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Agência Nacionalde Vigilância Sanitária www.anvisa.gov.br

“Consideration of the methods for the detection and

identification of foods derived from biotechnology”

CX/MAS/05/26/9

Elkiane Macedo Rama

Farmacêutica Bioquímica

Especialista em Regulação e Vig. Sanitária

2ª Reunião do Grupo Técnico de Métodos Analíticos e Amostragem do Codex Alimentarius no Brasil (Fiocruz- RJ)

20 e 21 de março de 2006


Abordagem GeralAbordagem Geral

• Presença de OGMs ou seus derivados:– Detecção das seqüências de DNA

• +: diferencia o evento pode ser usado em alimentos processados• - : custo mais elevado

– Proteína codificada pelo gene inserido• +: baixo custo

alta seletividade alta sensibilidade• - : desnaturação (exceto alimentos in natura) não diferenciação de eventos que produzem mesma proteína

Y


Apêndice I: Guia para Validação e Controle Apêndice I: Guia para Validação e Controle de Qualidadede Qualidade

• Posição do Codex: aceitação de métodos de análise os quais foram totalmente validados por meio de estudos colaborativos, seguindo protocolos aceitos internacionalmente;

• Poucos métodos estão totalmente validados Codex endossa protocolos de validação intra-laboratorial.


• Critérios para avaliação do método analítico:– Exatidão– Aplicabilidade– Limites de detecção– Limites de quantificação– Precisão (repetitividade e reprodutibilidade) – Recuperação– Seletividade– Sensibilidade– Linearidade



• Critérios específicos para os OGMs:– Para método baseado na análise de DNA:

• Tamanho do amplicon

• Se o método é “instrumento-específico”

• Se há diferenças entre as detecções quali e quanti

• Amplificações únicas ou múltiplas

– Para método baseado na análise de proteína:• “Equivalência” de reagentes



• Qualidade do Laboratório:– Acreditação pela ISO/IEC 17025: 2005– Testes de proficiência– Controle de qualidade interno– Métodos analíticos validados de acordo com os

requisitos estabelecidos pelo Codex

• Incerteza de medição (estimativa)



• Desenvolvimento do método à validação formal– Aplicabilidade do método – Processo de validação (desenvolvimento e

otimização, pré validação, validação total)– Validação com abordagem “modular”

• + : uma vez validada a etapa, pode ser utilizada para qualquer processo subseqüente

• - : apenas para análises com etapas independentes entre si (freqüentemente não é o caso )



• Critério de Aceitabilidade: Anexo I

• PCR:– Método de extração– Descrição das seqüências do primer que

identificam o evento de modificação genética;– Descrição das seqüências do primer que

identificam seqüências endógenas;– Protocolo descrevendo as condições reacionais;– Controles



• Requisições dos Métodos– O método deve ser específico e permitir

detecção/identificação/quantificação sem equívocos, de seqüências de DNA específicas ou de proteínas específicas.

– No caso de métodos de análise de DNA: permitir detecção/identificação/quantificação sem equívocos, de seqüências de nucleotídeos de alvos conhecidos.

– Todos os métodos devem ser aplicáveis ao material especificado no escopo.



• Requisições dos Testes Colaborativos– Validar as informações dos testes de pré-validação

ou dos testes de validação intra-laboratorial, determinando a repetitividade e reprodutibilidade do método.

– Testes colaborativos confirmam os resultados obtidos nas fases prévias de validação.



• Validação de Métodos usando PCR (Anexos III e IV)• Unidades de medida• Estimativa da incerteza da medição: referência citada

está em desenvolvimento.• Materiais de Referência: há alguns materiais

disponíveis comercialmente.• Amostragem: erro de amostragem nessa área é

esperado para contribuir muito na incerteza geral do resultado analítico, sendo motivo de discussão em GT específico.



• 1. Descrição do Método: completa e detalhada, de TODOS os componentes.– Proposta e relevância do método

– Base científica (referências e publicações de relevância científica)

– Especificação do modelo matemático/modelo de predição necessária para o método (no caso dos resultados derivarem de relações matemáticas, p. ex. regressão linear ou curva de calibração, número de replicatas, número de corridas, de amostras, etc.)

