Rev. del Instituto de Investigacin (RIIGEO), FIGMMG-UNMSM Julio - Diciembre 2012Vol. 15, N. 30, pp. 59-

Aislamiento de bacterias acidfilas a partir del drenaje cido proveniente de las inmediaciones a las unidades mineras de Julcani y Recuperada, Huancavelica

bacteria isolation from acid drainaGe waters at the suroundinGs of recuPerada and julcani mininG units, huancaVelica

Vladimir Arias A.1, Carlos Rodrguez V.1, Pablo Ramrez R.2, Eduardo Nonones V.3, Danica Salazar I.3 Juan Gil R., Jackelyn Paredes R.3, Gustavo Jamanca L.4

rECibido: 12/12/2012 aprobado: 25/02/2013

RESUMEN

Los efluentes de roca y de mina son caracterizados por su acidez y contenido de metales disueltos, por lo general son hbitat natural de bacterias del gnero y , bacterias ampliamente estudiadas por su importancia en la biooxidacion de minerales y capaces de obtener energa de la catlisis oxidativa de compuestos de azufre, hierro y sulfuros metlicos. Las muestras de estudio provienen de la regin Huancavelica de las inmediaciones de las unidades mineras de Julcani y Recuperada; logrndose el aislamiento en medios lquido 9k modificado y slido de agar FeO e identificado mediante microscopia ptica la presencia de un consorcio de bacterias oxidantes acidfilas. La contrastacin de estos resultados se realiz por la reaccin en cadena de la polimerasa a un 98% de probabilidad.

Palabras clave: aislamiento de bacterias, tincin Gram, medios de cultivo, , caracterizacin morfolgica

ABSTRACT

Rock mass and mine effluents are characterized by acidity and contents of dissolved metal. This environment is usually natural habitat of Acidithiobacillus Ferrooxidans and Thioxidans bacteria genus, widely studied for their intervention in the bio oxidation of minerals and also their capacity of obtaining energy from the oxidative catalysis of sulfur and iron compounds and metal sulfides. Samples for study come from Recuperada and Julcani mining units surroundings in Huancavelica Region. Bacteria isolation in modified 9k liquid media and agar FeO solid was achieved. The identification of a consortium of oxidizing acidophilic bacteria was obtained by opticalmicroscopy. The contrasting of these results was performed at 98 percent probability, by chain reaction of the polymerase.

Keywords: bacteria isolation, Gram stain, growing substrates, , morphological characterization

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1 Docente y responsable del Laboratorio de Biometlurgia, EAP Ingeniera Metalrgica, UNMSM. E-mail: variasa@unmsm.edu.pe.2 Docente y responsable del laboratorio de Microbiologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, UNMSM. E-mail: pramirezr@unmsm.edu.pe.3 Estudiantes de pregrado: Metalurgia, Qumica y Biologa4 Estudiante de posgrado en Ciencias con mencin en Geometalrgia.

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Aislamiento de bacterias acidfilas a partir del drenaje cido proveniente de las inmediaciones de las unidades mineras de Julcani y Recuperada, Huancavelica

I. INTRODUCCIN

Actualmente la biotecnologa se ha convertido en una alternativa viable para el procesamiento de diversos ma-teriales y derivados, una de sus reas de desarrollo es la biohidrometalurgia, que se refiere a la oxidacin de azufre elemental, y minerales sulfurados Cu, Pb, Zn, Fe, Ni me-diante microorganismos de tipo acidfilas (Misari, Fidel; 1985), usndose tambin en el pretratamiento oxidante de menas de oro refractarias; tornndola disponible para los procesos subsecuentes, como la lixiviacin con cianuro (Hernndez, G. et al., 1998), proceso alternativo y sosteni-ble frente a la calcinacin y oxidacin por presin.

