGE = single cell gel electrophoresis)
• Noniesienie komórek zmieszanych z agarozą na szkiełko mikroskopowe
• Liza błony komórkowej
• Elektroforeza -pofragmentowane DNA migruje w kierunku anody
• wybarwienie DNA (bromkiem etydyny, jodek propidyny)
2018-06-07
3
Detekcja w mikroskopie elektronowym
• Komórki apoptotyczne:– kurczą się,
– ich kształt ulega wydłużeniu,
– mitochondria zmniejszają się
– kondensacja chromatyny (kształt półksięzyca, gładka powierzchnia)
– formowanie bąbli błony kom. (po oddzieleniu od kom. - ciałka apoptotyczne)
– Zawartość komórki nie wylewa się na zewnątrz
• Nekroza objawia się:– puchnięcie komórki i
mitochondriów
– kondensacja chromatyny w przypadkowo położonych obszarach jądra
– brak jest pączkowania komórki
– następuje dezintegracja błony
– płyn komórkowy wydostaje się poza komórkę
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
• „Test drabinkowy” - obecność fragmentów wielkości nukleosomalnej (~180bp lub wielkokrotność)
• DNA komórek nekrotycznych daje jeden długi, rozmyty pasek (ang. smear).
• Wykrycie fragmentacji jest najbardziej niezawodnym sposobem na potwierdzenie apoptozyZimowska i in. (1997)
2018-06-07
4
Inne metody• Wyznaczanie stosunku
HMW/LMW DNA – DNA pofragmentowane wypłukiwane z jądra –(cytometr przepływowy, niska dokładność)
• DNA ELISA immunologiczna detekcja histonów w cytoplaźmie –czuła (przeciwciała kanapkowe antyH2a/H2b), odpowiednia dla wielu próbek
• Oznaczanie aktywności kaspazy 3 (Cysteine-dependent ASPartyl-specific proteASES)
– detekcja białek pociętych przez kaspazy (przeciwciała do C-końca strawionej aktyny)
– Wykrywanie samego enzymu (przeciwciała do aktywnej formy kaspazy 3 18 kDa - Prokaspaza 3 32kDa nie jest rozpoznawana)
– Degradacja enzymu PARP (naprawa dwuniciowych pęknięć DNA) - Podczas apoptozy oraz nekrozy zachodzi degradacja enzymu - Western Blot.
Inne… Badanie uwalniania cytochromu c z
mitochondriów
• Zachodząca podczas apoptozy translokacja cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy jest skutkiem tworzenia w zewnętrznej błonie mitochondrialnej kanału białkowego zbudowanego z proapoptotycznych białek Bax i Bak.
• Metoda: liza komórek, rozdział frakcji wzbogaconej w mitochondria od cytoplazmatycznej, elektroforeza białek, Western Blot - detekcja cytochromu c na membranie przeciwciałem monoklonalnym.
2018-06-07
5
Kladnik A i in. (2004) Plant Physiol. Vol. 136; 3572-3581
TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate biotin nick-labeling)
• fluorescencyjnye (lub radioizotopowe) znakowanie wolnych końców 3’ powstających podczas degradacji DNA
• Stosuje się terminalną transferazę dNTP (TdT) -katalizuje przyłączanie nukleotydów do końców 3’ w sposób niezależny od matrycy (Np.5-bromo-2’-deoksyurydyna znakowana biotyną lub digoksygeniną)
Test z aneksyną V• Błona komórkowa ma asymetryczne
rozmieszczenie lipidów błonowych
• wczesnym objawem apoptozy jest utrata tej asymetrii bez naruszenia integralności błony
• Fosfatydyloseryna (PS), obecna jest od strony cytoplazmatycznej błony, podczas apoptozy przemieszcza się do warstwy zewnętrznej
• PS in vivo umożliwia rozpoznanie i usunięcie komórki apoptotycznej przez fagocyty
• aneksyna V - 35-36 kDa, białko zależne od jonów wapnia, wykazuje duże powinowactwo do PS, wyznakowana FITC może słuzyć do jej detekcji
2018-06-07
6
SZLAKI INDUKCJI APOPTOZY
SZLAK BŁONOWY
Działanie ligandów na błonowe receptory:
* DISC – Death induced signalling complex
D
I
S
C
Aktywacja domen śmierci (DD)
Przyłączenie białek adaptorowych (FADD, TRADD)
Przyłączenie i autoproteliza prokaspazy 8
Receptorowa indukcja apoptozy przez ligandy:
-Tumor necrosis factor), TNFα
- APO-1/FAS (CD95),
-TRAIL (TNF-related apoptosis inducing factor)*
- Limfotoksyna
*dla komórek transformowanych
2018-06-07
7
Aktywacja apoptozy od zewnątrz
Aktywacja apoptozy od wewnątrz
SZLAK MITOCHONDRIALNY
1
2 Uwolnienie DIABLO (direct IAP binding protein with low PI)
SZLAKI INDUKCJI APOPTOZY cd.
