vorlesungimmunanalytik end.ppt [kompatibilitätsmodus] · pdf filecyanobacteria produce...

Immunanalytik

Thomas Scheper TCITCITCI Institut fürTechnische Chemie

P bl P l kl l M kl l

Problem: Polyklonal zu Monoklonal

Assay: heterogen – homogeny g g

Development of lateral flow assays with Sartorius and Dr Noack A G

Development of lateral flow assays with Sartorius and Dr. Noack A.G.

What is a Rapid Test?What is a Rapid Test?

Relies on the natural function of antibodies Relies on the natural function of antibodies (Biosensor)(Biosensor)

Simple to useSimple to useSimple to useSimple to use

Test resultTest result within a few minuteswithin a few minutes

No (or simple) instrumentation requiredNo (or simple) instrumentation required

Inexpensive Inexpensive productionproduction

Sensitivities similar to or greater than ELISASensitivities similar to or greater than ELISASensitivities similar to or greater than ELISA Sensitivities similar to or greater than ELISA

Detection level in the ng/mL range (we need pg/ml!!)Detection level in the ng/mL range (we need pg/ml!!)

g g ( g )g g ( g )

Components of a Rapid TestComponents of a Rapid Test

Capture (test) line Control lineCapture (test) line Co t o e

S l P dMembrane Absorbent Pad

Sample PadWith labelled AK

Conjugate PadCo jugate ad

Thomas Scheper TCITCITCI Institut fürTechnische ChemieAdhesive

Plastic backing

Application for Rapid TestsApplication for Rapid Testspp ppp p

Environmental Food Testing Military VeterinaryEnvironmental Food Testing Military Veterinary

Water Testing GM Foods Germ Warfare Feline Cancer

Pesticides

Dust Mite

E-Coli

Salmonella

Explosives

Chemical

Canine HeartDust Mite Testing

Salmonella Chemical Warfare

Canine Heart Worm

Disease STD‘s Fertility Drugs of Abuse

Malaria Chlamydia Pregnancy Cocainea a a

Hepatitis B

T b l i

C a yd a

Syphilis

eg a cy

Coca e

Cannabis

E tThomas Scheper TCITCITCI Institut für

Technische Chemie

Tuberculosis HIV FSH Ecstasy

Botulinum Neurotoxin

• Produced by the sporeforming, anaerobic Clostridium BotulinumClostridium Botulinum

• 7 immunologically distinct forms (indicated with letters from A-G) are acknowledged

• Most poisonous substance known (mouse• Most poisonous substance known (mouse intraperitoneal LD50 (BoNT/D) of 0.4 ng/kg)

• Consists of a 50-kDa light (L) chain and a 100-kDa heavy (H) chain linked by a disulfide bond

• The toxin causes flaccid muscle paralysis

Food Monitoring

Fodder MonitoringFodder Monitoring

BiBioweapon

Medical application of Botulinum Neurotoxin

• Strabismus

• Migraine headacheMigraine headache

• Spasticity

• Various dystonias

• Stroke

• Plastic surgeryPlastic surgery

AimsAims

D l t fD l t f

Development of an Development of an immunochromatographic assay for immunochromatographic assay for g p yg p ybotulinum toxin Type Dbotulinum toxin Type D

Sensitivity Sensitivity << 50 pg/mL 50 pg/mL

E l ti f th t t ith i ti t tE l ti f th t t ith i ti t tEvaluation of the test with existing test Evaluation of the test with existing test methods.methods.

Lateral Flow AssayLateral Flow Assay-- Sandwich assay Sandwich assay (multi epitopes)(multi epitopes)

-- Inhibition assay Inhibition assay (single epitope)(single epitope)

-- Competitive assay Competitive assay (single epitope)(single epitope)

-- Serological assay Serological assay (antibody detection)(antibody detection)

