acroleina estudios

8/3/2019 acroleina estudios

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S t u d i e s on t h e F o r m a t i o n o f A c r o l e i n i n D i s t i l l e r y M a s h e s 'D O R I S E . M I L L S , W. D . BAUGH AND H . A . CONNER

R e s e a r c h D i v i s i o n , N a t i o n a l D i s t i l l e r s P r o d u c t s C o r p o r a t i o n , C i n c i n n a t i , O h i oR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n J u l y 2 7 , 1 9 5 3

D u r i n g t h e d i s t i l l a t i o n o f a l c o h o l f r o m a g r a i nm a s h , i t may b e n o t e d o n r e l a t i v e l y r a r e o c c a s i o n st h a t t h e p r o d u c t h a s a p u n g e n t o d o r o r e v e n may b em i l d l y l a c h r y m a t o r y . T h e t e r m " p e p p e r y " h a s b e e na p p l i e d t o s u c h d i s t i l l a t e s . T h e w h i s k e y i s s o m e t i m e sk n o w n a s " r e d e y e " . I t h a s b e e n k n o w n f o r manyy e a r s t h a t t h i s " p e p p e r y " c h a r a c t e r i s d u e t o t h ep r e s e n c e o f a c r o l e i n . T h e s a m e o r a s i m i l a r p h e -n o m e n o n may o c c u r i n t h e m a n u f a c t u r e o f b r a n d y . I nt h e l a t t e r c a s e i t h a s b e e n s h o w n t h a t b a c t e r i a l a c t i o nd u r i n g t h e y e a s t f e r m e n t a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o r t h ep r o d u c t i o n o f t h e a l d e h y d e .V e r y l i t t l e h a s b e e n p u b l i s h e d c o n c e r n i n g t h i sp h e n o m e n o n a s i t o c c u r s i n g r a i n m a s h e s . T h i s p a p e rc o n t a i n s t h e r e s u l t s o f a s t u d y o n s o m e o f t h e f a c t o r si n f l u e n c i n g t h e m i c r o b i a l p r o d u c t i o n o f a c r o l e i n i nt h e s e m a s h e s .

V o i s e n e t ( 1 9 1 8 ) i s o l a t e d a n o r g a n i s m B a c i l l u sa m a r a c r y l u s ( B a c i l l u s p o l y m y x a ) w h i c h h e c o n s i d e r e dt o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r m a t i o n o f a c r o l e i n d u r i n gt h e f e r m e n t a t i o n o f w i n e s . He h a s r e p o r t e d t h e p r o -d u c t i o n o f a c r o l e i n b y t h i s o r g a n i s m o n a s u b s t r a t ec o n t a i n i n g g l y c e r o l , p e p t o n e a n d i n o r g a n i c s a l t s .H u m p h r e y s ( 1 9 2 4 ) f o u n d t h a t a l l o f h i s s t r a i n s o fC l o s t r i d i u m w e l c h i i ( C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s ) w e r ec a p a b l e o f p r o d u c i n g a c r o l e i n f r o m a s u b s t r a t e c o n -t a i n i n g g l y c e r o l .

O t h e r s t u d i e s o n t h e b a c t e r i a l f o r m a t i o n o f a c r o l e i ni n c l u d e t h o s e o f R e y n o l d s e t a l . ( 1 9 3 9 ) a n d M i c h e l s o na n d Werkman ( 1 9 4 0 ) . T h e s e w o r k e r s s h o w e d t h a ta c r o l e i n i s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e f e r m e n t a t i o n o fg l y c e r o l b y E s c h e r i c h i a ( C i t r o b a c t e r ) f r e u n d i i .Q u i t e e a r l y i n t h i s s t u d y i t w a s e v i d e n t t h a t t h eo r g a n i s m w h i c h i s t h e s u b j e c t o f t h i s r e p o r t w a sd i s t i n c t f r o m t h o s e s t u d i e d b y p r e v i o u s i n v e s t i g a t o r s .E X P E R I M E N T A L METHODS

I s o l a t i o n o f t h e o r g a n i s m . T h e b a c t e r i u m o n w h i c ht h e s e s t u d i e s ' w e r e m a d e w a s i s o l a t e d f r o m a s a m p l e o fr y e m a s h o r b e e r w h i c h h a d b e e n f e r m e n t e d f o r 7 2h o u r s a n d w h i c h h a d y i e l d e d a l a c h r y m a t o r y d i s t i l l a t e .S e v e r a l d i l u t i o n s o f t h e b e e r w e r e p l a t e d o n t o m a t oj u i c e a g a r , a n d t h e p l a t e s i n c u b a t e d a n a e r o b i c a l l y a t

1 The s u b s t a n c e o f t h i s p a p e r was p r e s e n t e d a t t h e M e e t i n go f t h e D i v i s i o n o f A g r i c u l t u r a l a n d Food C h e m i s t r y o f t h eA m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y , A t l a n t i c C i t y , N e w J e r s e y ,S e p t e m b e r 1 9 5 2 .

3 0 C f o r 5 d a y s . O n e o f t h e o r g a n i s m s w h i c h a p p e a r e df o r m e d l o n g c h a i n s i n t o m a t o j u i c e b r o t h . E v e n t u a l l yt h i s b a c t e r i u m p r o v e d t o b e t h e o n e w h i c h p r o d u c e da c r o l e i n .F e r m e n t a t i o n s . T h e s u b s t r a t e s u s e d i n t h i s s t u d yi n c l u d e d g r a i n m a s h e s o f e i t h e r d i s t i l l e r y o r l a b o r a t o r yo r i g i n , s y n t h e t i c m e d i a , t o m a t o j u i c e b r o t h ( e s s e n t i a l l yt h e s u b s t r a t e u s e d b y G a r e y e t a l . ( 1 9 4 5 ) b u t w i t h o u tt h e a g a r ) a n d a t o m a t o j u i c e b r o t h c o n t a i n i n g w a s h e dg r a i n r e s i d u e a n d g l y c e r o l . D e t a i l s a r e g i v e n l a t e r .