APOPTOSOM
Uwolnienie cytochromu C (Bax, Bad)
Przyłączenie Apaf-1 do prokaspazy 9
Autoproteoliza prokaspazy 9
2018-06-07
8
- uszkodzenie siateczki śródplazmatycznej
- uwolnienie jonów Ca2+
- aktywacja kaspazy 12
SZLAKI INDUKCJI APOPTOZY cd.
SZLAK SIATECZKI ŚRÓDPLAZMATYCZNEJ
CZYNNIKI INDUKUJĄCE APOPTOZĘ
Biologiczne:
• hormony: (glikokortykoidy, h. płciowe, ACTH,
• cytokiny TNFα, TGFβ, IL1β, IL3, IL6
• p-ciała anty Fas/APO-I
• niedobór czynników wzrostowych
• produkty limfocytów cytotoksycznych (perforyny, proteazy serynowe-granzymy A i B)
• niektóre wirusy (HIV)
• przerwanie kontaktu z otoczeniem
2018-06-07
9
CZYNNIKI INDUKUJĄCE APOPTOZĘ cd.
Chemiczne• wolne rodniki, • leki: antracykliny
niektóre antybiotyki (bleomycyna)aspiryna
• inhibitory niektórych enzymów (topoizomerazy I,II, kinazy C)• związki toksyczne: alkilujące, CCl4
cyjanki, alkohol
Fizyczne:
• Promieniowanie UV, Rtg
• szok zimny
• szok cieplny
INHIBITORY APOPTOZY
• Bcl – 2
• IAPs (Inhibitor of apoptosis proteins)
• FLIP (Flice inhibitory protein)
• Białko surwiwina (z rodziny IAP)
• Fosforylacje (receptorów, Bcl 2, Bad)
• SODD (silencer of death domains)
• Białka szoku termicznego
2018-06-07
10
ASPEKT MEDYCZNY
Zmiany dotyczące białek IAPs:
W komórkach transformowanych:
- nadekspresja
- zaburzenie degradacji
We wrodzonej atrofii mięśni kręgosłupa:
- mutacja prowadząca do nadmiernej aktywacji kaspaz
Specyfika Apoptozy w komórkach nowotworowych:
•Indukcja apoptozy przez TRAIL omija brak p53 i nadekspresję Bcl-2
•Indukcja apoptozy przez blokowanie receptorów związanych z przeżyciem
•Większość stosowanych leków działa poprzez szlak mitochondrialny zwłaszcza przez uwalnianie smac/DIABLO
•Mutacje genów proapoptotycznych – oporność na chemio- i radioterapię
2018-06-07
11
PRZYKŁADY APOPTOZY
• regresja ogona u kijanek• zanik błon międzypalcowych u ludzkich embrionów• redukcja ilości komórek w różnych tkankach (CSN) l• zanik gruczołu mlekowego po ustaniu karmienia• atrezja pęcherzyków jajnikowych• regresja korzenia włosa (catogen)• rogowacenie komórek naskórku • delecja autoreaktywnych T limfocytów i neutrofilów• utrzymanie stałej liczebności populacji wolno i szybko
rosnących• supresja nowotworów
W warunkach fizjologicznych
ROZPOZNAWIANIE KOMÓREK APOPTOCZNYCH PRZEZ
MAKROFAGI DZIĘKI:
- lektynom
- rozpoznanie zmienionego cukru w otoczce
- integrynom
- rozpoznanie :
trombospondyny
fibronektyny
fosfatydyloseryny (przemieszczonej do zewnętrznej blaszki)
2018-06-07
12
RÓWNOWAGA POMIĘDZY PROLIFERACJą KOMÓREK A APOPTOZĄ
APOPTOZA: AIDS
Ch.Alzheimera C. Parkinsona
anemia aplastyczna zawał serca
PROLIFERACJA: rak
lupus erythematosus glomerulonephritis infekcje wirusowe
PCD
apoptoza
autofagia
Nie-lyzosomalma