Los drenajes cidos de mina (DAM) caracterizados por acidez extrema (pH 2.5-4.0) y altas concentraciones de metales pesados, contienen poblaciones nativas de bacterias oxidantes, responsables de la oxidacin progresiva de los sulfuros. Dentro de los microorganismos encontrados en los ambientes cidos y dentro de la familia de los procariotas se ha identificado las bacterias del gnero de Thiobacillus, Leptospirillum y cidophilium (Segura, D., 1998), capaces de contribuir en la degradacin de sulfuros metlicos.

La Bacterias de gnero thiobacillus tienen gran avidez por compuestos sulfurados metlicos, obteniendo su fuente energtica a partir de la oxidacin de sulfuros reducidos y sales ferrosas (Jagnow, G; 2003) y en medio con tempera-tura moderada (mesofilos) y acidez en el rango de 0.5 a 4 pH, obteniendo crecimiento ptimo a pH entre 1.5 a 2.5.

Las bacterias de gnero Leptospirillum se desarrollan oxi-dando al hierro ferroso en compuestos frricos como la pirita (Hallberg, K; 2003). Este gnero de bacterias consideradas como aerobias estrictas se desarrollan en el rango 1.5 a 4.0 pH, estn ampliamente distribuidas en depsitos de minera-les alterados y en drenajes que se generan a travs de ellos (Abanto, M; 2008).

Las bacterias del gnero Acidophilium son clulas de forma de bacilos rectos, Gram-negativos, mesfilas, quimiorganotrofas obligadas que se inhiben a partir de determinadas concentraciones de materia orgnica. Estas bacterias pueden vivir a condiciones anaerbicas bajo el mecanismo de intercambio inico de los compuestos de hierro favoreciendo la lixiviacin de sulfuros de cobre.

En el gnero Acidithiobacillus se han estudiado las Aci-dithiobacillus Thiooxidans, Acidithiobacillus Caldus y Acidithiobacillus Ferroxidan; son caracterizadas por su evolucin favorable a temperaturas entre 28 y 35 C, uti-lizan CO2 como fuente de carbono y obtienen energa de la oxidacin del azufre, hierro y sulfuros metlicos.(Silverman, M. P., 1959 y Mena, J. et al., 2003).

La A. Ferrooxidans es la bacteria ms ampliamente estu-diada en procesos de biolixiviacin. Aislada por primera vez de drenajes cidos en minas de carbn (Colmer y Hinkle, 1947) y de hbitat comn en drenajes cidos de mina. Son bacterias no patgenas, Gram-negativas no forman esporulacin, tiene forma de bastn y tamao promedio de 0.5 a 0.6 m de ancho y 1 a 2 m de largo, con extre-mos redondeados (Panos 1996, Iglesias 1997, Rossi, 2001, Bosecker, 2001, Ho Lock 2004).

II. CARACTERIZACIN MORFOLGICA

La evaluacin morfolgica de un consorcio de bacterias aisladas para su clasificacin, est basada en observaciones microscpicas para determinar su forma, emparejamiento.

2.1. Identificacin por tincin Gram

Una coloracin diferencial ampliamente usada en bacterio-loga es la denominada tincin Gram y est en funcin a la adsorcin de su pared celular, a una coloracin de contraste (Gram positivas o negativas). Se utilizan colorantes para teir las clulas y aumentar as su contraste facilitando su observacin (Madigan, 2008). La respuesta celular de la bacteria a colorearse o no frente a un tinte orgnico espe-cfico. Un microorganismo Gram positivo debe presentar en su pared celular una capa de peptidoglicano externa a su membrana celular, a diferencia del Gram negativo, que tiene dos capas celulares entre las cuales se encuentra el peptidoglicano. La importancia del tipo de pared celular para la retencin o el escape de un colorante orgnico.

Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. basadas en la combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias. Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ci-das, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases (Segura D., 1998).

2.2. Mecanismo de tincin

1. Adicionar un colorante (cristal de violeta), este colorea a los microorganismos cargados negativamente por tratarse de un colorante bsico.

2. Aadir el mordiente (lugol) para fijar el cristal de violeta. En las clulas Gram negativas, los lpidos de la pared se disuelven por este tratamiento facilitando su expulsin.