Anexo I: Informações a serem fornecidas Anexo I: Informações a serem fornecidas para o Codex quando o método pretende ser para o Codex quando o método pretende ser

endossado pelo CCMASendossado pelo CCMAS


• 2. Informações sobre a otimização do Método– Pares de primers testados (justificativa da escolha daquele

primer)

– Especificidade do teste (do evento não transgênico versus plantas não transgênicas)

– Estabilidade do teste

– Sensibilidade do teste (LD, efeitos de diluição...)

– Robustez

– Reatividade cruzada




• 3. Aplicação Prática do Método– Aplicabilidade (indicação de matrizes – alimentos processados, in

natura, tipo de amostras – sementes, flores, etc, faixa na qual o método pode ser aplicado, limitações relevantes do método – interferência de outros analitos, custos, equipamentos ou riscos para operador/ambiente etc.)

– Características operacionais (equipamento, $, tempo, etc.)– Habilidades do operador

• 4. Controles Analíticos– Controles + e – utilizados– Amostras e plasmídeos– Materiais de referência utilizados




• 5. Validação / Performance do Método– Tamanho do amplicon

• Pequenos amplicons: alta possibilidade de sinal +

– Se o método é instrumento específico

– Se ocorrem amplificações de PCR “simples” ou “múltiplas” (usar até 7-10 primers por reação e demonstrar robustez, testando em ao menos um laboratório externo além daquele que desenvolveu o método)

– Se há diferenças entre métodos baseados na análise de DNA com os imunológicos em relação aos critérios de validação




• 1. Exatidão: diferença entre o valor obtido com o de referência.• 2. Aplicabilidade: analitos, matrizes e concentrações permitidas

pelo método.• 3. Faixa de Validação: intervalo de concentração que o

procedimento demonstra, por meio de testes colaborativos, níveis de precisão e exatidão.

• 4. LD: a menor concentração que pode ser detectada com confiança mas não necessariamente quantificada, demonstrado por validação intra ou inter laboratorial.

• 5. LQ: a menor concentração que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão, demonstrada por validação intra ou inter laboratorial.

• 6. Praticabilidade: a “facilidade” da operação, nos termos de amostras e custos, para atingir o critério de performance e especificação.

Anexo II: Definições do Codex aplicáveis à Anexo II: Definições do Codex aplicáveis à análise de OGMsanálise de OGMs


• 7. Desvio Padrão da Repetitividade: desvio padrão obtido sob condições de repetitividade (mesmo laboratório, com o mesmo método, mesmo operador e mesmo equipamento em intervalos de tempo pequenos) .

• 8. Desvio Padrão de Reprodutibilidade: desvio padrão obtido sob condições de reprodutibilidade (diferentes laboratórios, com o mesmo método, diferentes operadores e diferentes equipamentos).

• 9. Recuperação: proporção de quantidade de analito, presente ou adicionado no material testado, que é extraída para a medição.

• 10. Robustez: variações do método que ocorrem em diferentes laboratórios, por diferentes operadores.

• 11. Sensibilidade: medida da magnitude de resposta (LD ou inclinação da curva).

• 12. Especificidade: propriedade de um método responder exclusivamente ao analito de interesse.

• 13.Veracidade (Trueness): diferença entre o valor médio obtido e o valor de referência (exatidão da média).

Anexo II: Definições do Codex aplicáveis à Anexo II: Definições do Codex aplicáveis à análise de OGMsanálise de OGMs


• 1. Exatidão: + 35% do valor de referência

• 2. Aplicabilidade: analitos, matrizes e concentrações permitidas pelo método devem ser descritas

• 3. Faixa de Validação: de 0,1 a 100% de DNA (w/w) Recomendação: deve cobrir pelo menos 20% e 5 vezes a concentração do

alvo, quando possível Ex.: 0,1% (0,2) e 2 % (5) para a concentração de OGM de 1% ou 50 (100)

e 1000 (2500) cópias de genoma se o alvo possuir 500 cópias Se conteúdo for de 10-200% de OGM: complicado determinar a faixa de

quantificação Ex.:50% (nutracêuticos): faixa deveria ser maior que 100% não é

possível

Anexo III: Validação do método de PCR Anexo III: Validação do método de PCR quantitativoquantitativo


• 4. LD: deverá ser parte do procedimento de validação caso as concentrações utilizadas de OGM estejam próximas aos LD e LQ.