micro-autofagia macro-autofagia mega-autofagia
Wauter G. Van Doorn and Ernst J. Woltering. Trends in Plant Science vol. 3 No. 3 March 2005
2018-06-07
13
apoptoza
Nie-lyzosomalna
micro-autofagia
macro-autofagia
mega-autofagia
Wauter G. Van Doorn and Ernst J. Woltering (2005). Trends in Plant Science vol. 3 No. 3
Udział wakuoli
Hatsugai N i in.(2006) Apoptosis online 13.03.2006
2018-06-07
14
Regulacja PCDFitohormony
Etylen
Starzenie (słupek u Pisum sativum)
Tkanka bielma u zbóż
Miękisz powietrzny
Komórki epidermy zawiązków korzeni przybyszowych (Oryza sativa)
ABA
GA
Steffens B i in (2005) Plant Physiology Vol.139; 713-721
Orzaez D i Granell A(1997) Plant J.11; 137-144
Todd E. Young and Daniel R. Gallie (2000) Plant Molecular Biology 44: 283–301
Justin SHFW and Armstrong W (1991) New Phytol 118: 49-62
Fitohormony
Kwas jasmonowy BrassinosteroidyKwas salicylowy
Różnicowanie komórek drewna u Z. elegansHR związane z Fumonizyną
B1HR
Yamamoto T(2001) Plant Physiol 125; 556-563
Asai T i in.(2000) Plant Cell 12; 1823-1836
Maxwell D i in. (2002) The Plant Journal 29; 269-279
Inhibicja transportu elektronów, spadek ATP
2018-06-07
15
Udział ROS
Zmodyfikowano za Finkiel T i Holbrook NJ (2000) Nature vol 408; 239-247
Mittler T (2002) Trends in Plant Science Vol 7.No.9; 405-410
NO
HR Indukcja powstawania PTInhibicja transportu elektronów, spadek ATP
Casolo V i in. (2005) Journal of Experimental Botany vol. 56, No 413; 997-1006
Jones A (2000) Trends in Plant Science, vol 5; 225-229
Udział N0
2018-06-07
16
Udział mitochondriów
Zmodyfikowano za Lam E i in. (2001) Nature: 411; 848-853
Balk J i in.(2003) Plant J. 34, 573-583
zwierzęta rośliny
Mg2+-dependent nuclease
Udział mitochondriów
Uwolnienie cytochromu C do cytozolu
Integracja sygnałów stresu
Zmodyfikowano za Jones A (2000) Trends in Plant Science, vol 5; 225-229
Casolo V i in. (2005) Journal of Experimental Botany vol. 56, No 413; 997-1006
K+ATP
channelNO
H2O2
2018-06-07
19
Udział mitochondriów
Mitochondria w komórkach nie ulegających PCD
Mitochondria w komórkach ulegających PCD
Yu X-H i in(2002) Cell Death and Differentiation 9:189-198nekroza
Mitochondria w komórkach nekrotycznych
24 h
72 h24 h
72 h
Udział mitochondriów
Yu X-H i in(2002) Cell Death and Differentiation 9:189-198
2018-06-07
20
Udział chloroplastów
Zapata JM, Guera A, Esteban-Carrasco A, Martin M, Sabater B (2005) Cell Death and Differentiation 12, 77−1284
Udział chloroplastów
a. Albertson P-A (2001) TRENDS in Plant Science 6 (8): 349-354
b. Pfannschmidt T (2003) TRENDS in Plant Science 8(1):33-42
(a)
2018-06-07
21
Udział wakuoliVPE-proteinazy cysteinowe, asparagino specyficzne.Biorą udział w dojrzewaniu
białek wakuolarnych i lizosomalnych.
