anatomia e distribuição topoquímica de componentes em ...³p. esp.: formação... · anatomia e...

Anatomia e distribuição topoquímica de

componentes em materiais lignocelulósicos

André Ferraz

Departamento de Biotecnologia

Escola de Engenharia de Lorena

Universidade de São Paulo

Lorena, SP

Outline

- Why to study anatomy and topochemical distribution of

components in lignocellulosic materials?

- Wood and non-wood anatomy

- Cell wall structure: SEM and cell wall models

- Polysaccharide and lignin localization in wood cell walls

- Lignified cells do not permit enzyme infiltration

- Lignocellulosic materials with reduced lignin content are easier to

be hydrolyzed

1. Enzymatic hydrolysis of polysaccharides is supposed to

be a key step in cellulosic ethanol production

Why to study anatomy of lignocelullosic materials

and component topochemistry?

Is cellulose

free an

“clean” as

shown in this

figure?

2. Understanding cell wall structure is useful for any type

of application of lignocellulosic materials

Lignified cells are

arranged in a

complex matrix!

It is necessary to

study the anatomy of

lignocellulosic

materials Softwood

Madeira e gramíneas são similares em termos

anatômicos?

Onde está a cellulose e a hemicelulose que se

pretende utilizar (ou digerir com enzimas)?

A lignina ocorre em todos os tipos de células? A

concentração varia de acordo com a região

celular?

O que deveríamos poder responder........

Wood and non-wood anatomy Ref. básica: Geoffrey Daniel 2009 Wood and Fibre Morphology.. In:

Pulp and Paper Chemistry and Technology Vol 1: Wood Chemistry and

Wood Biotechnology. Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar

Henriksson

Cell formation and cell wall components

deposition during wood growth

C >> fusiform cell in the cambium

B >> bark cell

W >> xylem cell

Growing steps:

E: elongation

S: thickening of the cell wall

L: lignification of the cell wall

somente parede

primária (E)

deposição de parede

secundária (S)

Cell distribution in the xylem of conifer wood

(X) corte transversal, (T) corte tangencial e (R) corte radial.

(E) representa células juvenis - crescimento rápido e (L) células tardias -

crescimento lento. Na figura 3b, as setas indicam as células que compõem o raio

Tabela 1. Tipos de células em madeiras de coníferas

Longitudinais Transversais

A. Função de suporte ou condução ou ainda

ambos

1. Traqueídeos longitudinais

2. Traqueídeos fibrilares

A. Função de suporte ou condução ou ainda

ambos

1. Traqueídeos do raio

B. Função de secreção ou estocagem

1. Parênquima longitudinal

2. Células epiteliais

B. Função de secreção ou estocagem

1. Parênquima do raio

2. Células epiteliais

As células epiteliais secretam

resinas nos canais de resinas

que ocorrem em algumas

coníferas, principalmente as

espécies de Pinus

Cell distribution in a the xylem of angiosperm

wood

(X) corte transversal, (R) corte radial e (T) corte tangencial.

(E) indica os elementos de vaso que conectados formam um "tubo" denominado vaso

com a função essencial de conduzir líquidos

Tabela 2. Tipos de células em madeiras de folhosas

Longitudinais Transversais

A. Função de suporte ou condução ou ainda

ambos

1. Elementos de vasos

2. Fibras

3. Traqueídeos

A. Função de suporte ou condução ou ainda ambos

1. Não há

B. Função de estocagem

1. Parênquima longitudinal

B. Função de estocagem

1. Parênquima do raio

Dimensões

proporcionais em

células de

angiospermas

Conexão entre os elementos de vaso

Pontuações

na parede

celular

Anatomia em

gramíneas

Grass non-wood

Cana

Arroz

Abundance of different cell types

Cell wall structure: SEM and

cell wall models

Closer view of

cell wall

structure:

SEM and

cell wall models

Cellulose distribution

>>> Mapping lignin in wood cell walls by UV-

microspectrophotometry can help to direct our studies

Mapping lignin in wood cell walls with basis on the

Zeiss USMP-80 microscope

Lignin localization

in wood cell walls Koch G., Kleist G. (2001). Application of

scanning UV microspectrophotometry to

localise lignins and phenolic extractives in

plant cell walls. Holzforschung 55: 563-567.

Mapping lignin in wood cell walls by UV-

microspectrophotometry

Untreated

P. taeda

Delignified P. taeda

Partially delignified

P. taeda

Mendonça et al., Wood Sci Technol. 2004

Fibers from rind observed in the J&M microscope Example of a selected point (1 µm2)

to record the UV spectrum

400 x

1 µm-thick cut fixed in epoxi resin

Vessel from rind observed in J&M microscope

400 x

Parenchyma from rind observed in a J&M microscope

400 x

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 280 320 360 400

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

rd fiber 1rd fiber 2rd fiber 3rd fiber 4rd fiber 5media rd fiber

Spectral reproducibility obtained from several fibers

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

240 280 320 360 400

Comprimento de onda (nm)

Absro

bância

rd fiber 1

rd fiber 2

media rd fiber

Average spectrum from different cells in sugar cane

280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups

315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta

unsaturation >>> in grasses, correspond to ferulic and coumaric

acids

Células da região de "rind"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 260 280 300 320 340 360 380 400

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

media rd vessel

media rd fiber

media rd paren

Células da região do "pith"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 280 320 360 400

Comprimento de onda (nm)A

bsorb

ância

media pith vessel

media pith fiber

media pith paren

Spectrum shift as a consequence of ferulic and

coumaric acid (1:1 mixture) addition to a lignin

solution

He and Terashima, Holzforschung, 1991

Type % (w/w)

