associada aos polimorfismos no Éxon 1 do gene mbl2 … · 2019-10-25 · macario, michele chianca...

SUSCEPTIBILIDADE ÀS MICOSES SUPERFICIAIS NO DIABETES MELLITUS

ASSOCIADA AOS POLIMORFISMOS NO ÉXON 1 DO GENE MBL2

MICHELE CHIANCA MACARIO

RECIFE

2012

1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos.

Área de Concentração: Micologia aplicada Aluna: Michele Chianca Macario Orientadora: Profª. Drª. Rejane Pereira Neves Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Crovella Colaboradores: MSc Lúcia Cordeiro

MSc Vera dos Santos

RECIFE

2012

Macario, Michele Chianca Susceptibilidade às micoses superficiais no diabetes mellitus associada aos polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2/ Michele Chianca Macario– Recife: O Autor, 2012. 79 folhas : il., fig., tab.

Orientadora: Rejane Pereira Neves Coorientador: Sérgio Crovella Colaboradores: Lúcia Cordeiro e Vera dos Santos Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas. Biologia de Fungos, 2012. Inclui bibliografia e anexos

1. Lectinas 2. Diabetes mellitus 3. Micose I. Neves, Rejane

Pereira II. Crovella, Sérgio III. Cordeiro, Lúcia IV. Santos, Vera dos V. Título.

579.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2012-095

Chianca, M.M. - Susceptibilidade às micoses superficias no diabetes mellitus... 2

MICHELE CHIANCA MACARIO



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos.

Data da defesa: 27 de Fevereiro de 2012

COMISSÃO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES ______________________________________________________________________

Profª. Drª. Rejane Pereira Neves (Orientadora) Universidade Federal de Pernambuco

______________________________________________________________________ Profª. Drª. Danielle Patrícia Cerqueira Macêdo (1º membro)

Universidade Federal de Pernambuco

______________________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos André Cavalcanti Bezerra (2º membro)


MEMBROS SUPLENTES ______________________________________________________________________

Profª. Drª. Oliane Maria Correia Magalhães (1º membro) Universidade Federal de Pernambuco

______________________________________________________________________ Profª. Drª. Paula Sandrin Garcia (2º membro)



“Paciência e perseverança têm o efeito mágico de fazer as dificuldades

desaparecerem e os obstáculos sumirem.”

John Quincy Adams


Agradecimentos

A Deus, por jamais ter me desamparado.

À minha orientadora Rejane, pela oportunidade e confiança.

Ao meu co-orientador Sérgio Crovella, pelo apoio técnico-científico.

A Universidade Federal de Pernambuco e ao Programa de Pós-graduação em Biologia

de Fungos pela oportunidade de crescimento acadêmico e profissional.

Ao CNPq, pelo auxílio financeiro.

Ao Hospital Barão de Lucena, Hospital das Clínicas de Pernambuco e ao Instituto

Brasileiro de Diabetes, por abrirem as portas e confiarem no nosso trabalho.

A Drª Lúcia Cordeiro e Drª Vera dos Santos, por permitirem que eu fizesse parte das

suas rotinas.

Aos queridos pacientes, indispensáveis para a realização desse trabalho. Meus sinceros

agradecimentos a vocês.

As pessoas maravilhosas que não pouparam esforços, apesar do dia a dia conturbado

de cada um, e muito me ajudaram durante essa jornada. Meu agradecimento a Aline Mary,

Heidi, Igor e Carol Sanuzi.

Ao professor Marcos André, por toda ajuda ao abrir as portas do seu laboratório ao

nosso trabalho.

Aos amigos da minha turma de mestrado, vocês são especiais e foram importantes ao

tornarem os dias mais gratificantes mesmo quando tudo parecia conspirar contra. Vocês

estarão sempre em minhas melhores lembranças.

Aos professores Oliane e Armando, por tornarem divertido e gratificante cada minuto

dentro do laboratório.

Aos amigos do Laboratório de Micologia Médica, especialmente Fabíola (Bila) pela

ajuda nos momentos difíceis.

Ao meu namorado Thiago, por toda paciência e ajuda. Você é parte do meu

crescimento.

Especialmente aos meus pais, que sempre me apoiaram e confiaram em mim.

Obrigada por cada palavra de incentivo, por toda vibração a cada conquista. Essa vitória

também é de vocês!


RESUMO

A lectina ligadora de manose (MBL) é uma proteína plasmática que participa do sistema de

defesa inato neutralizando microrganismos patogênicos. Polimorfismos no éxon 1 do gene

MBL2 estão associados a baixos níveis séricos da proteína funcional, com influência na

susceptibilidade a uma variedade de processos infecciosos. Indivíduos com diabetes mellitus

apresentam maior susceptibilidade às infecções, dentre elas as infecções fúngicas. Porém as

causas para esta condição ainda não estão completamente esclarecidas. O propósito desse

estudo foi correlacionar susceptibilidade às micoses superficiais no diabetes mellitus aos

polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2. Foram incluídos no estudo 131 pacientes diabéticos

dos ambulatórios de três centros hospitalares localizados no estado de Pernambuco, Brasil.

Amostras sanguíneas foram coletadas destes pacientes para detecção dos polimorfismos

estruturais no gene MBL2, bem como amostras clínicas para diagnóstico micológico. Para

comparação estatística, foi utilizado um grupo controle sadio pertencente a um banco de

amostras. Dos pacientes avaliados, 31 apresentaram lesões clínicas de micose superficial com

prevalência de onicomicose (93,5%), maior acometimento das unhas dos pés (65,5%),

mulheres (64,5%) e idosos (80,6%). Entre os agentes etiológicos identificados, destacaram-se

as espécies do gênero Candida (64%). Observou-se maior frequência genotípica de

homozigotos O/O para o grupo com micose quando comparado ao controle (p=0,046). Não

houve diferença significante ao se comparar os outros grupos avaliados. Observamos que a

presença de polimorfismos estruturais no éxon 1 do gene MBL2 está associada à maior

susceptibilidade de pacientes diabéticos a infecções fúngicas superficiais.

Palavras-chave: Lectina ligadora de manose. Gene MBL2. Diabetes mellitus. Micoses

superficiais.


ABSTRACT

Mannose binding lectin (MBL) is a plasma protein that participates in the innate defense

system by neutralizing pathogens. Polymorphisms in the exon 1 of the MBL2 gene are

associated with low serum levels of functional protein that influence susceptibility for a

variety of infectious processes. Individuals with diabetes mellitus present a higher

susceptibility to infections, among them infection fungal. But the reasons for this condition

are still not completely understood. The purpose of this study was to correlate susceptibility to

superficial mycoses in diabetes mellitus to polymorphisms in the exon 1 of the MBL2 gene.

The study included 131 diabetics patients from ambulatories of three hospitals located in the

state of Pernambuco, Brazil. Blood samples were collected from these patients for structural

polymorphisms detection in the MBL2 gene, as well as clinical samples for mycological

diagnosis. A healthy control group belonging to a bank samples was used for statistical

comparison. From the patients evaluated 31 had clinical lesions of superficial mycosis with a

prevalence of onychomycosis (93,5%), greater involvement of toenails (65,5%), women

(64,5%) and elderly (80,6%). Among the identified etiologic agents, stood out the species of

the genus Candida (64%). It was observed a higher frequency of homozygous genotype O/O

for the group with mycosis when compared to the control group (p=0,046). There was no

significant difference when comparing the other groups. We observed that the presence of

structural polymorphisms in exon 1 of the MBL2 gene is associated with increased

susceptibility of diabetic patients develop superficial fungal infections.

Keywords: Mannose binding lectin. MBL2 gene. Diabetes mellitus. Superficial mycoses.


LISTA DE ABREVIATURAS

A...................................................................... Adenina

Å...................................................................... Ângström

AC.................................................................... Anticorpo

ADA................................................................. Associação Americana de Diabetes

Asn................................................................... Asparagina

C...................................................................... Citosina

C2.................................................................... Componente do sistema complement



DM................................................................... Diabetes mellitus

DM1................................................................. Diabetes mellitus tipo 1

DM2................................................................. Diabetes mellitus tipo 2

DMG................................................................ Diabetes mellitus gestacional

DRC................................................................. Domínio de Reconhecimento de Carboidratos

G...................................................................... Guanina

Glu................................................................... Glutamato ou Ácido glutâmico

Gly................................................................... Glicina

HbA................................................................. Hemoglobina A

HbA1c............................................................. Hemoglobina glicada

HIV.................................................................. Vírus da Imunodeficiência Humana

IDDM.............................................................. Diabetes mellitus insulino-dependente

IDF.................................................................. Federação Internacional de Diabetes

IL..................................................................... Interleucina

kDa.................................................................. Kilodalton

LADA.............................................................. Diabetes auto-imune latente do adulto

LDL................................................................. Lipoproteína de baixa densidade

M...................................................................... Molar

MAP ou sMAP............................................... Pequena proteína associada à MBL

MASP.............................................................. Serino protease associada à MBL

MBL................................................................ Lectina Ligadora de Manose

MBL2............................................................... Mannose Binding Lectin gene


MODY............................................................. Maturity-Onset Diabetes of the Young

NIDDM........................................................... Diabetes mellitus não insulino-dependente

OMS................................................................ Organização Mundial de Saúde

PEPC............................................................... Peptídeo C

Pro................................................................... Prolina

SC.................................................................... Sistema Complemento

T....................................................................... Timina

TNF................................................................. Fator de Necrose Tumoral

TOTG.............................................................. Teste de Tolerância Oral à Glicose

Xaa.................................................................. Representação de qualquer aminoácido


LISTA DE FIGURAS

Capítulo 2 Pág.

Figura 1. Estrutura da Lectina Ligadora de Manose............................................ 30

Figura 2. Estrutura do gene MBL2. O éxon 0 não é traduzido em proteína. O

éxon 1 codifica a região rica em cisteína e parte da região de colágeno. O

éxon 2 é responsável por codificar o restante da região de colágeno. O éxon 3

codifica a região de dobradiça e o éxon 4 codifica o DRC................................. 33

Figura 3. Alelos variantes alteram a região colagenosa da proteína MBL.

MBL não funcional.............................................................................................. 34

Capítulo 4

Figura 1. Distribuição das espécies fúngicas de acordo com sexo, idade, tipo

de diabetes e localização da lesão nos pacientes diabéticos................................ 48

Capítulo 5

Figura 1. Agentes etiológicos de micoses em pacientes com diabetes mellitus.. 58


LISTA DE TABELAS

Capítulo 2 Pág.

Tabela 1. Critérios de diagnóstico do diabetes mellitus segundo a Associação

Americana de Diabetes (2011)............................................................................

24

Capítulo 5

Tabela 1. Caracterização clínica e epidemiológica dos grupos em estudo

quanto a sexo, idade, tipo de diabetes e sítios acometidos.................................. 57

Tabela 2. Distribuição alélica para o gene MBL2 nos grupos diabéticos com

micose, diabéticos sem micose e controle........................................................... 59

Tabela 3. Distribuição genotípica para o gene MBL2 nos grupos diabéticos

com micose, diabéticos sem micose e controle................................................... 60


SUMÁRIO Pág.

1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 13

2 REVISÃO DA LITERATURA...................................................................... 15

2.1 DIABETES MELLITUS................................................................................ 15

2.1.1 Considerações gerais................................................................................ 15

2.1.2 Epidemiologia da diabetes....................................................................... 16

2.1.3 Classificação do diabetes mellitus............................................................ 18

2.1.4 Diagnóstico e avaliação do controle da diabetes.................................... 23

2.1.5 Diabetes e infecções................................................................................... 26

2.2 PROTEÍNA MBL E GENE MBL2................................................................ 29

3 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 38

3.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS............................................. 38

3.1.1 Manipulação das amostras clínicas......................................................... 38

3.1.2 Purificação das culturas........................................................................... 38

3.1.3 Identificação dos agentes etiológicos....................................................... 39

3.1.4 Avaliação clínica e epidemiológica.......................................................... 39

3.1.5 Seleção do grupo para estudo do gene MBL2........................................ 39

3.1.6 Extração de DNA...................................................................................... 39

3.1.7 Genotipagem do gene MBL2 por PCR em tempo real utilizando

Melting Temperature Assay (Ensaio de Temperatura de Anelamento).........

40

3.1.8 Análise estatística...................................................................................... 40

4 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E AVALIAÇÃO MICOLÓGICA DE

ONICOMICOSE EM PACIENTES BRASILEIROS COM DIABETES

MELLITUS...........................................................................................................

41

Resumo................................................................................................................ 42

Introdução............................................................................................................ 43

Materiais e Métodos............................................................................................ 44

Resultados............................................................................................................ 45

Discussão............................................................................................................. 46

5 MICOSES SUPERFICIAIS ASSOCIADAS AOS POLIMORFISMOS

NO ÉXON 1 DO GENE MBL2 EM PACIENTES COM DIABETES

MELLITUS...........................................................................................................

50


Resumo................................................................................................................ 51

Introdução............................................................................................................ 52

Materiais e Métodos............................................................................................ 53

Resultados............................................................................................................ 55

Discussão............................................................................................................. 61

6 CONSIDERAÇÕES GERAIS........................................................................ 65

REFERÊNCIAS.................................................................................................. 66

ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA.................................. 78

ANEXO B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO. 79


1 INTRODUÇÃO

O diabetes mellitus (DM), uma das doenças crônicas mais prevalentes na população

mundial (BASTOS JR. et al., 2005), é caracterizado por hiperglicemia resultante da falta de

insulina e/ou incapacidade da insulina em exercer adequadamente os seus efeitos (OLIVEIRA

et al., 2009). É classificado de acordo com a Associação Americana de Diabetes (ADA, 2011)

segundo 4 formas clínicas: diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus

gestacional e diabetes secundária a outras patologias.

Indivíduos com o DM apresentam maior susceptibilidade ao desenvolvimento de

infecções, entre estas infecção fúngica. Entretanto, ainda não estão completamente

esclarecidas as causas para esta condição. Sabe-se que portadores dessa doença apresentam

alterações no sistema de defesa com depressão da atividade dos polimorfonucleares

neutrófilos, alteração na aderência, quimiotaxia e opsonização leucocitária, alteração dos

sistemas antioxidantes e menor produção de interleucinas (ROCHA et al., 2002).