C u l t u r e s o f b a c t e r i a w e r e c a r r i e d i n s t a b s o f ac o m m e r c i a l s u b s t r a t e k n o w n a s " L " a g a r ( B - B - L ) .T r a n s f e r s f r o m t h e s e s l a n t s o r s t a b s w e r e m a d e t o t h et o m a t o j u i c e b r o t h , u s u a l l y 2 4 h o u r s b e f o r e t h ei n o c u l u m w a s t o b e u s e d . T h e r e s u l t i n g t o m a t o j u i c eb r o t h c u l t u r e w a s u s e d t o i n o c u l a t e t h e e x p e r i m e n t a lm a s h e s .

U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , t h e a c r o l e i n f e r m e n t a t i o n sw e r e c o n d u c t e d b y i n o c u l a t i n g 1 0 0 - m l p o r t i o n s o fs t e r i l i z e d m a s h e s w i t h t h e a c r o l e i n - p r o d u c i n g b a c t e r i u ma n d i n c u b a t i n g t h e c u l t u r e s a t 3 0 C .

A c r o l e i n w a s r e m o v e d f r o m t h e c u l t u r e s b y d i l u t i n gt h e l a t t e r w i t h 1 0 0 m l o f w a t e r a n d d i s t i l l i n g u n t i l 1 0 0m l o f d i s t i l l a t e h a d b e e n c o l l e c t e d . T h e m e t h o d o fC i r c l e , S t o n e , a n d B o r u f f ( 1 9 4 5 ) w a s u s e d t o d e t e r m i n et h e a c r o l e i n i n t h e d i s t i l l a t e .

R E S U L T SA t t e m p t s t o t r a n s m i t t h e p h e n o m e n o n o f " p e p p e r " i ns e r i e s , b y i n o c u l a t i n g a f r e s h g r a i n m a s h w i t h t h e m a s h

f r o m w h i c h t h e a c r o l e i n p r o d u c e r h a d b e e n i s o l a t e d ,g a v e c o m p l e t e l y n e g a t i v e r e s u l t s . S i m i l a r l y , w h e n p u r ec u l t u r e s o f i s o l a t e s f r o m " p e p p e r y " m a s h e s w e r e u s e d t oi n o c u l a t e f r e s h m a s h e s , n o a c r o l e i n w a s p r o d u c e d .I t h a d b e e n o b s e r v e d a s a r e s u l t o f s u c c e s s i v es a m p l i n g s o f p l a n t m a s h e s t h a t i n many c a s e s t h o s ew h i c h g a v e a " p e p p e r y " d i s t i l l a t e a t t h e e n d o f 8 0 h o u r sh a d b e e n q u i t e n o r m a l a t t h e e n d o f 4 8 h o u r s . T h i so b s e r v a t i o n l e d t o t h e i n o c u l a t i o n o f a 4 8 - h o u r m a s hw i t h t h e c h a i n - f o r m i n g i s o l a t e . A s t r o n g q u a l i t a t i v et e s t f o r a c r o l e i n w a s o b t a i n e d i n t h e d i s t i l l a t e a f t e r t h em a s h h a d i n c u b a t e d a n a d d i t i o n a l 2 4 h o u r s a t 3 0 C .T h e i n o c u l a t i o n o f p a r t i a l l y f e r m e n t e d m a s h e s w i t h t h ec h a i n - f o r m i n g i s o l a t e m a d e i t p o s s i b l e t o p r o d u c ea c r o l e i n i n c o n t r o l l e d l a b o r a t o r y f e r m e n t a t i o n s .A t t e m p t s t o i d e n t i f y t h e o r g a n i s m h a v e l e d t o t h ec o n c e p t t h a t i t i s a n u n i d e n t i f i e d s p e c i e s . A c o m p l e t e

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DORIS E . MILLS, W. D . BAUGH AND H . A . CONNER

F I G . 1 . Growth o f a c r o l e i n b a c t e r i u m a s p r o d u c e d on t o m a t oj u i c e b r o t h .d e s c r i p t i o n i s n o t w i t h i n t h e sco pe o f t h i s paper. I t st y p i c a l g r o w t h h a b i t i s t h a t o f l o n g , i n t e r l a c e d c h a i n s ,as s h o w n i n f i g u r e 1 .

T a b l e 1 s u m m a r i z e s some o f t h e common p h y s i o -l o g i c a l a n d m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h ea c r o l e i n - p r o d u c i n g o r g a n i s m . S i m i l a r d a t a f r o m t h el i t e r a t u r e on o t h e r o r g a n i s m s w h i c h h a v e b e e n r e p o r t e dt o p r o d u c e a c r o l e i n ar e i n c l u d e d f o r c o m p a r i s o n .

