6 effect of nebulised ant dnase on

8/3/2019 6 Effect of Nebulised ant DNase On

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Co s t e l l o ,O 'C o n n o r ,F i n l a y ,S h i e l s ,F i t z G e r a l d ,H a y e s

s p u t u mf r o m p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i si sa s s o c i a t e dw i t hDNA a n dm u c i n ,w h i c hi n h i b i ti t s a c t i v i t y . 2 2I n v i t r os t u d i e sh a v e s h o w nt h a tr h D N a s er e l e a s e ss e q u e s t e r e dp r o t e a s e sf r o mDNA ,r e s u l t i n gi na n i n c r e a s ei nf r e en e u t r o p h i le l a s t a s ea c t i v i t y . 2 3 2 4T h i s r a i s e st h e p o s s i b i l i t yt h a t s o l u b i l i s a t i o no f DNA i n t h ea i r w a y smayr e m o v ea s o u r c e o f e n z y m ei n h i b i t i o n ,e f f e c t -

i v e l yi n c r e a s i n gt h e e l a s t a s el o a d .The a i mo f t h i ss t u d yw a st o a s s e s st h ee f f e c to f r h D N a s et h e r a p yo n t h e n e u t r o p h i le l a s t a s el o a d i n p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .I n l i g h to ft h e p r o i n f l a m m a t o r yr o l eo f I L - 8 i n a t t r a c t i n gn e u t r o p h i l st o t h e l u n g ,t h e e f f e c to f r h D N a s et r e a t m e n to n I L - 8 l e v e l sw a sa l s oa s s e s s e d .Thes t u d y w a s d e s i g n e dt o e n a b l e e v a l u a t i o no fmed ium t e r m ( 1 2 w e e k s )a n d l o n g t e r m ( 5 2w e e k s ) e f f e c t so f c o n t i n u o u sr h D N a s ea d -m i n i s t r a t i o n .

Method sSTUDYDESIGNF i f t e e n a d u l tp a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s( e i g h twomen) a g e d 1 7 - 2 9y e a r sw e r er e c r u i t e di n a no p e n s t u d y .P a t i e n t sw e r e r e q u i r e d t o h a v ea f o r c e d v i t a lc a p a c i t y ( F V C )o f 40-70% o fp r e d i c t e da n d t o h a v ep r o v e nc y s t i c f i b r o s i sa sd e m o n s t r a t e db y a p o s i t i v es w e a t t e s t o rDF508 /DF508 g e n o t y p e .A l l p a t i e n t sw e r eg i v e n2 - 5 mg r h D N a s e( G e n e n t e c h )d a i l yv i aaHudson T- U p d r a f tI I J e tn e b u l i s e rw h i c hw a sc o n n e c t e dt o a P u l m o A i d ec o m p r e s s o r( R o c h eP r o d u c t s L t d , H e r t f o r d s h i r e ,U K ) . P a t i e n t sc o n t i n u e do n p h y s i o t h e r a p y ,a n d m e d i c a t i o n si n c l u d i n ga e r o s o l i s e da n t i b i o t i c s ,, Ba g o n i s t s ,m e t h y l x a n t h i n e s ,c o r t i c o s t e r o i d s ,

p a n c r e a t i ce n z y m e sa n d v i t a m i ns u p p l e m e n t sw e r em a i n -t a i n e d t h r o u g h o u tt h es t u d y .A l la c u t e i n f e c t i v ee p i s o d e sw e r er e c o r d e d .I n t r a v e n o u sa n t i b i o t i c sw e r eg i v e na sc l i n i c a l l yi n d i c a t e d .P a t i e n t sw e r ea s s e s s e da t e n t r y t o t h es t u d ya n d a t 1 1 - 1 2a n d4 9 - 5 7w e e k sf o l l o w i n gi n i t i a t i o no f r h D N a s et h e r a p y .A t e a c h v i s i ts p i r o m e t r i ct e s t sw e r ec a r r i e do u t a c c o r d i n gt o t h e g u i d e l i n e so f t h eA m e r i c a nT h o r a c i cS o c i e t ya t t h es a m e t i m eo n e a c hv i s i td a ya n db l o o da n ds p u t u ms a m p l e sw e r e t a k e n .Th e s t u d y w a s a p p r o v e db y t h eS t V i n c e n t ' sHo s p i t a l e t h i c a lc o m m i t t e ea n dw r i t t e ni n f o r m e dc o n s e n tw a s o b t a i n e df r o ma l lp a t i e n t s .

SAMPLEPROCESSINGANDANALYSISS p u t u ms a m p l e sw e r em a i n t a i n e da t r o om t e m -p e r a t u r e a n d p r o c e s s e dw i t h i n o n e h o u r o fc o l l e c t i o nt o p r e v e n tn e u t r o p h i ld e g r a n u l a t i o nf o l l o w i n gs a m p l i n g .A v o l u m eo f 0 07Ms o d i u mp h o s p h a t eb u f f e r( p H 6 - 0 ,c o n t a i n i n g0-5MNaCl a n d 5 0, u g / m ld i t h i o t h r e i t o l )e q u i v a l e n tt o f i v et i m e s t h e s p u t u mw e i g h tw a s a d d e d a n dt h e s a m p l eg e n t l ya g i t a t e d( m a n u a l l y )u n t i lau n i f o r ms u s p e n s i o nwas o b t a i n e d . T h i s s u s -p e n s i o nw a s t h e n d i v i d e di n t ot w o e q u a l a l i -q u o t s .To o n e a l i q u o tt h e s e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o r s ,p h e n y l m e t h y l s u l p h o n y lf l u o r i d e( P M S F ) a n d d i - i s o p r o p y lf l u o r o p h o s p h a t e( D I P F ) , a n d t h e m e t a l l o p r o t e i n a s ei n h i b i t o r s ,e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d (EDTA) a n dp h e n a n t h r o l i n e( PA ) ,a t a f i n a lc o n c e n t r a t i o n