Hatsugai N i in.( 2004) Science vol 305, 855-858
Hatsugai N i in.(2006) Apoptosis online 13.03.2006
Arabidopsis thaliana: βVPE i δVPE (nasiona); αVPE i γVPE (organy wegetatywne)
Udział wakuoli
Hatsugai N i in.( 2004) Science vol 305, 855-858
Hypersensitive cell death
2018-06-07
22
Udział wakuoli
Hara-Nishimura I i in.(2005), Current Opinion in Plant Biology 8:404-408
Procesy rozwojowe związane z PCD„koronkowy” kształt liści
Monstera species
Gunawardera AHLAN i in. (2004) The Plant Cell Vol 16; 60-73
1. Wzrost przepuszczalności /pęknięcie tonoplastu
2. Zahamowanie ruchu cytoplazmy
3. Kondensacja chromatyny
4. Degradacja DNA widoczna w metodzie TUNEL (15-20 min)
5. Brak „drabinki”
6. Rozrzedzenie cytoplazmy
7. Oddzielenie się błony komórkowej od ściany
8. Plastydy i mitochondria nabrzmiałe, niekiedy występuje uszkodzenie błon
9. Degradacja ściany komórkowej
2018-06-07
23
Różnicowanie członów naczyń
Obara K i in. (2001), Plant Physiol, Vol. 125, pp. 615-626
1. Pęknięcie wakuoli
2. Trawienie nDNA w ciagu 10-20 min.
3. Trawienie pierwotnej ściany komórkowej oraz organelli komórkowych
4. Brak kondensacji chromatyny
5. Brak stopniowej degradacji nDNA
Procesy rozwojowe związane z PCD
Eliminacja słabszych pędów
Belenghi B i in. (2004) Journal of Experimental Botany Vol.55 No 398; 889-897
Procesy rozwojowe związane z PCD
2018-06-07
24
Rozmnażanie
Wu H-M i Cheumg A-Y (2000) Plant Molecular Biology 44; 267-281
Procesy rozwojowe związane z PCD
Starzenie się liści
Keskitalo i in. (2005) Plant Physiology Vol. 139: 1635-1648
Procesy rozwojowe związane z PCD
2018-06-07
25
PCD a czynniki zewnętrzne
Tworzenie miękiszu powietrznego
Gunavardera AHLAN(2001) Planta 212; 205-214
Stresy abiotyczne
Hypersensitive Response
Hatsugai N i in.( 2004) Science vol 305, 855-858
Park Y-S i i in. (2005) Journal of Biochemistry i Molecular Biology Vol 38No 6; 748-754
Control TMV
PCD a czynniki zewnętrzne
Stresy biotyczne
2018-06-07
26
Podsumowanie
•Zjawisko PCD występuje na wielu etapach rozwoju roślin
•Może być indukowane przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne
•Jest to proces który może prowadzić do śmierci komórek, tkanek jak również całych organów
•Mechanizm PCD u roślin wynika ze specyfiki komórki roślinnej- obecności chloroplastów i wakuoli
Literatura1. Steffens B and Sauter Margaret (2005) Epidermal Cell Death in Rice Is Regulated by Ethylene, Gibberellin, and Abscisic Acid Plant Physiology 139; 713-721
2. Jones A (2000) Does the plant mitochondrion integrate cellular stress and regulate programmed cell death? Trends in Plant Science5(5); 225-230
3. Finkiel Tand Holrook NJ(2000) Oxidants, oxidative stess and the biology of ageing nature408; 239-247
4. Wauter G. Van Doorn and Ernst J. Woltering (2005) Many ways to exit? Cell death categories in plants. Trends in Plant Science19 (3); 117-122
5. Hatsugai N, Kuroyanagi M, Yamada K, Meshi T, TsudaS, Kondo M, Nishimura M, Hara-Nishimura I (2004) A plant Vacuolar Protease, VPE, Mediates Virus-Inducet Hypersensitive Cell Death Science305; 855-858
6. Hatsugai N, Kuroyanagi M, Nishimura M and Hara-Nishimura I (2006) A cellular suicide strategy of plants: vacuole- mediatet cell death Apoptosis
7. Maxwell DP, Nickels T and McIntosh L (2002) Evidence of mitochondrial involvement in the transduction of signals required for the induction of genes associated with pathogen attack and senescence The Plant Journal 29; 269-279
