testi utili genetica molecolare strachan t., read a.p genetica umana molecolare (utet)

TESTI UTILI

GENETICA MOLECOLARE•Strachan T., Read A.P Genetica Umana Molecolare (UTET)

(Human Molecular Genetics 3, Gardland Science)

GENETICA STATISTICA•Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage. Johns Hopkins University Press, Baltimore

•Sham P (1997) Statistics in human genetics. Arnold; Wiley, London, New York

VARIABILITA’ DEL GENOMA E MUTAZIONI•Replicazione del DNA -> errori -> meccanismi di riparo (non effic. al 100%)Tasso di mutazione per nucleotide nell’ordine di 1/109

•Agenti esterni (mutageni, radiazioni etc)

MUTAZIONIcambiamenti stabili (ereditabili) nella sequenza del DNASe una mutazione insorge in una porzione del DNA codificante o funzionalmente importante può avere un effetto sul fenotipo.

variabilità -> evoluzioneMutazioni patogeniche -> malattie genetiche

Possono insorgere a livello di:• cellule somatiche (-> cancro, invecchiamento)• cellule germinali

POLIMORFISMIpresenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche, con una frequenza significativamente alta (> 1%)

MUTAZIONI SEMPLICI (puntiformi)causate per lo più da errori spontanei nella replicazione del DNA e riparo

EFFETTI PATOGENI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI

Nella regione codificante di un gene

Sostituzioni sinonime (silenti) La > parte sono neutrali. Talvolta possono creare degli errori di splicingSostituzioni non sinonime (missense) Spesso deleterie. Nonsense: quasi sempre deleterie.

proteina troncatamRNA instabile (nonsense-mediated mRNA decay)exon skipping (raro)

Inserzioni/delezioni -> Framshift -> in genere introducono un codone di stop

Introni• mutazioni di splicing

• assenza di splicing dell’introne• uso di un sito di splicing illegittimo (criptico)• exon skipping

Mutaz nel 5’ o 3’ non tradottoes: nel segnale di poliadenilazione AAUAA siti target di microRNA

Mutazioni in regioni regolatorie

Riarrangiamenti mediati dalla presenza di SEQUENZE RIPETUTE

• Slipped strand mispairing

• Crossing-over ineguale

SEQUENZE RIPETUTE

DNA CODIFICANTE:•Famiglie multigeniche•Motivi strutturali conservati•Ripetizioni in tandem di geni per rRNA e istoni

DNA NON CODIFICANTE•In tandem•Sequenze ripetute intersperse

1) Famiglie geniche• duplicazione e divergenza da un gene ancestralees. geni globinici• Famiglie di geni con regioni conservate che codificano per domini funzionaliEs fattori di trascrizione (Homeobox, Zinc-finger etc)

PSEUDOGENI copie non funzionaliNon-processati (espressi/non espressi)Processati

2) Sequenze ripetute extrageniche•Ripetizioni in tandem

1)Altamente ripetuto -> DNA satellite2) Polimorfiche:minisatellitimicrosatelliti

•Seq ripetute intersperse

Alu

DNA SATELLITE

LINEs (L1)

LINEs> 5 kb104

Kpn o L1- 6.1kb, molte sono forme troncate al 5’2 ORF, ORF1 = RNA binding prot, ORF2 = RT e endonucleasi

SINEs <500 bp105

Alu - 2 ripetizioni di una seq di ~120 bp~ ogni 4 kbomologia con 7SL RNA-> propagate tramite retrotrasposizione

Propagazione delle LINEs e SINEs tramite retrotrasposizione

1)SLIPPED STRAND MISPAIRINGAppaiamento sfasato di corte sequenze ripetute in tandemCausa piccole delezioni/inserzioni (che possono essere patogene o generare polimorfismi STR )

Crossing-over ineguale (NAHR: non-allelic homologous recombination)

Direct repeats :deletion and/or duplication

Inverted repeats :inversion

Segmental duplicationsLCR (low copy repeat)Sequenziamento del genoma -> presenza di duplicazioni di sequenze 10-400Kb, con alta similarità (>95-97%).Rappresentano almeno il 5% genoma Inter-cromosomiche (soprattutto in reg pericentrom e subtelomeriche Intra-cromosomiche (cromosoma specifiche)

Causa di riarrangiamenti genomici associati a malattie geneticheSmith Magenis Syndrome, Charcot-Marie-Tooth (crom 17) Prader-Willi/Angelman Syndrome (crom 15).