Ex.: se LD for 1ng/kg mas as []s utilizadas são de pelo menos g/kg LD não tem importância. No entanto, sempre estabelecer o LQ na validação de métodos quantitativos.

Qtde de analito detectada com pelo menos 95% de detecção (< 5% falso negativo)

Recomendação: LD deve ser <10% do valor de especificação (valor do alvo).

• 5. LQ: Recomendação: <20% do valor de especificação com um desvio padrão relativo

de 25% ou o mais próximo disso. Ex.: Se o valor nominal for de 1%, valor mínimo de LQ é de 0,1% ou para 500

cópias, valor mínimo de LQ de 50 cópias. No caso da determinação aproximada de LQ (valor do branco + 6-10.DP), só

pode ser usado para distribuição normal. Nos métodos de PCR quantitativo, pela distribuição não ser dessa forma, esse cálculo não pode ser usado.



• 6. Praticabilidade: deve ser demonstrada

• 7. Desvio Padrão da Repetitividade: deve ser < 25% ao longo da faixa de quantificação do método

• 8. Desvio Padrão de Reprodutibilidade: deve ser < 35% da concentração do alvo ou ao longo da faixa de quantificação

• 9. Robustez: Variações que podem ocorrer: volume reacional (25-30L), temperatura de anelamento (+

1°C), etc. Experimentos devem ser feitos em TRIPLICATA. A resposta não pode variar mais que + 30% daquelas obtidas originalmente.

Levar em conta: diferenças nos modelos de termocicladores, DNApol, MgCl2, []s dos primers e da sonda, temperatura, tempo, []s dos dNTP e dUTP.



• 10. Sensibilidade: Descrever coeficiente de correlação, intercepto em y, regressão

linear e % de residual. Análise dos eventos: misturas de DNA genômico de plantas transgênicas e não transgênicas. O conteúdo de DNA de plantas transgênicas para a construção da curva pode ser 100, 50, 5, 1, 0,5, 0,1 e 0%, ou concentrações menores dependendo do caso. Sempre as leituras devem ser em TRIPLICATAS para cada ponto da curva.

Análise dos genes endógenos: misturas de DNA genômico das espécies alvo e espécies não alvo. O conteúdo de DNA de plantas alvo para a construção da curva geralmente é de 100, 50, 25, 10, 5, 1 e 0%, ou concentrações menores dependendo do caso. Sempre as leituras devem ser em TRIPLICATAS para cada ponto da curva.



• 11. Especificidade: deve ser demonstrada experimentalmente. Recomendação: esse parâmetro é crucial para a escolha do primer. Os

primers devem ser checados quanto a outros matches possíveis. Para ensaios eventos-específicos: testar pelo menos 10 amostras, em

seqüências não alvo de plantas transgênicas e plantas não transgênicas. Testar em pelo menos 10 amostras de fontes diferentes. Analisar em duplicata.

Para ensaios de genes endógenos: analisar pelo menos 10 amostras, comparando diferentes variedades de plantas, bem como plantas que pode ser encontradas como contaminantes (trigo, arroz, milho, batata...). Testar em pelo menos 10 amostras de fontes diferentes. Analisar em duplicata.

• 12. Veracidade: + 30% do valor de referência aceito ao longo da faixa de quantificação.



• Critério de Aceitabilidade do Controle analítico e interpretação dos resultados:

– Controle Positivo: a média das replicatas deve apresentar um desvio menor que 3 vezes o desvio padrão do valor especificado.

– Controle Negativo (todos os reagentes exceto o DNA molde): a amplificação do mesmo deve resultar num valor < LD.

– A % residual para cada padrão deve ser < 30%.

– Para aceitar o resultado de uma amostra desconhecida, o desvio padrão relativo das réplicas deve ser < 35%.



