aplicación práctica en avicultura · 2018. 12. 19. · pruebas de sensibilidad a los...
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aplicación práctica en avicultura
ESLAYAVP00035
Felix Ponsa
Technical Consultant Iberia
Elanco Animal Health
,
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¿Qué es AviPro® PLATE ?
2
Es un test de microdilución para determinar la sensibilidad bacteriana a los antibióticos y para identificar las cepas vacunales de AviPro®
SALMONELLA VAC E, VAC T y DUO
Es un método estándar recomendado para las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (OIE)
Ha sido desarrollado por Lohmann - Elanco en cooperación con Merlin Diagnostika GmbH y veterinarios avícolas
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Diseño de la Placa
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Panel de agentes antimicrobianos en cada placa
AviPro® PLATE
No Class of antibiotics Agent Abbreviation Remarks
1 β- lactam antibiotics Amoxicillin AMX
2 “ Oxacillin OXA
3 “ Penicillin G PEN
4 “ Ceftiofur CET
5 “ Cefpodoxime-Proxetil CPP
6 “ Cefotaxime CTX
7 Polypeptide antibiotics Colistin COL
8 Fluoroquinolones Enrofloxacin ENR
9 Macrolides Erythromycin ERY
10 “ ErythromycinD ERYD Marcador de Vacuna
11 “ Tilmicosin TILM
12 “ Tylosin TLS
13 Lincosamides Lincomycin LIN
14 Aminoglycosides Neomycin NEO
15 “ Streptomycin STR Marcador de Vacuna
16 Lincosamides/Aminocyclitoles Lincomycin-Spectinomycin LIS
17 Ansamycins Rifampicin RAM Marcador de Vacuna
18 Aminocyclitols Spectinomycin SPT
19 Tetracyclines Tetracycline / Doxycycline TET / DOX Clase representativa
para chlortetracycline,
oxytetracycline,
doxycycline.
20 Pleuromutilins Tiamulin TIA
21 Folate pathway inhibitors Trimethoprim-sulfamethoxazole T/S
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Contexto
En la Unión Europea, la legislación de zoonosis considera la vacunación de las aves de corral contra Salmonella como una medida complementaria a las buenas prácticas de manejo e higiene
La legislación europea señala la necesidad de diferenciar bacteriológicamente las cepas de campo de Salmonella de las cepas vacunales
Lohmann - Elanco desarrolló AviPro®PLATE para proporcionar un métodoestandarizado que permite el cumplimientode la normativa de la UE
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AviPro® SALMONELLA VAC E
AviPro® SALMONELLA VAC T
AviPro® SALMONELLA DUO
Marcador de superficie
• Sensibilidad aumentada a los antibióticos (Ssq)
• Marcador anti-epidémico (Rtt, macrólidos)
• Sensibilidad a la Eritromicina (VAC E y VAC T)
Marcador de atenuación
• Tiempo prolongado de generación
• Mutación por deriva metabólica (resistenciaantibiótica cromosómica)
• Resistencia a Rifampicina (VAC E y VAC T)
• Resistencia a Estreptomicina (VAC E)
• Resistencia a Ácido nalidíxico (VAC T)
AviPro® Salmonella Vac E (Rif 12/Sm 24/Ssq)
AviPro® Salmonella Vac T (Rif 9/Nal 2/Rtt)
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Determinación de las cepas vacunales segúnel principio de resistencia a los antibióticos
Concentración Salmonella