A p p r o p r i a t e e x p e r i m e n t s s e r v e d t o d e m o n s t r a t e t h a tt h e b a c t e r i u m i s c a p a b l e o f e n d u r i n g t h e t e m p e r a t u r ea n d t i m e o f c o n v e r s i o n o f g r a i n m a s h e s , n a m e l y , 6 2 Cf o r 2 0 m i n u t e s .I t was e s t a b l i s h e d t h a t a c r o l e i n c o u l d b e p r o d u c e di n t h e l a b o r a t o r y on e i t h e r rye, b o u r b o n , o r s p i r i t sm a s h e s . The p l a n t m a s h e s w h i c h were u s e d i n t h i sw o r k were o f t h e l a t t e r t y p e a n d c o n t a i n e d a p p r o x i -m a t e l y 5 3 pe r c e n t c o r n m e a l , 3 9 per c e n t m i l o m e a la n d 8 per c e n t g r o u n d m a l t .

The e x p e r i m e n t i n w h i c h a c r o l e i n was p r o d u c e d b yi n o c u l a t i n g a 4 8 - h o u r mash w i t h t h e i s o l a t e s u g g e s t e dt h a t t h e presence o f sugars i n t h e f r e s h m a s h e s m i g h ti n some way i n h i b i t t h e p r o d u c t i o n o f t h e a l d e h y d e .T h i s p r e m i s e was c o n f i r m e d b y a d d i n g v a r y i n g amountso f g l u c o s e t o 1 0 0 - m l p o r t i o n s o f a 4 8 - h o u r p l a n t m a s h ,s t e r i l i z i n g t h e m i x t u r e a n d i n o c u l a t i n g w i t h 1 ml o f a2 4 - h o u r t o m a t o - j u i c e - b r o t h c u l t u r e o f t h e i s o l a t e . T h er e s u l t s as s h o w n i n t a b l e 2 i n d i c a t e t h a t a c o n c e n t r a t i o no f sugar h i g h e r t h a n a p p r o x i m a t e l y 0 . 6 pe r c e n t ,e x p r e s s e d as g l u c o s e , c o m p l e t e l y i n h i b i t s a c r o l e i n

p r o d u c t i o n o n t h i s s u b s t r a t e . T h e e f f e c t s o f g l u c o s e w i l lb e c o n s i d e r e d l a t e r i n m o r e d e t a i l .T h e e f f e c t o f pH o n t h e f o r m a t i o n o f t h e a l d e h y d ew a s s h o w n b y a d j u s t i n g p o r t i o n s o f a 4 8 - h o u r p l a n tb e e r t o v a r y i n g pH v a l u e s , s t e r i l i z i n i g , a n d i n o c u l a t i n gw i t h t h e a c r o l e i n p r o d u c e r . T h e r e s u l t s g i v e n i n t a b l e 3s h o w t h a t a c r o l e i n w a s n o t p r o d u c e d b e l o w a pH o fa b o u t 4 . 0 . G o o d g r o w t h o f t h e o r g a n i s m o c c u r r e d a sl o w a s pH 3 . 5 i n a t o m a t o j u i c e b r o t h .I t w a s p o s t u l a t e d f r o m t h e r e s u l t s w h i c h w e r e o b -t a i n e d u p t o t h i s t i m e t h a t , i n o r d e r f o r t h e b a c t e r i u mt o p r o d u c e a c r o l e i n , i t w a s n e c e s s a r y f o r i t t o a t t a i ni t s maximum d e v e l o p m e n t a t a r e l a t i v e l y l a t e s t a g eo f t h e y e a s t f e r m e n t a t i o n . T w o p o s s i b l e m e c h a n i s m sb y w h i c h t h i s c o u l d o c c u r w e r e i n v e s t i g a t e d : 1 ) c o n -t a m i n a t i o n f r o m w o o d e n f e r m e n t o r s , a n d 2 ) t h e i n -t r o d u c t i o n o f v e r y s m a l l n u m b e r o f b a c t e r i a i n t o t h em a s h n e a r t h e b e g i n n i n g o f t h e y e a s t f e r me n t a t i o n .