o f 1 0mM ,w e r e a d d e dt o p r e v e n tp r o t e o l y s i sf o l l o w i n gs a m p l i n g .Th e s e c o n da l i q u o tw a sr e t a i n e dw i t h o u tt h e a dd i t io no f i n h i b i t o r st oe n ab l e a s s e s s m en to f e n z y m ea c t i v i t y .A l la l i -q u o t s w e r e c e n t r i f u g e da t 30000 g f o r 3 0m i n u t e sa n d t h e r e s u l t i n gs u p e r n a t a n t sw e r es t o r e d a t - 70 C p r i o rt o a n a l y s i s .To f u l l ye v a l u a t e e l a s t a s el o a d ,s p u t u ms a m p l e sw e r e

a n a l y s e df o re l a s t a s ea c t i v i t ya n d t o t a limmuno -r e a c t i v ee l a s t a s e .L e v e l s o f t h e n e u t r o p h i lc h e m o a t t r a c t a n tI L - 8 w e r ea l s oa s s e s s e d .S o d i u mc i t r a t ew a su s e da sa n t i c o a g u l a n tf o r

t h e c o l l e c t i o no f b l o o d s a m p l e s .P l a s m aw a sc o l l e c t e db y c e n t r i f u g a t i o na t 3 5 0 g f o r 1 0m i n u t e sa n d s t o r e d a t - 70 C u n t i la s s a y e d .A s e l a s t a s ei s r a p i d l yb o u n da n d i n a c t i v a t e db yi n h i b i t o r swhen i t e n t e r st h eb l o o d s t r e a m ,i tw a sa s s e s s e di n p l a s m as a m p l e sb y m e a s u r e m e n to f t o t a li m m u n o r e a c t i v ee l a s t a s ea n d e l a s t a s ec o m p l e x e dt o o x 1 P I .P l a s m aI L - 8 l e v e l sw e r ea l s oa s s e s s e d .

A s s e s s m e n to fn e u t r o p h i le l a s t a s ea c t i v i t yS p u t u ms a m p l e st h a td i d n o t c o n t a i np r o t e a s ei n h i b i t o r sw e r e a s s a y e d f o r e l a s t a s ea c t i v i t yu s i n g t h e c h r o m o g e n i cp e p t i d e s u b s t r a t eN - m e t h o x y s u c c i n y l - A l a - A l a - P r o - Va lp - n i t r o -a n i l i d e( S i g m a ,P o o l e ,UK) a t a c o n c e n t r a t i o no f 4 - 2mM . 2 5U s i n ga n e x t i n c t i o nc o e f f i c i e n to f8 8 0 0 / l / m o l / c m ,m o l a r c on c e n t r a t i o n s o fp e p -t i d eh y d r o l y s e dw e r e d e t e r m i n e da n d e n z y m eu n i t s ,d e f i n e d a s t h e r e l e a s eo f 1 M p - n i t r o -a n i l i d e / m i n / m ls p u t um , w e r ec a l c u l a t e d .

A s s e s s m e n to ft o t a li mm u n o r e a c t i v e

n e u t r o p h i le l a s t a s eAn i n d i r e c tELISA f o r t h e m e a s u r e m e n to fn e u t r o p h i le l a s t a s ew a s u s e d t o a s s a y t o t a le l a s t a s el e v e l si n s p u t u m a n dp l a s m as a m p l e s .B r i e f l y ,a 9 6 - w e l lm i c r o t i t r ep l a t ew a s c o a t e do v e r n i g h tw i t h n e u t r o p h i le l a s t a s ei n s o d i u mc a r b o n a t eb u f f e r ,pH 9 - 6 ,c o n t a i n i n g1 - 7 5mMPMSF. The p l a t ew a sw a s h e dw i t h p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e( P B S ) / 0 -1% Tween a n d n o n -s p e c i f i cb i n d i n gs i t e sw e r e b l o c k e dw i t h P B S /1% b o v i n e s e r u ma l b u m i nf o r o n e h o u r a t3 7 C . S t a n d a r d sa n d s a m p l e sw e r e i n c u b a t e dw i t h a n e q u a l v o l u m eo f s h e e p a n t i - h u m a nn e u t r o p h i le l a s t a s ea n t i b o d y( S e r o t e c ,O x f o r d ,UK) d i l u t e dt o a f i n a lc o nc e n t r a t i o n o f1m g /m l p r o t e i nc o n t a i n i n g1 - 7 5 mM PMSFf o rt w oh o u r sa t 3 7 C .The p l a t ew a sw a s h e di n P B S /Tween a n d s t a n d a r d sa n d s a m p l e sw e r ea d d e dt o t r i p l i c a t ew e l l sa n d i n c u b a t e df o rt w o h o u r sa t 3 7 C .A f t e rw a s h i n gf i v et i m e st h e w e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t h r a b b i ta n t i - s h e e pI g G ( w h o l em o l e c u l e )a n t i b o dy ( Si gm a ,P o o l e ,UK ) a t af i n a lc o n c e n t r a t i o no f 0 a1 5m g / m lf o r3 0 m i n -u t e s a t 3 7 C .A f t e rf i v ew a s h e sg o a t a n t i - r a b b i tI g G - h o r s er a d i s h p e r o x i d a s ec o n j u g a t e ( P r o -m e g a ,M a d i s o n ,USA) d i l u t e d1 : 1 0 0 0 0w a sa d d e dt o w e l l sa n d i n c u b a t e df o r3 0 m i n u t e sa t 3 7 C . The p l a t ew a s w a s h e d1 0 t i m e s ,t h es u b s t r a t eo - p h e n y l e n e d i a m i n e( BDH Chem-i c a l s ,P o o l e ,UK ) i n 0 1 M c i t r i ca c i d ( pH 5 0 )b u f f e rw a s a d d e dt o e a c hw e l la n d i n c u b a t e da t r o om t e m p e r a t u r ei n t h e d a r k f o rf i v em i n -u t e s .Th e r e a c t i o nw a s s t o p p e db y t h e a d d i t i o n