Vac E
Salmonella
Vac T
SE o ST Cepa
de campo
Rifampicina 200 µg/ml Resistente Resistente Sensible
Estreptomicina 200 µg/ml Resistente Sensible Sensible
Ac. Nalidíxico 20 µg/ml Sensible Resistente Sensible
Eritromicina 15-30 µg/ml Sensible Sensible Resistente
SALMONELLA DUO
Ficha Técnica AviPro ® SALMONELLA DUO
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Test para la identificación de Cepas Vacunales
Diferenciación optimizada de cepas de Salmonella de
campo y cepas de Salmonella de vacunas AviPro®:
– AviPro® Salmonella Vac E
– AviPro® Salmonella Vac T
– AviPro® Salmonella DUO
Control de la toma vacunal
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Durante la vacunación
1-2 días post
vacunación
3-4 días post
vacunación
5 dias post vacunación
Observación visualMuestras de agua
CalzasHisopos cloacales
HígadoBazo
CiegosContenido cecal
Programa de muestreo para verificar la toma de vacunas vivas de Salmonella de Elanco
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Diseño de la Placa – Antibióticos marcadores de vacuna AviPro®
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
T
E
A PEN
2
AMX
16
ENR
2
CET
2
TET
8
TILM
16
LIS
8/32
OXA
2
ERY
4
DOX
2
DOX
4
DOX
8
S
T
B PEN
0.5
AMX
8
ENR
1
CPP
4
TET
4
TILM
8
T/S
2/38
OXA
0,25
ERY
1
TIA
16
ERYD
30
STRE
200
C PEN
0.25
AMX
4
ENR
0.5
CTX
1
TET
2
NEO
16
T/S
1/19
COL
4
ERY
0.5
TIA
8
ERYD
20
RAM
50
1 D PEN
0.125
AMX
2
ENR
0.25
TLS
0.5
TLS
1.0
NEO
8
T/S
0.5/9.5
COL
2
ERY
0.25
LIN
4
ERYD
10
Growth
Control
T
E
E PEN
2
AMX
16
ENR
2
CET
2
TET
8
TILM
16
LIS
8/32
OXA
2
ERY
4
DOX
2
DOX
4
DOX
8
S
T
F PEN
0.5
AMX
8
ENR
1
CPP
4
TET
4
TILM
8
T/S
2/38
OXA
0,25
ERY
1
TIA
16
ERYD
30
STRE
200
G PEN
0.25
AMX
4
ENR
0.5
CTX
1
TET
2
NEO
16
T/S
1/19
COL
4
ERY
0.5
TIA
8
ERYD
20
RAM
50
2 H PEN
0.125
AMX
2
ENR
0.25
TLS
0.5
TLS
1.0
NEO
8
T/S
0.5/9.5
COL
2
ERY
0.25
LIN
4
ERYD
10
Growth
Control
Los pocillos que contienen los antibióticos marcadores de las cepas vacunales Elanco se
resaltan con el color Amarillo:
• Sensibilidad: Erythromycin (ERYD)
• Resistencia: Streptomycin (STRE) / Rifampicin (RAM)
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MIC breakpoints de antibióticos marcadores para las
cepas vacunales AviPro®
Antimicrobial agent1
(Strain)
Agent
abbreviation
Breakpoint (µg/mL)
LB MIC range
Erythromycin
Chicken
S.E. Sm24/Rif12/Ssq (vaccine strain)
S.E. Leipzig (field strain)
S.Tm. Nal2/Rif9/Rtt (vaccine strain)
S.Tm. Moskau 415 (field strain)
ERD
10
10
10
10
< 20
≥ 30
< 20
≥ 30
Rifampicin
Chicken
S.E. Sm24/Rif12/Ssq (vaccine strain)
S.E. Leipzig (field strain)
S.Tm. Nal 2/Rif9/Rtt (vaccine strain)
S.Tm. Moskau 415 (field strain)
RAM
50
50
50
50
> 50
< 50
> 50
< 50
Streptomycin
Chicken
S.E. Sm24/Rif12/Ssq (vaccine strain)
S.E. Leipzig (field strain)
STR
200
200
> 200
< 200
Para cada marcador, se muestra la concentración minima inhibitoria (MIC)
para el breakpoint inferior (LB) en combinación con el rango MIC.
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AviPro® Salmonella Vac E AviPro® Salmonella Vac T
Cepa de Campo S. E. Cepa de Campo S. T.