3. Luego se agrega el decolorante que es un solvente orgnico (alcohol-acetona). El alcohol y/o acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos Gram positivos, tratados con mor-diente.

4. Finalmente, se adiciona un contracolor (safranina) buscando contrastar con el cristal de violeta.

Una vez terminada la tincin de Gram, las bacterias Gram positivas aparecen de color morado mientras que las Gram negativas presentan color rosado (Figura N. 1) estas di-ferencias en la tincin de Gram se debe a diferencias en la estructura de la pared celular.(Wistreich, G. A. et al., 1983).

2.3. Medios de cultivo

Se ha desarrollado una gran variedad y tipos de medios de cultivo especficos dependiendo de las necesidades de cada bacteria para proveer el ambiente bioqumico adecuado. Los medios de cultivo son empleados para el aislamien-to, mantenimiento de cultivos puros e identificacin de bacterias, de acuerdo a sus propiedades bioqumicas y fisiolgicas.

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Los medios de cultivo, 9k y T&K, son los medios ms em-pleados para el crecimiento de los Acidithiobacillus (Barrie, J., 2006). Muchos autores concuerdan en que para este tipo de bacterias Ferroxidans (Acidithiobacillus y Leptosirillum), la obtencin de cultivos a partir de minerales y soluciones pueden efectuarse usando el medio nutriente 9k lquido y slido. (lvarez, M. T., 2005).

Los medios lquidos son utilizados para el aislamiento y crecimiento de consorcios bacterianos, mientras que los medios slidos son preferentemente utilizados para el ais-lamiento de cepas puras (Arias, V. y col., 2012).

III. DISEO EXPERIMENTAL

1. Toma de muestras de drenajes cidos emitidos por labores mineras con alta presencia de metales disueltos y acidez.

2. Aislamiento y generacin del consorcio microbiano de organismos acidfilos mediante concentracin progre-siva en medio lquido.

3. Seleccin de la cepa bacteriana Acidithiobacillus Ferro-xidans en medio slido, por morfologa de las colonias

4. Siembra de las colonias aisladas como Acidithiobacillus Ferroxidans en medio lquido.

5. Caracterizacin morfolgica de la bacteria aislada mediante tincin Gram y observacin microscpica.

6. Caracterizacin del crecimiento bacteriano por ve-locidad de oxidacin y conteo manual de poblacin bacteriana frente a la variacin de pH y concentracin de sulfato de hierro.

IV. MATERIALES Y DESARROLLO EXPERIMENTAL

El laboratorio de Biometalrgia de la EAP de Ingeniera Metalrgica fue implementado con un mnimo de mate-riales y equipos bsicos, a fin de satisfacer las necesidades y cumplir con los objetivos de la investigacin.

Figura N. 1. Bacterias tipo Gram negativas, obtenidas a partir de soluciones cidas.

(a) (b) (c)

Figura N. 2. Equipos para laboratorio de Biometalgia (a) Autoclave de esterilizacin, (b) Incubadora, (c) Microscopio trinocular.

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4.1. Implementacin del laboratorio

El compromiso y esfuerzo de cada uno de los integrantes del grupo de investigacin se ha traducido en la implemen-tacin y funcionamiento del laboratorio de biometalrgia, logrando la adquisicin de los siguientes equipos: microsco-pio trinocular, incubadora, autoclave, biodigestor, agitador centrifugador, agitador-rotador, etc. (Ver Figura N. 2).

4.2. Toma de muestras

Las muestras fueron tomadas de las inmediaciones de las unidades mineras de Julcani y Recuperada, remitidas por el departamento de Medio Ambiente de la Ca. de Minas Buenaventura. En todas ellas se obtuvieron resultados favorables (Figura N. 3, 4 y 5).