6 2 0


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N e b u l i s e dr e c o m b i n a n tD N a s ei n c y s t i cf i b r o s i s

Ta b l e1 Mean ( S E ) a n d r a n g eo fb a s e l i n ep u l m o n a r yf u n c t i o nl e v e l sa n dp e r c e n t a g ec h a n g ef r o mb a s e l i n ea t 1 2a n d 5 2 w e e ki n t e r v a l s

FEV, FVC

B a s e l i n e% p r e d i c t e d 3 4 - 7 ( 2 - 1 ) 5 2 7 ( 2 - 3 )( 2 3 t o 5 1 ) ( 4 1 t o 6 9 )

% C h a n g ea t 1 2 w e e k s 1 - 4 6 ( 5 - 4 6 ) 1 - 0 4 ( 5 - 6 )( - 3 3 t o -4 6 ) ( -3 2 t o - 5 3 )

% C h a n g ea t 5 2 w e e k s - 3 - 1 3 ( 7 - 0 3 ) - 4 - 4 5 ( 87 )( - 4 7 t o -4 6) ( -5 0 t o -56 )

o f 4 N H , S O 4a n d a b s o r b a n c er e a d a t 4 9 0n m( B i o t e km i c r o p l a t er e a d e r ,E L - 3 0 9 ,Ve r m o n t ,U S A ) .

A s s e s s m e n to f n e u t r o p h i le l a s t a s e l / c i P Ic o m p l e x e sN e u t r o p h i le l a s t a s ebound t o o x 1 P Iw a s m e a s -u r e d i n p l a s m as a m p l e sb y a d o u b l e l i g a n dELISA ( M e r c k , D a r m s t a d t , G e r m a n y ) .S a m p l e sw e r e a d d e d t o p l a s t i ct u b e s c o a t e dw i t h a n t i - n e u t r o p h i le l a s t a s ea n t i b o d ya n d i n -c u b a t e d a t 2 0 C f o r o n e h o u r . A n a l k a l i n ep h o s p h a t a s e - co n j u ga t e d a n t i b o d yt o o c t P Iw a st h e n a d d e d a n di n c u b a t e da t 2 0 Cf o r3 0 m i n -u t e s .F o l l o w i n gw a s h i n gt o r e m o v ee x c e s sa n t i -b o d y , t h e e n z y m ea c t i v i t yo f t h e c o m p l e x e da l k a l i n ep h o s p h a t a s ew a s m e a s u r e dp h o t o -m e t r i c a l l yu s i n g 4 - n i t r o p h e n y lp h o s p h a t ea ss u b s t r a t e .A b s o r b a n c e sw e r e r e a d a t 4 0 5nm( U l t r o s p e cP l u s ,U p p s a l a ,S w e d e n ) .

A s s e s s m e n to fI L - 8I L - 8 l e v e l si ns p u t u ma n dp l a s m as a m p l e sw e r em e a s u r e dw i t h a c o mm e r c i a l l ya v a i l a b l ehumanI L - 8 i m m u n o a s s a yk i t ( R & D s y s t e m s ,O x o n ,U K ) . I n b r i e f ,s t a n d a r d s a n d s a m p l e sw e r ea d d e dt o a 9 6 w e l lELISA p l a t ec o a t e d w i t hm o n o c l o n a la n t i b o d ys p e c i f i cf o r I L - 8 .A f t e rw a s h i n g ,a n e n z y m el i n k e dp o l y c l o n a la n t i b o d yf o l l o w e db y a s u b s t r a t e s o l u t i o n( s t a b i l i s e dh y d r o g e n p e r o x i d e a n d c h r o m o g e nt e t r a -m e t h y l b e n z i d i n e )r e s u l t e di n c o l o u r d e v e l o p -m e n t . A b s o r b a n c ew a s m e a s u r e da t d u a lw a v e l e n g t h4 5 0 / 5 4 0nm ( B i o t e k m i c r o p l a t er e a d e r ,E L - 3 0 9 ,Ve r m o n t ,U S A ) .