8. He-ming Wu and Cheung AY (2000) Programmed cell death in plant reproduction Plant Molecular Biology 44; 267-281
9. Casolo V, Petrussa E, Krajnakova J, Macri F and Vianello A (2005) Involvement of the mitochondrial K+ATP channel H2O2 or NO induced programmed death of soybean suspension cell cultures Journal
of Experimental Botany 56 (413) 997-1006
10. Gunawardera AHLAN, Greenwood JS, Dengler NG (2004) Programmed Cell Death remodels Lace Plant leaf Shape during Development The Plant Cell 16; 60-73
11. Kinoshita T, yamada K, Hiraiwa N, Kondi M, Nishimura M, hara-Nishimura i (1999) Vacuolar Processing enzyme is up-regulated in the lytic vacuoles of vegetative tissue during denescence and under various stressed conditions The Plant Journal 19(1); 43-53
12. Lam E (2004) Controlled Cell Death, Plant Survival and Development Nature Molecular Cell Biology 5; 305-315
13. Balk J, Chew SK, Leaver CJMcCabe PF (2003) The intermembrane space of plant mitochondria contains a Dnase activity that may be involved in programmed cell death Plant Journal 34; 573-583
14. Clarke, A., Desikan, R., Hurst, R. D., Hancock, J. T. & Neil, S. J. NO way back: nitric oxide and programmed cell death in Arabidopsis thaliana suspension cultures. Plant J. 24, 667–677
15. Asai, T. et al. Fumonisin B1-induced cell death in Arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways. Plant Cell 12, 1823–1836
16. Orzaez, D & Granell, A. DNA fragmentation is regulated by ethylene during carpel senescence in Pisum sativum. Plant J. 11, 137–144
17. Yamamoto, R. et al. Brassinosteroid levels increase drastically prior to morphogenesis of tracheary elements. Plant Physiol. 125, 556–563 (2001).
18. Obara K (2001). Direct evidence of active and rapid nuclear degradation triggered by vacuole rupture during programmed cell death in zinnia, Plant Physiol 125; 615--626
19. Zapata JM Guera A, Esteban-Carrasco A, Martin M, Sabater B (2005) Chloroplast regulate leaf senescence; delayed senescence in transgenic ndhF-defective tobacco Cell Death and Differentiation 12; 1277-1284
20. Pfannschmidt T (2003) Chloroplat redox signals: how photosynhesis controls its own genes Trends in Plant Science 8(1):33-42
21. Justin SHFW, Armstrong W (1991) Evidence for the involvement of ethylene in aerenhyma formation in adventitious roots of rice (Oryza sativa L) New Phytol 118; 49-62
22. A Kladnik, K Chamusco, M Dermastia, and P Chourey (2004)Evidence of Programmed Cell Death in Post-Phloem Transport Cells of the Maternal Pedicel Tissue in Developing Caryopsis of Maize Plant Physiol. 136: 3572-3581;
23. Yamamoto T(2001) Brassinosteroid levels increase drastically prior to morphogenesis of traheary elements Plant Physiol 125; 556-563
24. X-H Yu, T D Perdue, Y M Heimerb and A M Jones (2002) Mitochondrial involvement in tracheary element programmed cell deathCell Death and Differentiation 9, 189-19
25. Hara-Nishimura, Ikuko ,A Hatsugai, Noriyuki ,A Nakaune, Satoru ,A Kuroyanagi, Miwa ,A Nishimura, Mikio ,D (2005) Vacuolar processing enzyme: an executor of plant cell deathCurrent Opinion in Plant Biology ( 8 ); 404-408
26. Albertson P-A (2001) A quantitative model of the domain structure of the photosyntetic membrane Trends in Plant Science 6(8); 349-354