Botulinum Toxin: Two differentBotulinum Toxin: Two differentBotulinum Toxin: Two different Botulinum Toxin: Two different antibodies are needed to assure antibodies are needed to assure

specificityspecificityThomas Scheper TCITCITCI Institut für

Technische Chemie

specificityspecificity

Sandwich assaySandwich assay

P l l l Ab Detector

Polyclonal Ab Detector reagent

Botulinum Toxin Type D Analyte

Monoclonal Ab Capture Monoclonal Ab Reagent

Detector Reagent

Mobile sandwich Analytecomplex

Specification Reagent

CaptureSecondary Ab

n Reagent

Capture Reagent

Secondary Ab

Rapid TestRapid Test0.5 cm

Absorbent Pad

ap d estap d est

• cellulose paper wick

0.5 cm Rapid TestRapid TestMembrane

ap d estap d estMembrane

• Nitrocellulose Membrane (Unisart CN 200, Sartorius AG)

Capture (test) zoneCapture (test) zone• Coating of 1.25 mg/mL goat anti g g g

mouse IgG or streptavidine

• Dispensing volume 0 8 µl/cm• Dispensing volume 0.8 µl/cm.

• The membrane was dried 2h at 30 °C

Rapid TestRapid Test0.5 cm ap d estap d est

Sample Pad

Gl fib t i (R 2040 R• Glass fibre strips (Reemay 2040, Reemay Ltd.)

• Impregnation with 20 mM borate buffer + Sucrose+ Protein + Tenside

BoNT Type D ImmunoassayBoNT Type D ImmunoassayPolyclonal B NT A tib dBoNT Antibody(Chicken)Labelled

BoNT Type Ddifferent EpitopesLabelled

different Epitopes

Biotinylated Polyclonal

MonoclonalAnti BoNT Antibody(Mouse)Biotinylated Polyclonal

BoNT Antibody(Goat)

(Mouse)

BoNT Type D ImmunoassayBoNT Type D Immunoassayyp yyp y

Chicken IgY Anti-Chicken

BoNT IgY

Mouse IgG

4 hours 28 Min

ProcedureProcedure

P ti f t d d t ti• Preparation of standard concentration range + polyclonal Ab Detector Reagent+ monoclonal Ab Specification Reagent

• Sample pre treatment (Incubation) (4 h at 37°C)• Sample pre-treatment (Incubation) (4 h at 37 C)

• 150 µL of sample (18 min)

• 100 µL washing buffer (15 min)

• Total test time 4.5 h

• label: latex black carbonThomas Scheper TCITCITCI Institut für

Technische Chemie

• label: latex, black carbon

SamplesSamplesSa p esSa p es

5 pg/mL50 pg/mL0,5 ng/mL5 ng/mL50 ng/mL Negative5 pg/mL50 pg/mL0 5 ng/mL5 ng/mL50 ng/mL Negative5 pg/mL50 pg/mL0.5 ng/mL5 ng/mL50 ng/mL Negative

ResultsResultsDevelopment of an immunochromatographic Development of an immunochromatographic

esu tsesu tsp g pp g p

assay (latex or black carbon)assay (latex or black carbon)

S i i iS i i i 0 / L b / l!!0 / L b / l!!Sensitivity Sensitivity << 50 ng/mL but not pg/ml!! 50 ng/mL but not pg/ml!!

Improved test time (4 5 h)Improved test time (4 5 h)Improved test time (4.5 h)Improved test time (4.5 h)

Quantitative analysis in principle possibleQuantitative analysis in principle possible

with image analysis (linear behavior) with image analysis (linear behavior)

⇒⇒ Enhancement necessaryEnhancement necessary

Use of gold labelled antibodies(detector antibodies)

SamplesSamplesSamplesSamples

5 pg/mL50 pg/mL0,5 ng/mL5 ng/mL50 ng/mL Negative5 pg/mL50 pg/mL0 5 ng/mL5 ng/mL50 ng/mL Negative5 pg/mL50 pg/mL0.5 ng/mL5 ng/mL50 ng/mL Negative

Polyclonal B NT A tib dBoNT Antibody(Chicken) BoNT Type D

different Epitopes

Biotinylated Polyclonal

MonoclonalAnti BoNT Antibody(Mouse)Biotinylated Polyclonal

BoNT Antibody(Goat)

(Mouse)

BoNT Type D Immunoassay IIBoNT Type D Immunoassay II

Goat IgGB gB

Mouse IgG

Outlook: SamplesOutlook: Samples

500 ng/mL 5 ng/mL 50 pg/mL

50 ng/mL

0,5 ng/mL negative

Algae toxin microcystineAlgae toxin microcystineCyanobacteria produce highly potent toxins,Cyanobacteria produce highly potent toxins, e.g. microcystins (hepatotoxic) or anatoxins (neurotoxic).

