an improved probabilistic disease-association method to identify … · 2019. 8. 1. · the variant...

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Benchmarking of VAAST v3 vs SKAT-O We compared FCA’s performance to that of SKAT-O, another commonly used association burden testing tool, using the AMD dataset. As shown in Table 2, VAAST identifies the disease-causing gene with a genome-wide significant p-value, but SKAT-O p-values do not reach significance. We also filtered the test dataset to remove common variants, a common practice with SKAT-O. AF filtering did not affect the VAAST results, while AF filtering did improve SKAT-O results, although the CFI gene still did not achieve genome-wide significance. These results suggest that the VAAST results are less affected by the presence of both common and rare variants than are SKAT-O’s. They also demonstrate how VAAST’s integration with VVP provides consistent results when using amino acid scores. An improved probabilistic disease-association method to identify common and rare disease associated variants from large-scale case/control association studies by next-generation sequencing Francisco M. De La Vega, 1,2 Sahar Nohzadeh-Malakshah, 1 Steven Flygare, 3 Barry Moore, 3 Edgar Hernandez, 3 Edward Kiruluta, 1 and Mark Yandell 3 1 Fabric Genomics, Oakland, California; 2 Department of Biomedical Data Sciences, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA; 3 Department of Human Genetics and USTAR Center for Genetic Discovery, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, Utah, USA VAAST v3 Algorithm Validation To validate VAAST v3, we created synthetic case-control samples by spiking known disease variants from ClinVar into a pre-existing unrelated WES dataset. We picked nine different genes where disease-associated variants have been previously identified with different inheritance modes to spike in our study cases, and where we spiked the pathogenic variants at different carrier rates. Table1 summarizes the results with the carrier rate that achieves genome-wide statistical significance. We further evaluated the ability of VAAST to identify disease genes by replicating the findings of a published association study of age-related macular degeneration (AMD), where only the the CFI gene showed statistically significant increased burden of rare missense variants. For this analysis we spiked the variants discovered at the prevalence reported in the study on our pre-existing unrelated WES dataset balancing the number of cases and controls. A Q-Q plot of the results is shown in Figure 2, which demonstrates little inflation over expectation (i.e. little population stratification – note that our pipeline at this time does not account for population stratification which should be dealt with as a pre-processing step). Introduction Whole-genome (WGS) and whole-exome sequencing (WES) are increasingly used in genome-wide genetic association studies (GWAS) to identify disease-causing genes. Because WES and WGS data are much larger and richer than traditional genotyping microarray data, statistical tools to analyze such studies need to be scalable, fast, and handle all types of variants discovered by sequencing. These tools must also deal with allelic and locus heterogeneity, including cases wherein disease or other outcomes are the result of de novo, simple recessive, or compound heterozygous genotypes. The methods to analyze GWAS from NGS data typically operate by aggregating variants within gene regions, with the resulting ‘burden’ of variation at that locus being used for association testing. The Variant Annotation, Analysis & Search Tool (VAAST) algorithm is a burden-test based test that uses a composite likelihood ratio test to score genes in affected individuals relative to a set of control genomes. This score incorporates the allele frequencies of the variants in the case genomes relative to the controls, the amino acid substitution frequencies of disease alleles relative to healthy genomes and the phylogenetic conservation at a variant site. The variant scores can be aggregated to the gene level and tested on a given inheritance model. Statistical significance is determined using an empirical permutation test. We have recently made improvements to VAAST (v3), including a complete re-implementation in the C language, which allows to carry out millions of permutations in a matter of minutes. We bundled this software in a pipeline we call Fabric Cohort Analysis, that uses VCF input files of the cases and controls, performs automated pre-processing and data cleanup steps, pre-scores variants with a new method (VVP, Flygare et al., 2018), and optionally can run the Phevor algorithm (Phenotype Driven Variant Ontological Re-ranking Tool), a phenotype-driven method that that can combine VAAST outputs with knowledge from the Human Phenotype and Gene Ontologies to improve statistical power. Whole-genome and whole-exome sequencing data (WGS and WES) are increasingly used in genome-wide genetic association studies to identify disease-causing genes and for the identification of genetic biomarkers of drug efficacy and adverse reactions. Because WES and WGS data are much larger and richer than traditional genotyping microarray data, statistical tools to analyze such studies need to be scalable, fast, and handle all types of variants discovered by sequencing—SNPs, Indels, rare, common, coding, and non-coding. These tools must also deal with phenomena such as allelic and locus heterogeneity, including cases wherein disease or other outcomes are the result of de novo, simple recessive, or compound heterozygous genotypes. To address these needs, we have developed an integrated pipeline that includes a completely recoded version of the Variant Annotation, Analysis & Search Tool (VAAST), which employs a robust gene-level burden test statistic suitable for case/control studies analysis and provides an empirically calculated p-value for every gene-hit. ABSTRACT We implemented a streamlined case/control cohorts analysis software to identify associations between germline variants and complex disease or traits of interest from NGS data Our software includes an accelerated version of the VAAST algorithm (v3), as well as improved variant scores (VVP), and the Phevor algorithm, to leverage deep-phenotyping data on cases. This software identifies common and rare-disease associated variants simultaneously, without prefiltering, from VCF files. We have demonstrated that our methods correctly identify disease- associated genes in semi-synthetic datasets and have improved statistical power as compared to other commonly used tool CONCLUSIONS © 2018 Fabric Genomics TM , Inc. All rights reserved. Fabric Genomics and the Fabric Genomics logo, are trademarks or registered trademarks of Fabric Genomics, Inc. in the United States and other territories. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners. Methods We tested VAAST v3’s ability to detect disease variants at range of allele frequencies, carrier rates, inheritance models, and allelic heterogeneities by synthetically creating cases spiking known disease variants onto WES data form 2,000 ethnically matched samples, jointly genotyped with GATK, and divided them into 200 cases and 1,749 controls. Pathogenic variants reported in ClinVar for the selected genes were obtained, and were spiked in the case genomes, weighted by their population allele frequency (gnomAD), to reach various carrier rates. We also replicated the findings of a published case-control analyses for age- related macular degeneration (AMD), where 681 genes thought to be involved in the disease were sequenced. We spiked 59 missense rare variants in CFI gene to our WES data, adjusting the disease allele frequencies, so as to make the final carrier rates in our cases identical to the paper (7.8%). We kept the case/control ratio to 1:1 (605 cases and 600 controls). We ran VAAST analysis using the default recessive mode and subsequently we ran Phevor using as input VAST p-values and appropriate HPO terms. We also used the AMD datasets to benchmark VAAST v3 against SKAT-O, a commonly used association burden testing tool. Because SKAT-O does not operate on VCFs, we first converted the VCF data to the “Plink” input format needed by SKAT-O and used the linear.weighted kernel. Gene Condition Carrier rate Rank P-value VAAST Score ABCA4* Cone-rod dystrophy (vision disorder), Stargardt Macular Degeneration 0.25 1 2x10 -7 2145.64 APC Desmoid Tumor (non-cancerous growth), Familial Adenomatous Polyposis 0.25 1 2x10 -7 236.618 BRCA1 Breast, Ovarian & Prostate cancer 0.08 1 2x10 -7 178.171 BRCA2 Breast, Ovarian & Prostate cancer, Fanconi anemia 0.1 1 2x10 -7 222.018 CFTR* Cystic Fibrosis, Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens 0.25 1 2x10 -7 2313.24 FBN1 Acromicric Dysplasia (short stature), Ectopia Lentis(off-center eyes) 0.1 1 2x10 -7 176.795 KCNQ1 Familial Atrial Fibrillation (arrhythmia), Lange-Nielsen Syndrome (arrhythmia and profound hearing loss from birth) 0.25 1 2x10 -7 290.663 NF1 Neurofibromatosis Type 1 (noncancerous tumors), Lung Cancer 0.1 1 1.80x10 -6 170.403 SCN1A Familial Hemiplegic Migraine type 3, Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus 0.1 1 9.66x10 -6 125.431 Table 1. Minimum carrier rate for spiked-in genes in simulated case/control studies that is needed to produce a genome wide significant p-value using VAAST. Permutation max was set at 1x107. *Analysis carried out in recessive mode – others using dominant mode B A Figure 3. The Manhattan plots for the analysis of the simulated AMD study data. Panel A - VAAST analysis for variants MAF<1, 5 million permutations. The Y-axis is the –log 10 (p-value) from FCA gene burden test. Panel B – Result of Phevor analysis using phenotype term HPO:0007868 “Age-related macular degeneration”. Fabric Cohort Analysis (FCA) performs a multi-stage workflow that automatically launches the series of steps necessary for the analysis (Figure 1). A largely unappreciated complexity of the analysis of large-scale studies, is the complex quality control (QC) steps necessary to prevent false positive findings due to sequencing or variant calling artifacts. The FCA software includes a number of QC steps before the actual analysis begins. First, multiallelic variants are decomposed to ensure each can be scored; second, length parsimony and position left alignment is enforced; then, low quality genotypes are optionally removed by selecting a threshold genotype quality value; and finally, positions with a high number (>25%) of missing data are deleted from consideration (‘no-called’). For the current release, it is assumed the users have already examined the data for population stratification, and that outlier samples have been removed. Figure 1. Streamlined Fabric Cohort Analysis workflow for identification of disease associated rare and common variants. Parameters VAAST SKAT-O Without AA* weight, MAF<1 3.01x10 -6 8.00x10 -3 Without AA weight, MAF<0.05 3.01x10 -6 5.24x10 -5 With AA weight**, MAF<1 1.00x10 -6 2.9x10 -3 Table 2. CFI gene p-values in different association test runs. For SKAT-O we used CADD for variant scoring whereas for VAAST VVP scores were used. *AA: amino acid, **VVP for VAAST and CADD for SKAT-O B A VAASTc - MAF<0.05%; AA- SKAT-O - MAF<0.05%; AA- Figure 4. Manhattan plots of analyzes of the age-related macular degeneration replicated dataset comparing VAAST vs SKAT-O with different parameters. Panel A: Panel B: VAAST v3 results filtering for variants of MAF<0.05% without amino-acid scoring (VVP). Panel B: SKAT-O results filtering for variants of MAF<0.05% and default no-variant scoring. Figure 4 shows the Manhattan plots of VAAST vs SKAT-O without giving any weight to different amino acid substitutions. This test evaluates the performance of the statistical models employed by the two algorithms to calculate a p-value based solely on the enrichment of variants in case versus control datasets. 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 Expected Pvalue (log10 scale) Observed Pvalue (log10 scale) Figure 2. Q-Q plots for the analysis of the simulated AMD study data. Figure 3 shows the Manhattan plots of the AMD simulated study . Panel A shows that spiking these variants at similar carrier rates as in the publication, CFI achieves genome-wide statistical significance. Furthermore, using the HPO term for AMD with Phevor on VAAST output, the statistical significance of the CFI gene increases dramatically well above other hits (Figure 3B). This highlights how a probabilistic approach that leverages phenotype and gene ontologies such as Phevor, can increase power to detect association dynamically, without limiting the analysis to ad hoc and static gene lists.