DATAANALYSISM e a s u r e m e n t sb e f o r ea n d a f t e rr h D N a s ew e r ec o m p a r e du s i n gt h e Wi l c o x o ns i g n e dr a n kt e s t .A p v a l u e o f l e s s t h a n 0 - 0 5 w a s c o n s i d e r e d

Ta b l e2 Mean ( S E ) a n d r a n g eo fp l a s m aa n d s p u t u ml e v e l so fe l a s t a s eb e f o r ea n d a f t e rr h D N a s et h e r a p y

B e f o r e 1 2 w ee ksa f t e r 5 2 w e e k sa f t e rr h D N a s e r h D N a s e r h D N a s e

P l a s m a :To t a l e l a s t a s e( n g / m l ) 2 4 2 0 ( 3 4 6 ) 2 9 9 - 8 ( 6 8 - 0 ) 1 5 9 - 6 ( 1 2 - 4 ) * *

( 1 2 0 - 5 4 2 ) ( 9 4 9 - 9 2 3 ) ( 6 6 6 - 2 0 64 )E l a s t a s e / o c , P 1 ( p g / l ) 8 9 - 2 ( 1 9 - 3 ) 7 4 - 8 ( 6 - 4 ) 5 5 - 8 ( 44 )

( 3 9 - 3 - 3 1 4 ) ( 4 2 - 1 - 1 1 8 - 6 ) ( 3 9 - 5 - 7 52 )

S p u t u m :E l a s t a s ea c t i v i t y( m U ) 0 - 6 8 6 ( 0 - 1 3 1 ) 0 4 3 5 ( 0 0 65 )* 0 3 6 6 ( 0 0 89 )

( 0 - 0 8 3 - 1 - 5 8 ) ( 0 - 0 8 8 - 0 - 7 2 1 ) ( 00 3 7 - 0 8 6 2 )To t a l e l a s t a s e( p g l m l ) 4 1 - 7 ( 7 - 1 ) 3 9 0 ( 5 7 ) 3 1 - 5 ( 8 - 2 )

( 2 0 - 9 4 ) ( 1 3 - 2 - 8 4 ) ( 1 0 - 9 3 - 3 )I L - 8 ( n g /m l ) 1 2 1 - 0 ( 1 3 - 2 ) 1 0 4 - 9 ( 1 3 - 3 ) 111 - 2 ( 1 7 - 5 )

( 2 9 - 3 - 1 9 7 ) ( 1 8 - 1 8 2 ) ( 1 7 - 2 - 2 0 7 - 5 )

*p < 0 0 5 ;** p5% a b o v eb a s e l i n e )i n f o r c e d e x p i r a t o r y v o l u m ei n o n e s e c o n d( F E V I )w e r eo b s e r v e di n f i v eo f t h e s e p a t i e n t s .H o w e v e r ,i n f o u r ( 2 7 % )p a t i e n t sa f a l lo f 5%i n b o t h F VC a n d FEV1 w a s o b s e r v e d .By 5 2w e e k sa n i m p r o v e m e n ti nF E V,w a s m a i n t a i n e di n o n l y 27% o f p a t i e n t ss t u d i e d .D u r i n g t h e c o u r s e o f t h e s tu dy o n l yt w o

p a t i e n t sr e m a i n e d f r e e o f i n f e c t i v ee x -a c e r b a t i o n s .The r e m a i n i n g1 2 p a t i e n t sr e -q u i r e di n t r a v e n o u sa n t i b i o t i ct h e r a p y1 - 8 t i m e s

( m e a n number o f i n f e c t i v ee p i s o d e s= 2 - 7

( 0 - 6 ) ) .

ALTERATIONSIN ELASTASELOAD F O LL OW I NGRHDNASE THERAPY

T h e r e w a s a s i g n i f i c a n td e c r e a s e i n s p u t u me l a s t a s ea c t i v i t y( p < 00 5 ) a t 1 2 w e e k sf o l l o w i n gi n i t i a t i o no f rhDNase t h e r a p y( t a b l e2 ) .How -e v e r ,t h e r e w a s n o c o r r e s p o n d i n gc h a n g ei nt o t a l( i mm u n o g e n i c ) s p u t u mo r p l a s m ae l a s t a s el e v e l so r i n p l a s m al e v e l so f t h e e l a s t a s e / o t , P Ic o m p l e xa t t h i st i m e .The r e d u c t i o ni n s p u t u me l a s t a s ea c t i v i t yo b s e r v e da t 1 2w e e k sw a sm a i n -t a i n e d a t 5 2 w e e k s( t a b l e2 ) , a t w h i c ht i m e a

s i g n i f i c a n tr e d u c t i o ni n t o t a lp l a s m ae l a s t a s e( p < 0 0 0 5 )w a s a l s o o b s e r v e d ( f i g u r e ) .A l -t h o u g h , a s e x p e c t e d ,t h e r ew a s a s i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w e e n p l a s m a l e v e l so f t o t a le l a s t a s ea n d e l a s t a s e / o t 1 P Ic o m p l e x( r = 0 - 6 5 ,p < O O l ) ,t h e d e c r e a s ei n e l a s t a s e / o t 1 P Ic o m p l e xl e v e l so b s e r v e da t 5 2 w e e k sd i d n o t r e a c hs t a t -i s t i c a ls i g n i f i c a n c e .No r e l a t i o n s h i pb e t w e e na l t e r a t i o n s i ne l a s t a s el e v e l sa n d c h a n g ei n l u n gf u n c t i o nw a s o b s e r v e d( p= 0 0 5 7 ) .

I L - 8 LEVELSN a n o g r a mq u a n t i t i e so f I L - 8w e r e r e a d i l yd e -t e c t a b l ei n b a s e l i n es p u t u ms a m p l e sf r o m a l lp a t i e n t s .N e b u l i s e drhDNase t r e a t m e n t f o re i t h e r1 2 o r 5 2 w e e k sd i d n o t a l t e rs p u t u mI L -8 l e v e l s( t a b l e2 ) .I L - 8was n o t d e t e c t a b l e( a s s a yd e t e c t i o nl i m i t = 1 8 - 0p g / m l ) i n c o r r e s p o n d i n gp l a s m as a m p l e s .