Mi i li ib lMicrocystins are cyclic nonribosomal peptides.

Microcystins consist of several uncommon non-proteinogenic amino acids:

- Dehydroalanine derivatives

- Special b-amino acid ADDA ((all S all E) 3 Amino 9 methoxy 2 6 8((all-S,all-E)-3-Amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-diene acid)

Detection of microcystineDetection of microcystine

P blProblem:

- Accumulation of microcystins in theAccumulation of microcystins in thefood chain

- Toxicity for plants and animalsincluding humansg

- Critical microcystine concentration inliquid samples

Immobilized secondary antibody (testline)

Immobilized antigen forproducing a test signalAnalyte

Gold/Latex-labelled antibody

(testline)

Membrane

Conjugate fleecePlastic component

Sample adsorption fleece

Adsorption fleece

Competitive test formatep

Signal intensity is anti-proportional in relation to the antigen concentration

to the antigen concentration

FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting

488 nm laser FSC Detector

Deflection

Detector

Deflection plate

Sorted scells

Correlation between the amount of surface IgG1and secretion rate.

Cells covered with a surface affinity matrix, which captures the secreted product with antibodies linked to cell surface proteins via biotin-avidin bridges.

Protein analysis via immunoreactionsProtein analysis via immunoreactions

1 immobilization of antibodies 2 sample injection1. immobilization of antibodies 2. sample injection

3 hi 4 l ti3. washing 4. elution

antibody cartridge antigen, (sample) byproducts

y g g p yp

system control

sample

system controldata processing

equilibration buffer

elution buffercartridge fluorescence

detector

pump injection valve selector

unit s

fluo r 2

AT III concentration [µg/ml]

080 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

withoutBSA addition

addition of1mg/ml BSA

addition of10 mg/ml BSA

MV+15%

MV-15%Inte

0 200 400 600 800

Peakno.0 200 400 600 800

MV-15%

Peakno.(mean value 99,97; standard deviation 5.97; cv=6.04%) (mean value 99,79; standard deviation 4.11; cv=4.12%)

60units

30entr

TIAELISA

00 40 80 120 160 200 240 280

Cultivation time [h]

Aptamere

Was sind Aptamere ?Was sind Aptamere ?

Aus dem Griechischen „haptein“ : t bi d “ h ft “„an etwas binden“, „haften“

Oligonukleotide (DNA oder RNA) mit der FähigkeitOligonukleotide (DNA oder RNA) mit der Fähigkeit, beinahe jedes Zielmolekül mit hoher

Bindungsstärke und hoher Spezifität erkennen und g pbinden zu können

F kti i i d l k lF kti i i d l k lFunktionsprinzip der molekularen Funktionsprinzip der molekularen ErkennungErkennungErkennungErkennung

nach Schlüsselnach Schlüssel--SchlossSchloss--Prinzip/ Prinzip/ InducedInduced--fitfit--MechanismusMechanismus

Bildung eines AptamerBildung eines Aptamer--ZielmolekülZielmolekül--KomplexesKomplexes

h h Affi ität d S ifität üb d Zi l l külh h Affi ität d S ifität üb d Zi l l külhohe Affinität und Spezifität gegenüber dem Zielmolekülhohe Affinität und Spezifität gegenüber dem Zielmolekül

Inhibierung der biologischen Aktivität des ZielmolekülsInhibierung der biologischen Aktivität des Zielmoleküls

(www.ufz.de)

SELEX SELEX -- KreisprozessKreisprozessI k b ti & Bi dI k b ti & Bi dInkubation & BindungInkubation & Bindung

WaschenWaschenEl tiEl tiElutionElutionAmplifikationAmplifikationR i iR i iReinigungReinigung

(Proske et al. 2005)