Ester 2.5

Ether and Ester 5.2

Total ferulic and coumaric

acids in sugar cane

Rind fibers

Pith fibers

280 nm

Similar lignin contents

Untreated sugar cane

3-D and Histograms

Example:

Fibers from

rind

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0

0,1

2

0,2

0

0,2

6

0,3

3

0,3

9

0,4

6

0,5

2

0,5

9

0,6

5

0,7

2

0,7

8

0,8

5

0,9

1

0,9

7

Valores de absorbância

Fre

qu

ên

cia

Data processing and average absorbance based on

weighed absorbance values

Amostra RD04, fibra de rind

abs frequencia freq normalizada freq xabs

0 0 0 0

0,12 850 0,061195104 0,007343

0,20 900 0,064794816 0,012959

0,26 1600 0,115190785 0,030468

0,33 2800 0,201583873 0,066321

0,39 1600 0,115190785 0,045328

0,46 1700 0,122390209 0,056055

0,52 1980 0,142548596 0,074482

0,59 1550 0,111591073 0,065504

0,65 600 0,043196544 0,028143

0,72 200 0,014398848 0,01031

0,78 80 0,005759539 0,004495

0,85 20 0,001439885 0,001217

0,91 5 0,000359971 0,000327

0,97 5 0,000359971 0,000351

soma 13890 1 0,403301

equivale a absorbância média

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0

0,1

2

0,2

0

0,2

6

0,3

3

0,3

9

0,4

6

0,5

2

0,5

9

0,6

5

0,7

2

0,7

8

0,8

5

0,9

1

0,9

7

Valores de absorbância

Fre

qu

ên

cia

Weighed average Absorbance = 0,40

Average Abs = Sum(Absi x freqi)/Sum freqi

Rind fibers

Pith fibers

280 nm

Similar lignin contents

Absm=0,40

Absm=0,39

Average spectrum from different cells in sugar cane

280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups

315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta

unsaturation >>> in grasses corresponds to ferulic and coumaric

acids

Células da região de "rind"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 260 280 300 320 340 360 380 400

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

media rd vessel

media rd fiber

media rd paren

Células da região do "pith"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 280 320 360 400

Comprimento de onda (nm)A

bsorb

ância

media pith vessel

media pith fiber

media pith paren

Rind fibers

Pith fibers

315 nm: indicative of

ferulic and coumaric

acids

Similar ferulic acid contents

Rind Vessel (large wall)

280 nm

Pith Vessel (large wall)

Lower lignin content

Average abs does not

make sense / different

cells in the image

Average spectrum from different cells in sugar cane

280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups

315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta

unsaturation >>> in grasses corresponds to ferulic and coumaric

acids

Células da região de "rind"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 260 280 300 320 340 360 380 400

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

media rd vessel

media rd fiber

media rd paren

Células da região do "pith"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 280 320 360 400

Comprimento de onda (nm)A

bsorb

ância

media pith vessel

media pith fiber

media pith paren

Rind Vessel (large wall)

Pith Vessel (large wall)

Lower ferulic acid content

315 nm

Rind Parenchyma

Pith Parenchyma

280 nm

Absm=0,31

Significantly lower

lignin content

Absm=0,18

Average spectrum from different cells in sugar cane

280 nm > aromatic ring substituted with oxygenated groups

315 nm > aromatic ring conjugated with alfa-carbonil or alfa-beta

unsaturation >>> in grasses corresponds to ferulic and coumaric

acids

Células da região de "rind"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 260 280 300 320 340 360 380 400

Comprimento de onda (nm)

Absorb

ância

media rd vessel

media rd fiber

media rd paren

Células da região do "pith"

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

240 280 320 360 400

Comprimento de onda (nm)A

bsorb

ância

media pith vessel

media pith fiber

media pith paren

Rind Parenchyma

Pith Parenchyma

lower Ferulic acid

content

315 nm

Hemicellulose localization in cell walls

• Immunohistochemistry

– Primary antibody: monoclonal antibody to (1-3,1-4)-ß-glucan (MOUSE IgG)

– Secondary antibody: Alexa Fluor 514

Fluorophore

Example o immunofluorescence localization of substitute xylans in fiber (F)

and vessel (V) cell walls of mature xylen from apen wood. LM11 denotes

the antibody used to bind to substituted xylan structures. The bar size

corresponds to 10 m. Note that the cell corners and middle lamella were

poorly labeled whereas secondary walls were strongly labeled with the LM

11 antibody indicating the regions where substitute xylan predominates in

the mature xylem (Reproduced from Kim et al. 2012)

Xylan localization

Xiloglucanas

(1→3),(1→4)-β-D-GLUCANAS

Glucurono-

arabinoxilana

Hemiceluloses

Típicas em

paredes

secundárias

Típicas em

paredes

primárias

Típicas em

paredes

primárias

9/9/2014 54

Distribuição de beta-glucanas

Híbrido 58 - Aumento: 50x

Medula

Interface Córtex

• Distribuição de beta-glucanas

– Feixe vascular – Híbrido 58 – medula (aumento 200x)

Imunofluorescência - Híbrido 58 - Medula

Anticorpo primário: LM10 (Xilana) e LM11 (Arabinoxilana)

Secundário: Alexa Fluor 568. TX2

Brilho e contraste normalizado

- Controles LM10 LM11

100x

200x

- Controles LM10 LM11

100x

200x

Imunofluorescência - Híbrido 58 - Interface

Anticorpo primário: LM10 (Xilana) e LM11 (Arabinoxilana)

Secundário: Alexa Fluor 568. TX2

Brilho e contraste normalizado

- Controles LM10 LM11

100x

200x

Imunofluorescência - Híbrido 58 - Córtex

Anticorpo primário: LM10 (Xilana) e LM11 (Arabinoxilana)

Secundário: Alexa Fluor 568. TX2

Brilho e contraste normalizado