O sistema complemento, incluindo a lectina ligadora de manose (MBL), associado à

ação das células fagocitárias, fazem parte da resposta imune inata inicial aos microrganismos,

apresentando como principal objetivo impedir a instalação das infecções (FILHO et al., 2011).

A MBL é uma glicoproteína plasmática sintetizada no fígado (SEGAT et al., 2009),

componente central da via das lectinas do sistema complemento (GARCIA-LAORDEN et al.,

2008). Desempenha um papel importante devido ao efeito antimicrobiano, através de sua

capacidade de reconhecer hidratos de carbono na superfície microbiana (BOUWMAN et al.,

2006; GARCIA-LAORDEN et al., 2008).

A produção desta proteína é codificada pelo gene MBL2 e polimorfismos das regiões

estruturais desse gene estão associados com deficiência parcial ou total de MBL no soro

(DENHOLM et al., 2010). Essa deficiência tem sido associada ao aumento da frequência e

severidade das infecções bacterianas, virais e fúngicas em crianças e adultos (DEAN et al.,

2005).

Estudos vêm sendo realizados buscando avaliar essa possível correlação entre

polimorfismos no gene MBL2, com consequente baixos níveis séricos de MBL, e a

susceptibilidade às infecções, entre elas a infecção fúngica (AMPEL et al., 2009; GIRALDO

et al., 2007; LAMBOURNE et al., 2009). Também existem relatos que associam essa

deficiência a afecções clínicas, entre estas o diabetes mellitus (ARAÚJO et al., 2007; MEGIA

et al., 2004; TSUTSUMI et al., 2003).


Alguns estudos buscam entender a maior susceptibilidade de indivíduos diabéticos a

infecções (HOVIND et al., 2005; KAUNISTO et al., 2009), porém as evidências clínicas que

sustentam essa associação não estão esclarecidas. Dessa forma, o presente estudo apresenta

como propósito correlacionar susceptibilidade às micoses superficiais no diabetes mellitus aos

polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2 com conseqüente redução dos níveis séricos da MBL

funcional.


2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DIABETES MELLITUS

2.1.1 Considerações gerais

O diabetes mellitus é uma doença endócrina caracterizada por desordens metabólicas,

as quais incluem elevada glicemia de jejum (hiperglicemia) e pós-prandial, devido a uma

menor sensibilidade insulínica em tecidos alvo e/ou reduzida secreção de insulina (ARSA et

al., 2009).

Na doença, os sintomas característicos apresentados são sede (polidipsia), poliúria

(excesso de urina), polifagia (fome excessiva), perda de peso, sonolência, dores generalizadas,

câimbras e dormências, nervosismo, indisposição para o trabalho, desânimo, turvação da

visão, cansaço físico e mental (GÓES; VIEIRA; LIBERATORE JR., 2007).

Em sua forma mais grave, o diabetes mellitus pode levar a cetoacidose diabética, a

qual pode resultar em estupor, coma ou, na ausência de tratamento eficaz, em morte. Porém,

muitas vezes os sintomas não são tão graves ou estão ausentes e, conseqüentemente, a

hiperglicemia suficiente para causar alterações patológicas e funcionais pode estar presente

por um longo período até que o diagnóstico seja realizado (OMS, 1999).

A hiperglicemia é um efeito comum da diabetes descompensada e a longo prazo,

conduz a sérios danos a muitos dos sistemas do corpo, com provável disfunção e falência de

vários órgãos, especialmente de nervos e vasos sangüíneos (OMS, 2011).

Essas conseqüências do DM a longo prazo acontecem devido a alterações micro e

macrovasculares (BEM; KUNDE, 2006). Segundo Deshpande, Harris-Hayes e Schootman

(2008), as complicações microvasculares incluem danos ao sistema nervoso (neuropatia), ao

sistema renal (nefropatia) e lesões oculares (retinopatia). Complicações macrovasculares

incluem a doença cardiovascular, acidente vascular cerebral e doença vascular periférica. Esta

última pode levar a contusões ou lesões que não cicatrizam, gangrena e, por fim, à amputação.

Embora os tipos de complicações sejam semelhantes para DM tipo 1 e DM tipo 2, a

frequência ou o tempo de ocorrência pode variar. Essas complicações podem apresentar-se em

forma de episódios, que se repetem inúmeras vezes e podem ser tratadas; ou de maneira

progressiva, que geralmente iniciam-se relativamente suaves, mas ao longo do tempo resultam

em maiores danos aos órgãos e maior perda da funcionalidade, sendo essa forma, geralmente,

irreversível (DESHPANDE; HARRIS-HAYES; SCHOOTMAN, 2008).


Sendo assim, a diabetes é uma doença crônica que exige o acompanhamento médico e

uma contínua educação do paciente quanto a cuidados próprios para evitar complicações

agudas e reduzir o risco em longo prazo (ADA, 2011).

2.1.2 Epidemiologia da diabetes

Segundo a Associação Americana de Diabetes - ADA (2007 apud PAPELBAUM et

al., 2011, p. 3), os pacientes diabéticos devem manter baixos níveis de hemoglobina glicada,

pressão arterial e lipoproteína de baixa densidade (LDL). No entanto, apenas 10% dos

pacientes preenchem os três objetivos simultaneamente e, como conseqüência, o controle da

doença é inadequado, levando a um aumento na morbidade e mortalidade (PAPELBAUM et

al., 2011).

A prevalência mundial da doença tem apresentado um crescimento com proporções

epidêmicas. Esse aumento deve-se a maior longevidade da população, associada ao consumo

aumentado de gorduras saturadas e sedentarismo com conseqüente obesidade (FORTI et al.,

2006).

O número estimado de diabéticos no mundo, segundo a Federação Internacional de

Diabetes (IDF), no ano de 2003 foi de 194 milhões. Estimava-se que em 2025, a população de

diabéticos alcançasse os 334 milhões (IDF, 2003), porém, segundo a OMS (2011), essa

população atinge o número de 346 milhões de pessoas no mundo.

Em nível global, a prevalência de diabetes é semelhante em homens e mulheres,

contudo apresenta-se ligeiramente maior em homens com idade inferior aos 60 anos e em

mulheres em idades mais avançadas. Entretanto, o que se observa é um maior número de

mulheres diabéticas se comparado aos homens. Acredita-se que devido a um maior número de

mulheres idosas, na maioria das populações e ainda, um aumento da prevalência da diabetes

com a idade seja a explicação mais provável para essa observação (WILD et al., 2004).

Nos países desenvolvidos, a maioria das pessoas diagnosticadas diabéticas apresenta-

se com idade superior a 60 anos. Em contraste, nos países em desenvolvimento a maioria

encontra-se na faixa etária entre 40-60 anos. Esta diferença provavelmente permanecerá até

2030, embora de forma menos acentuada, uma vez que a idade da população diagnosticada

nos países em desenvolvimento irá aumentar um pouco mais do que nos países desenvolvidos

(SHAW; SICREE; ZIMMET, 2010).

Estima-se que até 2030, o número de pessoas diabéticas acima dos 64 anos de idade

seja superior a 82 milhões de pessoas nos países em desenvolvimento e superior a 48 milhões


nos países desenvolvidos (WILD et al., 2004). O crescimento relativo da prevalência de

diabetes mellitus será, entre 1995 e 2025, da ordem de 48% para os países em

desenvolvimento e 27% para os países desenvolvidos (MORAES et al., 2010).

O Brasil, que no ano 2000 ocupava o oitavo lugar entre os dez países com maior

número de casos de diabetes, apresentando 4,6 milhões de pessoas (WILD et al., 2004),

ocupou em 2010 a quinta posição, totalizando 7,6 milhões de pessoas diagnosticadas (SHAW;

SICREE; ZIMMET, 2010).

A ocorrência do diabetes mellitus é um fenômeno universal e afeta populações de

países em todos os estágios de desenvolvimento. Dessa forma, observa-se o aumento da

frequência dessa doença nas estatísticas de mortalidade, tanto como causa básica ou

contributória, especialmente associada a doenças renais, cardiovasculares e cerebrovasculares

(CESSE et al., 2009).

Segundo Deshpande, Harris-Hayes e Schootman (2008), a diabetes no ano de 2002 foi

a sexta maior causa de morte, com 73.249 listagens de óbitos tendo a diabetes como causa

base da morte e um adicional de 224.092 atestados com essa doença associada à morte. Em

2004, um número estimado de 3,4 milhões de pessoas foram a óbito por conseqüências de

elevada taxa glicêmica, e estima-se que esse número duplique entre os anos 2005-2030 (OMS,

2011).

De acordo com Zhang e colaboradores (2010), os diabéticos representam maior

número de consultas ambulatoriais, maior uso de medicamentos, bem como uma maior

probabilidade de hospitalização quando comparados a não diabéticos. Esses fatores tornam o

DM responsável por gastos expressivos em saúde, além de substancial redução da capacidade

de trabalho e da expectativa de vida (GÓES; VIEIRA; LIBERATORE JR., 2007). Segundo

Barceló e colaboradores (2003), medicamentos, hospitalizações e consultas representam,

respectivamente, 43%, 10% e 24% dos custos diretos com diabetes mellitus na América

Latina.

A diabetes é uma doença crônica que exige a manutenção do atendimento médico para

redução do risco de complicações a longo prazo. O plano de gestão deve ser formulado como

uma aliança de colaboração terapêutica entre o paciente, a família e o médico, bem como

outros profissionais de saúde (ADA, 2011).


2.1.3 Classificação do diabetes mellitus

A primeira classificação amplamente aceita de diabetes mellitus foi publicada pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1980. O Comitê de Especialistas em 1980 propôs

duas classes principais e as nomeou, diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM) ou tipo 1,

e diabetes mellitus não insulino-dependente (NIDDM) ou tipo 2. Também foram incluídos

outros tipos de diabetes, tolerância a glicose, bem como diabetes mellitus gestacional - DMG

(OMS, 1999).

Os termos diabetes mellitus insulino-dependente e diabetes mellitus não insulino-

dependente são confusos e classificam o paciente quanto ao seu tratamento ao invés de serem

classificados em função da patogênese (OMS, 1999). Em 1997, foi proposta pela ADA a

classificação atual que é baseada na etiologia da doença, e não na sua forma de tratamento

(FORTI et al., 2006). Dessa forma, os termos tipo 1 e tipo 2 tornam-se mais adequados, por

indicarem a patogênese da doença e devem assim ser utilizados na classificação da diabetes

(OMS, 1999).

Segundo a ADA (2011), a classificação da diabetes inclui 4 classes clínicas: DM tipo

1, DM tipo 2, DMG e outros tipos específicos de diabetes devido a diversas causas como,

doenças do pâncreas exócrino como fibrose cística; uso de drogas após transplante de órgãos.

Pode-se ainda citar a diabetes neonatal, quando é constatada hiperglicemia nos primeiros três

meses de vida. É uma condição rara, que pode estar associada ao retardo do crescimento intra-

uterino. Pacientes com diabetes neonatal transitória podem, mais tarde, apresentarem diabetes

permanente (CRAIG; HATTERSLEY; DONAGHUE, 2009).

Pacientes com DM tipo 1 apresentam insulinopenia absoluta pronunciada com perda

da função secretória das células β das ilhotas pancreáticas, enquanto que pacientes com DM

tipo 2 apresentam secreção de insulina normal ou elevada, porém insuficiente para suprir a

demanda exacerbada pela resistência insulínica (RODACKI et al., 2008).

O DM tipo 1 é responsável por cerca de 5% a 10% de todos os casos de DM

(DESHPANDE; HARRIS-HAYES; SCHOOTMAN, 2008) sendo subdividido em: Tipo 1A,

tipo 1B e diabetes auto-imune latente em adultos (LADA) (Forti et al., 2006).

Pacientes com início abrupto dos sinais e sintomas, e descompensação metabólica

pronunciada necessitando de insulinoterapia desde o início do tratamento geralmente são

incluídos na categoria DM tipo 1 clássico (RODACKI et al., 2008). Uma característica

marcante nesses indivíduos é a tendência à cetose; podendo ser a cetoacidose diabética a

manifestação inicial da doença em até 30% dos casos (FORTI et al., 2006).


Apesar dos pacientes DM tipo 1 serem em sua maioria crianças, adolescentes ou

adultos jovens, o diagnóstico pode ser estabelecido em qualquer faixa etária (RODACKI et

al., 2008). Esse tipo de diabetes é caracterizado pela destruição de células β pancreáticas,

tornando-se clinicamente sintomática quando aproximadamente 90% das células β do

pâncreas são destruídas (CRAIG; HATTERSLEY; DONAGHUE, 2009).

No DM tipo 1A, a destruição das células β é de etiologia auto-imune, representando

90% dos casos, enquanto que o DM tipo 1B não apresenta causa conhecida (idiopático),

sendo este último descrito inicialmente em asiáticos e africanos. Entretanto, essa forma vem

sendo melhor estudada, descrita em outras populações como uma nova nomenclatura “DM

com tendência à cetoacidose” (MARASCHIN et al., 2010).

Na grande maioria dos casos, a agressão inicial às células β ocorre devido à ação dos

anticorpos, produzidos contra antígenos virais, que lesionam as células β, devido a um

mimetismo molecular entre os antígenos virais e os antígenos dessas células (FORTI et al.,

2006).

No DM tipo LADA, ocorre destruição das células β do pâncreas, porém de forma mais

lenta quando comparado ao DM tipo 1A. Acomete, geralmente, adultos jovens, entre os 30 e

50 anos de idade; e representa cerca de 10% dos casos de DM tipo 1 (FORTI et al, 2006).

As características dos pacientes com DM tipo LADA são peculiares. Estes não são

obesos e o diagnóstico acontece em idade compatível com o diagnóstico de DM tipo 2

(MARASCHIN et al., 2010). Pacientes com esse tipo de diabetes apresentam hiperglicemia

acentuada sintomática nos primeiros 6 a 12 meses, porém não havendo requerimento de

insulina nesse período, o que o assemelha ao DM tipo 2, entretanto apresentam auto-

anticorpos contra as células β e progressão mais rápida a insulino-dependência (CALSOLARI

et al., 2008).

O DM tipo 2 é responsável por mais de 90% dos casos, não apresentando componente

auto-imune (MARASCHIN et al., 2010). Esse tipo possui um componente genético

influenciado pelo meio ambiente (dieta e atividade física) e cuja interação contribui para a

manifestação clínica da doença (SIMÕES; BANDEIRA, 2003).

