8/3/2019 Agar Diffusion by Paper

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J . c l i n . P a t h . , 1 9 7 5 , 2 8 , 9 8 9 - 9 9 2

D e t e r m i n a t i o n o f a n t i m i c r o b i a l MIC b y p a p e rd i f f u s i o n m e t h o dM. S . SHAFIFrom t h e D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , C e n t r a l M i d d l e s e x H o s p i t a l , L o n d o n NWJO 7NS

SYNOPSIS B e c a u s e t h e y are c u m b e r s o m e , t e s t s t o d e t e r m i n e t h e q u a n t i t a t i v e s u s c e p t i b i l i t y o fo r g a n i s m s t o a n t i m i c r o b i a l d r u g s are n o t p e r f o r m e d r o u t i n e l y i n many d i a g n o s t i c l a b o r a t o r i e s .T h i s paper d e s c r i b e s a s i m p l e m e t h o d o f i n c o r p o r a t i n g t h e a n t i m i c r o b i a l d r u g i n a g a r . I t i s a na d a p t a t i o n o f t h e R o l i n s o n a n d R u s s e l l t e c h n i q u e w h i c h a l l o w s t h e d e t e r m i n a t i o n o f minimumi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n s ( M I C ) o f a n t i m i c r o b i a l d r u g s f o r a l a r g e number o f o r g a n i s m s . R e s u l t sare c o m p a r a b l e w i t h t h o s e o b t a i n e d when t h e s t a n d a r d agar d i l u t i o n m e t h o d i s u s e d . S t r a i n s o fa e r o b i c G r a m - n e g a t i v e b a c i l l i w e r e t e s t e d b y b o t h m e t h o d s u s i n g a m p i c i l l i n ( 8 6 s t r a i n s ) , c e p h a l o r i -d i n e ( 7 2 s t r a i n s ) , t r i m e t h o p r i m ( 7 2 s t r a i n s ) , a n d g e n t a m i c i n ( 7 2 s t r a i n s ) . Of t h e 3 0 2 t e s t s t h u sp e r f o r m e d , a d i f f e r e n c e i n MIC o f more t h a n o ne d o u b l e d i l u t i o n was n o t e d i n o n l y 11 t e s t s . Witho ne s t r a i n o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a , h o w e v e r , i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e c t a m p i c i l l i n r e s i s t a n c eb y t h e m e t h o d d e s c r i b e d i n t h i s paper.I t i s c o m m o n p r a c t i c e t o r e p o r t t h e s u s c e p t i b i l i t y o fa n o r g a n i s m i s o l a t e d f r o m a p a t i e n t a n d c o n s i d e r e dt o b e o f c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e a s e i t h e r ' s e n s i t i v e ' o r' r e s i s t a n t ' t o a p a r t i c u l a r a n t i m i c r o b i a l d r u g .L a b o r a t o r y m e t h o d s f o r a s s e s s i n g t h e s u s c e p t i b i l i t yo f a n o r g a n i s m t o s u c h d r u g s v a r y . B r o a d l y , t h e yf a l l i n t o t w o g r o u p s - d i s c d i f f u s i o n t e s t s a n d d i l u t i o nt e s t s . B e c a u s e t h e y a r e s i m p l e t o p e r f o r m , d i s cd i f f u s i o n t e s t s a r e u s e d r o u t i n e l y i n many d i a g n o s t i cl a b o r a t o r i e s .S e v e r a l s t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d t o c o m p a r er e s u l t s o f a n t i m i c r o b i a l s e n s i t i v i t y t e s t s o b t a i n e d b yd i f f e r e n t l a b o r a t o r i e s on s t r a i n s o f o r g a n i s m s s e n te i t h e r a s s i m u l a t e d c l i n i c a l s p e c i m e n s o r a s p u r ec u l t u r e s ( I n s t i t u t e o f M e d i c a l L a b o r a t o r y T e c h -n o l o g y , 1 9 6 0 ; A s s o c i a t i o n o f C l i n i c a l P a t h o l o g i s t s ,1 9 6 5 ; C o l l e g e o f P a t h o l o g i s t s o f A u s t r a l i a , 1 9 6 8 ;C a s t l e a n d E l s t u b , 1 9 7 1 ) . T h e s e s t u d i e s h a v e s h o w na w i d e r a n g e o f d i s c r e p a n t r e s u l t s a n d t h i s h a s g i v e nc a u s e f o r c o n c e r n .I n r e c e n t y e a r s a t t e m p t s h a v e b e e n made t os t a n d a r d i z e d i s c d i f f u s i o n t e s t s a n d t o i n t e r p r e t z o n ed i a m e t e r s i n t e r m s o f minimum i n h i b i t o r y c o n c e n t r a -t i o n s ( M I C ) o f t h e a n t i m i c r o b i a l s u b s t a n c e ( B a u e re t a l , 1 9 6 6 ; E r i c s s o n a n d S h e r r i s , 1 9 7 1 ) . S u c h m e t h o d sr e q u i r e r i g i d s t a n d a r d i z a t i o n a n d , when p e r f o r m e da s r e c o m m e n d e d , a r e t i m e c o n s u m i n g a n d l a b o r i o u s .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 4 J u l y 1 9 7 5