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Page 1: An improved probabilistic disease-association method to identify … · 2019. 8. 1. · The Variant Annotation, Analysis & Search Tool (VAAST) algorithm is a burden-test based test

Benchmarking of VAAST v3 vs SKAT-OWe compared FCA’s performance to that of SKAT-O, another commonly used association burden testing tool, using the AMD dataset. As shown in Table 2, VAAST identifies the disease-causing gene with a genome-wide significant p-value, but SKAT-O p-values do not reach significance. We also filtered the test dataset to remove common variants, a common practice with SKAT-O. AF filtering did not affect the VAAST results, while AF filtering did improve SKAT-O results, although the CFI gene still did not achieve genome-wide significance. These results suggest that the VAAST results are less affected by the presence of both common and rare variants than are SKAT-O’s. They also demonstrate how VAAST’s integration with VVP provides consistent results when using amino acid scores.

An improved probabilistic disease-association method to identify common and rare disease associated variants from large-scale case/control association studies by next-generation sequencingFrancisco M. De La Vega,1,2 Sahar Nohzadeh-Malakshah,1 Steven Flygare,3 Barry Moore,3 Edgar Hernandez,3 Edward Kiruluta,1 and Mark Yandell31Fabric Genomics, Oakland, California; 2Department of Biomedical Data Sciences, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA; 3Department of Human Genetics and USTAR Center for Genetic Discovery, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, Utah, USA

VAAST v3 Algorithm Validation

To validate VAAST v3, we created synthetic case-control samples by spiking known disease variants from ClinVar into a pre-existing unrelated WES dataset. We picked nine different genes where disease-associated variants have been previously identified with different inheritance modes to spike in our study cases, and where we spiked the pathogenic variants at different carrier rates. Table1 summarizes the results with the carrier rate that achieves genome-wide statistical significance.

We further evaluated the ability of VAAST to identify disease genes by replicating the findings of a published association study of age-related macular degeneration (AMD), where only the the CFI gene showed statistically significant increased burden of rare missense variants. For this analysis we spiked the variants discovered at the prevalence reported in the study on our pre-existing unrelated WES dataset balancing the number of cases and controls. A Q-Q plot of the results is shown in Figure 2, which demonstrates little inflation over expectation (i.e. little population stratification – note that our pipeline at this time does not account for population stratification which should be dealt with as a pre-processing step).

