diagnóstico laboratorial vih

VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (V.I.H.)

DIAGNOSTICO LABORATORIAL

PRUEBAS LABORATORIALES

• Diagnóstico de la Infección del VIH– Screening (tamizaje)– Confirmatorio

• Pruebas complementarias para el seguimiento de paciente con la infección– Recuento de de Linfocitos CD4/CD8– Carga Viral

• Pruebas de Rutina– Hemograma– Orina– Baciloscopia– Parasitológico– Otros

leucopenia

linfopenia

trombocitopenia

VSG elevada

DIAGNOSTICO DE LA INFECCION POR EL VIH

METODOS• METODOS DIRECTOS

- Aislamiento viral: Cultivo viral H9

- PCR : Detección de fracciones antigénicas

del virus ó genoma viral

• METODOS INDIRECTOS

- Detectan la presencia de anticuerpos específicos contra el VIH por medio de técnicas serológicas.

* TEST RAPIDOS * IFI * ELISA

* WESTERN BLOT * LIA

La técnica mas utilizada actualmente para el screening serológico es el test de ELISA y en menor proporción los Test Rápidos (OMS)

TAMIZAJE SEROLOGICOELISA

Negativo Positivo/Indeterminado Repetidamente

Correr una nueva muestra

Repetidamente POSITIVO

Etapa

(1)

WESTERN BLOT

Negativo Indeterminado Positivo

Correr una nueva muestra 30 a 60 días después

Repetir etapas 1 y 2

Etapa

(2)

PRUEBAS RAPIDAS

Buena sensibilidad

Económicas y rápidas

Baja Especificidad

CULTIVOS CULTIVOS VIRALES VIRALES

Buena especificidadLentas, baja sensibilidad

Complicado. Costo

ELISAELISA

Buena Sensibilidad y Especificidad

Sencillo y rápido

Periodo de Ventana

Costo

WESTERN WESTERN BLOTBLOT

Confirmatorio, alta Sensibilidad y Especificidad.

Seguro

Elevado Costo

Contaminación

Especificidad

Costo

GenotipificaciónPeriodo de Ventana PCRPCR

TEST TEST VENTAJAS VENTAJAS DESVENTAJAS DESVENTAJAS

PRUEBA RAPIDA PARA VIH

(INMUNOCROMATOGRAFIA)

Gaby Fabiola Mamani V.

BIOQUIMICA

PRUEBA RAPIDA PARA VIH (INMUNOCROMATOGRAFIA)• ObjetivoObjetivo

“ Detectar anticuerpos anti-VIH ½ y no componentes virales ”• Fundamento

- - Método cualitativo indirecto basado en

el principio de adsorción selectiva de

inmunoglobulinas.

Prueba rápida para VIH

Prueba rápida para VIH

Prueba rápida para VIH

8. Coloque la muestra de sangre completa colectada en el capilar en la

superficie absorbente, y espere un minuto

Prueba rápida para VIH

Prueba in Vitro

Tarjetas de ensayo recubiertas de antígeno recombinante del VIH 1 y VIH 2 y de

péptidos sintéticos.

Laboratorios Abbott

ENZIMOINMUNOENSAYO

(ELISA)

TEST DE ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA)

• ObjetivoObjetivo

“ Detectar anticuerpos anti-VIH ½ y no componentes virales ”• Fundamento

- - Método enzimático, cualitativo indirecto

basado en el principio de “Sandwich” en un

solo paso

FUNDAMENTO

Antígenos VIH1/2

Anticuerpos Suero o Plasma

ConjugadoAntígenos

HIV1/2 marcado con Enzima HPR

ConjugadoAntígenos

HIV1/2 marcado con Enzima HPR

Sustrato(Sustrato

Enzimático + Cromógeno)

H2SO4

POSITIVO Presencia de anticuerpos HIV

1/2 (color amarillo)

PLACA DE ELISAPLACA DE ELISANEGATIVO Ausencia de Anticuerpos

para VIH1/2 (Sin color)

L EC T OR D E E

L I S A

Se lee a 450/630 nm

Lectura de la reacción final

INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBACALCULOS (Organón Teknika)

Validación del Test

* CN < 0.250 (Control Negativo)

* CP1 - CNx > 0.400 (Control Positivo)

* El CP2 - CNx > 0.400

* El Cutt Off = CNx + 0.100 = valor “x”

Valores mayores al Cutt Off, son Positivos Valores menores al Cutt Off, son Negativos Valores +/- 10% del Cutt Off, Indeterminados

WESTERN BLOT

(TEST CONFIRMATORIO)

TEST DE WESTERN BLOT

• Objetivo- Detectar anticuerpos específicos

contra el VIH1/2

• Fundamento• Test Inmunolineal o ELISA en banda, que detecta anticuerpos

• Lisado viral de células infectadas, sometidos a electroforésis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas de nitrocelulosa

• POSITIVO- Si dos bandas presentan intensidad >1+ en relación

al control , - Una banda de envoltura y la p24- Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17

para HIV1- Proteínas gp105 y gp36 para HIV2

Criterios de interpretación

gp120 gp41 p31 p24 p17

3+ 1+ +/-

Control

gp105 gp36

• INDETERMINADO- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/-- Si una banda presente intensidad <1+ y el resto son negativos en relación al control