Vorteile von Aptameren gegenüberVorteile von Aptameren gegenüberVorteile von Aptameren gegenüber Vorteile von Aptameren gegenüber AntikörpernAntikörpernpp

Identifikation durch automatisierbaren Identifikation durch automatisierbaren in vitroin vitro ProzessProzessbenötigt keine Tiere oder Zelllinienbenötigt keine Tiere oder Zelllinienmit gewünschte Eigenschaften, unter definierten mit gewünschte Eigenschaften, unter definierten Selektionsbedingungen (z B pHSelektionsbedingungen (z B pH Wert) herstellbarWert) herstellbarSelektionsbedingungen (z.B. pHSelektionsbedingungen (z.B. pH--Wert) herstellbarWert) herstellbargegen gering immunogene Zielmolekülegegen gering immunogene Zielmoleküleleicht reproduzierbar, geringe Batchleicht reproduzierbar, geringe Batch--to Batch Variationto Batch Variationleicht reproduzierbar, geringe Batchleicht reproduzierbar, geringe Batch to Batch Variationto Batch Variationpharmakokinetischen Parameter veränderbarpharmakokinetischen Parameter veränderbarKopplung mit Reportermolekülen & Immobilisierung Kopplung mit Reportermolekülen & Immobilisierung dede-- und renaturierbarund renaturierbarkein Beweis für Immunogenitätkein Beweis für Immunogenität & Toxizität & Toxizität

Aptamer AnwendungsbeispieleAptamer Anwendungsbeispiele

Aptamere sind geeignet für viele Anwendungen in• Aptamere sind geeignet für viele Anwendungen in Bereichen wie• DiagnostikDiagnostik• Therapeutik• Apheresis• Imaging• Umweltanalytik• Proteomics• Proteomics• Biochips• Spezifische Prozesskontrolle (Kontaminationskontrolle)p ( )

Wie funktionieren DNA Chips?

Oligonukleotide als

DNA-Target-Moleküle

Hybridisierungkomplementärer

EinzelsträngeOligonukleotide alsSondenmoleküle

e s gezur Doppelhelix

Wie funktionieren Proteinchips?Wie funktionieren Proteinchips?

Vorteile der Aptamer ChipsVorteile der Aptamer ChipsAptamere monoklonale Antikörper

- Neue in vitro Technologie - hohe Kreuzreaktivitäten(Neue Moleküle-Patentierbarkeit),- immer in gleicher Qualität - Intrazelluläre Targetsimmer in gleicher Qualität - Intrazelluläre Targetsherstellbar sind in vivo kaum möglich- mehr Modifikationen möglich,z B für Immobilisierungenz.B. für Immobilisierungen- Alle Zielmoleküle möglich: - Nicht viele Lösungsmittel möglichz.B. „kleine Moleküle“, zelltoxische; wasserunlösliche; intrazelluläre;wasserunlösliche; intrazelluläre;Zielmoleküle, die sichnur in einem Zuckerrest oder - als Proteine in AnwendungPhosphatrest unterscheiden;... empfindlichPhosphatrest unterscheiden;... empfindlich- Hohe Spezifität durch speziellein vitro Methodennicht immunogen

- nicht-immunogen,

Probleme bei Antikörper-ProteinchipsProbleme bei Antikörper Proteinchips

•Proteine verhalten sich nicht so einfach wie Nukleinsäuren

•Funktion der Proteine abhängig von:P i h f lli 3D k L i bili–Präziser, sehr anfälliger 3D- Struktur, Langzeitstabilität

–muss im Array erhalten werdenP i P i I k i•Protein-Protein Interaktionen:

–Bindungsstärken und –Stabilität nicht standardisiert wie bei NukleinsäurenNukleinsäuren

Aptamer-Methodik ist komplementär zu und in einigen FällenAptamer Methodik ist komplementär zu und in einigen Fällen geeigneter als Antikörper-Methodik⇒ Substitution der Antikörper durch Aptamere

Vergleich DNA / Protein / Aptamer Chip

DNA-Chip AK-Chip Aptamer-Chip

Transkriptomanalyse

Glasssubstrat

Proteomanalyse

Membransubstrat

Proteomanalyse

Neue Membran

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