Introduction

Whole-genome (WGS) and whole-exome sequencing (WES) are increasingly used in genome-wide genetic association studies (GWAS) to identify disease-causing genes. Because WES and WGS data are much larger and richer than traditional genotyping microarray data, statistical tools to analyze such studies need to be scalable, fast, and handle all types of variants discovered by sequencing. These tools must also deal with allelic and locus heterogeneity, including cases wherein disease or other outcomes are the result of de novo, simple recessive, or compound heterozygous genotypes.

The methods to analyze GWAS from NGS data typically operate by aggregating variants within gene regions, with the resulting ‘burden’ of variation at that locus being used for association testing. The Variant Annotation, Analysis & Search Tool (VAAST) algorithm is a burden-test based test that uses a composite likelihood ratio test to score genes in affected individuals relative to a set of control genomes. This score incorporates the allele frequencies of the variants in the case genomes relative to the controls, the amino acid substitution frequencies of disease alleles relative to healthy genomes and the phylogenetic conservation at a variant site. The variant scores can be aggregated to the gene level and tested on a given inheritance model. Statistical significance is determined using an empirical permutation test. We have recently made improvements to VAAST (v3), including a complete re-implementation in the C language, which allows to carry out millions of permutations in a matter of minutes. We bundled this software in a pipeline we call Fabric Cohort Analysis, that uses VCF input files of the cases and controls, performs automated pre-processing and data cleanup steps, pre-scores variants with a new method (VVP, Flygare et al., 2018), and optionally can run the Phevor algorithm (Phenotype Driven Variant Ontological Re-ranking Tool), a phenotype-driven method that that can combine VAAST outputs with knowledge from the Human Phenotype and Gene Ontologies to improve statistical power.

Whole-genome and whole-exome sequencing data (WGS and WES) are increasingly used in genome-wide genetic association studies to identify disease-causing genes and for the identification of genetic biomarkers of drug efficacy and adverse reactions. Because WES and WGS data are much larger and richer than traditional genotyping microarray data, statistical tools to analyze such studies need to be scalable, fast, and handle all types of variants discovered by sequencing—SNPs, Indels, rare, common, coding, and non-coding. These tools must also deal with phenomena such as allelic and locus heterogeneity, including cases wherein disease or other outcomes are the result of de novo, simple recessive, or compound heterozygous genotypes. To address these needs, we have developed an integrated pipeline that includes a completely recoded version of the Variant Annotation, Analysis & Search Tool (VAAST), which employs a robust gene-level burden test statistic suitable for case/control studies analysis and provides an empirically calculated p-value for every gene-hit.

ABSTRACT

• We implemented a streamlined case/control cohorts analysis software to identify associations between germline variants and

complex disease or traits of interest from NGS data

• Our software includes an accelerated version of the VAAST algorithm (v3), as well as improved variant scores (VVP), and the

Phevor algorithm, to leverage deep-phenotyping data on cases.

• This software identifies common and rare-disease associated variants simultaneously, without prefiltering, from VCF files.

• We have demonstrated that our methods correctly identify disease-

associated genes in semi-synthetic datasets and have improved statistical power as compared to other commonly used tool

CONCLUSIONS

© 2018 Fabric GenomicsTM, Inc. All rights reserved. Fabric Genomics and the Fabric Genomics logo, are trademarks or registered trademarks of Fabric Genomics, Inc. in the United States and other territories. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

Methods

We tested VAAST v3’s ability to detect disease variants at range of allele frequencies, carrier rates, inheritance models, and allelic heterogeneities by synthetically creating cases spiking known disease variants onto WES data form 2,000 ethnically matched samples, jointly genotyped with GATK, and divided them into 200 cases and 1,749 controls. Pathogenic variants reported in ClinVar for the selected genes were obtained, and were spiked in the case genomes, weighted by their population allele frequency (gnomAD), to reach various carrier rates. We also replicated the findings of a published case-control analyses for age-related macular degeneration (AMD), where 681 genes thought to be involved in the disease were sequenced. We spiked 59 missense rare variants in CFI gene to our WES data, adjusting the disease allele frequencies, so as to make the final carrier rates in our cases identical to the paper (7.8%). We kept the case/control ratio to 1:1 (605 cases and 600 controls). We ran VAAST analysis using the default recessive mode and subsequently we ran Phevor using as input VAST p-values and appropriate HPO terms. We also used the AMD datasets to benchmark VAAST v3 against SKAT-O, a commonly used association burden testing tool. Because SKAT-O does not operate on VCFs, we first converted the VCF data to the “Plink” input format needed by SKAT-O and used the linear.weighted kernel.