Em geral, ocorre após os 30 anos em indivíduos com histórico familiar da doença. O

tratamento é, geralmente, realizado com dieta e agentes hipoglicemiantes orais, sem

necessidade do uso de insulina. Quando o uso da insulina se faz necessário, ocorre pelo menos

cinco anos após o diagnóstico, diferenciando esse tipo do DM tipo 1, no qual há dependência

da insulina (MARASCHIN et al., 2010).


Os principais mecanismos fisiopatológicos que levam à hiperglicemia no DM tipo 2

são, a resistência insulínica periférica nos adipócitos, principalmente no músculo esquelético;

deficiente secreção de insulina pelo pâncreas e aumento na produção hepática de glicose,

resultante da resistência insulínica no fígado (FORTI et al., 2006).

Devido uma significativa proporção de diabéticos tipo 2 apresentarem-se

assintomáticos ou oligossintomáticos, o diagnóstico da doença é geralmente tardio. Este fato

implica na presença, não raramente, de complicações micro e macrovasculares quando ocorre

a detecção inicial da hiperglicemia (FORTI et al., 2006).

O tratamento atual do DM tipo 2 visa manter o controle glicêmico adequado, seja com

dieta hipocalórica, aumento da prática de exercícios físicos ou uso de medicamentos. Este

último é indicado quando a dieta e a atividade física não são capazes de obter um bom

controle, ou seja, glicemias de jejum, pós-prandial e hemoglobina glicada próximos aos níveis

normais (ARAÚJO; BRITTO; CRUZ, 2000).

O tratamento medicamentoso do DM tipo 2 é feito com hipoglicemiantes orais,

entretanto, pelo menos 30% dos pacientes irão fazer uso da insulinoterapia para obtenção do

controle glicêmico adequado. Isso ocorre devido a uma lenta e progressiva exaustão da

capacidade secretória de insulina, uma característica intrínseca da célula β neste tipo de DM

(FORTI et al., 2006).

Na categoria “outros tipos de DM”, destaca-se o Maturity Onset Diabetes of the Young

(MODY), uma forma de herança dominante de diabetes diagnosticada antes dos 25 anos

(SHIELDS et al., 2010). O termo MODY é usado para descrever um grupo de formas

clinicamente heterogêneas, sendo caracterizado por defeito na secreção de insulina, sem

dependência da mesma (MARASCHIN et al., 2010).

A prevalência de MODY ainda não foi completamente definida, mas acredita-se que

2% a 5% dos pacientes diagnosticados como portadores de DM tipo 2 e cerca de 10%

daqueles com aparente DM tipo 1 sejam, na verdade, MODYs (FORTI et al., 2006).

Ainda no quadro de “outros tipos de DM”, pode ser citada a diabetes originada pelo

uso de glicocorticóides (reguladores do metabolismo de carboidratos), ciclosporina (droga

imunossupressora que reduz as chances de rejeição de órgãos transplantados) e tacrolimus

(droga imunossupressora), uma vez que essas drogas podem levar a um aumento da

resistência à insulina e/ou diminuição da secreção insulínica por efeito tóxico direto sobre a

célula β pancreática (BASTOS JR. et al., 2005).


O diabetes mellitus gestacional é definido como qualquer grau de intolerância à

glicose com início ou primeiramente identificada na gestação (BULZICO, 2011; FORTI et al.,

2006).

As modificações hormonais ocorridas durante a gravidez ocasionam condições

favoráveis à diminuição da tolerância à glicose. Os hormônios produzidos pela placenta como

o estrogênio, a progesterona e a gonadotrofina coriônica possuem a capacidade de bloquear o

efeito da insulina; efeito este instalado entre a 20ª e 24ª semana de gestação. Com o avanço da

gestação a produção hormonal da placenta tende a ampliar, podendo assim iniciar a

resistência à insulina. Em muitas mulheres o pâncreas é capaz de produzir uma quantidade

adicional de insulina, compensando o efeito resistente. Porém, quando o pâncreas atinge o

máximo de sua produção de insulina e a quantidade produzida ainda é insuficiente para

reverter os efeitos dos hormônios placentários, tem-se como resultado o diabetes gestacional

(SCHMITT et al., 2009).

Normalmente, após o parto, o quadro se reverte, porém mulheres com passado de

DMG são consideradas como tendo um maior risco de desenvolvimento de DM tipo 2 no

futuro (BULZICO, 2011).

A classificação do diabetes mellitus geralmente é feita com base no quadro clínico do

paciente. Porém em algumas situações, especialmente em adultos, a classificação correta do

tipo de DM pode ser um pouco mais complicada, necessitando de investigação complementar,

com detecção de auto-imunidade (dosagem de auto-anticorpos) e avaliação da capacidade

secretória das células β pancreáticas (RODACKI et al., 2008).

Segundo Santos (2011), dentre os anticorpos (AC) que agem contra as células β,

destruindo as ilhotas, os mais importantes são os anticorpos anti-insulina, o anticorpo anti-

ilhota pancreática e o anticorpo contra enzimas das células β (anticorpo antidescarboxilase do

ácido glutâmico).

A autoimunidade contra as ilhotas pancreáticas foi descrita em 1965, mas a presença

de AC contra as ilhotas foi demonstrada em 1974. Desde então diferentes tipos de anticorpos

dirigidos ao pâncreas foram descritos, auxiliando no diagnóstico de pacientes com DM tipo 1,

uma vez que a presença de anticorpos indica um DM de etiologia auto-imune, e portanto, do

tipo 1 clássico, denominado tipo 1A (MARASCHIN et al., 2010). Quanto maior o número

desses anticorpos, e quanto mais elevados forem seus títulos, maior a chance do indivíduo

desenvolver a doença (FORTI et al., 2006).


Enquanto que a presença de anticorpos indica um DM tipo 1A, o DM tipo 1B é

caracterizado pela ausência de tais anticorpos, não havendo uma causa aparente para a

destruição das células pancreáticas (FORTI et al., 2006).

Os anticorpos são marcadores de autoimunidade e sua presença indica diabetes do tipo

1A. O AC anti-insulina está presente em indivíduos mais jovens, principalmente com início

do DM antes dos 5 anos de idade, sendo o melhor marcador da doença nessa faixa etária. O

antidescarboxilase do ácido glutâmico tem seu melhor desempenho nos indivíduos com início

da doença acima dos 20 anos de idade, e é o que permanece por mais tempo. Os AC anti-

ilhota estão presentes durante a fase de pré-diabetes e no início do quadro clínico, mas seus

títulos diminuem rapidamente. A presença está associada à perda mais rápida da função da

célula β e à previsão de necessidade de insulina em pacientes inicialmente classificados como

DM tipo 2 (MARASCHIN et al., 2010).

A positividade dos anticorpos prediz a necessidade de insulina e sua solicitação está

indicada nos casos de dúvida diagnóstica, que ocorrem especialmente quando a instalação do

quadro de DM ocorre após os 30 anos de idade (MARASCHIN et al., 2010).

Além da utilização dos AC como auxiliar na classificação do tipo de DM, a avaliação

da função secretória das células β também tem sido empregada. Uma das formas de avaliação

seria a dosagem da própria insulina. Contudo, a dosagem da insulina plasmática tem utilidade

limitada, uma vez que esta apresenta meia-vida curta (4 minutos), extração hepática variável e

clearance intra e interindividual bastante variável. Portanto, a insulinemia plasmática,

geralmente, não reflete de maneira fidedigna a capacidade secretória das células β

pancreáticas. Além disso, os testes para medir insulina plasmática não distinguem insulina

endógena da exógena, o que pode ser um importante problema no uso do teste em pacientes

em insulinoterapia (RODACKI et al., 2008).

Uma alternativa para avaliação da função residual das células β, seria a dosagem do

peptídeo C (PEPC). Segundo Rodacki e colaboradores (2008), a sua utilização apresenta

algumas vantagens em relação à insulina. O PEPC é secretado, em quantidades equimolares,

com a insulina, possui meia-vida mais longa (30 minutos), não sofre metabolização hepática

significativa e possui clearance mais previsível.

A medida do PEPC pode ser realizada em condição basal, randômica (em qualquer

horário do dia) ou estimulada por glucagon endovenoso (EV), intramuscular ou subcutâneo,

por refeição mista ou por glicose oral ou EV (RODACKI et al., 2008). Porém, os dois

estímulos mais utilizados são o glucagon EV e o teste da refeição mista, sendo este último

recomendado pela ADA (MARASCHIN et al., 2010).


Como ponto de corte para classificar os pacientes, deve ser considerado que valores de

PEPC basal acima de 0,9ng/mL e acima de 1,8ng/mL após a injeção de glucagon evidenciam

reserva de insulina compatível com diabetes tipo 2 e valores inferiores confirmam o

diagnóstico de diabetes tipo 1 (GROSS et al., 2002).

A concentração de PEPC fornece, assim, uma avaliação precisa da função residual das

células β, tornando-se um importante marcador da secreção de insulina em pacientes com

diabetes (LITTLE et al., 2008).

2.1.4 Diagnóstico e avaliação do controle da diabetes

O diagnóstico de diabetes mellitus passa por duas fases, a primeira na qual sugere

doença (diagnóstico presuntivo ou hipotético), e a segunda, na qual se certifica da existência

(diagnóstico de certeza). Para o correto diagnóstico se faz necessário não só interrogar e

examinar o paciente, bem como conhecer seu histórico clínico e familiar (MORALES et al.,

2006). Portanto, o diagnóstico da diabetes é realizado associando-se o aspecto clínico e

laboratorial do paciente (FORTI et al., 2006).

Os sintomas clínicos clássicos do DM como a polidpsia, poliúria e polifagia,

associados a perda de peso, são mais característicos do DM tipo 1, estando sempre presentes.

Porém a obesidade não exclui o diagnóstico. Sintomas mais inespecíficos tais como tontura,

dificuldade visual, astenia (fraqueza muscular) e/ou câimbras são mais comuns no DM tipo 2.

Nesse tipo de diabetes cerca de 50% dos pacientes desconhecem ter a doença por serem

assintomáticos ou oligossintomáticos e 80% apresentam-se acima do peso (FORTI et al.,

2006).

Os critérios de diagnóstico para diabetes estão também baseados em medições de

glicose no sangue. Três maneiras de diagnosticar essa doença são possíveis e cada uma delas,

na ausência de hiperglicemia inequívoca, deve ser confirmada em um dia subseqüente

(CRAIG; HATTERSLEY; DONAGHUE, 2009).

Na ausência de sintomas, na presença de sintomas leves de diabetes, em condições

infecciosas agudas ou por algum estresse, a hiperglicemia detectada pode ser transitória e não

deve ser isoladamente considerada como diagnóstico de diabetes (CRAIG; HATTERSLEY;

DONAGHUE, 2009).

Ao se detectar taxas de glicose elevadas em um paciente, é necessário certificar-se de

que não estejam sendo causadas por outros fatores, tais como estresse, situações emocionais,


diuréticos, anti-hipertensivos, contraceptivos orais, antidepressivos, entre outros; uma vez que

nem sempre a hiperglicemia é sinônimo de diabetes mellitus (MORALES et al., 2006).

O diagnóstico da diabetes não deve basear-se em uma única concentração de glicose

no plasma, sendo necessária a observação contínua dos níveis glicêmicos em jejum, e/ou duas

horas após refeição (glicemia pós-prandial) e/ou em um teste de tolerância oral à glicose

(TOTG) (CRAIG; HATTERSLEY; DONAGHUE, 2009). Segunda a Associação Americana

de Diabetes, existem alguns critérios que possibilitam o diagnóstico do diabetes mellitus

como demonstrado na Tabela 1.

Tabela 1. Critérios de diagnóstico do diabetes mellitus segundo a Associação Americana de Diabetes (2011). Glicemia de jejum* ≥ 126mg/dL O jejum é definido como ausência de ingestão calórica por, pelo menos, 8h. Glicose plasmática* ≥ 200mg/dL, 2h após ingestão de glicose durante o TOTG O teste deve ser realizado como descrito pela OMS por ingestão de 75g de glicose anidra dissolvida em água. HbA1c ≥ 6,5% Hiperglicemia ocasional ≥ 200mg/dL em pacientes com sintomas clássicos de hiperglicemia ou crise hiperglicêmica. *Na ausênica de hiperglicemia inequívoca, o resultado deve ser confirmado pela repetição do teste. Fonte: ADA, 2011

O nível glicêmico máximo considerado normal da glicemia de jejum é de 99mg/dL,

estando a glicemia de jejum inapropriada (pré-diabetes) definida entre 100 e 125mg/dL

(BEM; KUNDE, 2006). Pré-diabetes é uma condição precursora da diabetes na qual uma

pessoa tem níveis elevados de glicose no sangue, porém não satisfaz os critérios diagnósticos

de diabetes. Indivíduos com pré-diabetes podem ter glicemia de jejum alterada ou tolerância à

glicose diminuída, ou ambos (DESHPANDE; HARRIS-HAYES; SCHOOTMAN, 2008).

A glicemia de jejum apresenta-se como a forma mais prática de se avaliar o nível

glicêmico, e dois valores maiores ou iguais a 126mg/dL, obtidos em dias diferentes, são

suficientes para se estabelecer o diagnóstico de diabetes mellitus.Valores glicêmicos entre 100

e 125mg/dL caracterizam a glicemia de jejum alterada e nesse caso, os pacientes devem ser

submetidos ao TOTG (FORTI et al., 2006).

O TOTG consiste, após a coleta sangüínea para análise da glicemia de jejum, na

administração de 75g de glicose anidra ou 82,5g de glicose monohidratada dissolvidos em

250 a 300 mL de água. Sendo administrado em crianças 1,75g/kg de peso corporal até um

máximo de 75g (CRAIG; HATTERSLEY; DONAGHUE, 2009; FORTI et al, 2006).


No critério de diagnóstico considerado pela ADA, a dosagem da HbA1c é de extrema

importância uma vez que a membrana da hemácia apresenta-se altamente permeável à

molécula de glicose, fazendo com que a hemoglobina presente em seu interior fique exposta

praticamente à mesma concentração da glicose plasmática (SUMITA; ANDRIOLO, 2008).