Criterios de interpretación

• NEGATIVO• Si todas las bandas presentan valoración <+/-• Ausencia de proteínas

3+ 1+ +/-

Control

3+ 1+ +/-

Control Gp120 p24

PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA EL SEGUIMIENTO DE PARA EL SEGUIMIENTO DE

PACIENTES POSITIVOSPACIENTES POSITIVOS

PRUEBAS COMPLEMENTARIAS

• Test para el seguimiento de pacientes VIH Positivos

– Recuento de Linfocitos CD4/CD8

– Carga Viral

RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8

• Citometría de flujo– Tamaño celular – Complejidad interna o gránulos internos– Intensidad relativa de la Fluorescencia

• ELISA (Enzimoinmunoensayo)

• Inmunofluorescencia (IFI)

CITOMETRO DE FLUJO EPICS XL PECKMAN COULTER

Fundamento del Citómetro de Flujo

• El Recuento de CD4/CD8, tiene como finalidad de evaluar el estado inmunológico de la persona infectada

• Valores de referencia:– Células CD4+ varían entre 600 a 1500 células

por mm3 de sangre– Células CD8+ varia entre 300 a 800 células

por mm3 de sangre– Relación de células CD4+ vs. CD8+ es de 2:1

PARAMETROS DEL RECUENTO DE CELULAS CD4/CD8

– Superiores a 500 celulas CD4+ (Buen estado de salud)– Entre 200 y 500 celulas CD4+

• Incrementa riesgo de Herpes, Aftas, Infecciones en piel, Infecciones pulmonares, TB

• Enfermedades Oportunistas Pneumonia por Pneumocistis Carini, Citomegalovirus

– Entre 50 y 200 células CD4+• Se incrementa el riesgo por PCP y otras enfermedades oportunistas• Se recomienda ya el tratamiento preventivo• Inferiores a 100, considerar el tratamiento preventivo para

enfermedades oportunistas e infecciones masivas por hongos.

– Inferiores a 50 células CD4+• Se incrementa riesgo de enfermedades oportunistas• Continuar con terapias preventivas

VALORES ABSOLUTOS

CARGA VIRALCARGA VIRAL

DETECCIÓN DE RNA VIRAL

• AMPLICOR HIV MONITORTM Test

(Roche Diagnostic Systems)

• QuantiplexTM HIV RNA Assay

(Chiron Corporation)

• NASBA HIV-1 RNA QT

(Organon Teknika)

CARGA VIRALCARGA VIRAL

• La carga viral nos indica la actividad del virus

• Herramientas

– Niveles de RNA Viral

– Nivel de riesgo del desarrollo de la enfermedad

– Reacción a la terapia antirretroviral:

• Iniciar, modificar o incrementar medicamentos

– Si la droga o medicamento esta dando o no resultado y cuando empieza a perder su efectividad

CARGA VIRALCARGA VIRAL

• Muestra de sangre (plasma sanguíneo)• Múltiples copias del virus presente en la

muestra• Proceso matemático se da el número estimado

de las partículas virales presentes en la muestra(200 –1.000.000 copias/ml)

• Margen de error del 20%• Utilizar el mismo laboratorio y examen para el

seguimiento y los cambios de la carga viral

CARGA VIRALCARGA VIRAL

• Los niveles altos de RNA Viral se correlacionan con bajos recuentos de Linfocitos CD4+

• Niveles superiores a 100.000 copias/ml propensas a desarrollar la enfermedad SIDA

• Niveles inferiores a 10.000 copias/ml disminuye el riesgo a la enfermedad

CARGA VIRALCARGA VIRAL

CARGA VIRALCARGA VIRAL

METODO AMPLICOR (Roche) RT-PCR

NASBA HIV-1 RNA QT Amplificación isotérmica de RNA

QUANTIPLEX HIV-1 RNA

Rango de detección

200-750.000 400-10.000.000 500-800.000

Nivel de detección mínimo (Sensibilidad copias/ml)

200 400 240

Volumen de plasma

200 ul 1000 ul 2000 ul

DIAGNOSTICO

PEDIATRICO

• La presencia de IgG materna en el recién nacido dificulta el diagnóstico.

• Seguimiento durante 15 a 18 meses con WB en forma seriada.

• Detección de antígeno, aislamiento viral y la PCR son de utilida, pero debe ser evaluado con:– Clínico

– Inmunológico

Factores que pueden influir en los resultados:

– Laboratorio– Reactivos– Tiempo de procesamiento – Horario de la toma de muestra– Presencia de infecciones– Falta de sueño– Estrés– Otros factores biológicos

• Para el diagnóstico de la Infección por el VIH– PRUEBA RAPIDA, nos permite realizar el tamizaje

serológico, mediante la detección de anticuerpos Anti -VIH1/2, con buena sensibilidad.

– ELISA, nos permite detectar los anticuerpos Anti-VIH1/2, con una alta sensibilidad y especificidad

– Es importante realizar el Test Confirmatorio de Western Blot, para dar un resultado final

CONCLUSIONES

• Para el seguimiento de pacientes con la infección, es importante:– El Recuento de Linfocitos CD4/CD8, debe ir paralelo a la

prueba Carga Viral– Evaluar el estado clínico del paciente

• Realizar seguimiento al paciente VIH positivo, en coordinación de:– Médico-Clínico, – Laboratorio y– Consejería– Adherencia permanente

CONCLUSIONES

PREVENCIÓN

• Promoción a todo nivel social del uso del preservativo

• Tratamiento y prevención de otras enfermedades de transmisión sexual

• Programa de reparto de jeringas para drogadictos

BIOSEGURIDAD

TODO MATERIAL BIOLOGICO DEBE SER

CONSIDERADO Y MANIPULADO COMO POTENCIALMENTE

INFECCIOSO