6 2 1


4/5

C o s t e l l o ,O ' C o n n o r ,F i n l a y ,S h i e l s ,F i t z G e r a l d ,H a y e s

5 5 0

5 0 0

3 0 0

4

In

E

2 5 0

2 0 0

1 5 0

1 0 0

5 0QP r e

P l a s m al e v e l so fn e u t r o p h i le l a s t a s eb e f o r ec o m m e n c i n gtreatment w i t h DNase ( p r e )a n d a t 5 2 w e e k s( p o s t ) .

D i s c u s s i o nS i n c e i t s i n t r o d u c t i o ni n 1 9 9 4 , t r ea tmen t w i t hn e b u l i s e drhDNase h a s b e e ns h o w nt o i m p r o v ep u l m o n a r yf u n c t i o na n dp a t i e n twe l l b e i n ga n dr e d u c e t h e r i s ko f i n f e c t i v ee x a c e r b a t i o n s . 6 - 9D e s p i t e t h i s app a r e n t i m p r o v e m e n ti n p u l -monary s t a t u s i n c y s t i cf i b r o s i sp a t i e n t s ,t h ee f f e c to f n e b u l i s e drhDNase on i n f l a m m a t i o no f t h e a i r w a y s ,w h i c hm i g h t suppo r t a l o n g e rt e rm b e n e f i t ,h a s n o t b e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e d .I n d e e d , c o n c e r n s h a v e b e e n r a i s e d t ha ts o l -u b i l i s a t i o no f DNA i n t h e a i r w a y smay s e r v et o r e l e a s es e q u e s t e r e dn e u t r o p h i le l a s t a s ew i t hp o t e n t i a la d v e r s el o n g t e rm e f f e c t s .S u c h c o n -c e r n a r i s e sf r o m i n v i t r os t u d i e sw h i c hdem-o n s t r a t e t h e r e l e a s eo f a c t i v en e u t r o p h i le l a s t a s eb y r h D N a s e . 2 3 2 4R e s u l t sf r o mt h e present s t u d yi n d i c a t e t h a t , i n v i v o ,rhDNase s i g n i f i c a n t l yr e d u c e s r a t h e r t h a n i n c r e a s e s t h e n e u t r o p h i le l a s t a s el o a d i n p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .F o l l o w i n g1 2 w e e k s o f d a i l yr hDNase a d -m i n i s t r a t i o n ,t h e l e v e l so f a c t i v e e l a s t a s ei n t h es p u t um were s i g n i f i c a n t l yr e d u c e dand b y 5 2w e e k st h i sr e d u c t i o nwas r e f l e c t e di n d e c r e a s e dp l a s m al e v e l so f t o t a ln e u t r o p h i le l a s t a s e .Noc h a n g e i n t o t a ls p u t um e l a s t a s ewas n o t e d ,s u g g e s t i n gmore e f f e c t i v ei n h i b i t i o nw i t h i n t h el u n g o f r e l e a s e de l a s t a s e .Tw o p r e l i m i n a r yre -p o r t s h a v ev a r i o u s l yd e s c r i b e db o t h i n c r e a s e s 2 4a n d d e c r e a s e s 2 6i n s p u t u m e l a s t a s ea c t i v i t yf o l l o w i n g rhDNase t h e r a p y .R o c h a t andc o l l e a g u e so b s e r v e da s i g n i f i c a n ti n c r e a s e i ne l a s t a s ea c t i v i t yf o l l o w i n g t w o w e e k s o frhDNase t r e a tmen t i ne i g h tp a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s . 2 4Shah e t a l r e p o r t e d a d e c r e a s e i ns p u t um e l a s t a s ea c t i v i t yi n a l a r g e rg r o u p o fp a t i e n t st r e a t e d f o r 2 4 w e e k s . 2 6 H o w e v e r ,

p a t i e n t swho d e v e l o p e dr e s p i r a t o r yt r a c ti n -f e c t i o n sw e r e e x c l u d e df r o mt h e s t u d y .I n t h ec u r r e n t s t u d y a d e c r e a s ei n e l a s t a s el o a d waso b s e r v e de v e n t h o u g hm o s t o f t h e p a t i e n t se x p e r i e n c e da t l e a s to n e i n f e c t i v ee x a c e r b a t i o no v e r t h e 5 2 w e e kp e r i o d .T h e s ed a t a s u g g e s tt h a t c o n c e r n s o v e r t h e p o s s i b l ed e l e t e r i o u se f f e c to f l o n g t e r m r h D N a s et r e a t m e n to n e l -a s t a s el o a d

i n c y s t i cf i b r o s i sa r e l a r g e l yu n -f o u n d e d .S e v e r a l s t u d i e sh a v e i m p l i c a t e dI L - 8 a s a

m a j o rm e d i a t o ro f n e u t r o p h i li n f l u xt o t h e l u n gi n i n f l a m m a t o r yd i s e a s e s . 2 7 2 8Khan a n d c o -w o r ke r s h a v er e c e n t l yr e p o r t e dt h e p r e s e n c eo fh i g h l e v e l so f I L - 8 i n t h e l u n g so f i n f a n t sw i t hc y s t i cf i b r o s i si n t h e a b s e n c eo f c o l o n i s a t i o nw i t h c ommo n c y s t i cf i b r o s i s - r e l a t e dp a t h o -g e n s . ' 2T h e s ea u t h o r s s u g g e s tt h a te x p r e s s i o no f I L - 8 b y a l v e o l a rm a c r o p h a g e smay b e f u n -d a m e n t a l t o t h e n eu tr op h i ld o m i n a t e di n -f l a m m a t o r yr e s p o n s ei n t h e l u n g s o f p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .I n t h e c u r r e n t s t u d yt r e a t -m e n tw i t h r h D N a s ew a si n e f f ec t i v e i nr e d u c i n gt h e h i g h l e v e l so f I L - 8 o b s e r v e di n s p u t u ms a m p l e s , s u g g e s t i n gt h a tc l e a r a n c e o f mucusf r o m t h ea i r w a y smay h a v e l i t t l ee f f ec t i nr e -d u c i n gu n d e r l y i n gn e u t r o p h i lc h e m o t a x i s .A l t h o u g ht h e m a i np u r p o s eo f t h i ss t u d yw a s