O termo hemoglobina glicada define um grupo de substâncias formado a partir da

reação entre a hemoglobina A (HbA) e um açúcar. O componente mais importante deste

grupo é a fração A1c, na qual um resíduo de glicose liga-se ao aminoácido valina, amino

terminal, de uma ou de ambas as cadeias β da HbA. A ligação entre a HbA e a glicose é o

produto de uma reação não-enzimática definida como glicação, ocorrendo em maior ou menor

grau, conforme o nível de glicemia. A HbA1c permanece dentro das hemácias e sua

concentração dependerá, basicamente, da taxa glicêmica média e da meia-vida das hemácias

(SUMITA; ANDRIOLO, 2008).

A dosagem da HbA1c é considerada não só um critério diagnóstico como também um

parâmetro essencial na avaliação do controle do DM. Visto que a quantidade de glicose ligada

à hemoglobina é diretamente proporcional à concentração média de glicose no sangue, e

como as hemácias possuem meia vida de aproximadamente 120 dias, a dosagem da glicose

ligada à hemoglobina pode fornecer uma avaliação do controle glicêmico médio no período

de 60 a 90 dias que antecedem a coleta de sangue para o exame (GOLDSTEIN et al., 2004,

NETTO et al., 2009).

Uma vez que os níveis da HbA1c apresentem-se acima dos níveis de normalidade e

uma medida terapêutica seja adotada, o intervalo para que essa hemoglobina retorne aos

níveis estáveis é de aproximadamente dez semanas. Portanto, a repetição do exame de HbA1c

para avaliar a eficácia do tratamento deve ser realizada somente dois a três meses após o

início ou a modificação do esquema terapêutico. Caso deseje-se avaliar as mudanças

glicêmicas em períodos mais curtos, deve-se utilizar outro método como critério de controle, a

dosagem de frutosamina (SUMITA; ANDRIOLO, 2008).

A frutosamina é uma proteína glicada, formada pela reação não-enzimática entre

glicose e proteína, sendo 60 a 70% dessa última a albumina sérica. A dosagem da frutosamina

reflete, diretamente, a dinâmica da concentração de glicose das últimas 2 a 3 semanas

(SALES et al., 2010), uma vez que a albumina apresenta uma meia-vida de até 20 dias

(FORTI et al., 2006).

Entre tantos critérios diagnósticos, a glicemia de jejum ainda é o método de escolha

por ser mais econômica, de fácil execução, favorecendo, dessa forma, a realização em maior

número de pessoas. Esse método é, ainda, o mais recomendado pela ADA quando comparado


ao TOTG que na realização apresenta dificuldades devido à possibilidade de causar náuseas,

necessitar de preparação prévia e apresentar maior variabilidade (GROSS et al., 2002).

De acordo com a ADA (2011), ao se realizar um teste diagnóstico de diabetes, assim

como na maioria dos testes de diagnóstico, se faz necessário repetição para exclusão de

possível erro laboratorial. É preferível que o mesmo teste seja repetido para confirmação

diagnóstica, uma vez que haverá maior probabilidade de concordância neste caso. Por

exemplo, se a HbA1c é de 7,0% e um resultado de repetição é de 6,8%, o diagnóstico de

diabetes é confirmado. No entanto, se dois testes diferentes (como HbA1c e glicemia de

jejum) estão ambos acima dos seus valores referenciais, o diagnóstico de diabetes também

estará confirmado.

Entretanto, se dois diferentes testes são realizados e seus resultados apresentam-se

discordantes, o teste cujo resultado encontra-se acima do valor referencial para o diagnóstico

deve ser repetido, sendo o diagnóstico feito com base na confirmação deste (ADA, 2011).

O rastreamento da diabetes deve ser uma prática comum entre os indivíduos com mais

de 45 anos de idade a cada 3 anos, ou mais precocemente e mais freqüentemente em

indivíduos assintomáticos quando apresentarem fatores de risco para o desenvolvimento da

doença (GROSS et al., 2002).

O diagnóstico correto e precoce do DM e das alterações da tolerância à glicose é

extremamente importante já que permite adotar medidas terapêuticas que podem evitar o

aparecimento de diabetes nos indivíduos com tolerância diminuída, bem como retardar o

aparecimento de complicações crônicas em pacientes diagnosticados com diabetes mellitus

(GROSS et al., 2002).

2.1.5 Diabetes e infecções

Considerando-se a alta prevalência da diabetes, os médicos devem estar preparados

não apenas para lidar com as intercorrências mais simples e cotidianas da doença, mas

também com condições clínicas secundárias como infecções. Diversos achados laboratoriais

auxiliam na compreensão da associação entre DM e infecção. O paciente diabético apresenta

depressão da atividade dos polimorfonucleares neutrófilos, diretamente relacionada aos níveis

de hiperglicemia, demonstrando menor capacidade de fagocitose. Expressam, também,

alteração na aderência, quimiotaxia e opsonização leucocitária - o sistema imune celular

apresenta uma resposta ineficiente. E, por fim, alteração dos sistemas antioxidantes e menor

produção de interleucinas (IL-2), indispensáveis no processo inflamatório para uma resposta


imunológica eficaz. Por outro lado, a função humoral parece estar preservada (ROCHA et al.,

2002).

Pacientes com diabetes parecem ter um risco aumentado para bacteriúria assintomática

e infecção do trato urinário, bem como infecção da pele e mucosas, incluindo infecções por

Candida (MULLER et al., 2005).

Pavlović e colaboradores (2007) afirmam que diabéticos, freqüentemente, apresentam

algum tipo de lesão na pele que, geralmente, aparece logo após o desenvolvimento da doença,

porém também podendo ocorrer como o primeiro sinal.

Entre as lesões na pele, pode-se citar a lesão mais conhecida como pé diabético, que

resulta da presença de neuropatia e/ou vasculopatia, sendo considerada uma complicação que

piora a qualidade de vida do paciente, representando um importante fator de predisposição à

presença de infecções (RODRIGUES et al., 2010). Segundo o Consenso Internacional sobre

Pé Diabético (2001), o pé diabético, de etiologia multifatorial, é caracterizado como uma das

mais sérias e dispendiosas complicações do DM, sendo responsável por 40% a 70% das

amputações das extremidades inferiores. Os portadores dessa condição clínica apresentam o

risco 15 vezes maior de amputação (BONA et al., 2010), porém com a higiene adequada do

pé, o uso de meias e sapatos confortáveis, cuidados com as unhas, bem como evitar os pés

descalços são medidas simples que podem impedir o surgimento de lesões (RODRIGUES et

al., 2010).

De maneira geral, os pacientes com DM são reconhecidos como mais vulneráveis a

uma série de complicações de natureza metabólica e/ou de origem infecciosa, como processos

bacterianos, fúngicos e virais (MINELLI et al., 2003).

Diversas infecções superficiais causadas por fungos acometem mais freqüentemente a

população com DM (RODRIGUES et al., 2010). Entre as infecções fúngicas superficiais,

destacam-se as freqüentes infecções ungueais (onicomicoses), que levam a relevantes

alterações das unhas, podendo favorecer o aparecimento de infecções secundárias, como

paroníquias (infecção da pele ao redor da unha) (MINELLI et al., 2003). Destaca-se, ainda, o

intertrigo que se refere a qualquer lesão cutânea ocorrida em superfícies opostas em contato,

como por exemplo, a região inguinal, axilas, região inframamária e dobras abdominais

(RODRIGUES et al., 2010).

Infecções ungueais raramente causam sintomas ou desconforto (RODRIGUES et al.,

2010), e o longo período de tratamento com drogas antifúngicas, exige o cumprimento

rigoroso do paciente. Portanto, tem sido sugerido que muitos pacientes com onicomicose

sejam negligenciados e permaneçam sem tratamento. Porém, a subestimação de onicomicose


em pacientes diabéticos pode conduzir a uma inflamação grave na derme e camada

subcutânea da pele, bem como pode agir como um fator predisponente a úlceras nos pés

(TAKEHARA et al., 2011).

O paciente com DM freqüentemente é acometido por infecções cutâneas e sistêmicas.

Muitas de suas doenças necessitam de diagnóstico e tratamento precoces para que sejam

evitadas complicações ocasionalmente graves ou mesmo fatais (MINELLI et al., 2003).


2.2 PROTEÍNA MBL E GENE MBL2

O sistema complemento (SC) é formado por aproximadamente 35 proteínas

plasmáticas e associadas à membrana celular, constituindo uma das principais vias efetoras da

resposta imunológica e inflamatória. Essas proteínas, ativadas em forma de cascata por meio

de clivagens proteolíticas seqüenciais e formação de complexos de proteínas, desempenham

importante papel na manutenção da homeostase do hospedeiro, uma vez que combatem

microrganismos e removem complexos imunes circulantes bem como células apópticas

(ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; TULAMO et al., 2010).

A cascata do SC é ativada por de três diferentes vias: clássica, alternativa e das

lectinas (GULLA et al., 2009). Esta última consiste em moléculas padrão de reconhecimento

denominada MBL (SCHLAPBACH et al., 2010).

A MBL é o componente central da ativação da via das lectinas do sistema

complemento responsável por mediar um efeito antimicrobiano através da formação do

complexo de ataque à membrana (GARCIA-LAORDEN et al., 2008) ou exercer papel de

opsonina promovendo a fagocitose de microrganismos patogênicos por um mecanismo

independente de anticorpo (SILVA, 2010). Embora o mecanismo desta última função não

tenha sido completamente elucidado, presume-se que se houver atuação direta da MBL como

opsonina, há uma interação com receptores específicos para colectinas expressos na superfície

de células fagocíticas (CARVALHO, 2006).

Sua síntese é realizada no fígado e, embora essa proteína circule predominantemente

no soro, também tem sido encontrada em outros sítios, como no fluido do ouvido médio,

líquido amniótico de uma gestação de 26 semanas e secreção nasofaríngea (GARRED et al.,

1993; MALHOTRA et al., 1994).

A MBL pertence à família de proteínas chamadas colectinas, cujos membros

apresentam domínios de reconhecimento de carboidratos associados a estruturas colagenosas

(CARVALHO, 2006). A forma circulante de MBL consiste em multímeros de cadeias

polipeptídicas idênticas de 32 kDa, possuindo cada cadeia quatro regiões distintas codificadas

por éxons diferentes do gene MBL2 (DOMMETT; KLEIN; TURNER, 2006; IP et al., 2009).

Cada cadeia tem uma região C-terminal, domínio de reconhecimento de carboidratos

cálcio-dependente (DRC), através do qual a MBL se liga aos diferentes patógenos; um

domínio hidrofóbico α-helicoidal (região de dobradiça); uma região que se assemelha ao

colágeno contendo 19 trincas Gly-Xaa-Xaa e uma região N-terminal rica em cisteína (Figura

1). (ARAÚJO, 2009; CARVALHO, 2006; DOMMETT; KLEIN, TURNER, 2006).


Figura 1. Estrutura da Lectina Ligadora de Manose.

DRC: Domínio de reconhecimento de carboidratos.

Fonte: KALIL, 2006.

Três cadeias polipeptídicas formam uma tripla hélice, interagindo através de suas

regiões colagenosas. A região hidrofóbica de cada cadeia adota forma espiralada e os

domínios de reconhecimento de carboidratos apresentam características de proteínas

globulares (CARVALHO, 2006, DOMMETT; KLEIN; TURNER, 2006). O trímero é

estabilizado por interações hidrofóbicas e pontes dissulfeto entre as regiões N-terminais, ricas

em cisteína, de cada cadeia. Esta forma trimérica é a subunidade estrutural básica de todas as

formas circulante de MBL (IP et al., 2009).

No soro, a MBL consiste de oligômeros, variando de dímeros a hexâmeros, que

formam uma estrutura quaternária com a aparência de um “buquê de tulipas”, devido a uma

interrupção na região colagenosa, dando origem a uma torção/dobradiça, segundo estudos de

cristalografia de raios-x/eletromicrografias (CARVALHO, 2006; DOMMETT; KLEIN;

TURNER, 2006).

A MBL liga-se a açúcares como D-manose, L-fucose e N-acetil-D-glucosamina na

superfície de vírus, bactérias e fungos, levando à ativação do complemento. Muitos destes

açúcares não estão normalmente expostos em grandes quantidades nas superfícies celulares de

mamíferos, o que dificulta o reconhecimento de estruturas próprias pela MBL e favorece uma


interação mais apropriada com superfícies celulares microbianas (CARVALHO, 2006). Além

das estruturas de açúcar, tem sido demonstrado que a MBL também pode se ligar a

fosfolipídios (KILPATRICK, 1998), ácidos nucléicos (PALANIYAR et al., 2004) e proteínas

não-glicosiladas (IP et al., 2009).

Como todas as proteínas pertencentes à família das colectinas, a MBL mostra-se

seletiva e dependente de cálcio ao realizar ligação com os açúcares D-manose, L-fucose e N-

acetil-D-glucosamina, porém não apresenta seletividade para D-galactose e ácido siálico. Essa

seletividade baseia-se na presença de resíduos de aminoácidos conservados dentro de seus

domínios reconhecedores de carboidratos (DRCs) (IP et al., 2009).

O DRC contém uma região formada por três aminoácidos (Glu-Pro-Asn) que

proporciona uma preferência por açúcares com grupos hidroxilas equatoriais 3-OH e 4-OH,

como D-manose, L-fucose N-acetil-D-glucosamina encontrados na superfície de vários

microrganismos. A presença desse trímero de aminoácidos (Glu-Pro-Asn) é portanto essencial

para a capacidade de distinção de próprio e não-próprio, uma vez que a maioria das estruturas

de carboidratos animais é encerrada por ácido siálico e galactose, não reconhecidos pela MBL

(IP et al., 2009).

O domínio α-helicoidal da região de dobradiça fornece flexibilidade para a orientação

do DRC que reconhece a orientação específica dos grupos hidroxilas presentes em

determinados açúcares, como D-manose e L-fucose. No entanto, a afinidade de um único

DRC a um monossacarídeo é fraca e, portanto, uma forte interação requer ligações

simultâneas de múltiplos DRCs (IP et al., 2009).