Tabla N. 1. Aguas cidas de las unidades mineras de Julcani, Recuperada y Antapite, Huancavelica

MUESTRA pH T (C)

Bocamina abandonada, Rio Huachocolpa 4.7 12.2

Mina Esperanza, Nv 520 4.5 9.7

U. Julcani, NV 420 3.0 No medido

U. Julcani , NV 580 3.0 No medido

Ingreso PT Palcas 4.55 9.7

U. Antapite NV 3285 3.77 13.4

P. T. Antapite - NV 3240 3.3 17.4

Figura N. 3. Drenaje cido Huachocolpa. a) Bocamina abandonada de antigua labor minera; y b) Muestreo de efluente cido.

Figura N. 4. Drenaje cido de mina U. Antapite. a) Interior de Bocamina Nv. 3525; y b) Caja de captacin de efluentes cidos Nv. 3240.

(a)

(a)

(b)

(b)

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4.3. Aislamiento en medio lquido 9k modificado

El cultivo de bacterias se ha realizado en matraces de 250 ml usando como nutriente 100 ml de solucin 9k preparada a las condiciones requeridas de esterilizacin, posteriormente se adiciona 10 ml de solucin cida (agua cida). Ver Figura N. 6.

Las muestras se agitaron a 180 rpm, a temperatura ambien-te (20-25 C), provistas de tapones con algodn para facili-tar la oxigenacin y evitar el ingreso de microorganismos.

Figura N. 6. Solucin de medio lquido 9k modificado.

Figura N. 7. Solucin en proceso sembrada en proceso de madura-cin, adquiere coloracin rojiza como indicio de la oxidacin del ferroso a frrico por accin bacteriana.

Figura N. 8. Solucin final despus de 96 horas de inoculacin (luego de la 8.a resiembra) de matiz rojo xido intenso por la formacin del frrico y la colmatacin bacteriana del medio.

Cada etapa de resiembra concluye cuando el medio vire a color rojizo, debido a la oxidacin del hierro ferroso a frri-co. Transcurrido lo anterior, se toma una alcuota de 10 ml, esta vez de la solucin de siembra para adicionarlo nue-vamente a un medio lquido 9k fresco (Figuras N. 7 y 8).

El procedimiento se repite hasta obtener organismos completamente adaptados al medio y con la finalidad por reducir el tiempo de viraje al mnimo. En la Tabla N. 2 se presenta tiempos de respuesta de crecimiento frente a resiembras sucesivas.

Tabla N. 2. Resiembras sucesivas con tiempo de viraje como respuesta del crecimiento bacteriano.

Resiembra Tiempo de crecimiento (das)

Siembra 30

1. resiembra 20

2. resiembra 16

3. resiembra 10

4. Resiembra 8

5. Resiembra 6

6. Resiembra 4

7. Resiembra 4

8. Resiembra 4

El crecimiento bacteriano estuvo monitoreado por tincin Gram, observndose la morfologa y poblacin de un con-sorcio de bacterias.

Figura N. 5. Muestreo de aguas cidas Nv. 420 y 580, U. Julcani.

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4.4. Aislamiento en medio slido Obtencin de cepa bacteriana Acidithiobacillus Ferroxidans

El medio slido FeO es vertido sobre placas Petri a razn de 10 ml/un, y dejados gelificar por enfriamiento. Se adicion 0.1 ml de cepa bacteriana proveniente de cultivo lquido (resiembra 8) y diseminado mediante asa de siembra. Se coloca en una incubadora a 28 C por espacio de 05 a 10 das. La evaluacin del crecimiento es por observacin directa a partir del 5.to da (Figura N. 9).

Figura N. 9. Placa de Petri luego de 6 das de cultivo slido, los puntos rojos indican colonias de bacterias acidfilas. Acchilla.

Figura N. 10. Desarrollo de colonia bacteriana. a) Cultivo bacterial al 6.to da, caracterizado macroscpicamente, coloracin marrn rojizo. Muestra Mina Esperanza. b) cultivo bacterial al 6.to da caracterizado ma-croscpicamente, coloracinmarrn rojizo. Muestra ingreso PT placas.