Gene Condition Carrier rate Rank P-value VAAST Score

ABCA4* Cone-rod dystrophy (vision disorder), Stargardt Macular Degeneration

0.25 1 2x10-7 2145.64

APC Desmoid Tumor (non-cancerous growth), Familial Adenomatous Polyposis

0.25 1 2x10-7 236.618

BRCA1 Breast, Ovarian & Prostate cancer 0.08 1 2x10-7 178.171

BRCA2 Breast, Ovarian & Prostate cancer, Fanconi anemia

0.1 1 2x10-7 222.018

CFTR* Cystic Fibrosis, Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens

0.25 1 2x10-7 2313.24

FBN1 Acromicric Dysplasia (short stature), Ectopia Lentis(off-center eyes)

0.1 1 2x10-7 176.795

KCNQ1Familial Atrial Fibrillation (arrhythmia), Lange-Nielsen Syndrome (arrhythmia and profound hearing loss from birth)

0.25 1 2x10-7 290.663

NF1 Neurofibromatosis Type 1 (noncancerous tumors), Lung Cancer

0.1 1 1.80x10-6 170.403

SCN1A Familial Hemiplegic Migraine type 3, Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus

0.1 1 9.66x10-6 125.431

Table 1. Minimum carrier rate for spiked-in genes in simulated case/control studies that is needed to produce a genome wide significant p-value using VAAST. Permutation max was set at 1x107.

*Analysis carried out in recessive mode – others using dominant mode

B

A

Figure 3. The Manhattan plots for the analysis of the simulated AMD study data. Panel A - VAAST analysis for variants MAF<1, 5 million permutations. The Y-axis is the –log10(p-value) from FCA gene burden test. Panel B – Result of Phevor analysis using phenotype term HPO:0007868 “Age-related macular degeneration”.

Fabric Cohort Analysis (FCA) performs a multi-stage workflow that automatically launches the series of steps necessary for the analysis (Figure 1). A largely unappreciated complexity of the analysis of large-scale studies, is the complex quality control (QC) steps necessary to prevent false positive findings due to sequencing or variant calling artifacts. The FCA software includes a number of QC steps before the actual analysis begins. First, multiallelic variants are decomposed to ensure each can be scored; second, length parsimony and position left alignment is enforced; then, low quality genotypes are optionally removed by selecting a threshold genotype quality value; and finally, positions with a high number (>25%) of missing data are deleted from consideration (‘no-called’). For the current release, it is assumed the users have already examined the data for population stratification, and that outlier samples have been removed.

Figure 1. Streamlined Fabric Cohort Analysis workflow for identification of disease associated rare and common variants.

Parameters VAAST SKAT-O

Without AA* weight, MAF<1 3.01x10-6 8.00x10-3

Without AA weight, MAF<0.05 3.01x10-6 5.24x10-5

With AA weight**, MAF<1 1.00x10-6 2.9x10-3

Table 2. CFI gene p-values in different association test runs. For SKAT-O we used CADD for variant scoring whereas for VAAST VVP scores were used.

*AA: amino acid, **VVP for VAAST and CADD for SKAT-O

B

CFI

A VAASTc - MAF<0.05%; AA-

SKAT-O - MAF<0.05%; AA-

Figure 4. Manhattan plots of analyzes of the age-related macular degeneration replicated dataset comparing VAAST vs SKAT-O with different parameters. Panel A: Panel B: VAAST v3 results filtering for variants of MAF<0.05% without amino-acid scoring (VVP). Panel B: SKAT-O results filtering for variants of MAF<0.05% and default no-variant scoring.

Figure 4 shows the Manhattan plots of VAAST vs SKAT-O without giving any weight to different amino acid substitutions. This test evaluates the performance of the statistical models employed by the two algorithms to calculate a p-value based solely on the enrichment of variants in case versus control datasets.

0 1 2 3 4 5 60

1

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Expected P−value (−log10 scale)

Obs

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Figure 2. Q-Q plots for the analysis of the simulated AMD study data.

Figure 3 shows the Manhattan plots of the AMD simulated study . Panel A shows that spiking these variants at similar carrier rates as in the publication, CFI achieves genome-wide statistical significance. Furthermore, using the HPO term for AMD with Phevor on VAAST output, the statistical significance of the CFI gene increases dramatically well above other hits (Figure 3B). This highlights how a probabilistic approach that leverages phenotype and gene ontologies such as Phevor, can increase power to detect association dynamically, without limiting the analysis to ad hoc and static gene lists.