Estudos estruturais têm demonstrado que os três sítios de ligação de uma subunidade

da proteína MBL (ou seja, a tripla hélice) são separados por uma distância constante de 45 Å

(IP et al., 2009). Devido a essa distância, a ligação a uma molécula simples de manose se

torna inviável, favorecendo tal interação com padrões repetitivos de açúcares. Embora a

afinidade de cada interação lectina-açúcar seja de apenas 10-3 M, a oligomerização da MBL

permite uma ávida ligação aos carboidratos, dada pela presença de múltiplos sítios que se

ligam simultaneamente. Formas com menor grau de polimerização ligam-se menos

avidamente aos açúcares, além de apresentarem falhas na ativação do complemento

(CARVALHO, 2006).

Estudos recentes têm sugerido que MBL atua em processos inflamatórios, através do

estímulo na liberação de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1 e IL-6. Entre outras

funções, a proteína ainda reconhece estruturas próprias alteradas e depura células apópticas

(CARVALHO, 2006; DOMMETT; KLEIN; TURNER, 2006).


Diferentemente de algumas proteínas de fase aguda, como por exemplo a proteína C-

reativa, cujos níveis podem aumentar 10-1000 vezes durante a inflamação, os níveis de MBL

são relativamente constantes, aumentando 2-3 vezes durante processos inflamatórios (IP et al.,

2009).

Quanto à depuração das células apópticas, o atraso na remoção de tais células pode

resultar na desintegração celular e liberação de componentes intracelulares, o que facilitaria a

resposta auto-imune. Assim, tem sido sugerido que a deficiência de MBL pode levar ao

acúmulo de restos celulares, o que predispõe os pacientes a auto-imunidade (CARRÉRA et

al., 2010).

Entretanto, em estudo feito por Stuart e colaboradores (2005) em camundongos MBL

nulo com atraso na remoção de células apópticas, foi possível observar que apesar da

circulação prolongada dessas células não foi verificado qualquer sinal de doença auto-imune;

sugerindo que a MBL exerça um papel na depuração de células apópticas, porém a propensão

a desenvolver uma auto-imunidade exige mais do que uma falha no clearance dessas células

(IP et al., 2009).

Para que a MBL exerça sua atividade funcional completa, é necessário que esteja no

mínimo na forma de tetrâmero (CARVALHO, 2006; DOMMETT; KLEIN; TURNER, 2006,

IP et al., 2009). E uma vez que ocorra a ativação do sistema complemento pela via das

lectinas, é necessário que a proteína MBL forme um complexo, através de sua região

colagenosa, com diferentes proteases denominadas MASP-1, MASP-2, MASP-3 e a proteína

de 19KDa sMAp ou MAp19 (CARVALHO, 2006).

MASP-1 e MASP-2 são codificadas por genes distintos, enquanto que a MASP-3 e

sMAp são produtos de splicing aternativo de genes da MASP-1 e MASP-2, respectivamente.

Apenas MASP-1 e MASP-2 possuem um domínio serina protease, o que sugere ser as outras

MASPs apenas reguladoras da via. Estudos sugerem que a ligação da MBL à superfície

celular inicia uma auto-ativação da MASP-2, ocorrendo clivagem do C4 e C2 para a formação

da C3 convertase (C4bC2a); enquanto que a MASP-1 cliva, apenas, o C2 (IP et al., 2009;

MATSUSHITA et al., 2000).

A proteína MBL é codificada pelo gene MBL2, localizado no braço q11.2-q21 do

cromossomo 10, sendo formado por quatro éxons (CHAGAS et al., 2005). O éxon 1 codifica

o peptídeo sinalizador, a região rica em cisteína e parte da região de colágeno. O éxon 2 é

responsável por codificar o restante da região de colágeno. O éxon 3 codifica a região de

dobradiça e o éxon 4 codifica o DRC - Figura 2 (MONTICIELO, 2008).


Figura 2. Estrutura do gene MBL2. O éxon 0 não é traduzido em proteína. O éxon 1 codifica a região rica em

cisteína e parte da região do colágeno. O éxon 2 é responsável por codificar o restante da região de colágeno.

O éxon 3 codifica a região de dobradiça e o éxon 4 codifica o DRC. Fonte: Adaptado de MARTINY, 2011.

Três polimorfismos comuns são encontrados no éxon 1, nos códons 52, 54 e 57,

responsáveis por causarem substituições de aminoácidos, arginina-cisteína (CGT para TGT);

glicina-ácido aspártico (GGC para GAC) e glicina-ácido glutâmico (GGA para GAA),

respectivamente, na região de colágeno, alterando sua capacidade de oligomerização (Figura

3) (BOUWMAN; ROEP; ROOS, 2006; IP et al., 2009); apresentado os monômeros variantes

resultantes baixa capacidade de fixação de complemento (EISEN; MINCHINTON, 2003).


Figura 3. Alelos variantes alteram a região colagenosa da proteína MBL. MBL não funcional. Fonte: EISEN

e MINCHINTON, 2003.

Por convenção, o tipo selvagem do gene é chamado de alelo ‘A’, estando associado a

níveis normais de MBL. Os polimorfismos são chamados de 'B' (códon 54), 'C' (códon 57) ou

'D' (códon 52), refletindo a ordem de sua descoberta; sendo a presença de qualquer uma

dessas mutações de codificação denominada de alelo 'O' (WORTHLEY; BARDY;

MULLIGHAN, 2005).

Deficientes e baixos níveis séricos de MBL são principalmente devido à presença

dessas três mutações, sendo esses níveis muito baixos ou ausentes encontrados em pacientes

homozigotos para o alelo O (GARCIA-LAORDEN et al., 2008).

A concentração sérica da proteína MBL também pode ser alterada devido a

polimorfismos presentes na região promotora do gene MBL2. Sequenciamento da região

promotora 1 do gene MBL2 revelou que esta é altamente polimórfica e três mutações, em

particular, estão associadas com diferentes níveis da proteína independente dos alelos

variantes estruturais do gene MBL2. Os três polimorfismos estão situados nas posições -550

(variante H/L resultante da substituição de G por C), -221 (variante X/Y, substituição de C

por G) e na porção 5’ não traduzida do éxon 1 na posição 4+ (variante P/Q, substituição de C

por T). Apresentando o locus -221, que abriga a variante X, maior influência na redução dos

níveis séricos de MBL (GARRED et al., 2009).

Essa proteína é considerada ainda um enigma da imunidade inata, devido ao seu

caráter duplo, sendo relatada por alguns autores como uma “faca-de-dois-gumes”, citada

como “Jekyl-and-Hyde” (SILVA, 2010). As implicações de baixos níveis de MBL têm sido

alvo de um grande número de pesquisas devido a influência na susceptibilidade do hospedeiro


a uma variedade de recorrentes processos infecciosos e doenças auto-imunes (MILLER et al.,

2010).

Porém, esses mesmos níveis baixos de MBL foram citados representando uma

proteção contra microrganismos intracelulares como, por exemplo, Leishmania (SANTOS et

al., 2001), uma vez que este se utiliza da opsonização e fagocitose mediada pela MBL para

entrar na célula do hospedeiro, podendo assim se disseminar (CARVALHO, 2006; SILVA,

2010).

O primeiro caso de associação entre doenças e deficiência de MBL data de 1968.

Neste estudo, de Miller e colaboradores (1968), uma menina sofria de infecções bacterianas

recorrentes não responsivas à antibioticoterapia e esteróides, devido a uma deficiência de um

fator do plasma que, embora desconhecido na época, era a proteína MBL (WORTHLEY;

BARDY; MULLIGHAN, 2005).

Desde então, deficiência de MBL vem sendo associada ao aumento da frequência e

severidade das infecções bacterianas, virais e fúngicas em crianças e adultos (DEAN et al.,

2005).

Roy e colaboradores (2002) realizaram estudo em pacientes diagnosticados com

doença pneumocócica invasiva, o qual demonstrou uma associação entre o genótipo MBL e o

risco de desenvolver a doença. Os autores observaram que o genótipo homozigoto (OO)

apresentava-se mais freqüente em pacientes portadores da doença quando comparados aos

indivíduos controles. Da mesma forma, Eisen e colaboradores (2008) realizaram um estudo

em portadores da infecção pneumocócica, demonstrando que a deficiência de MBL contribui

para o aumento do risco de morte em pacientes com esta infecção.

Tan e colaboradores (2009) observaram em estrudos realizados na China, que a

frequência de genótipos mutantes foi significativamente maior em pacientes infectados pelo

Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) quando comparados aos controles, bem como se

apresentava associada à progressão da doença. Da mesma forma, em um estudo realizado por

Silva (2010), os polimorfismos no gene MBL2 foram encontrados em maior frequência em

pacientes HIV positivos, de Porto Alegre, Brasil, quando comparados ao grupo controle,

indicando que esses pacientes podem apresentar uma maior dificuldade na eliminação do

patógeno, aumentando assim a susceptibilidade à infecção pelo HIV.

Ainda relacionando os polimorfismos no gene MBL2 a infecções virais, Segat e

colaboradores (2007) realizaram estudo com portadores da hepatite C do Nordeste brasileiro e

observaram maior frequência do alelo variante O nesses pacientes quando comparados a um


grupo controle, indicando que a MBL pode ter um importante papel protetor na infecção pelo

vírus da hepatite C.

Além dos estudos realizados buscando associar deficiência de MBL a infecções

bacetrianas e virais, várias são as pesquisas realizadas que buscam correlacionar essa mesma

deficiência a infecções fúngicas. Giraldo e colaboradores (2007) realizaram um estudo no Rio

Grande do Norte, Brasil, buscando associar polimorfismo no códon 54 no éxon 1 do gene

MBL2 e diagnóstico de candíase vulvovaginal recorrente. Os autores observaram que

mulheres com esta infecção apresentavam a frequência do alelo mutante 2 ½ maior quando

comparadas ao grupo controle.

Em 2009, Ampel e colaboradores realizaram estudo no Arizona avaliando os níveis de

MBL em pacientes com coccidioidomicose ativa. Puderam concluir que os pacientes, com

qualquer forma sintomática da doença, apresentavam baixos níveis da proteína, sugerindo

uma associação entre os níveis deficientes da MBL e a coccidioidomicose sintomática.

Os polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2, com conseqüente diminuição da MBL

funcional, também vem sendo associado a doenças auto-imunes como lúpus eritematoso

sistêmico (MONTICIELO, 2008; SANDRIN-GARCIA et al., 2011), artrite reumatóide (IP et

al., 2000), doença celíaca (BONIOTTO et al., 2002), entre outras; uma vez que essa proteína

se liga a células apópticas e restos celulares, contribuindo, assim, para eliminação de

potenciais auto-antígenos (TSUTSUMI et al., 2003).

Existem também relatos associando deficiente MBL a algumas afecções clínicas como

leucemias (SCHMIEGELOW et al., 2002), abortos recorrentes (CHRISTIANSEN et al.,

1999), diabetes mellitus tipo 1 (TSUTSUMI et al., 2003), diabetes mellitus gestacional

(MEGIA et al., 2004), entre outras.

Vários são os estudos que buscam compreender a razão para a maior susceptibilidade

de pacientes diabéticos em desenvolver as mais diversas infecções e complicações clínicas

(HANSEN et al., 2004; HOVIND et al., 2005; KAUNISTO et al., 2009). Porém, ao contrário

do que se pensa, não são fortes as evidências clínicas que sustentam a associação entre DM e

infecção. O que está bem definido é uma maior incidência de infecções específicas, muitas

vezes com maiores taxas de complicações e maior severidade (ROCHA et al., 2002).

Dessa forma, faz-se necessário a realização de estudos para que se possa concluir a

razão da maior susceptibilidade desses pacientes no desenvolvimento das mais diversas

infecções, entre estas a infecção fúngica.

Os achados científicos correlacionando baixos níveis de MBL e doenças vêm se

mostrando de grande importância, uma vez que a partir da identificação dessa deficiência, a


MBL pode ser administrada em quantidades terapêuticas objetivando a reconstituição de

defeitos opsônicos e na recuperação de infecções (GUPTA; GUPTA; HAJELA, 2008), como

demonstrado em alguns estudos realizados (GARRED et al., 2002; JENSENIUS et al., 2003;

VALDIMARSSON, 2003).


3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS

Foram realizadas coletas, para diagnóstico micológico, de 131 pacientes com diabetes

mellitus do Hospital Barão de Lucena (HBL), Hospital das Clínicas da Universidade Federal

de Pernambuco (HC-UFPE) e do Instituto Brasileiro de Diabetes (IBRADI), localizados em

Recife, Pernambuco, no período de outubro/2010 a setembro/2011, de acordo com a

solicitação médica.

Escamas ungueais e epidérmicas foram obtidas por escarificação da região, com

auxílio de um bisturi e placa de Petri, previamente esterilizados. E, quando necessário, foi

realizada a técnica de Porto (1953) com auxílio de fita adesiva e lâmina.

Após coleta, as amostras clínicas foram transportadas ao Laboratório de Micologia

Médica da Universidade Federal de Pernambuco para realização do diagnóstico micológico.

O projeto passou pela aprovação do Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde

da UFPE protocolado com o nº 307/10 e registrado no SISNEP FR – 366987(Anexo A).

Todos os indivíduos que participaram do estudo assinaram o termo de consentimento livre e

esclarecido (Anexo B).

3.1.1 Manipulação das amostras clínicas

Após a obtenção das amostras, foram preparadas lâminas para realização do exame

direto clarificadas com solução aquosa a 20% de hidróxido de potássio (KOH), bem como as

amostras coletadas através da técnica de Porto foram coradas com azul de metileno.

Concomitantemente, foram semeadas, em duplicata, na superfície do meio ágar Sabouraud

adicionado de cloranfenicol (50mg/L) e de uma fonte de lipídios (1%), mantidas às

temperaturas de 30ºC e 37ºC por um período de até 20 dias. Após o surgimento das colônias,

estas foram purificadas e em seguida, identificadas.

3.1.2 Purificação das culturas

Fragmentos da colônia foram adicionados a água destilada esterilizada contendo

50mg/L de cloranfenicol. Desta suspensão, 0,2 mL foram semeados na superfície do meio

Ágar Sabouraud adicionado de cloranfenicol (50mg/L) contido em placas de Petri. As


unidades formadoras de colônia foram repicadas para tubos de ensaio contendo meio

específico, de acordo com o fungo isolado, para posterior identificação.