•Regioni pericentromeriche e subtelomeriche contengono alto num di segmental duplications

1) Membri di famiglie geniche/peudogeni ripetuti in tandemEs: Talassemia alfa-globina Daltonismo pigmenti rosso/verde dei coni

2) Sequenze ripetute che fiancheggiano geniCharcot Marie Tooth (CMT-1A) PMP22Ittiosi X-linked STSSmith MagenisWilliams Syndrome

3) Sequenze ripetute inverseEmofilia A Fattore VIII

Genomic DisordersPatologie che derivano da riarrangiamenti di una regione di DNA, causati da ricombinazione omologa ineguale tra LCR-> delezione o duplicazione di 1 o + geni sensibili al dosaggio, o inattivazione di uno specifico gene

Polimorfismi•Presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche di un gene o una determinata sequenza di DNA•Allele più raro frequenza maggiore 1%•La > parte di polimorfismi sono neutrali, non hanno un effetto sul fenotipo

TIPI DI POLIMORFISMI PIU’ COMUNI•Cambiamenti di una singola base (SNPs)•Inserzioni o delezioni di piccole dimensioni•Variazione nel numero di sequenze ripetute in tandem •microsatelliti (Short Tandem Repeats)•minisatelliti (VNTR)

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

•Differenze di singola base•Biallelici•Più frequenti varianti di DNA (circa 1/300 bp) •Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in larga scala•Basso tasso di mutazione in confronto ai microsatelliti

VariantiSeq DNA

Variabilità fenotipica

Predisposizione a malattieCaratteristiche fisicheRisposta a influenze ambientaliRisposta a farmaci

DbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

SNP variation in humansNumber of SNPs in dbSNP

~ 10 million common SNPs in the human

genome

double hit

validated by genotyping

total non-redundant SNPs

Nature 437:1299 (2005)

•Microsatelliti (STR Short Tandem Repeats)

Classe di sequenze ripetute, costituite da ripetizioni in tandem di 2-3-4 pbFiancheggiate da sequenze uniche

Es: Ripetiz di dinucleotidi CA/GT CT/AG

Molto polimorfici e uniformemente distribuiti nel genoma (1/50-100 Kb)-> utili come marcatori genetici •Minisatelliti •ripetizioni in tandem di una corta sequenza (10-100 bp)•distribuzione non omogenea (vicino ai telomeri)•sequenza comune (core) GGGCAGGAXG + seq specifiche

Molto polimorfici : utili come marcatori per mappe genetiche ma distribuz non omogeneaUtilizzati in passato per DNA FINGERPRINTING(descritti da Jeffreys)

Genetic variation in the human genome

Tecniche citogenetiche -> anomalie cromosomiche (> 3 Mb)Tecniche molecolari (sequenziamento) -> varianti del DNA di piccole dimensioni (< 1-10 Kb)

Nuove tecnologie hanno recentemente permesso di individuare varianti del DNA di dimensioni intermedie:

Varianti strutturali submicroscopiche•Copy Number Variants (CNVs) (inserzioni, duplicazioni, delezioni)•Inversioni

ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization)

Rivela le differenze tra 2 genomiArrays: BAC

Oligonucleotidi (60-100 bp)

ROMA (representational oligonuclotide microarray analysis)

AGTGGGTCGAGCTGATCGATCGGTCG

AGTGGGTCGAGCCGATCGATCGGTCG

AGTGGGTCGAGCAGATCGATCGGTCG

AGTGGGTCGAGCGGATCGATCGGTCG

Allele AAllele B PM-A

MM-APM-BMM-B

mismatch

Affymetrix SNP arraysAB BB AA

mismatch

analisi su 270 individui 1400 CNVs 12% (360 Mb) genoma

Effetti delle varianti strutturali sul fenotipo:• dosaggio genico• position effect

•285 geni in OMIM morbid map -> overlap con CNVs•Alta densità di CNVs vicino ai breakpoint di genomic disorders•Difficoltà nel risolvere le correlazioni genotipo-fenotipo

Database of genomic variantshttp://projects.tcag.ca/variation