t o a s s e s sa l t e r a t i o n si n e l a s t a s el o a d d u r i n gr h D N a s et h e r a p y ,t h e l a c ko f i m p r o v e m e n ti np u l m o n a r yf u n c t i o n d e s e r v e sc o m m e n t .B o t hs h o r tt e r m ( 1 - 2 w e e k s ) a n d l o n g t e r m ( u pt o t w o y e a r s )c l i n i c a lt r i a l sr e p o r t s i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n to v e rb a s e l i n ev a l u e si nb o t hF E V,a n d FVC i n p a t i e n t s t r e a t e dw i t h r h D N a s e .W h i l e t h e e x t e n t o f i n i t i a li m p r o v e m e n to b -s e r ve d w i t h i nd a y s o f commencemen t o f t h e r -a p y ( 1 0 - 1 5 % )i s n o t m a i n t a i n e d ,s u s t a i n e di n c r e a s e so f 4 - 7% o v e r b a s e l i n ea r eo b s e r v e dw i t h d a i l ya d m i n i s t r a t i o no f r h D N a s eo v e r at w o y e a r p e r i o d . 2 9I n a l ls t u d i e s ,h o w e v e r ,s i g -n i f i c a n ti n d i v i d u a lv a r i a t i o ni n r e s p o n s ei s o b -s e r v e d .I n t h e l a r g e s ts t u d yc a r r i e do u t t o d a t eF u c h s e t a l i n d i c a t et h a t 6-7% o f t r e a t e dp a t i e n t sa c t u a l l ye x p e r i e n c e da d e c l i n ei nF E Vyo f more t h a n 1 0% .8 D av i sh a s s u g g e s t e dt h a ta s i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n ti n F E Vyw i l lb e o b -s e r v e d i n l e s st h a n 30% o f p a t i e n t s ,a f i g u r es i m i l a rt o t h e 27% o f p a t i e n t si no u r s t u d ywhod i s p l a y e da s u s t a i n e d i m p r o v e m e n ti n F E V Lo v e r t h e 5 2 w e e ks t u d yp e r i o d . 3 0O t h e rr e c e n ts t u d i e sr e p o r t r e s u l t sc o n s i s t e n tw i t h t h o s e o b -s e r v e dh e r e ,s u g g e s t i n gt h a to n l y a p r o p o r t i o no f p a t i e n t smay d e r i v es u s t a i n e d b e n e f i ti np u l m o n a r yf u n c t i o nf r o mDNase t h e r a p y. 3 "

I n s u m m a r y ,t h i ss t u d y i n d i c a t e st h a tp r o -l o n g e dd a i l ya d m i n i s t r a t i o no f rhDNase r e s u l t si n d e c r e a s e si n s p u t u me l a s t a s ea c t i v i t ya n d i np l a s m al e v e l so f t o t a ln e u t r o p h i le l a s t a s e ,t h u ss e r v i n gt o r e d u c e ,r a t h e rt h a n i n c r e a s e ,t h ee l a s t a s el o a d i n p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .

1 Chemick WS, B a r b e r oG J . C o m p o s i t i o no f t r a c h e o b r o n c h i a ls e c r e t i o n s i n c y s t i cf i b r o s i so f t h e p a n c r e a s a n d b r o n -c h i e c t a s i s .P e d a t I c s 19 5 9 ; 2 4 : 7 3 9 - 4 5 .

2 C h e r n i c kWS, B a r b e r oG J , E i ch e l H J.I n v i t r oe v a l u a t i o no f e f f e c to f e n z y m e son t r a c h e o b r o n c h i a ls e c r e t i o n sf r o mp a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .P e d i a t r i c s1 9 6 1 ; 2 7 : 5 8 9 - 9 6 .3 L i e b e r m a nJ . Domase a e r o s o le f f e c ton s p u t u mv i s c o s i t yi nc a s e s o f c y s t i cf i b r o s i s .J 7 AMA1 9 6 8 ; 2 0 5 : 3 1 2 - 3 .

4 R a s k i nP .B r o n c h o s p a s ma f t e ri n h a l a t i o no f p a n c r e a t i cd o r -n a s e . Am R e vR e s p i rD i s 1 9 6 8 ; 9 8 : 6 9 7 - 8 .

5 S h a k S , C a p o nDJ , H e l l m i s sR , M a r s t e r sSA , B a k e rC L .R e c o m b i n a n th uman DNase 1 r e d u c e s t h e v i s c o s i t yo f

6 2 2

" l l *


5/5

N e b u l i s e dr e c o m b i n a n tD N a s ei n c y s t ic f i b r o s i s

c y s t i cf i b r o s i ss p u t u m .P r o cN a t lAcad Sc i US A 1 9 9 0 ; 8 7 :9 1 8 8 - 9 2 .

6 A i t k e nML, B e r kW , M a c D o n a l dG , S h a kS ,M o n t g o m e r yA B ,S m i t hA . R e c o m b i n a n thuman DNase i n h a l a t i o ni nn o r m a ls u b j e c t sa n d p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .J A A AM1 9 9 2 ; 2 6 7 : 1 9 4 7 - 5 1 .