3.1.3 Identificação dos agentes etiológicos

Após serem obtidas culturas puras, estas foram identificadas de acordo com as

características macroscópicas (bordos, textura, coloração do verso e reverso das colônias,

produção de pigmentos e tempo de crescimento), microscópicas (estruturas somáticas e

reprodutivas), fisiológicas (assimilação e fermentação de fontes de carbono e nitrogênio) e

bioquímicas (produção de urease e ácido acético) (BARNETT; PAINE; YARROW, 2000; DE

HOOG et al., 2000; LACAZ et al., 2002).

3.1.4 Avaliação clínica e epidemiológica

Foram avaliados os seguintes parâmetros: sexo, idade, tipos de diabetes, sítios

anatômicos acometidos e agentes etiológicos identificados.

3.1.5 Seleção do grupo para estudo do gene MBL2

As amostras sanguíneas foram coletadas por punção venosa, em tubos a vácuo do tipo

Vacuette® contendo anticoagulante EDTA, de pacientes diabéticos com infecção micótica

atendidos nos Ambulatórios de Endocrinologia do HC-UFPE, do HBL e IBRADI. Para

controle do gene MBL2, foram utilizados pacientes portadores de diabetes atendidos nos

mesmos serviços de saúde, sem micose, pareados em sexo e idade em relação aos pacientes,

escolhidos aleatoriamente na população. Como controle sadio foi utilizado o banco de DNA

do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA).

3.1.6 Extração do DNA

O DNA foi extraído do sangue periférico total utilizando o kit de extração AccuPrep®

Genomic DNA, de acordo com as instruções do fabricante.


3.1.7 Genotipagem do gene MBL2 por PCR em tempo real utilizando o Melting

Temperature Assay (Ensaio de Temperatura de Anelamento)

O DNA dos pacientes e controles foram genotipados para os SNPs (polimorfismos de

único nucleotídeo) selecionados para o éxon 1 do gene MBL2, tomando como base a PCR

(Reação em cadeia da polimerase) em tempo real alelo específica, utilizando o “primer

forward” (5'-AGGCATCAACGGCTTCCCA-3') e “primer reverse” (5'-

CAGAACAGCCCAACACGTACCT-3') com subseqüente genotipagem por meio da curva de

Melting Temperature Assay.

As reações de amplificações foram realizadas, de acordo com Arraes e colaboradores

(2006), em um volume final de 25 µL com Master Mix 1X SYBR Green I (Eroclone, Milan,

Italy), 150 picomoles do iniciador forward, 50 picomoles do iniciador reverse e 10 ng de

DNA genômico. As condições de ciclagem foram os seguintes: 95ºC por 10 minutos, seguida

por 95ºC por 30 segundos e 60ºC por 1 min, repetido 45 vezes no aparelho Rotor Gene-

3000TM (Cobertt Research Mortlake, Sydney, Australia). Ao final da PCR, realizou-se

protocolo de curva de Melting, o qual incluiu aquecimento lento de 60º a 95ºC em etapas de

0,2ºC com intervalo de 8 segundos entre as etapas. O perfil da curva de fusão foi obtido

usando software de dissociação do aparelho Corbett Rotor GeneTM RG3000 (Uniscience

Cobertt Research). De acordo com a temperatura de fusão foram analisados os genótipos do

MBL2: AA (um pico de 83.1 ± 0.1°C), AO (dois picos de 82.6 ± 0.3 e 80.7 ± 0.1°C) e OO

(um pico de 81.7 ± 0.1°C).

3.1.8 Análise estatística

Para correlacionar as frequências gênicas com o aumento da susceptibilidade às

infecções fúngicas foi utilizado o Teste do Qui-quadrado com a correção do Teste Exato de

Fisher. O intervalo de confiança (IC) utilizado foi de 95%, portanto valores de “p” menores

ou iguais a 0,05 foram aceitos.


4 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E AVALIAÇÃO MICOLÓGICA DE

ONICOMICOSE EM PACIENTES BRASILEIROS COM DIABETES MELLITUS 1

_______________ 1Trabalho submetido para publicação na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical como Chianca, M.M., Cordeiro, L.H.O., Santos, V.M., Lima, D.M.M., Crovella, S., Neves, R.P.


Resumo

A onicomicose é uma infecção fúngica que apresenta impacto deletério na qualidade de vida

de indivíduos com diabetes mellitus. Geralmente essa infecção apresenta um curso mais grave

nos diabéticos quando comparados a pessoas sem a diabetes. O objetivo do estudo foi

identificar os patógenos fúngicos predominantes de onicomicoses em pacientes com diabetes

mellitus de Recife, Pernambuco. Foram avaliados 131 pacientes com diabetes mellitus quanto

à presença de lesões fúngicas. Amostras clínicas foram coletadas para realização do exame

direto, clarificadas com KOH a 20% e, concomitantemente, inoculadas na superfície de Ágar

Sabouraud adicionado de cloranfenicol (50mg/L). As colônias foram identificadas segundo as

características morfofisiológicas e bioquímicas. Dos pacientes avaliados, em 31 foi

confirmada a suspeita clínica de infecção fúngica através do exame direto e/ou obtenção do

agente etiológico. Desses pacientes, 29 apresentavam acometimento das lâminas ungueais

(93,5%), sendo a diabetes tipo 2 predominante (86%). Apresentaram-se mais prevalentes

mulheres (18 casos) e a faixa etária superior aos 60 anos (79%). As unhas dos pés foram mais

acometidas, com 19 casos, e a apresentação clínica subungueal distal apresentou-se mais

freqüente (86%). Foram identificadas leveduras do gênero Candida e Trichosporon e o fungo

não dermatófito Fusarium solani, sendo mais prevalentes as espécies de Candida (69,5%).

Onicomicose ocorre com alta prevalência em pacientes diabéticos, especialmente em idosos.

A detecção prévia desta infecção contribui para a instituição de terapêutica correta e eficaz,

diminuindo o risco desses pacientes apresentarem uma infecção disseminada.

Palavras-chave: Onicomicose. Diabetes mellitus. Candida.


Introdução

Onicomicose é definida como infecção fúngica da unha e representa um dos principais

problemas dermatológicos de todas as onicopatias devido à alta taxa de falha terapêutica,

dificuldades de gestão e tratamento (CARRILLO-MUÑOZ et al., 2010). A incidência está

relacionada a vários fatores, incluindo doenças como o diabetes mellitus (GODOY-

MARTINEZ et al., 2009).

Pacientes diabéticos podem apresentar complicações em todo o corpo e as alterações

das unhas por fungos representam um fator de risco para a gravidade do pé diabético devido a

possíveis seqüelas como a amputação de membros inferiores (DROZDOWSKA;

DRZEWOSKI, 2008). Cathcart, Cantrell e Elewski (2009) afirmam que o tratamento imediato

de onicomicose é um aspecto adicional de cuidados com os pés diabéticos que pode,

potencialmente, diminuir o risco de amputação.

As infecções fúngicas podem também disseminar microrganismos para áreas

adjacentes da pele, além de poder levar a uma deterioração adicional da qualidade de vida

com diversas implicações para a saúde geral (NATHER et al., 2008; CATHCART;

CANTRELL; ELEWSKI, 2009; KAFAIE; NOORBALA, 2010).

A identificação de fatores de risco pode ser a base para medidas preventivas que

busquem reduzir tanto a infecção quanto recorrência, incluindo recaídas em pacientes

susceptíveis como aqueles com diabetes mellitus (FAERGEMANN et al., 2005).

A infecção fúngica das unhas pode ser causada por três classes de fungos,

dermatófitos, leveduras e fungos filamentosos não-dermatófitos (WELSH; VERA-

CABRERA; WELSH, 2010; CAMBUIM et al., 2011). Diferentes apresentações de lesões das

unhas são observadas na prática clínica e estratégias de tratamento são fortemente

influenciadas por essas características, bem como pela análise de laboratório microbiológico

(PROMPERS et al., 2007).

Suspeitar de onicomicose, bem como realizar o diagnóstico micológico é importante

para prevenir distrofia ungueal e disseminação da infecção (VEER; PATWARDHAN;

DAMLE, 2007). Além disso, um bom controle da glicose no sangue pode prevenir as

mudanças clínicas provocadas nas unhas (TAKEHARA et al., 2011).

Entretanto poucos estudos avaliaram a prevalência de onicomicoses entre os pacientes

diabéticos (MAYSER; FREUND; BUDIHARDJA, 2009; GONZÁLEZ-AVILA et al., 2011).

Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi identificar os patógenos fúngicos

predominantes de onicomicoses em pacientes com diabetes mellitus.


Materiais e Métodos

Foram incluídos no estudo 131 pacientes com diabetes mellitus (DM) atendidos no

setor de Endocrinologia Clínica, para checkup de rotina, do Hospital das Clínicas

(Universidade Federal de Pernambuco-HC/UFPE), Hospital Barão de Lucena (HBL) e do

Instituto Brasileiro de Diabetes (IBRADI), Recife, Brasil.

O estudo foi desenvolvido no período entre Novembro de 2010 e Novembro de 2011.

Os pacientes foram incluídos no estudo somente após aprovação do Comitê de Ética do

Centro de Ciências da Saúde com registro nº 307/10 e SISNEP FR – 366987, bem como após

assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido.

Todos os pacientes foram avaliados quanto às lesões sugestivas de micoses, as quais

foram inicialmente limpas com álcool a 70% e, posteriormente, coletadas com auxílio de

bisturi e placa de Petri esterilizados.

As amostras clínicas foram clarificadas com hidróxido de potássio a 20% (KOH) para

hidrólise da queratina e detritos, facilitando a observação através de microscopia direta de

elementos fúngicos. Para a cultura, as amostras foram inoculadas em Ágar Sabouraud

Dextrose (Difco) com cloranfenicol (50 mg/L) contido em placas de Petri, incubadas a 30ºC.

O crescimento das culturas foi monitorado durante 15 dias e as colônias puras transferidas

para tubos contendo Ágar Sabouraud, mantidas a temperatura de 30ºC por 15 dias e

identificadas segundo Barnett, Paine e Yarrow (2000) e De Hoog e colaboradores (2000).

Foram realizadas preparações, com lactofenol azul de algodão, a partir das culturas

para avaliação, sob o microscópio, de detalhes micológicos (LACAZ et al., 2002). O critério

utilizado para considerar o fungo como patógeno, foi o isolamento do mesmo, em cultura, por

duas ocasiões consecutivas, com intervalos de 10 dias. Quando estruturas fúngicas foram

observadas em lâminas de microscopia direta e não houve crescimento de colônias fúngicas

em culturas, a investigação micológica foi repetida, em pelo menos, duas outras ocasiões.

Assim, foi considerado que um paciente possuía onicomicose quando os achados

clínicos e micológicos eram confirmados.


Resultados

Dos 131 pacientes diabéticos avaliados, em 31 foi confirmado envolvimento fúngico

nas lesões clínicas através da observação de estruturas fúngicas ao exame direto e/ou obtenção

do agente etiológico. Destes, 29 apresentaram envolvimento das lâminas ungueais (93,5%).

Entre esses pacientes 86% possuíam diabetes mellitus tipo 2, 18 eram mulheres e 11 homens.

A faixa etária variou dos 30 aos 83 anos, havendo prevalência de pacientes com idade

superior aos 60 anos (79%).

Entre os 29 pacientes, 16 apresentaram lesões nas unhas dos pés, 10 das mãos e em

três pacientes foram verificados o acometimento tanto das unhas dos pés quanto das mãos.

Entre as formas clínicas das lesões observou-se a subungueal distal e distrófica total,

destacando-se a apresentação clínica subungueal distal com 86% dos casos.

Ao exame da microscopia direta, das escamas ungueais, foi possível observar células

de leveduras e/ou hifas, das quais foram isoladas, em superfície de cultura, colônias de 22

amostras clínicas de 19 pacientes. Destas colônias foram identificadas leveduras do gênero

Candida (69,5%) e Trichosporon (13%), bem como fungo não dermatófito Fusarium solani

(17,5%) - Figura 1.


Discussão

Ao se avaliar a clínica dos pacientes, foi possível verificar maior número de diabéticos

tipo 2. Segundo Maraschin e colaboradores (2010), o DM tipo 2 é responsável por mais de

90% dos casos de diabetes acometendo, geralmente, indivíduos com mais de 30 anos.

Entre os pacientes deste estudo, destacam-se as mulheres e idosos. Segundo GODOY-

MARTINEZ e colaboradores (2009) a predominância de mulheres acometidas por

onicomicoses provavelmente se deve a fatores sócio-culturais, como traumas associados a

trabalhos domésticos. Os autores ainda afirmam que a redução do crescimento das unhas e

traumas recorrentes são fatores que podem estar relacionados à maior prevalência de

onicomicose na população idosa quando comparada a um grupo etário mais jovem.

Nesse estudo foi observado maior prevalência de onicomicoses nos pés dos pacientes

diabéticos. Dogra e colaboradores (2002) e Manzano-Gayosso e colaboradores (2008), em

estudos realizados com pacientes diabéticos, observaram a prevalência de acometimento

fúngico das unhas dos pés, 67,6% e 80% respectivamente, estando de acordo com nosso

estudo.

Este fato pode ser explicado devido às unhas dos pés crescerem 50-66% mais

lentamente que as unhas das mãos, o que facilita a invasão do agente etiológico, bem como

por serem mais submetidas a traumatismos repetidos (EFFENDY et al., 2005; ARENAS et

al., 2010).

Cathcart, Cantrell e Elewski (2009) afirmam que apesar da onicomicose ser uma

infecção leve e bem tolerada para a maioria das pessoas, para os diabéticos é mais do que uma

preocupação estética. Essa infecção está relacionada ao espessamento das unhas, considerado

um problema para os pacientes diabéticos, uma vez que pode induzir a formação de úlceras na

região subungueal devido a uma maior pressão das lâminas ungueais por sapatos mal

ajustados (RICH, 2000).

A apresentação clínica subungueal distal mostrou-se mais freqüente nesse estudo.

Ghisi e Santin (2011) afirmam que essa forma clínica é responsável por mais de 90% dos

casos de onicomicoses, sendo caracterizada por uma lesão que se inicia na extremidade livre

da unha e progride deslocando-se na lâmina superficial, tornando-a esbranquiçada, opaca e

apresentando um material de aparência farinácea, resultante da queratólise intensa.