C y p r e s s b l o c k s m e a s u r i n g 1 x 1 x 4 i n c h e s w e r ep l a c e d i n f l a s k s c o n t a i n i n g t o m a t o j u i c e b r o t h . A f t e rs t e r i l i z a t i o n , t h e b r o t h w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e a c r o -l e i n - p r o d u c i n g b a c t e r i u m a n d i n c u b a t e d . A f t e r 2 4h o u r s t h e b l o c k s w e r e r e m o v e d , w a s h e d w i t h w a t e r ,s t e a m e d g e n t l y a n d t r a n s f e r r e d t o f l a s k s o f f r e s h l y c o n -v e r t e d a n d y e a s t e d m a s h . A f t e r 7 2 h o u r s t h e m a s h e sc o n t a i n i n g t h e b l o c ks c o n t a i n e d 8 ppm o f a c r o l e i n .C o n t r o l f l a s k s c o n t a i n e d n o n e . I t w a s c o n c l u d e d f r o mt h e s e d a t a t h a t w o o d e n f e r m e n t o r s a r e a p o t e n t i a ls o u r c e o f i n o c u l u m o f t h e a c r o l e i n - p r o d u c i n g o r g a n i s m .I t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e i n t r o d u c t i o n o f a v e r ys m a l l i n o c u l u m i n t o a m a s h w o u l d r e s u l t i n t h e s l o wd e v e l o p m e n t o f t h e a c r o l e i n p r o d u c e r a n d t h u s , i ne f f e c t , p r o d u c e r e l a t i v e l y l a r g e n u m b e r s o f t h e o r g a n -i s m a t a b o u t 2 4 - 4 8 h o u r s a f t e r y e a s t i n g . O n e l i t e r o f af r e s h l y - y e a s t e d m a s h w a s i n o c u l a t e d w i t h 5 m l o f a2 4 - h o u r t o m a t o - j u i c e - b r o t h c u l t u r e o f t h e a c r o l e i np r o d u c e r . S i m i l a r l y , o t h e r m a s h e s w e r e i n o c u l a t e dw i t h 1 0 - m l p o r t i o n s o f 1 0 - 5 t o 1 0 - 7 d i l u t i o n s o f t h es a m e c u l t u r e o f t h e o r g a n i s m . B a c t e r i a l c o u n t s a n da c r o l e i n d e t e r m i n a t i o n s w e r e m a d e d a i l y . T h e d a t aa r e p r e s e n t e d i n t a b l e 4 .I t may b e s e e n f r o m t h e s e d a t a t h a t t h e m a s h e sg i v e n v e r y s m a l l i n o c u l a p r o d u c e d a c r o l e i n , w h i l e t h em a s h g i v e n a h e a v y i n o c u l u m p r o d u c e d n o n e . M a x i -m u m b a c t e r i a l c o u n t s w e r e r e a c h e d i n t h e h e a v i l yi n o c u l a t e d m a s h i n 2 4 h o u r s , b u t 7 2 h o u r s w e r e r e -q u i r e d f o r maximum c o u n t s w i t h t h e s m a l l i n o c u l a .O n l y t h e l a t t e r m a s h e s c o n t a i n e d a c r o l e i n . T h e s e d a t amake i t q u i t e c l e a r why o r d i n a r y s a n i t a t i o n m e t h o d si n a d i s t i l l e r y o f t e n f a i l t o e l i m i n a t e " p e p p e r " . I no r d e r t o d o t h i s , i t w o u l d b e n e c e s s a r y t o r e d u c e t h eb a c t e r i a i n t h e m a s h t o l e s s t h a n 1 2 c e l l p e r m l . S u c ha d e g r e e o f s a n i t a t i o n c a n s e l d o m , i f e v e r , b e r e a l i z e di n a d i s t i l l e r y .A n u m b e r o f a n t i s e p t i c s w e r e a d d e d t o i n o c u l a t e d

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FORMATION O F A C R O L E I N IN D I S T I L L E R Y MASHEST A B L E 1 . C o m p a r i s o n o f t h e m o r p h o l o g y a n d p h y s i o l o g y o f t h e a c r o l e i n b a c t e r i u m w i t h o t h e r a c r o l e i n - p r o d u c i n g o r g a n i s m s

C H A R A C T E R I S T I C A C R O L E I N B A C T E R I U M C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s E s c h e r i c h s a f r e u n d i i B a c i l l u s p o l y m y x a( w e l c / , i i ) * ( C i t r o b a c t e r f r e u n d i i ) * ( B a c i l l u s a m a r a c r y l u s ) *M o t i l i t y N o n m o t i l e N o n m o t i l e M o t i l e o r N o n m o t i l e M o t i l eGram s t a i n P o s i t i v e P o s i t i v e N e g a t i v e P o s i t i v eM o r p h o l o g y R o d s o c c u r r i n g s i n g l y , R o d s o c c u r r i n g s i n g l y , R o d s o c c u r r i n g s i n g l y , R o d s o c c u r r i n g s i n g l y a n dp a i r s , c h a i n s p a i r s , c h a i n s p a i r s , c h a i n s c h a i n sN i t r a t e r e d u c t i o n P o s i t i v e P o s i t i v e P o s i t i v e N e g a t i v eS u r f a c e g r o w t h C o l o n i e s s m a l l , c i r c u l a r , C o l o n i e s c i r c u l a r , r a i s e d , C o l o n i e s s m o o t h , g r a y , C o l o n i e s - l o b a t e d , c i r c u -r a i s e d m o i s t s h i n i n g l a r g r a y - w h i t eS p o r e f o r m a t i o n N o n e S p o r e s o v a l c e n t r a l t o None S p o r e s - o v o i d c e n t r a le x c e n t r i cC a t a l a s e p r o du c t i o n N e g a t i v e P o s i t i v eG r o w t h o n l i t m u s N o a c t i o n A c i d c o a g u l a t e d A c i d may c o a g u l a t e G a s c o a g u l a t e dm i l kG r o w t h o n b r o t h T u r b i d T u r b i d T u r b i d , g r a y i s h p e l l i c l eG e l a t i n l i q u e f a c t i o n None L i q u e f i e d None NoneH 2 S p r o d u c t i o n None P o s i t i v e N o n eF e r m e n t a t i o n o f :

d e x t r o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sm a n n o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sa r a b i n o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sx y l o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sr a f f i n o s e N o n e A c i d a n d g a s A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sl a c t o s e None A c i d a n d g a s A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sg a l a c t o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sm a l t o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sl e v u l o s e A c i d A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sd e x t r i n None A c i d a n d g a sr h a m n o s e None A c i d a n d g a s N o n ei n o s i t o l None A c i d a n d g a s V a r i a b l em a n n i t o l None A c i d a n d g a s A c i d a n d g a sT e m p e r a t u r e O p t i m u m , 3 5 C ; v i a b l e O p t i m u m , 3 5 C O p t i m u m , 3 0 - 3 7 C O p t i m u m , 3 0 Cc h a r a c t e r i s t i c s a f t e r 2 0 m i n a t 7 5 CO x y g e n r e q u i r e - M i c r o a e r o p h i l i c A n a e r o b i c A e r o b i c , f a c u l t a t i v e A e r o b i c , f a c u l t a t i v em e n t s* D a t a a s g i v e n i n B e r g e y ' s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y , 6 t h E d . , 1 9 4 8 , Th e W i l l i a m s & W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e , Md.TABLE 2 . I n h i b i t i o n o f a c r o l e i n p r o d u c t i o n b y sugarsNO . ADDED GLUCOSE TOTAL SUGAR AS A C R O LE lNG LU COSEC