7 R a n a s i n h aC , A s s o u f iB , S h a kS , C h r i s t i a n s e nD , F u c h s H ,EmpeyD . E f f i c a c ya n ds a f e t yo f s h o r t - t e r ma d m i n i s t r a t i o no f a e r o s o l i s e dr e c o m b i n a n thuman DNase 1 i na d u l t sw i t hs t a b l es t a g ec y s t i cf i b r o s i s .L a n c e t1 9 9 3 ; 3 4 2 : 1 9 9 - 2 0 2 .

8 F u c h sH J , B o r o w i t zD S , C h r i s t i a n s e nDH, M o r r i sEM ,Nash ML, Ramsey BW.E f f e c to f a e r o s o l i s e dr e c o m b i n a n thuman DNa s e o n e x a c e r b a t i o n so f r e s p i r a t o r ys y m p t o m sa n d o n p u l m o n a r yf u n c t i o ni np a t i e n t sw i t hc y s t i cf i b r o s i s .N E n g l_ tMed 1 9 9 4 ; 3 3 1 : 6 3 7 - 4 2 .

9 S h a hP L , Sc o t t SF , F u c h sH J ,G e d d e sDM , Hodson ME.Med ium t e r m t r e a t m e n to f s t a b l es t a g ec y s t i cf i b r o s i sw i t hr e c o m b i n a n thuman DNase 1 . T h o r a x1 9 9 5 ; 5 0 : 3 3 3 - 8 .

1 0 B e r g e rM. I n f l a m m a t i o ni n t h e l u n g i n c ys t i cf i b r o s i s .Av i c i o u sc y c l e t h a td o e s m o r eharm t h a n g o o d ?C l i nR e vA l l e r g y1 9 9 1 ; 9 : 1 1 9 - 4 2 .

1 1 C a n t i nA . C y s t i cf i b r o s i sl u n gi n f l a mm a t i o n :e a r l y ,s u s t a i n e d ,a n d s e v e r e .Am j R e s p i rC r i tC a r eMed 1 9 9 5 ; 1 5 1 : 9 3 9 - 4 1 .

1 2 Khan T Z ,Wa g e n e rJ S ,B o s t T , M a r t i n e zJ , A c c u r s oF J ,R i c h e sDWH .E a r l yp u l m o n a r yi n f l a m m a t i o ni n i n f a n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .Am J R e s p i rC r i tC a r eMed 1 9 9 5 ; 1 5 1 :1 0 7 5 - 8 2 .

1 3 S u t e r S , S c h a a dUB , Roux L , N y d e g g e rUE, Wa l d vo g e l F A .G r a n u l o c y t en e u t r a lp r o t e a s e sa n dP s e u d o m o n a se l a s t a s ea sp o s s i b l ec a u s e s o f a i r w a yd a m a g ei n p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .J I n f e c tD i s 1 9 8 4 ;1 4 9 : 5 2 3 - 31 .

1 4 J a n o f f A , W h i t eR , C a r pH , H a r e l S , D e a r i n gR , L e e D .Lung i n j u r yi n d u c e db y l e u c o y t ep r o t e a s e s .Am J P a t h o l1 9 7 9 ; 9 7 : l 111 - 2 9 .

1 5 A m i t a n iR , W i l s o nR , Rutman A , R e a dR , Ward C , B u r n e t tD , e t a l .E f f e c t so f human n e u t r o p h i le l a s t a s ea n d P s e u d o -m o n a sa e r u g i n o s ap r o t e i n a s e so n human r e s p i r a t o r ye p i -t h e l i u m .Am . 7R e s p i rC e l lMol B i o l1 9 91 ; 4 : 2 6 - 3 2 .

1 6 F i c k R B , N a e g e lG P , S q u i r e SU , Woo d R E , G e e B L ,R e y n o l d sHY P r o t e i n s o f t h ec y s t i cf i b r o s i sr e s p i r a t o r yt r a c t .F r a g m e n t e di m m u n o g l o b u l i nG o p s o n i ca n t i b o d yc a u s i n gd e f e c t i v eo p s o n o p h a g o c y t o s i s ._ 7C l i nI n v e s t1 9 8 4 ;7 4 : 2 3 6 - 4 8 .

1 7 B e r g e rM, S o e r e n s e nR J ,To s i MF, D e a r b o r nDG, D o r i n gG . C o m p l e m e n tr e c e p t o re x p r e s s i o non n e u t r o p h i l sa t a ni n f l a m m a t o r ys i t e ,t h eP s e u d o m o n a si n f e c t e dl u n gi nc y s t i cf i b r o s i s ._ 7C l i nI n v e s t1 9 8 9 ; 8 4 : 1 3 0 2 - 1 3 .

1 8 F i c k B B , R o b b i n sR A , S q u i e r S U , S c h o d e r b e kWE, R u s sWD . C o m p l e m e n ta c t i v a t i o ni n c y s t i cf i b r o s i sr e s p i r a t o r yf l u i d s :i n v i v o a n d i n v i t r o g e n e r a t i o no f C5 a a n dc h e m o t a c t i ca c t i v i t y.P e d i a t rR e s 1 9 8 6 ; 2 0 :1 2 5 8 - 6 8 .

1 9 Nakamura H , Yo s h i m u r aK , M c E l v a n e yNG, C r y s t a lRG.N e u t r o p h i le l a s t a s ei n r e s p i r a t o r ye p i t h e l i a ll i n i n gf l u i do fi n d i v i d u a l sw i t h c y s t i cf i b r o s i si n d u c e si n t e r l e u k i n - 8g e n ee x p r e s s i o ni n a human b r o n c h i a le p i t h e l i a lc e ll l i ne ._ 7C l i nI n v e s t1 9 9 2 ; 8 9 : 1 4 7 8 - 8 4 .