Foi possível obter colônias das amostras clínicas de apenas 19 pacientes com

onicomicose, apresentando exame direto positivo para leveduras ou fungos filamentosos. Este

fato pode estar relacionado à ocorrência de microrganismos contaminantes na amostra clínica,


os quais apresentavam crescimento rápido, inibindo o desenvolvimento lento do agente

etiológico da lesão ou pode ser explicado pelo uso prévio de antifúngicos (LIMA et al., 2008).

Entre os agentes etiológicos mais observados neste estudo, destaca-se Candida

albicans. O mesmo achado foi verificado por alguns autores em seus trabalhos, os quais

apontam essa espécie fúngica como a mais comumente isolada de onicomicoses (MIRANDA

et al., 2005; ASADI; DEHGHANI; SHARIF 2009).

O diagnóstico micológico, com a identificação das espécies envolvidas, é essencial na

busca de tratamento mais específico das onicomicoses. A detecção e divulgação da

diversidade de espécies fúngicas, agentes de onicomicoses, tanto em pacientes com

imunodepressão como em hospedeiros imunocompetentes, poderá contribuir para instituição

da terapêutica correta nas diferentes apresentações clínicas dessa micose (LIMA et al., 2008).

A alta prevalência de infecções fúngicas em diabéticos, bem como suas complicações,

associada a um número crescente de espécies resistentes a antifúngicos padrões, leva a

considerar a introdução do exame micológico nos métodos de avaliação da condição clínica

de diabéticos, uma vez que pode ser extremamente útil no controle de infecções sistêmicas

(DROZDOWSKA; DRZEWOSKI, 2008).


Figura 1. Distribuição das espécies fúngicas de acordo com sexo, idade, tipo de diabetes e localização da lesão nos pacientes diabéticos.


Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pelo

suporte financeiro.

Conflito de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesse referente a este artigo.


5 MICOSES SUPERFICIAIS ASSOCIADAS AOS POLIMORFISMOS NO ÉXON 1 DO GENE MBL2 EM PACIENTES COM DIABETES MELLITUS 2

_______________ 2Trabalho a ser submetido para publicação como Chianca, M.M., Cordeiro, L.H.O., Santos, V.M., Cruz, Macedo, G.M.C., H.L.A., Domingos, I.F., Bezerra, M.A.C., Crovella, S., Neves, R.P.


Resumo

Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma glicoproteína que desempenha importante efeito

antimicrobiano através da capacidade de reconhecer carboidratos presentes nas superfícies de

patógenos. Polimorfismos das regiões estruturais do gene MBL2 estão associados à

deficiência de MBL sérica funcional, com consequente aumento da frequência e gravidade

das infecções, entre estas as de etiologia fúngica. Indivíduos portadores de diabetes mellitus

apresentam-se como um grupo mais susceptível ao desenvolvimento dessas infecções, porém

a razão para esta condição ainda não está esclarecida. O presente estudo apresenta como

propósito correlacionar susceptibilidade às micoses superficiais no diabetes aos

polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2. Avaliamos 131 diabéticos de três centros

hospitalares de Recife, Brasil. Um grupo controle sadio, pertencente a um banco de dados, foi

utilizado para realização da comparação estatística. Dos pacientes avaliados, 31 apresentaram

acometimento fúngico, sendo mais freqüente a faixa etária superior aos 60 anos (80,6%) nesse

grupo, e diabéticos tipo 2 (87%). A micose superficial foi o único tipo de infecção fúngica

observada, com maior incidência de onicomicose (93,5%), maior frequencia de unhas dos pés

afetadas (65,5%) e mulheres (62%). Entre os agentes etiológicos, as espécies de Candida

foram as mais frequentes (64%). Após genotipagem, ao se comparar o grupo diabéticos com

micose ao controle, foi observada maior prevalência do genótipo O/O no primeiro grupo

(p=0.046). Ao comparar os outros grupos não foi observada significância estatística. A

presença dos polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2 parece ser um modulador genético que

predispõe portadores de diabetes mellitus a micoses superficiais.

Palavras-chave: Lectina ligadora de manose. Gene MBL2. Diabetes mellitus. Micoses

superficiais.


Introdução

Diabetes mellitus (DM) é um grupo de doenças metabólicas caracterizado por

hiperglicemia crônica devido a defeitos na secreção de insulina, ação da insulina, ou ambos

(CRAIG; HATTERSLEY; DONAGHUE, 2009). O retardo no início do tratamento do

diabetes predispõe ao desenvolvimento de diversas afecções como doenças cardiovasculares,

retinopatias, neuropatias, nefropatias, doença vascular periférica, aterosclerose, doença

cerebrovascular, hipertensão e susceptibilidade a infecções (ARSA et al., 2009).

As causas da maior susceptibilidade às infecções em diabéticos não estão esclarecidas,

todavia, é possível que haja relação com a deficiência imunológica (FOSS et al., 2005)

caracterizada por depressão da atividade dos neutrófilos, macrófagos e menor eficiência da

imunidade celular. Dessa forma, o diabetes tem sido aceito como um importante fator de risco

ao desenvolvimento de micoses (ROCHA et al., 2002; OKUBO et al., 2008). Neste contexto,

complicações em diabéticos podem estar relacionadas à concentração sérica e função da

lectina ligadora de manose (MBL), em dependência de polimorfismos do gene MBL2.

A MBL é uma proteína codificada pelo gene MBL2, localizado no braço q11.2-q21 do

cromossomo 10 formado por quatro éxons (CHAGAS et al., 2005). Essa proteína é o

componente central da ativação da via das lectinas do sistema complemento responsável por

mediar um efeito antimicrobiano com a formação do complexo de ataque à membrana

(GARCIA-LAORDEN et al., 2008) ou exercer papel de opsonina promovendo a fagocitose de

microrganismos patogênicos (SILVA, 2010), através do reconhecimento de carboidratos

presentes na superfície de patógenos (IP et al., 2009).

Três polimorfismos no éxon 1 (códons 52, 54 e 57) têm sido associados à deficiência

da MBL. Neste sentido, polimorfismo no gene MBL2, com diminuição dos níveis séricos de

MBL resulta em maior susceptibilidade a doenças infecciosas e autoimunes (GRANELL et

al., 2006). Assim, o propósito desse estudo foi correlacionar susceptibilidade às micoses

superficiais no diabetes mellitus aos polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2.


Materiais e Métodos

Pacientes e Amostras Clínicas

Foram avaliados pacientes com história de diabetes mellitus do Hospital das Clínicas

(HC), Hospital Barão de Lucena (HBL) e do Instituto Brasileiro de Diabetes (IBRADI),

localizados em Recife, Pernambuco, a fim de se investigar lesões sugestivas de micoses. O

projeto foi previamente aceito pelo Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da UFPE

protocolado com o nº 307/10 e registrado no SISNEP FR – 366987. Todos os indivíduos que

participaram do estudo assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Nos casos sugestivos de micoses foi realizada coleta de amostras clínicas, após

limpeza cuidadosa da área acometida com etanol a 70%, com auxílio de bisturi e placa de

Petri, previamente esterilizados. E, quando necessário, realizada a técnica de Porto (1953),

com auxílio de fita adesiva e lâmina.

Diagnóstico Micológico

Para o exame direto, as amostras clínicas foram processadas com solução aquosa a

20% de hidróxido de potássio (KOH). Concomitantemente, foram semeadas, em duplicata, na

superfície do meio Sabouraud Dextrose Agar (Difco) adicionado de uma fonte de lipídios

(1%) e cloranfenicol (50mg/L), mantidas às temperaturas de 30ºC e 37ºC por um período de

até 20 dias. Após o surgimento das colônias, estas foram purificadas e em seguida,

identificadas segundo características morfofisiológicas e bioquímicas (BARNETT; PAINE;

YARROW, 2000; DE HOOG et al., 2000; LACAZ et al., 2002).

Análise dos Polimorfismos do gene MBL2

Foram utilizados três grupos de indivíduos para análise dos polimorfismos: grupo de

pacientes com diabetes e micoses, grupo representado por pacientes com diabetes e ausência

de infecção fúngica e o grupo controle composto de 100 amostras de DNA extraído de

indivíduos sadios, pertencentes a um banco do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami

(LIKA). Entende-se como indivíduo sadio nesse estudo, todo aquele sem diabetes mellitus e

sem lesões fúngicas.


O DNA foi extraído do sangue periférico total dos pacientes utilizando o kit de

extração AccuPrep® Genomic DNA, de acordo com as instruções do fabricante.

A genotipagem dos polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) no éxon 1 do gene

MBL2 foi realizada utilizando primers projetados com o Primer Express 1.5 Softaware

Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), “primer foward” (5’-AGGCATCAACGGC

TTCCA-3’) e “primer reverse” (5’-CAGAACAGCCCAACACGTACCT-3’).

As reações de amplificações foram realizadas, de acordo com Arraes e colaboradores

(2006), em um volume final de 25 µL com Master Mix 1X SYBR Green I® (Eroclone, Milan,

Italy), 150 picomoles do iniciador forward, 50 picomoles do iniciador reverse e 10 ng de

DNA genômico. As condições de ciclagem foram os seguintes: 95ºC por 10 minutos, seguida

por 95ºC por 30 segundos e 60ºC por 1 minuto, repetido 45 vezes no aparelho Rotor Gene-

3000 (Cobertt Research Mortlake, Sydney, Australia). Ao final da PCR, realizou-se protocolo

de curva de Melting, o qual incluiu aquecimento lento de 60ºC a 95ºC em etapas de 0,2ºC com

intervalo de 8 segundos entre as etapas. O perfil da curva de fusão foi obtido usando software

de dissociação do aparelho Corbett Rotor GeneTM RG3000 (Uniscience Cobertt Research). De

acordo com a temperatura de fusão foram analisados os genótipos do MBL2: AA (um pico de

83.1 ± 0.1°C), AO (dois picos de 82.6 ± 0.3 e 80.7 ± 0.1°C) e OO (um pico de 81.7 ± 0.1°C).

Análise Estatística

Para correlacionar as frequências gênicas com o aumento da susceptibilidade às

infecções fúngicas foi utilizado o Teste do Qui-quadrado com a correção do Teste Exato de

Fisher. O intervalo de confiança (IC) será de 95%, portanto valores de “p” menores ou iguais

a 0,05 foram aceitos.


Resultados

Grupos de Estudo

Durante o período do estudo, foram coletadas amostras sangüíneas de 100 pacientes

diabéticos com ausência de lesões fúngicas e 31 amostras de pacientes diabéticos com

suspeita clínica de infecção fúngica.

Dados Clínicos e Epidemiológicos

Os parâmetros observados para avaliação clínica e epidemiológica agruparam sexo,

idade, tipo de diabetes, sítios acometidos (Tabela 1) e agentes etiológicos de micoses (Figura

1).

O grupo de pacientes diabéticos com micose compreendeu 20 mulheres (64,5%) e 11

homens (35,5%). A média de idade foi de 63 anos, variando dos 30 aos 83 anos, sendo faixa

etária ≥ 61 anos mais freqüente (80,6%). Apresentando-se nesta faixa etária maior prevalência

de mulheres (68%). Avaliou-se o tipo de diabetes nesses pacientes, apresentando-se o DM

tipo 2 mais prevalente (87%) quando comparado ao DM tipo 1 (13%).

Dos 31 pacientes do grupo diabético com suspeita clínica de micose, todos tiveram

confirmação da suspeita através da observação de estruturas fúngicas em parasitismo. Foi

possível isolar o agente etiológico de 20 pacientes deste grupo.

A micose de origem superficial foi a única apresentação clínica observada, sendo a

onicomicose a representante do maior número de casos (93,5%), com as unhas dos pés mais

freqüentemente afetadas (65,5%), bem como pacientes do sexo feminino (62%). As espécies

de Candida foram os agentes etiológicos predominantes nas micoses, como ilustrado na

figura 1.

O grupo de pacientes diabéticos sem envolvimento fúngico consistiu de 70 mulheres

(70%) e 30 homens (30%). A média de idade foi de 52 anos, variando dos 18 aos 80 anos,

prevalecendo idade ≥ 61 anos (31%). Deste total de pacientes acima de 60 anos de idade, foi

possível observar a prevalência de mulheres (77,5%). Neste grupo foi possível avaliar

pacientes com dois tipos de diabetes mellitus, o DM tipo 1 e o DM tipo 2. O DM tipo 1

apresentou uma frequência de 13%, enquanto o DM tipo 2 mostrou-se mais incidente com

87% dos casos.


O grupo controle incluiu 69 mulheres (69%) e 31 homens (31%) saudáveis. A média

de idade deste grupo foi de 27 anos, variando dos 18 aos 51 anos, com prevalência na faixa

etária dos 21 aos 30 anos (71%).


Tabela 1. Caracterização clínica e epidemiológica dos grupos em estudo quanto a sexo, idade, tipo de diabetes e sítios acometidos.

Parâmetros Grupos

Diabéticos com micose Diabéticos sem micose Controle n = 31 n = 100 n = 100

Sexo Feminino 20 (64,5%) 70 (70%) 69 (69%) Masculino 11 (35,5%) 30 (30%) 31 (31%)

Idade (anos) ≤ 20 - 4 (4%) 9 (9%)

21 a 30 1 (3,2%) 6 (6%) 71 (71%) 31 a 40 1 (3,2%) 14 (14%) 14 (14%) 41 a 50 - 15 (15%) 5 (5%) 51 a 60 4 (13%) 30 (30%) 1 (1%)

≥ 61 25 (80,6%) 31 (31%) -

Tipos de Diabetes DM tipo 1 4 (13%) 13 (13%) - DM tipo 2 27 (87%) 87 (87%) -

Sítios acometidos

Unha do pé 19 (56%) - - Unha da mão 13 (38%) - -

Braço 1 (3%) - - Nádegas 1 (3%) - -


Figura 1. Agentes etiológicos de micoses superficiais em pacientes com diabetes mellitus.


Genotipagem dos Pacientes

Após genotipagem para o MBL2 foi possível observar maior prevalência do alelo

selvagem A em todos os grupos em estudo, apresentando o grupo diabéticos com micose um

resultado de 67,7%, o grupo diabéticos sem micose 71% e o grupo controle 73,5%. Ao se

realizar a análise estatística, observou-se que quando comparado ao grupo controle, os grupos

diabéticos sem micose (p=0.65) e diabéticos com micose (p=0.41) não apresentaram valores

estatisticamente significantes, demonstrando não haver diferença nas frequências alélicas. O

mesmo foi observado quando comparado o grupo diabéticos sem micose ao diabéticos com

micose - p=0.63 (Tabela 2).