gm/100 ml gm/100 ml ppm1 0 . 0 0 . 2 2 3 4 2 02 0 . 0 5 0 . 2 7 3 4 3 63 0 . 1 0 . 3 2 3 3 9 44 0 . 2 0 . 4 2 3 2 8 05 0.3 0 . 5 2 3 1 2 86 0 . 4 0 . 6 2 3 0

m a s h e s f o r t h e purpo se o f i n h i b i t i n g t h e a c r o l e i n -p r o d u c i n g o r g a n i s m s . O f t h e s e , o n l y t h e q u a t e r n a r yammonium c o m p o u n d s p r o v e d t o b e o f a n y v a l u e . To1 0 0 - m l p o r t i o n s o f a f r e s h l y - s e t p l a n t mash w e r e a d d e dt h e i n d i c a t e d amounts o f t h e q u a t e r n a r y ammoniumc o m p o u n d a n d o f t h e o r g a n i s m . A c o n c e n t r a t i o n o f1 - 1 0 , 0 0 0 . o f t h i s p a r t i c u l a r c o m p o u n d was q u i t e e f f e c -t i v e i n i n h i b i t i n g t h e a c r o l e i n p r o d u c t i o n . A l c o h o ly i e l d s w e r e n o t a f f e c t e d t o a n y a p p r e c i a b l e d e g r e e .The d a t a ar e g i v e n i n t a b l e 5 .

A g i t a t i o n u n d e r a e r o b i c o r a n a e r o b i c c o n d i t i o n s com-

T A B L E 3 . E f f e c t o f m a s h pH o n a c r o l e i n p r o d u c t i o nNO . I N I T A L MASH ACROLEIN

pH p p m1 3 . 5 02 4 . 0 4 73 4 . 6 * 2 1 24 5 . 0 1 6 25 5 . 5 1 0 86 6 . 0 1 0 07 6 . 5 1 0 08 7 . 0 1 1 09 7 . 5 0

* U n a d j u s t e d c o n t r o l .p l e t e l y i n h i b i t e d t h e p r o d u c t i o n o f t h e a l d e h y d e .A e r o b i o s i s , a s o b t a i n e d i n a q u i e s c e n t i n c u b a t i o n i n as h a l l o w l a y e r , r e d u c e d t h e y i e l d o f a c r o l e i n . T h e d a t aa r e p r e s e n t e d i n t a b l e 6 . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n so f t h e m a s h e s i n d i c a t e d t h a t g o o d g r o w t h o c c u r r e du n d e r a l l t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e r e a s o n s f o rt h i s p h e n o m e n o n h a v e n o t b e e n c l a r i f i e d .S o m e p r e l i m i n a r y s t u d i e s h a v e b e e n m a d e o n s u b -

1 1


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DORIS E . MILLS, W. D . BAUGH AND H . A . CONNERTABLE 4 . E f f e c t o f a m o u n t o f i n i t i a l c o n t a m i n a t i o n o na c r o l e i n p r o d u c t i o n

T IM E O F A N A LY SI SA D D E D 2 4 Hr 4 8 Hr 7 2 HrBACTERIA

A c r o - B a c t e r i a A c r o - B a c t e r i a A c r o - B a c t e r i al e i n l e i n l e i nn o . / m l m a s h pp m n o . / m l m a s h p p m n o . / n l m a s h pp m n o . / m l m a s h2 4 5 X 1 0 4 0 1 7 X 1 0 7 0 1 4 X 1 0 7 0 2 2 X 1 0 7

4 9 0 2 3 X 1 0 3 9 2 3 X 1 0 5 2 5 1 3 X 1 0 74 . 9 0 7 9 0 0 0 7 9 X 1 0 4 3 3 7 0 X 1 0 60 . 4 9 0 0 4 9 X 1 0 4 8 9 7 0 X 1 0 6

TABLE 5 . I n h i b i t i o n o f a c r o l e i n p r o d u c t i o n b y a q u a t e r n a r yammonium c o m p o u n dC O N T R O L M A S H * I N O C U L A T E D M A S H tC O N C E N TR A TIO N _

OFQUATERNARYFiaFnlA l c o h o l F p n H l A c r o l e i n A l c o h o l Final A c r o l e i np e r c e n t pp m p e r c e n t pp m

None 7 . 5 1 4 . 1 0 7 . 4 4 3 . 9 5 61 - 5 , 0 0 0 7 . 4 2 4 . 4 0 7 . 4 7 4 . 4 01 - 1 0 , 0 0 0 7 . 4 7 4 . 3 0 7 . 2 9 4 . 2 0

* A n a l y z e d a f t e r 7 2 h o u r s ' f e r m e n t a t i o n .t I n o c u l a t e d w i t h 1 m l 1 0 - 6 d i l u t i o n o f a 2 4 - h o u r b r o t hc u l t u r e o f a c r o l e i n p r o d u c e r .