STRE
200
RAM
50
ERYD
20
ERYD
30
Sensibles a antibióticos, i.e. No crecimiento bacteriano
Resistente a antibióticos, i.e. Crecimiento bacteriano
ERYD
10
STRE
200
Resultados: Identificación de cepas vacunales
AviPro® SALMONELLA Vac E, Vac T y DUO
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SE
vac
cin
e st
rain
Rif
12/S
m 2
4/S
sqProcedimiento del TestAviPro® PLATE → Lectura visual
ST
vac
cin
e st
rain
Rif
9/N
al2/
Rtt
SE
vac
cin
e st
rain
Rif
12/S
m 2
4/S
sq
ST
vac
cin
e st
rain
Rif
9/N
al2/
Rtt
Estreptomicina es el marcador clave para la
diferenciación entre ambas cepas vacunales
SE → Resistante
(crecimiento)
ST → Sensible
(no crecimiento)
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Test de Sensibilidad Antimicrobiana - Antibiograma
– Valoración cuantitativa de la sensibilidad in vitro
de bacterias gram-positivas y gram–negativas a
los antibióticos
– Guía para una intervención terapéutica
– Detección de la resistencia antimicrobiana en
las manadas de aves de corral:
Cambios en la prevalencia de resistencia
antimicrobiana (“monitoreo”)
Aparición de resistencias antimicrobianas
(“vigilancia”)
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– Test de sensibilidad a los antimicrobianos
muy común
– Valoraciones cualitativas (S, I, R)
– Falta de valores “breakpoints” veterinarios
específicos (MICs)
– Variedad de normas nacionales, p. e. DIN
58940, NCCLS, BSAC, CA-SFM, WRG
– Pobre correlación entre métodos
– Método poco robusto
Método de difusión en agar (discos)
Test de Sensibilidad Antimicrobiana - Antibiograma
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Protocolo del ensayo
– Descrito en el Manual AviPro® Plate
– Procedimiento de acuerdo a:
– NCCLS: Document M31-A2, Vol. 22,
No. 6, 2002, Wayne, PA, USA
– CLSI: Document M31-A3, Vol. 28,
No. 8, 2008, Wayne, PA, USA
– Atención: Versión del Manual y
Referencia del Lote
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Toma de muestras
Hisopos
cloacales Heces
Hisopos
visceralesVísceras
Qué podemos esperar?
E. coliSalmonella (cepas de campo
y/o cepas vacunales)
Campylobacter
Pseudomonas
StaphylococcusStreptococcus
etc.
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Muestra
Aislamiento e Identificación
Cultivo puro
Procedimiento del Test
AviPro® PLATE → Partir de un cultivo puro
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Procedimiento del test
Colonia de cultivo puro en NaCl 0,9%
(0.5 McFarland standard)
Bacterias
Gram-negativas
Bacterias
Exigentes (i.e. Haempnhilus)
Bacterias
Gram-positivas
Inocular 50 µl en 10-11 ml caldo Mueller Hinton
o
Inocular 50 µl en 10-11 ml caldo ISO-Sensitest
Inocular 100 µl en 10-11 ml caldo Mueller Hinton
o
Inocular 100 µl en 10-11 ml caldo ISO-Sensitest
Inocular 200 µl en 10-11 ml H-broth
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Dispensar en Placa
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Caldo inoculado
Dispensar 100 µl en cada pocillo de la placa AviPro® PLATE y sellar la
parte superior de la placa
Incubar a 35 - 37 °C
18 - 24 hours
Lectura de placas visualmente o con espectrofotómetro
Procedimiento del Test
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Resultados
– Medición automática o visual del crecimiento bacteriano
– Determinación de la concentracíon mínima inhibitoria
(MIC) basado en valores “breakpoints” definidos
– Interpretación:
• Sensible (S)
• Intermedio (I)
• Resistente (R)
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• Espectrofotómetro para garantizar una interpretación de resultados objetiva y sin sesgos
• MICRONAUT Software Program
Lectura Automática
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Lectura Visual
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Lectura Visual
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Interpretación del “breakpoint” de un agente antimicrobiano
MIC: minimum inhibitory concentration
CMI: concentración mínima inhibitoria
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MICbreakpointsy normas
interpretativasde agentes
antimicrobianos
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MICbreakpointsy normas
interpretativasde agentes
antimicrobianos
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Interpretación de Resultados: S, I, R
Verde: Crecimiento / Rojo: No crecimiento
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Características del producto
– 100 placas por paquete con selladores
de placa adhesivos
– Análisis de 2 muestras diferentes por
placa
– 21 agentes antimicrobianos
– 3 marcadores de vacuna
– Almacenar a 15 ºC – 25 ºC
– Almacenamiento de las placas a
temperatura ambiente hasta 24 meses
– Transporte normal
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Resumen
– Método fiable de diferenciación de las cepas vacunales de Salmonella
de Elanco y las cepas de Salmonella de campo
– Control de la toma vacunal
– Test in-vitro para la determinación de la sensibilidad de bacterias gram-
positivas y gram-negativas a los antibióticos
– Guía para la intervención terapéutica
– Análisis cuantitativos objetivos e interpretación de la concentración
mínima inhibitoria (MIC) basado en valores “breakpoint” definidos
– Procesamiento de gran número de muestras mediante automatización
– Método de laboratorio robusto
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Referencias
1. AviPro® PLATE Instruction Manual
2. Commission Regulation (EC) No 1177/2006
3. ISO 6579:2002/DAmd 1. International standard for detection of
Salmonella spp
4. Summary of product characteristics AviPro® Salmonella DUO
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Muchas gracias
por su atención
Elanco Animal Health
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