A l t h o u g h t h e S t o k e s m e t h o d o f d i s c s e n s i t i v i t yt e s t i n g ( S t o k e s , 1 9 6 8 ) a i m s a t c o n t r o l l i n g a l l v a r i a b l e si n c l u d i n g t h e p e r f o r m a n c e o f t h e d i s c , i t g i v e s o n l y aq u a l i t a t i v e i n d i c a t i o n o f t h e s u s c e p t i b i l i t y o f a no r g a n i s m t o a n a n t i m i c r o b i a l d r u g .S t a n d a r d m e t h o d s f o r d e t e r m i n i n g t h e MIC o fa n t i m i c r o b i a l d r u g s a r e t i m e c o n s u m i n g a n d a r et h e r e f o r e n o t p e r f o r m e d r o u t i n e l y . R o l i n s o n a n dR u s s e l l ( 1 9 7 2 ) , h o w e v e r , d e s c r i b e d a m e t h o d o fs e n s i t i v i t y t e s t i n g b y m e a n s o f f i l t e r p a p e r i m p r e g -n a t e d w i t h k n o w n a m o u n t s o f d r u g w h i c h d i f f u s e di n t o a s h a l l o w l a y e r o f a g a r . T h i s p a p e r d e s c r i b e sa n a d a p t a t i o n o f t h e R o l i n s o n a n d R u s s e l l t e c h n i q u ew h i c h a l l o w s q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f d r u g s u s -c e p t i b i l i t y i n r o u t i n e m i c r o b i o l o g y a n d w i l l b er e f e r r e d t o a s t h e p a p e r d i f f u s i o n m e t h o d .M a t e r i a l a n d M e t h o d sDETERMINATION OF MIC BY THE AGARDILUTION 'STANDARD' METHODS o l u t i o n s c o n t a i n i n g 4 0 , 8 0 , 1 2 0 , 1 6 0 , 2 0 0 , a n d 4 0 0, u g a m p i c i l l i n o r c e p h a l o r i d i n e p e r m l a n d 5 , 1 0 , 2 0 ,4 0 , a n d 8 0 u g t r i m e t h o p r i m o r g e n t a m i c i n p e r m lw e r e p r e p a r e d i n d i s t i l l e d w a t e r . Tw o m l a l i q u o t so f e a c h s o l u t i o n w e r e s t o r e d a t - 2 0 C a n d w e r eu s e d w i t h i n t w o w e e k s o f p r e p a r a t i o n . T h e a m p i c i l l i n ,c e p h a l o r i d i n e , a n d g e n t a m i c i n w e r e o f t h e k i n di n t e n d e d f o r t h e r a p e u t i c u s e b y i n j e c t i o n . T r i m e t h o -