• Taxa de falsos positivos:– Probabilidade de classificar uma amostra negativa em positiva.– % Falsos positivos = n° de amostras negativas classificadas incorretamente número total de resultados negativos

• Taxa de falsos negativos:– Probabilidade de classificar uma amostra positiva como negativa.– % Falsos negativos = n° de amostras negativas classificadas incorretamente número total de resultados positivos

Anexo IV: Validação do método de PCR Anexo IV: Validação do método de PCR qualitativoqualitativo


• Critérios de Aceitabilidade e Interpretação dos resultados– Tabela 1: Critério de classificação de uma análise qualitativa de PCR


Resultado do PCR (analito GM)

Resultado PCR (endógeno)

Classificação do teste

+ + +

- + -

+ - +/-

- - Rejeitado


• Critérios de Aceitabilidade e Interpretação dos resultados– Tabela 2: Critério de classificação de análises qualitativas de PCR, em duplicata


1a Análise 2a Análise Classificação do teste

+ + +

- + Repetir/Indeterminado

+ - Repetir/Indeterminado

- - Negativo


• Teste Quantitativo– Imunoensaios quantitativos são feitos para estabelecer os níveis de determinadas proteínas em

partes específicas das plantas.– Quantidade de amostra influencia o LD e linearidade do teste. – Extração do analito (uso de solventes, tensoativos, detergentes, etc.)– Método:

• Imobilização do anticorpo na placa• Adição da amostra ou padrão• Adição do segundo anticorpo (sanduíche)• Lavagem da placa, deixando apenas o complexo anticorpo-amostra-anticorpo.• Adição de substrato colorimétrico• Leitura da absorção colorimétrica por meio de um fotômetro• Produção da curva padrão (sigmóide): DO versus concentração• Para obter valor exato e preciso, o valor de DO deve estar compreendido dentro da porção

linear da curva padrão • Controles do ensaio: branco (background), controle negativo (só a matriz), controle positivo,

amostra fortificada, réplicas...

Anexo V: Validação do método baseado na Anexo V: Validação do método baseado na análise de proteínaanálise de proteína


• Validação do Teste Quantitativo– Exatidão: é medida pela recuperação de amostras fortificadas. Recuperação

entre 70-120% e CV < 20%– Eficiência de extração: % de proteína extraída da amostra.– Precisão: intra-laboratório, medida pelo CV entre as réplicas. Geralmente é maior do que análise de PCR.– Sensibilidade: quantidade de analito que pode ser medida pela leitura de

absorbância de 2 vezes o desvio padrão do ruído.– Faixa de Validação: considerar para proteínas que devido a possíveis

modificações/degradações durante o processamento (mais que DNA), pode ocorrer interferência no sinal de leitura.

– LD e LQ: Anexos III e IV – Especificidade: deve ser demonstrada experimentalmente, em eventos não

transgênicos e plantas não transgênicas. Verificar também os efeitos da matriz.

– Robustez: Verificar possíveis variações de volume, temperatura, etc. Devem ser feitos em triplicata e a recuperação deve ser calculada. Variação aceitável: + 30%.



• Teste Qualitativo: – Lateral flow devices é uma ferramenta fácil, baixo custo e alta

exatidão. O fabricante quem deve conduzir os testes de validação do produto e descrever sua performance.

– Determinação do limiar do teste: utilização de referências negativas e de referências limites (com proporção de proteína recombinante conhecida). Número de corridas suficiente para garantir a sensibilidade adequada do teste.


Positivo

Negativo


• Validação do teste qualitativo – Mesmos critérios da análise qualitativa usando PCR (cálculo de

falsos positivos e de falsos negativos).

– Se utilização de “lateral flow devices”: não há necessidade de réplicas.

– Se utilização de ELISA: pelo menos duplicata.

– Mesmos tipos de controles, critérios de aceitabilidade/rejeição que os utilizados na análise qualitativa de PCR.

– LD: <5% de resultados falsos negativos. No entanto, no caso de lateral flow strip tests, as concentrações utilizadas no teste são pelo menos 2 vezes acima do LD.



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