Tabela 2. Distribuição alélica para o gene MBL2 nos grupos diabéticos com micose, diabéticos sem micose e controle.

A O

Diabéticos com micose 42/62 (67,7%) 20/62 (32,3%)n = 31

OR = 1.16

*p = 0.63Diabéticos sem micose OR = 1.32 142/200 (71%) 58/200 (29%)

IC = 0.71 - 2.45n = 100

OR = 1.13 IC = 0.73 - 1-75

*p = 0.65

Controle 147/200 (73,5%) 53/200 (26,5%)n = 100

NOTA: *p = Teste exato de Fisher; OR = Odds Ratio; IC = Intervalo de Confiança

*p = 0.41

Grupos Alelos MBL 2

IC = 0.63 - 2.15


Avaliando-se as frequências genotípicas para os grupos em estudo, verificou-se para o

grupo diabéticos com micose, 48,4% dos pacientes com genótipo A/A, 38,7% genótipo A/O e

12,9% genótipo O/O. Para o grupo diabéticos sem micose, 49% genótipo A/A, 44% genótipo

A/O e 7% genótipo O/O. E para o grupo controle, 49% dos indivíduos com genótipo A/A,

49% com genótipo A/O e 2% genótipo O/O (Tabela 3).

Tabela 3. Distribuição genotípica para o gene MBL2 nos grupos diabéticos com micose, diabéticos sem micose e controle.

A/A A/O O/O

Diabéticos com micose 15/31 (48,4%) 12/31 (38,7%) 4/31 (12,9%)n = 31

OR = 1.86IC = 0.48 - 7.25*p = 0.53

49/100 (49%) 44/100 (44%) 7/100 (7%)

n = 100OR = 3.50IC = 0.69 - 17.7*p = 0.22

Controle 49/100 (49%) 49/100 (49%) 2/100 (2%)n = 100

NOTA: *p = Teste exato de Fisher; OR = Odds Ratio; IC = Intervalo de Confiança

Grupos Genótipos MBL 2

*p = 0.046

OR = 6.5IC = 1.08 - 39.2Diabéticos sem micose

Foi observado que as diferenças genotípicas entre os grupos diabéticos com micose e

diabéticos sem micose não foram estatisticamente significantes, apresentando um valor de p

igual a 0.53. Da mesma forma quando comparado o grupo diabéticos sem micose ao grupo

controle, não foi possível observar significância estatística (p=0.22). Porém, ao se comparar o

grupo diabéticos com micose ao grupo controle, foi encontrada uma razão de chances para

associação entre diabetes mellitus e micose (OR=6.5) na presença do genótipo O/O,

apresentando um valor de p igual a 0.046, demonstrando diferença significante.


Discussão

Onicomicose foi a micose superficial, de maior prevalência, diagnosticada neste

estudo. A infecção das unhas é um processo muito freqüente causada por diferentes espécies

de dermatófitos, leveduras e fungos não-dermatófitos (GARMENDIA; VIEDMA; ARZA,

2008). Segundo Arenas e colaboradores (2010), esta condição clínica é o distúrbio mais

comum das unhas afetando principalmente as unhas dos pés (90%) e, ocasionalmente, as

unhas das mãos (10%), o que corrobora nosso estudo.

As unhas dos pés são mais freqüentemente afetadas, provavelmente, devido ao

crescimento lento, o que facilita a invasão do agente etiológico, bem como por serem mais

submetidas a traumatismos repetidos (ARENAS et al., 2010).

A presença das infecções fúngicas, como a onicomicose, pode ter resultados negativos

significativos sobre o desenvolvimento emocional e social. Além de causarem prejuízo

estético, refletem na auto-estima e discriminação social, uma vez que podem vir a serem

tratadas como pessoas de maus hábitos de higiene e prováveis fontes de infecção

(BALLESTÉ; MOUSQUÉS; GEZUELE, 2003).

Neste estudo, a presença de fungos patogênicos nas lâminas ungueais teve maior

incidência em pacientes do sexo feminino. Porém, vale ressaltar que este sexo esteve mais

presente na nossa amostragem. Alguns autores também relataram maior incidência de

mulheres acometidas por onicomicose quando comparado aos homens (ARAÚJO et al., 2003;

SANTOS; ANDRIOLI, 2005). Martelozo, Guilhermetti e Svidzinski (2005) afirmam que este

fato se deve, provavelmente, à exposição da mulher à umidade por trabalhos domésticos,

contato com detergentes agressivos e com a prática de manicure e pedicure, o que facilitam a

infecção.

Alguns estudos associam a maior prevalência da micose com o avançar da idade

(ROBERTS, 1992; ROSSEEW, 1999; SZEPIETOWSKI et al., 2006), fato confirmado neste

trabalho, o qual demonstrou ser crescente a presença de micose com o aumento da idade,

estando os pacientes com idade igual ou superior aos 61 anos como o grupo de maior

acometimento fúngico.

Segundo Ghisi e Santin (2011), as infecções fúngicas ganharam considerável

importância ao longo da última década, devido ao aumento significativo na incidência de

agentes oportunistas, entre os quais se destacam as leveduras.

Foi possível isolar colônias, das amostras clínicas, de apenas 20 pacientes do grupo de

pacientes diabéticos com micose. Fato que pode ser explicado pela ocorrência de


microrganismos contaminantes na amostra clínica, os quais apresentavam crescimento rápido,

inibindo o desenvolvimento lento do agente etiológico da lesão ou pelo uso prévio de

antifúngicos (LIMA et al., 2008).

Das colônias isoladas destacam-se leveduras do gênero Candida, sobretudo nas

onicomicoses, prevalecendo C. albicans. Também outros autores verificaram que C. albicans

foi a espécie fúngica mais comumente isolada de onicomicoses (MIRANDA et al., 2005;

ASADI; DEHGHANI; SHARIF, 2009).

A onicomicose é responsável por até 50% das infecções em unhas (VEER;

PATWARDHAN; DAMLE, 2007) e pode representar um problema de saúde ainda mais

grave para pacientes imunossuprimidos (KAUR; KASHYAP; BHALLA, 2008), como

aqueles que apresentam como doença de base, diabetes mellitus. Onicomicose nesse grupo de

pacientes é considerada fator predisponente ao desenvolvimento de úlceras nos pés (BOYKO

et al., 2006), uma vez que a lâmina ungueal sofre espessamento nesse tipo de micose,

podendo resultar em pressão por calçados mal ajustados (RICH, 2000). Além de poder

ocasionar uma inflamação da derme e camada subcutânea da pele (ROUJEAU et al., 2004),

bem como pode levar a amputação dos membros inferiores (DROZDOWSKA;

DRZEWOSKI, 2008).

Entre os pacientes diabéticos, tanto no grupo sem micose quanto no grupo com

micose, desse estudo, o que se observa é o maior número de mulheres com idade igual ou

superior aos 61 anos. Wild e colaboradores (2004) afirmam que o maior número de mulheres

idosas na maioria das populações associado ao fato da prevalência de diabetes aumentar com

a idade justifique esse achado.

Entre os dois grupos de pacientes diabéticos foi possível observar o predomínio de

diabetes mellitus tipo 2. Este é o tipo de diabetes mais prevalente responsável por mais de

90% dos casos de DM (BRASIL, 2006; MARASCHIN et al., 2010; ADA, 2011).

Aproximadamente 150 milhões de pessoas, em todo o mundo, são afetadas pelo DM tipo 2 e a

estimativa indica que este número deverá dobrar nos próximos 20 anos (FREEMAN; COX,

2006).

Foi possível observar associação dos SNPs no éxon 1 do gene MBL2 com

susceptibilidade a infecções fúngicas nos pacientes com DM. A maior frequência de

homozigotos variantes no grupo diabéticos com micose ao se comparar com o grupo controle,

com relevância estatística p=0,046, sugere uma predisposição de pacientes diabéticos, com

polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2, em desenvolver micose.


Tem sido demonstrado que a MBL pode se ligar a manose ou outros carboidratos

presentes na superfície de numerosos microrganismos e ativar o complemento através da via

das lectinas para lisar esses patógenos e promover a fagocitose (HU et al., 2010). Brouwer e

colaboradores (2008) relataram que a MBL tem uma contribuição significativa na

opsonofagocitose das leveduras, após ativação da via das lectinas do sistema complemento.

Porém, três polimorfismos pontuais no éxon 1 do gene MBL2 podem prejudicar a

expressão da proteína MBL, conduzindo a formação de moléculas pequenas, não funcionais, o

que pode ocasionar recorrentes processos infecciosos (GARRED et al., 2006; BROUWER et

al., 2008).

Alguns estudos realizados correlacionam a presença de polimorfismos no gene MBL2

ao desenvolvimento de micoses como aspergilose pulmonar necrotizante crônica

(CROSDALE et al., 2001), coccidioidomicose sintomática (AMPEL et al., 2009), candidíase

vulvovaginal e sua foma recorrente (BABULA et al., 2003; LIU; LIAO; LIU, 2006;

GIRALDO et al., 2007) e aspergilose invasiva aguda (LAMBOURNE et al., 2009).

Entretanto, Milanese e colaboradores (2008) demonstraram no estudo realizado em pacientes

com diagnóstico de infecções vaginais recorrentes, entre elas candidíase vulvogavinal, que

não houve correlação entre polimorfismos funcionais no primeiro éxon do gene MBL2 e esta

infecção.

Foi também possível verificar um aumento do número de indivíduos com a presença

do genótipo O/O quando comparamos o grupo controle aos diabéticos sem micose. Porém,

não foi possível atingir significância estatística.

Tsutsumi e colaboradores (2003), estudaram possível relação entre a ocorrência de

diabetes tipo 1 e polimorfismo no gene MBL2 e constataram que a frequência do alelo

variante apresentava-se maior quando comparado ao grupo saudável, porém não obtiveram

resultados estatisticamente significantes.

Em estudo realizado também com diabéticos tipo 1, Araújo e colaboradores (2007)

observaram que o alelo variante O apresentava-se mais freqüente nesses pacientes quando

comparados ao grupo controle saudável, sugerindo maior risco de desenvolver a doença

quando na presença do polimorfismo do gene MBL2. Os autores afirmam que mais estudos

devem ser realizados buscando correlacionar as funções da imunidade inata na ocorrência do

diabetes tipo 1 para compreensão da patogênese dessa doença.

Demonstramos que a presença de polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2, com

redução da produção de MBL funcional, pode tornar pacientes diabéticos mais susceptíveis ao

desenvolvimento de infecções fúngicas. O conhecimento da deficiência dessa proteína é uma


importante ferramenta para pacientes imunossuprimidos, como diabéticos, uma vez que

estudos vêm demonstrando a possibilidade da reposição de quantidades terapêuticas da

proteína em busca da melhora no quadro clínico dos pacientes.

Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pelo

suporte financeiro.

Conflito de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesse referente a este artigo.


6 CONSIDERAÇÕES GERAIS

A partir da análise dos dados obtidos neste estudo, pode-se concluir:

Os pacientes diabéticos avaliados desenvolveram apenas quadros clínicos de micoses

superficiais.

Onicomicose é a micose superficial prevalente em pacientes diabéticos, sendo estes

acometidos principalmente nas lâminas ungueais dos pés.

Indivíduos do sexo feminino são mais acometidos por diabetes mellitus e micoses

superficiais, principalmente ao avançar da idade.

Observamos associação entre polimorfismos no éxon 1 do gene MBL2 e

susceptibilidade a micoses superficiais em indivíduos com diabetes mellitus.


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ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA


ANEXO B - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (Baseado na Resolução 196/06-CNS)

Título da pesquisa: “Susceptibilidade às micoses no diabetes mellitus associada ao polimorfismo do gene MBL2” Pesquisadora responsável: Michele Chianca Macario

Rua Antônio Valdevino da Costa, nº94, aptº201 – Torrões, Recife-PE. Fone: (81) 9790-8511

E-mail: [email protected]

Contato com o Comitê de Ética em Pesquisa: Av. Prof. Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, Recife-PE, CEP: 50670-901, Tel.: 2126 8588.

Você está sendo convidado a participar da pesquisa cujo título está acima descrito. Esta

propõe o diagnóstico das principais micoses que ocorrem em pacientes portadores de diabetes mellitus, relacionando esses dados com a presença de uma mutação em um gene responsável pela imunidade, sendo possível, assim, avaliar o risco dos pacientes em adquirirem essas infecções. As micoses, se não tratadas, podem provocar complicações a sua saúde. No entanto, a avaliação genética ajudará o médico a adotar tratamentos mais eficientes visando o combate a ação dos fungos.

Profissionais capacitados irão realizar as coletas de acordo com o local da micose, de forma correta e segura, utilizando material esterilizado e descartável. Concomitantemente será coletada uma pequena amostra sangüínea (cerca de 4ml) para a análise do gene responsável pela imunidade através de uma simples coleta de sangue com agulhas e seringas esterilizadas, não oferecendo grandes riscos ao paciente. Porém, riscos mínimos como algum tipo de constrangimento e injúria da escarificação podem ocorrer.

Você pode ficar à vontade para não fazer a coleta sem que isso prejudique sua relação com os médicos ou hospital. O material colhido será levado ao Laboratório de Micologia Médica e ao Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami da Universidade Federal de Pernambuco para a realização dos estudos. Caso você aceite participar deste estudo será beneficiado diretamente com um diagnóstico confiável, podendo iniciar um tratamento de forma mais rápida, ajudando em sua recuperação. OBS 1: Os dados pessoais dos pacientes serão mantidos em anonimato, sendo garantida a privacidade. OBS 2: Os pacientes, mesmo após a aprovação do presente termo, poderão retirar-se a qualquer momento da pesquisa, sem nenhum prejuízo para os mesmos. OBS 3: Uma cópia deste documento será entregue ao paciente voluntário.

Recife, _______ de ________________ de ______.

____________________________ ________________________________ Nome do pesquisador Assinatura ____________________________ ________________________________ Nome do paciente Assinatura ____________________________ ________________________________

1ª Testemunha Assinatura ____________________________ ________________________________ 2ª Testemunha Assinatura

associada aos polimorfismos no Éxon 1 do gene mbl2 … · 2019-10-25 · macario, michele chianca...

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