TABLE 6 . I n f l u i e n c e o f o x y g e n t e n s i o n a n d a g i t a t i o n ona c r o l e i n p r o d u c t i o n

NO . TREATMENT* A C R O L EI Np p m

1 I n c u b a t e d a n a e r o b i c a l l y u n d e r m i n e r a l 2 3 2o i l . 2 5 0 - m l f l a s k s e a l e d w i t h p a r a f i l m .Not a g i t a t e d

2 I n c u b a t e d a e r o b i c a l l y i n 1 - L f l a s k 2 23 I n c u b a t e d a e r o b i c a l l y . A g i t a t e d i n 1 - L 0f l a s k4 I n c u b a t e d a n a e r o b i c a l l y u n d e r N 2 . 0

A g i t a t e d i n 1 - L f l a s k5 I n c u b a t e d a n a e r o b i c a l l y u n d e r C O 2 . 0

A g i t a t e d i n 1 - L f l a s k* P o r t i o n s , 1 0 0 ml o f s t e r i l e 4 8 - h o u r p l a n t m a s h .

s t r a t e s o t h e r t h a n g r a i n mash f o r t h e f o r m a t i o n o fa c r o l e i n . A t t e m p t s t o p r o d u c e t h e a l d e h y d e on V o i s e -n e t ' s s u b s t r a t e o r on t o m a t o j u i c e b r o t h c o n t a i n i n ga d d e d g l y c e r o l w e r e c o m p l e t e l y n e g a t i v e . Th e work o fR e y n o l d s e t a l . on E s c h e r i c h i a ( C i t r o b a c t e r ) f r e u n d i ic o u l d b e d u p l i c a t e d r e a d i l y w i t h h i s o r g a n i s m , b u t n o tw i t h ours. S i n c e i t was kno w n t h a t a c r o l e i n c o u l d b ep r o d u c e d on a 4 8 - h o u r p l a n t b e e r , a s a m p l e o f t h el a t t e r was f i l t e r e d , a n d t h e f i l t r a t e i n o c u l a t e d w i t ht h e a c r o l e i n p r o d u c e r . N o a c r o l e i n was p r o d u c e d ont h i s c l e a r f i l t r a t e , a l t h o u g h t h e a l d e h y d e was p r o d u c e don t h e u n f i l t e r e d m a s h . Th e presence o f t h e g r a i n r e s i -d u e , t h e r e f o r e , i s n e ce ssary f o r t h e p r o d u c t i o n o f t h ec o m p o u n d . T h a t t h e g r a i n r e s i d u e was n o t f u n c t i o n i n gi n a p u r e l y m e c h a n i c a l manner was shown b y s u b -

TABLE 7 . E f f e c t o f g l u c o s e o n a c r o l e i n p r o d u c t i o n i n a" s y n t h e t i c " s u b s t r a t e *N O . GLUCOSE A C R O L E I N

p e r c e n t p p m1 0 3 62 0 . 1 2 93 0.5 3764 1 . 0 5 0 05 2 . 0 1 0

* S u b s t r a t e c o n t a i n e d : w a s h e d g r a i n r e s i d u e f r o m 1 0 0 m l4 8 - h o u r m a s h ; 4 0 p e r c e n t t o m a t o j u i c e ( s u g a r f r e e ) ; 1 p e r c e n ty e a s t e x t r a c t ; 3 p e r c e n t g l y c e r o l ; 0 . 5 p e r c e n t s a l t s ; H20 t o1 0 0 m l .s t i t u t i n g w a s h e d s a w d u s t , H y f l o o r V e r m i c u l i t e f o rt h e r e s i d u e . No a c r o l e i n w a s p r o d u c e d o n s u b s t r a t e sc o n t a i n i n g t h e s e m a t e r i a l s . Mash r e s i d u e w a s u s e d a sa c o n s t i t u e n t o f t h e s u b s t r a t e i n many s u b s e q u e n te x p e r i m e n t s .

I t w a s s h o w n b y m e a n s o f a p p r o p r i a t e e x p e r i m e n t st h a t t o m a t o j u i c e b r o t h c o r n t a i n i n g g l y c e r o l a n d g l u -c o s e c o u l d b e s u b s t i t u t e d f o r t h e m a s h f i l t r a t e . I nt a b l e 7 a r e s h o w n t h e e f f e c t s o f v a r y i n g a m o u n t s o fg l u c o s e i n a s u b s t r a t e c o n t a i n i n g w a s h e d g r a i n r e s i d u e ,t o m a t o j u i c e , y e a s t e x t r a c t a n d 3 p e r c e n t g l y c e r o l .T h e a c r o l e i n p r o d u c t i o n p a s s e s t h r o u g h a maximuma t a g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t 1 p e r c e n t . H i g h e ro r l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f s u g a r r e s u l t e d i n l o w e ry i e l d s o f t h e a l d e h y d e . T h e g r o w t h o f t h e o r g a n i s mw a s c o n s i d e r a b l y r e d u c e d i n t h o s e s u b s t r a t e s c o n t a i n -i n g l i t t l e o r n o g l u c o s e , a n d t h i s may a c c o u n t f o r t h er e d u c e d a m o u n t s o f a c r o l e i n . P o s s i b l y t h e o r g a n i s mc a n u t i l i z e g l y c e r o l much m o r e e f f i c i e n t l y i n t h e p r e s -e n c e o f s o m e g l u c o s e ; b u t i f s u f f i c i e n t g l u c o s e i s p r e s e n tt o s u p p l y t h e n e e d s o f t h e o r g a n i s m , t h e n n o g l y c e r o li s m e t a b o l i z e d . T a b l e 8 s h o w s t h e e f f e c t s o f v a r y i n ga m o u n t s o f g l y c e r o l i n t h e s a m e g r a i n r e s i d u e - t o m a t oj u i c e s u b s t r a t e c o n t a i n i n g 1 p e r c e n t g l u c o s e . I n c r e a s -i n g a m o u n t s o f g l y c e r o l r e s u l t e d i n h i g h e r y i e l d s o fa c r o l e i n .S i n c e t h e g r a i n r e s i d u e c o n t a i n s y e a s t c e l l s a n d i n -s o l u b l e p a r t i c l e s d e r i v e d f r o m t h e g r a i n s , i t s e e m e df e a s i b l e t o u s e y e a s t c e l l s i n p l a c e o f t h e g r a i n r e s i d u e .