2 0 O'Connor CM , G a f f n e yK , K e a n eJ , S o u t h e yA , B y r n eN , O ' M a h o n e yS , e t a l . o , - p r o t e i n a s ei n h i b i t o r ,e l a s t a s ea c t i v i t y ,a n d l u n g d i s e a s e s e v e r i t yi n c y s t i cf i b r o s i s .AmR e vR e s p i rD i s 1 9 9 3 ; 1 4 8 : 1 6 6 5 - 7 0 .

2 1 S u t e r S , S c h a d d U B , T e g n e r K , O h l s s o n K , D e s -g r a nd c h am p s D ,Wa l d v o g e lF A .L e ve l s o ff r e eg r a n u l o c y t ee l a s t a s ei n b r o n c h i a ls e c r e t i o n sf r o mp a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s :e f f e c to f a n t im i cr o b i al t r e a t m e n ta g a i n s tP s e u d o -monas a e r u g i t n o s a .. 7I n f e c tD i s 1 9 8 6 ; 1 5 3 : 9 0 2 - 9 .2 2 L i e b e r m a nJ , Tr immer BM , K u r n i c kNB . S u b s t r a t es p e c i -f i c i t yo f p r o t e a s ea c t i v i t i e si n p u r u l e n ts p u t u m .L a bI n v e s t1 9 9 5 ; 1 4 : 2 4 9 - 5 7 .

2 3 Thomson AH . Huma n r e c o m b i n a n tDNase i n c y s t i cf i b -r o s i s .. 7R So cMed 1 9 9 5 ; 8 8 : 2 4 - 9 .

2 4 R o c h a tT , D a y e rF , S c h l e g e l S , B a r a z z o n eC , B e l l iD ,F i l t h u t h I , e t a l . E f f e c to f t r e a t m e n tw i t h rhDNase onl e u k o c y t i ce l a s t a s ea c t i v i t ya n d q u a n t i t a t i v es p u t u mb a c -t e r i o l o g y .P e d i a t rP u l m o n o l1 9 9 4 ;S u p p l1 0 : 2 3 7 .

2 5 P e l l e t i e rA , D i m i c o l iJ L , B o u d i e rC , B i e t h J G . Non-c h r o m o g e n i ch y d r o l y s i so f e l a s t a s ea n d c a t h e p s i nG p -n i t r o a n i l i d es u b s t r a t e sb y P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ae l a s t a s e .Am J R e s p i rC e l lMo l B i o l 1 9 8 9 ; 1 : 3 7 - 9 .

2 6 S h a hP L , S c o t t S ,K n i g h tR A ,Hod s on ME. A s s e s s m e n to fspu tum s o lp h a s ee l a s t a s ea n d i n t e r l e u k i n - 8i n c y s t i cf i b -r o s i sp a t i e n t st r e a t e dw i t h a e r o s o l i s e dr e c o m b i n a n thumanDNa s e 1 . Am R e vR e s p i rD i s 1 9 9 4 ; 1 4 9 : A 6 7 2 .

2 7 D o n n e l l yS C , S t r i e t e rRM , K u n k e lS L , Wa l zA , R o b e r t s o nCR, C a r t e rDC, e t a l . I n t e r l e u k i n8 a n d d e v e l o p m e n to fa d u l t r e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m ei n a t r i s kp a t i e n tg ro u p s . L a n ce t1 9 9 3 ; 3 4 1 : 6 4 3 - 7 .2 8 C a r r e P C , M o r t e n s o n R L ,K i n gT E J , N o b l ePW , S a b l e C ,R i c h e sDWH. I n c r e a s e de x p r e s s i o no f t h e i n t e r l e u k i n - 8g e n e b y a l v e o l a rm a c r o p h a g e si n i d i o p a t h i cp u l m o n a r yf i b r o s i s .A p o t e n t i a lm e c h a n i s mf o rt h e r e c r u i t m e n ta n da c t i v a t i o no f n e u t r o p h i l si n l u n g f i b r o s i s .. 7 C l i nI n v e s t1 9 91 ; 8 8 : 1 8 0 2 - 1 0 .

2 9 S h a hP L , Sc o t t SF , G e d d e sDM , Hodson M E. Two y e a r se x p e r i e n c ew i t h r e c o m b i n a n tDNa s e 1 i n t h e t r e a t m e n to f p u l m o n a r yd i s e a s ei n c y s t i cf i b r o s i s .R e s p i rMed 1 9 9 5 ;8 9 : 4 9 9 - 5 0 2 .

3 0 D a v i sP B . E v o l u t i o no f t h e r a p yf o rc y s t i cf i b r o s i s .N E n g l_ JM e d 1 9 9 4 ; 3 3 1 : 7 6 2 - 3 .

3 1 Wo j n a r o w s k iC , E i c h l e rI , F r i sc he r T ,S t o r mK , R e n n e rS ,K o l l e rDY , e t a l . I s i t p o s s i b l et o p r e d i c t l u n g f u n c t i o ni m p r o v e m e n td u e t o a e r s o l i z e d r e c o m b i n a n thumanDNa s e t h e r a p yi n p a t i e n t sw i t h c y s t i cf i b r o s i s .E u rR e s p i r. 7 1 9 9 5 ; 8 : 5 7 4 5 s .

6 2 3

6 effect of nebulised ant dnase on

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