9 8 9

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M. S . S h a f ip r i m l a c t a t e was o b t a i n e d f r o m B u r r o u g h s W e l l c o m e& C o m p a n y . P l a t e s w e r e p r e p a r e d b y m i x i n g 1 mla n t i m i c r o b i a l s o l u t i o n w i t h 1 9 m l m o l t e n DST a g a r( O x o i d ) a t a t e m p r a t u r e o f l e s s t h a n 5 0 C . T h e f i n a lc o n c e n t r a t i o n s o f t h e d r u g i n a gar w er e 2 , 4 , 6 , 8 ,1 0 , a n d 2 0 Z t g / m l f o r a m p i c i l l i n a n d c e p h a l o r i d i n ea n d 0 - 2 5 , 0 - 5 , 1 , 2 , a n d 4 u g / m l f o r t r i m e t h o p r i ma n d g e n t a m i c i n . A p p r o x i m a t e l y 0 - 0 0 3 m l o f a 4 - h o u rb r o t h c u l t u r e o f e a c h t e s t o r g a n i s m was a p p l i e d t ot h e ag ar s u r f a c e b y means o f a m u l t i p o i n t i n o c u l a t o r ' .R e s u l t s w e r e r e c o r d e d a f t e r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n a t3 7 C . T h e MIC o f e a c h d r u g was t a k e n as t h e l e a s tc o n c e n t r a t i o n c o m p l e t e l y i n h i b i t i n g g r o w t h .PAPER DIFFUSION METHODP r e p a r a t i o n o f papersA b s o r b e n t papers ( 9 x 9 c m ) i m p r e g n a t e d w i t h 4 0 ,8 0 , 1 2 0 , 1 6 0 , 2 0 0 , a n d 4 0 0 ug a m p i c i l l i n w e r eo b t a i n e d f r o m M a s t L a b o r a t o r i e s .S a m p l e s o f t h e s e a b s o r b e n t papers w e r e i n v e s t i -g a t e d b y e l u t i n g t h e d r u g f r o m t h e m i n t o d i s t i l l e dw a t e r , a n d assays w e r e p e r f o r m e d b y t h e p l a t ed i f f u s i o n m e t h o d t o a s c e r t a i n t h a t t h e papersc o n t a i n e d t h e i n t e n d e d amounts o f a m p i c i l l i n .C e p h a l o r i d i n e , t r i m e t h o p r i m , a n d g e n t a m i c i npapers w e r e p r e p a r e d i n t h e l a b o r a t o r y , I n i t i a l l y ,t e s t s w e r e c a r r i e d o u t t o d e t e r m i n e w h e t h e r a c o n s t a n tv o l u m e o f w a t e r i s a b s o r b e d b y f i l t e r paper o f a g i v e ns i z e . F o r t h i s purpose, W h a t m a n ' s N o . 1 f i l t e r paper9 x 9 cm square ( s t e r i l i z e d b y a u t o c l a v i n g ) w e r ew e i g h e d . A f t e r i m m e r s i n g t h e paper i n w a t e r , excessw a t e r was r e m o v e d b y l i g h t l y b l o t t i n g over t h es u r f a c e o f d r y a b s o r b e n t p a p e r . Th e f i l t e r paper wasw e i g h e d a g a i n t o d e t e r m i n e t h e amount o f w a t e rh e l d b y i t . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d w i t h 1 0p a p e r s . T h e w e i g h t o f w a t e r ( a n d h e n c e t h e v o l u m e )h e l d b y e a c h paper r a n g e d f r o m 1 0 5 t o 1 0 9 g .S i n c e b y t h i s m e t h o d e a c h paper w a s f o u n d t oh o l d a p p r o x i m a t e l y 1 ml w a t e r , papers w e r e p r e -p a r e d b y i m m e r s i n g t h e m i n c e p h a l o r i d i n e , t r i -m e t h o p r i m , a n d g e n t a m i c i n s o l u t i o n s o f a p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o n s . A f t e r r e m o v a l o f t h e excess s o l u t i o nas d e s c r i b e d a b o v e , t h e f i l t e r papers w e r e d r i e d i n a' O b t a i n e d from Denby I n s t r u m e n t s L t d , B o l n e y . Sussex