TABLE 8 . E f f e c t o f g l y c e r o l o n a c r o l e i n p r o d u c t i o n i n a" s y n t h e t i c " s u b s t r a t e *N O . GLYCEROL ACROLEIN

p e r c e n t pp m1 0 02 0 . 1 03 0 . 5 74 1 . 0 3 8 85 2 . 0 4 0 26 3 . 0 4 8 0

* S u b s t r a t e s c o n t a i n e d : w a s h e d r e s i d u e f r o m 1 0 0 m l 4 8 - h o u rm a s h ; 4 0 p e r c e n t t o m a t o j u i c e ( s u g a r f r e e ) ; 1 p e r c e n t y e a s te x t r a c t ; 1 p e r c e n t g l u c o s e ; i n o r g a n i c s a l t s ; H20 t o 1 0 0 m l .

1 2


5/5

F O R M A T I O N OF ACROLEIN IN DISTILLERY M A S H E SA s u b s t r a t e h a v i n g t h e c o m p o s i t i o n : 2 0 p e r c e n t m o i s ty e a s t c e l l s , 4 0 p e r c e n t f i l t e r e d t o m a t o j u i c e , 3 p e rc e n t g l y c e r o l , 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t a n d 1 p e r c e n tg l u c o s e w a s p r e p a r e d a n d i n o c u l a t e d w i t h t h e a c r o l e i np r o d u c e r . A y i e l d o f 5 0 ppm o f a c r o l e i n w a s p r o d u c e d .A c r o l e i n w a s p r o d u c e d o n a s u b s t r a t e c o n t a i n i n g t h ei n s o l u b l e f r a c t i o n o f a n u n f e r m e n t e d g r a i n m a s h . Ab o u r b o n g r a i n m a s h w a s c o o k e d a n d c o n v e r t e d i n am a n n e r s i m i l a r t o t h a t u s e d i n f e r m e n t a t i o n s t u d i e s .A f t e r f i l t r a t i o n a n d w a s h i n g w i t h h o t w a t e r , t h e i n -s o l u b l e f r a c t i o n w a s a d d e d t o a s u b s t r a t e c o n t a i n i n gt o m a t o j u i c e , y e a s t e x t r a c t , g l u c o s e , a n d g l y c e r o l .T w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r i n o c u l a t i o n w i t h t h e a c r o l e i np r o d u c e r , t h e s u b s t r a t e c o n t a i n e d 5 5 ppm o f a c r o l e i n .

C o n f i r m a t o r y e v i d e n c e t h a t t h e a b o v e e f f e c t wasn o t m e c h a n i c a l w a s f o u n d b y a u t o c l a v i n g t h e g r a i nr e s i d u e t w i c e . A r e s i d u e w h i c h w a s a ut o c l a v e d o n l yo n c e , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e l i q u i d p h a s e o f t h es u b s t r a t e , g a v e a y i e l d o f 1 5 0 ppm o f a c r o l e i n . A r e s i -d u e w h i c h w a s a u t o c l a v e d t w i c e , o n c e a l o n e a n d o n c ea f t e r b e i n g a d d e d t o t h e l i q u i d p h a s e , g a v e n o a c r o l e i n .N o e x p l a n a t i o n h a s b e e n f o u n d f o r t h e r o l e o f t h e s o l i d si n t h e f o r m a t i o n o f a c r o l e i n .

D I S C U S S I O NT h e o r g a n i s m w h i c h h a s b e e n i s o l a t e d a n d s t u d i e di n t h i s i n v e s t i g a t i o n i s d i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r o m t h o s ep r e v i o u s l y r e p o r t e d t o p r o d u c e a c r o l e i n . I t a l s o i sd i s t i n c t m o r p h o l o g i c a l l y f r o m t h o s e o r g a n i s m s s t u d i e db y S e r j a k , D a y , Van L a n e n , a n d B o r u f f ( 1 9 5 3 ) .F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n w i l l b e r e q u i r e d t o d e t e r m i n e

w h e t h e r t h e b a c t e r i u m r e p o r t e d h e r e a n d t h o s e r e -p o r t e d b y t h e a b o v e i n v e s t i g a t o r s a r e r e l a t e d o rw h e t h e r t h e y b e l o n g t o d i f f e r e n t g e n e r a .T h e f a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e f o r m a t i o n o f " p e p p e r y "w h i s k e y , w h i l e n o t u n i q u e , a r e s u c h a s n o t t o b e r e a d i l ya p p a r e n t . T h i s may a c c o u n t f o r t h e l a c k o f i n f o r m a -t i o n c o n c e r n i n g t h e p h e n o m e n o n a n d f o r t h e manyf a n c i f u l e x p l a n a t i o n s w h i c h h a v e e x i s t e d i n t h e i n -d u s t r y . I t a l s o i s q u i t e e v i d e n t t h a t t h e f a c t o r s i n -f l u e n c i n g t h e f o r m a t i o n o f a c r o l e i n b y t h i s b a c t e r i u ma r e d i f f e r e n t f r o m t h o s e w h i c h i n f l u e n c e t h e f o r m a t i o no f t h e c o m p o u n d b y o t h e r o r g a n i s m s . T h e n u t r i t i o n a lr e q u i r e m e n t s o f t h e b a c t e r i u m r e p o r t e d h e r e a r e m u c hm o r e c r i t i c a l t h a n t h o s e o f o t h e r a c r o l e i n p r o d u c e r s .L i t t l e o r n o g r o w t h o f t h e o r g a n i s m o c c u r r e d w h e n i tw a s i n o c u l a t e d i n t o V o i s e n e t ' s , H u m p h r e y s ' , o r R e y -