La seleccin de las colonias de Acidithiobacillus Ferroxi-dans se hizo de manera visual, de acuerdo a caractersti-cas fsicas como color y morfologa (redondeada). Estas colonias fijadas sobre el gel son pequeas y de color marrn rojizo (Figura N. 10), debido a la formacin de hierro frrico. La colonia identificada es resembrada en medio lquido fresco, logrndose as el enriquecimiento de la cepa y la obtencin de las caractersticas intrnsecas del A. Thiooxidans. En ambos aislamientos se usa el hierro debido a que es un micronutriente esencial para las bacterias, ya que por sus propiedades redox acta como transportador de electrones y como cofactor de muchas enzimas.

Posteriormente una cepa pura ha sido enviada al labora-torio de biologa molecular de la UNMSM para la identifi-cacin y caracterizacin final mediante la tcnica biolgica molecular del PCR.

4.5. Identificacin morfolgica mediante tincin de Gram

Como resultado se obtiene bacterias Gram negativas de forma bacilar. Las resiembras en medio lquido y slido fueron monitoreadas mediante esta tcnica. Adems, se observaron hongos y esporas de diferente tamao y forma. (Ver Figura N. 11).

Figura N. 11. Visualizacin de esporas fngicas obtenidas en las primeras siembras en medio lquido. 1000 X.

Los tipos de espora fueron eliminndose mediante resiem-bras lquidas. La presencia de hongos fue observada hasta la 3.a siembra junto a bacterias de tipo Acidithiobacillus Ferroxidans (Figura N. 12).

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Figura N. 12. Identificacin morfolgica de hongos (crculo rojo), adaptados a las condiciones del 9k lquido junto con bacterias

(crculo verde). 1000 X.

La presencia de residuos de safranina y cristal violeta fue observada en las pruebas preliminares de tincin. Se debe cuidar el orden y el tiempo de contacto de cada reactivo para evitar interferencias visuales (Figura N. 13).

Figura N. 13. Bacterias y cristales de safranina residuales por excesivo tiempo de contacto con la muestra. Magnificacin: 1000 X.

La obtencin de la cepa pura (Figura N. 14) es carac-terizada por una gran poblacin bacteriana de igual morfologa. Esta fue contrastada con la morfologa y propiedades qumicas de la A. Ferroxidans, dando una similitud al 100%.

Figura N. 14. Tincin Gran y visualizacin microscpica (1000 X), muestra de agua cida de Mina Esperanza Nv. 520

V. CONCLUSIONES

1. El drenaje cido de las labores mineras estudiadas (Huancavelica), presenta acidez en un rango de 3.0 a 4.5 pH, con una cantidad importante de metales en solucin. Adems este medio contiene una serie de microorganismos entre los cuales se encuentra la cepa bacteriana de estudio.

2. La formulacin usada como medio de cultivo 9k modificado result satisfactorio para conseguir el ais-lamiento y el crecimiento de la cepa Acidithiobacillus Ferroxidans. Su empleo como medio de aislamiento est limitado al tipo de microorganismos acompaantes y su capacidad de adaptacin a nuevas condiciones lo que tambin aumenta con el nmero de resiembras.

3. El aislamiento de la bacteria en medio slido es favoreci-do por la identificacin macroscpica de las colonias de bacterias, hongos y esporas, permitiendo su extraccin manual y mejora el nivel de aislamiento. La cepa pura es capaz de obtenerse en no menos de 8 resiembras en medio lquido y slido, alternativamente.

4. El exceso de sulfato ferroso en el medio 9k modificado inhibe el crecimiento bacterial. El pH ideal esta alre-dedor de 1.8, a mayor grado de acidez se provoca la precipitacin de insolubles.

VI. AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento al Vicerrectorado de Investigacin, que a travs del Consejo Superior de Investigaciones contribuy econmicamente para la reali-zacin de los Proyectos de Estudios N. 111601011 y N. 121601071, tambin los integrantes del grupo de estudio en Biotecnologa Metalrgica, por su entrega en la realizacin de cada una de las tareas que implicaron la consecucin

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de los resultados. Asimismo, al Departamento de Medio Ambiente de la Compaa de Minas Buenaventura por proveernos muestras de aguas cidas.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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