l a m i n a r f l o w c a b i n e t f o r 3 - 4 h o u r s and s t o r e d a t4 C over a n h y d r o u s c a l c i u m c h l o r i d e i n a d e s i c c a t o r .T h e papers w e r e u s e d w i t h i n t w o w e e k s o f p r ep a r a -t i o n .D e t e r m i n a t i o n o f MIC b y t h e P a p e r D i f f u s i o nMethodT e s t s w e r e c a r r i e d o u t on square p l a t e s 1 0 x 1 0 cmc o n t a i n i n g 2 0 m l DST ag ar ( O x o i d ) . F i l t e r p ap e rsi m p r e g n a t e d w i t h a n t i m i c r o b i a l d r u g were p l a c e don t h e s u r f a c e o f t h e agar. R o l i n s o n a n d R u s s e l l( 1 9 7 2 ) o b s e r v e d t h a t many o f t h e commonly u s e da n t i b i o t i c s r e q u i r e d I j t o 4 h o u r s f o r u n i f o r md i f f u s i o n o f t h e d r u g f r o m t h e pap e r i n t o t h e agar.P l a t e s w e r e t h e r e f o r e l e f t a t room t e m p e r a t u r ef o r 4 h o u r s t o a l l o w d i f f u s i o n o f t he d r u g . T h ee x p e c t e d c o n c e n t r a t i o n s o f d r u g i n a g a r w e r e f o ra m p i c i l l i n a n d c e p h a l o r i d i n e 2 , 4 , 6 , 8 , 1 0 , a n d 2 0, u g / m l a n d f o r t r i m e t h o p r i m a n d g e n t a m i c i n 0 - 2 5 ,0 5 , 1 , 2 , a n d 4 , u g / m l . P a p e r s w e r e t h e n r e m o v e da n d e a c h p l a t e was i n o c u l a t e d w i t h up t o 2 0 b a c t e r i a ls t r a i n s . S i m i l a r i n o c u l a w e r e u s e d f o r b o t h t h e paperd i f f u s i o n a n d agar d i l u t i o n t e s t s .P r e l i m i n a r y t e s t s w i t h f i v e s t r a i n s o f o r g a n i s m sh a d s h o w n t h a t t h e d r u g d i f f u s e d u n i f o r m l y i n t o t h ea g a r . To d o so e a c h o f t h e f i v e s t r a i n s was i n o c u l a t e don f o u r d i f f e r e n t p a r t s o f p l a t e s c o n t a i n i n g v a r i o usc o n c e n t r a t i o n s o f a m p i c i l l i n . I n some p l a t e s t h ea m p i c i l l i n h a d b e e n i n t r o d u c e d b y a d d i n g i t t o t h em o l t e n a g a r a n d i n o t h e r s b y t h e paper d i f f u s i o nm e t h o d .

One h u n d r e d s t r a i n s o f G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i ai s o l a t e d f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s w e r e t e s t e d b y b o t ht h e s t a n d a r d m e t h o d a n d t h e paper d i f f u s i o n m e t h o d .E i g h t y - s i x o f t h e s e s t r a i n s w e r e t e s t e d w i t h a m p i c i l l i nw h e r e a s 7 2 s t r a i n s w e r e u s e d t o p e r f o r m t h e t e s t sw i t h c e p h a l o r i d i n e , t r i m e t h o p r i m , a n d g e n t a m i c i n .E s c h e r i c h i a c o l i NCTC 1 0 4 1 8 a n d t wo o t h e r s t r a i n so f E s c h . c o l i ( N o s 3 6 6 9 / 7 4 a n d 3 1 7 9 9 / 7 4 ) i s o l a t e df r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s w e r e i n c l u d e d as c o n t r o l sw i t h e a c h b a t c h o f t e s t s . An a d d i t i o n a l c o n t r o l s t r a i no f K l e b s i e l l a aerogenes (NCTC 8 1 7 2 ) w a s i n c l u d e di n t e s t s w i t h c e p h a l o r i d i n e , t r i m e t h o p r i m , a n d g e n t a -micin.