n o l d s ' s u b s t r a t e s . A l l o f t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d a c r o -l e i n p r o d u c e r s a p p a r e n t l y a r e c a p a b l e o f u t i l i z i n gg l y c e r o l a s t h e s o l e s o u r c e o f c a r b o h y d r a t e s . T h e o r -g a n i s m u s e d i n t h e s e s t u d i e s r e q u i r e s f e r m e n t a b l es u g a r s i n a d d i t i o n t o t h e g l y c e r o l . I t i s i n t e r e s t i n g t on o t e t h a t W a r c o l l i e r a n d L e M o a l ( 1 9 3 2 ) w e r e u n a b l et o e f f e c t t h e c o n v e r s i o n o f g l y c e r o l t o a c r o l e i n u s i n gt h e c u l t u r e s w h i c h t h e y i s o l a t e d f r o m c i d e r s c o n t a i n i n gt h e a l d e h y d e .An i n s p e c t i o n o f t a b l e 8 w i l l r e v e a l t h a t a n o n l i n e a rr e l a t i o n s h i p e x i s t s b e t w e e n t h e a v a i l a b l e g l y c e r o l a n dt h e a c r o l e i n w h i c h i s p r o d u c e d . I n c r e a s e d a m o u n t so f g l y c e r o l o p e r a t e i n a m a n n e r o t h e r t h a n s i m p l yf u r n i s h i n g a d d i t i o n a l r a w m a t e r i a l f o r a c r o l e i n p r o d u c -t i o n .

SUMMARY" P e p p e r y " w h i s k e y i s c a u s e d b y t h e p r e s e n c e o fa c r o l e i n , w h i c h i n t u r n may b e p r o d u c e d a s t h e r e s u l t

o f t h e m e t a b o l i s m o f a n u n c l a s s i f i e d b a c t e r i u m . Someo f t h e f a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e t h e p r o d u c t i o n o f t h ea l d e h y d e a r e t h e pH o f t h e s u b s t r a t e , o x y g e n t e n s i o n ,a g i t a t i o n , p r e s e n c e o f y e a s t c e l l s a n d / o r m a s h r e s i d u e ,f e r m e n t a b l e s u g a r s , a n d g l y c e r o l .

R E F E R E N C E SC I R C L E , S . J . , S T O N E , L . , AND B O R U F F , C . S . 1 9 4 5 A c r o l e i nd e t e r m i n a t i o n b y m e a n s o f t r y p t o p h a n e . I n d . E n g .C h e m . A n a l . E d . , 1 7 , 2 5 9 - 2 6 2 .G A R E Y , J . C . , R I T T S C H O F F , L . A . , S T O N E , L . , A N D BORUFF, C . S .

1 9 4 5 C u l t u r a l m e t h o d s f o r t h e q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a -t i o n o f b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s o f d i s t i l l e r y m a s h e s . J .B a c t e r i o l . , 4 9 , 3 0 7 - 3 1 0 .H U M P H R E Y S , F . B . 1 9 2 4 F o r m a t i o n o f a c r o l e i n f r o m g l y c e r o lb y B . w e l c h i i . J . I n f e c t . D i s . , 3 5 , 2 8 2 - 2 9 0 .M I C K E L S O N , M. N . , AND WERKMAN, C . H . 1 9 4 0 T h e d i s -s i m i l a t i o n o f g l y c e r o l b y C o l i - A e r o g e n e s i n t e r m e d i a t e s .J . B a c t e r i o l . , 3 9 , 7 0 9 - 7 1 5 .R E Y N O L D S , H . , H OEH N, W. M . , A ND W ERK M A N, C . H. 1 9 3 9O c c u r r e n c e o f a c r o l e i n a s a n i n t e r m e d i a t e d u r i n g t h ef e r m e n t a t i o n o f g l y c e r o l b y t h e C o l i - A e r o g e n e s b a c t e r i a .I o w a S t a t e C o l l e g e J . S c i e n c e , 1 3 , 2 7 5 - 2 7 7 .S E R J A K , W. C . , D A Y , W. H . , V AN LANEN, J . M . , AND B O R U F F ,C . S . 1 9 5 3 A c r o l e i n p r o d u c t i o n b y b a c t e r i a f o u n d i nd i s t i l l e r y g r a i n m a s h e s . A p p l . M i c r o b i o l . 2 , 1 4 - 2 0 .V O I S E N E T , E . 1 9 1 8 S u r u n e b a c t e r i e d e l ' e a u . V e g e t a n t p a r i sl e s v i n s a m e r s . c a p a b l e d e d e s h y d r a t e s l a g l y c e r i n e -g l y c e r o l r e a c t i o n s . A n n . I n s t . P a s t e u r , 3 2 , 4 7 6 - 5 1 0 .W A R C O L L I E R , G . , AND LE M O A L , A . 1 9 3 2 A c c i d e n t a l p r e s -e n c e o f a c r o l e i n i n c i d e r b r a n d y . A n n . f a l s . e t . f r a u d e s . ,2 5 , 2 7 1 - 2 7 3 .

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acroleina estudios

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