E s c h . c o hNCTC 1 0 4 1 8 3 8 0 7 6 / 7 4 3 3 8 7 4 / 7 4 3 8 2 7 5 / 7 4 3 8 3 4 2 / 7 4

MIC b y s t a n d a r d m e t h o d ( & g / m l ) .2 4 4 6 862 4 4 6 8.2 4 4 6 8

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D e t e r m i n a t i o n o f a n t i m i c r o b i a l MIC b y paper d i f f u s i o n m e t h o d>20 20- 1420 3 3 2g o 1 I I I I I8 2 I 3I b 6 1 2 3 41

04 2Q 10 I 1282

4 2 10 l 6 b 6 1,4 6 8 10 2 0 >2 0 2 4 6 8 10 2 0 >2 0M I C ( p i g / m l ) b y S t a n d a r d ( A q a r D i l u t i o n ) M e t h o d4 1 I3 I2 21 ~2 3 6154

05 14 1 4 1 8 2 0 - 2 5 1 5 1 2 3 _

4 6 0 2 2 5 0 5 1 2 4 >4MIC ( , u q / m l ) b y S t a n d a r d ( A q a r D i l u t i o n ) M e t h o d

9 9 1

F i g u r e C o m p a r i s o n o f p ap e rd i f f u s i o n m e t h o d w i t h s t a n d a r d( a g a r d i l u t i o n ) m e t h o d : MICd e t e r m i n a t i o n of a m p i c i l l i n ( t o pl e f t ) , c e p h a l o r i d i n e ( t o p r i g h t ) ,t r i m e t h o p r i m ( b o t t o m l e f t ) , a n dg e n t a m i c i n ( b o t t o m r i g h t ) .

N o . o f T i m e s N o . o f T i m e s S t r a i n s s h o w i n g MIC ( p i g / m l )t e s t e dP a p e r D i f f u s i o n M e t h o d S t a n d a r d M e t h o d

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9 9 2R e s u l t sT a b l e I s h o w s t h e MIC o f a m p i c i l l i n f o r f i v e s t r a i n so f o r g a n i s m s w h i c h were i n o c u l a t e d on f o u r d i f f e r e n tp a r t s o f e a c h p l a t e . F o r e a c h s t r a i n t e s t e d t h ev a r i a t i o n i n MIC f o r t h e paper d i f f u s i o n m e t h o d wasn o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t f o r t h e agard i l u t i o n m e t h o d . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e a n t i b i o t i ci n t h e paper d i f f u s e d u n i f o r m l y i n t o t h e a g a r .A l t h o u g h t h e MIC f o r t h e s t r a i n s 3 8 2 7 5 / 7 4 a n d3 8 3 4 2 / 7 4 was d i f f e r e n t b y e a c h o f t h e t w o m e t h o d st h e d i f f e r e n c e was no t more t h a n one d o u b l ed i l u t i o n . T h e d a y - t o - d a y v a r i a t i o n i n r e s u l t s o f t h ec o n t r o l o r g a n i s m s i n c l u d e d w i t h e a c h b a t c h o f t e s t si s s h o w n i n t a b l e s L I a n d III. A g a i n t h e v a r i a b i l i t yi n MIC f o r e a c h s t r a i n b y t h e a g a r d i l u t i o n m e t h o da n d b y t h e paper d i f f u s i o n m e t h o d d o e s no t d i f f e rs i g n i f i c a n t l y .A c o m p a r i s o n o f MIC i s s h o w n i n t h e f i g u r e .None o f t h e 7 2 s t r a i n s t e s t e d a g a i n s t c e p h a l o r i d i n es h o w e d a d i f f e r e n c e i n MIC o f more t h a n o ne d o u b l ed i l u t i o n . O n l y t w o o f t h e 7 2 s t r a i n s t e s t e d a g a i n s t

g e n t a m i c i n s h o w e d a d i f f e r e n c e i n MIC o f moret h a n o ne d o u b l e d i l u t i o n w h i l e f o u r s t r a i n s s h o w e ds u c h a d i f f e r e n c e w i t h t e s t s u s i n g t r i m e t h o p r i m . Oft h e 8 6 s t r a i n s t e s t e d a g a i n s t a m p i c i l l i n , f i v e s h o w e da d i f f e r e n c e i n MIC o f more t h a n o ne d o u b l e d i l u t i o n .One o f t h e s e f i v e , a m u c o i d s t r a i n o f P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a i s o l a t e d f r o m t h e sputum o f a p a t i e n tw i t h b r o n c h i e c t a s i s , s h o w e d t h e MIC o f a m p i c i l l i nt o b e 4 , u g / m l f o r t h e paper d i f f u s i o n m e t h o d b u t>20 j g / m l f o r t h e a g a r d i l u t i o n m e t h o d . T h e d i s -crepancy was r e p r o d u c i b l e when t e s t s w e r e r e p e a t e d .When t h i s s t r a i n was t e s t e d b y t h e b r o t h d i l u t i o nm e t h o d t h e MIC was 6 2 5 j i g / m l a m p i c i l l i n . C l e a r l yt h i s s t r a i n was r e s i s t a n t t o a m p i c i l l i n a n d t h e r e s u l tb y t h e paper d i f f u s i o n method was m i s l e a d i n g .I n v e s t i g a t i o n d i d n o t r e v e a l a ny i n h i b i t o r y s u b s t a n c ei n t h e paper i m p r e g n a t e d w i t h a m p i c i l l i n .D i s c u s s i o nT h e d i s c d i f f u s i o n m e t h o d f o r s e n s i t i v i t y t e s t i n g i ss i m p l e t o p e r f o r m b u t d o e s n o t g i v e a q u a n t i t a t i v ea s s e s s m e n t o f s u s c e p t i b i l i t y u n l e s s cumbersomes t a n d a r d i z a t i o n p r o c e d u r e s a re a d o p t e d . The s i m -p l i c i t y o f t h e t e s t i s t h e n l o s t .I d e a l l y a n t i m i c r o b i a l t r e a t m e n t s h o u l d b e b a s e don t h e k n o w l e d g e o f t w o f e a t u r e s , f i r s t , t h e r e l e v a n to r g a n i s m ' s s u s c e p t i b i l i t y t o t h e d r u g s a v a i l a b l e , a n d ,s e c o n d , t h e amount o f t h e d r u g a t t a i n a b l e a t t h es i t e o f i n f e c t i o n . I n f o r m a t i o n on t h e f i r s t o f t h e s ef e a t u r e s i s no t u s u a l l y a v a i l a b l e i n q u a n t i t a t i v e termsb e c a u s e m e t h o d s s u i t a b l e f o r r o u t i n e use are no ta v a i l a b l e . The agar d i l u t i o n method ( h e r e d e s c r i b e d

M . S . S h a f ia s t h e s t a n d a r d m e t h o d ) f o r d e t e r m i n i n g t h e MIC i sg e n e r a l l y a c c e p t e d a s r e l i a b l e b u t i t i s n o t c o m m o n l yu s e d i n c l i n i c a l l a b o r a t o r i e s b e c a u s e i t i s t e c h n i c a l l yc u m b e r s o m e . F u r t h e r m o r e , m i s t a k e s i n t h e a d d i t i o no f d r u g s t o m e d i a a r e r e a d i l y made a n d d i f f i c u l t t or e c o g n i z e . T h e r e p o r t o f t h e i n t e r n a t i o n a l c o l l a b o r a -t i v e s t u d y ( E r i c s s o n a n d S h e r r i s , 1 9 7 1 ) s u g g e s t e dt h a t , i f u s e d w i t h t h e a i d o f s e m i m e c h a n i z e d p r o c e -d u r e s , d i l u t i o n t e s t s a r e f u l l y a c c e p t a b l e f o r r o u t i n em e t h o d s . H o w e v e r , t h e n e e d t o s i m p l i f y t h e i n c o r -p o r a t i o n o f d r u g s i n t o a g a r w a s e m p h a s i z e d . Toa c h i e v e t h i s t h e y s u g g e s t e d t h a t t h e a v a i l a b i l i t y o fa m p o u l e s c o n t a i n i n g a p p r o p r i a t e a m o u n t s o f f r e e z e -d r i e d d r u g w o u l d b e h e l p f u l .

I n t h i s s t u d y , c o n s i d e r a t i o n h a s b e e n g i v e n t o t h ef e a s i b i l i t y o f d e t e r m i n i n g t h e MIC o f a l a r g e n u m b e ro f s t r a i n s u s i n g a s i m p l e m e t h o d o f i n c o r p o r a t i n gt h e d r u g i n a g a r . T h e p a p e r d i f f u s i o n m e t h o d i s e a s yt o p e r f o r m a n d t h e r e s u l t s o b t a i n e d a r e s i m i l a r t ot h o s e o b t a i n e d w h e n t h e c o n v e n t i o n a l a g a r d i l u t i o nm e t h o d i s u s e d . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i m i c r o b i a ld r u g s u s e d i n t h e t e s t s m i g h t b e c h o s e n e i t h e r t og i v e a c o m p r e h e n s i v e r a n g e f o r r e s e a r c h p u r p o s e so r a l i m i t e d r a n g e s o t h a t s t r a i n s t e s t e d m i g h t b ec l a s s i f i e d f o r c l i n i c a l p u r p o s e s a s s e n s i t i v e , r e s i s t a n to r i n t e r m e d i a t e . C o n t r o l s t r a i n s o f d i f f e r e n t MICs h o u l d b e i n c l u d e d i n e a c h b a t c h o f t e s t s s o a s t oc h e c k t h e l o w e r , i n t e r m e d i a t e , a n d h i g h e r c o n c e n -t r a t i o n o f e a c h a n t i m i c r o b i a l d r u g .I s h o u l d l i k e t o t h a n k D r . C . E . D . T a y l o r a n d D r .D . A . M c S w i g g a n f o r t h e i r h e l p a n d e n c o u r a g e m e n ta n d M r . P h i l i p p e Wong K a i I n f o r t e c h n i c a l a s s i s t -a n c e .R e f e r e n c e sA s s o c i a t i o n o f C l i n i c a l P a t h o l o g i s t s ( 1 9 6 5 ) . R e p o r t ona n t i b i o t i c s e n s i t i v i t y t e s t t r i a l o r g a n i z e d b y t h e B a c t e r i o l o g yC o m m i t t e e o f t h e A s s o c i a t i o n o f C l i n i c a l P a t h o l o g i s t s .J . c l i n . P a t h . , 1 8 , 1 - 5 .B a u e r , A . W . , K i r b y , W. M. M . , S h e r r i s , J . C . , a n d T u r c k ,M. ( 1 9 6 6 ) . A n t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g b y a s t a n d a r d -i z e d s i n g l e d i s k m e t h o d . Amer. J . c l i n . P a t h . , 4 5 , 4 9 3 - 4 9 6 .C a s t l e , A . R . a n d E l s t u b , J . ( 1 9 7 1 ) . A n t i b i o t i c s e n s i t i v i t y

t e s t i n g : a s u r v e y u n d e r t a k e n i n S e p t e m b e r 1 9 7 0 i n t h eU n i t e d K i n g d o m . J . c l i n . P a t h . , 2 4 , 7 7 3 - 7 7 8 .C o l l e g e o f P a t h o l o g i s t s o f A u s t r a l i a ( 1 9 6 8 ) . A s u r v e y o fa n t i b i o t i c s e n s i t i v i t y t e s t i n g . M e d . J . A u s t . , 2 , 1 7 1 - 1 7 2 .E r i c s s o n , H . M. a n d S h e r r i s , J . C . ( 1 9 7 1 ) . A n t i b i o t i c s e n -s i t i v i t y t e s t i n g : r e p o r t o f an i n t e r n a t i o n a l c o l l a b o r a t i v es t u d y . A c t a p a t h . m i c r o b i o l . s c a n d . , B S u p p l . , No. 2 1 7 .I n s t i t u t e o f M e d i c a l L a b o r a t o r y T e c h n o l o g y ( 1 9 6 0 ) . ' A s u r v e yo f a n t i b i o t i c s e n s i t i v i t y t e s t s . J . m e d . L a b . T e c h n o l . , 1 7 ,1 3 3 - 1 4 3 .R o l i n s o n , G . N . a n d R u s s e l l , E . J . ( 1 9 7 2 ) . Ne w m e t h o d f o ra n t i b i o t i c s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g . A n t i m i c r o b . A g e n t sC h e m o t h e r . , 2 , 5 1 - 5 6 .S t o k e s , E . J . ( 1 9 6 8 ) . C l i n i c a l B a c t e r i o l o g y , 3 r d e d i t i o n , p . 1 7 9 .A r n o l d , L o n d o n .