beebe-diverse effects wideband non ionizing radiation cells tissues-04216264

7/28/2019 Beebe-diverse Effects Wideband Non Ionizing Radiation Cells Tissues-04216264

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D i v e r s e E f f e c t s o f W i d e b a n d I n t e n s e , N o n - I o n i z i n gR a d i a t i o n o n C e l l s a n d T i s s u e sS . J . B e e b e , E . H . H a l l a n d K . H . SchoenbachE a s t e r n V i r g i n i a M e d i c a l S c h o o l , O l d D o m i n i o n U n i v e r s i t y , a n dT h e F r a n k R e i d y R e s e a r c h C e n t e r f o r B i o e l e c t r i c s

A b s t r a c t - I o n i z i n g r a di a t i o n c a n b e a n e n v i r o n m e n t a l h e a l t h T h u s , nsPEF e f f e c t s a r e d u e t o c h a r g i n g o f t h e p l a s m ar i s k a s w e l l a s a c a n c e r t h e r a p e u t i c , b u t s i m i l a r r o l e s f o r n o n - m e m b r a n e , a s w e l l a s e f f e c t s o n i n t r a c e l l u l a r s t r u c t u r e s a n di o n i z in g r a d i a t i o n a r e c o n t r o v e r s i a l . We h a v e e x a m i n e d e f f e c t s f u n c t i o n s i n c e l l s a n d t i s s u e s t h a t a r e d e f i ne d b y t h e E r s c a l i n go f w i d e b a n d , i n t e n s e n o n - i o n i z i n g r a d i a t i o n a p p l i e d t o c e l l s a n d l a w . I t i s a nt i c i pa t e d t h at when X s i g n i f i c a n t l y d i m i n i s h e s a n dt i s s u e s a s n a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s ( n s P E F s ) . c h a r g i n g m e c h a n i s m s a r e n o t l i k e l y t o p r e d o m i n a t e , t h e E TCompared t o c o n v e n t i o n a l e l e c t r o p o r a t i o n p u l s e s , n s P E F s h a v e s c a l i n g l a w w i l l n o t h o l d a n d a new p a r a d i g m o f u l t r a s h o r ts h o r t e r p u l s e d u r a t i o n s ( 2 1 0 ns ) a n d h i g h e r e l e c t r i c f i e l d s p u l s e d e l e c t r i c f i e l d e f f e c t s i s e x p e c t e d .( - 3 0 0 k V / c m ) . I n s p i t e o f t h e h i g h e l e c t r i c f i e l d , m e a s u r e dt h e r m a l c h a n g e s a r e n e g l i g i b l e . F o r t h e s e s h o r t p u l s e s we h a v e I . INTRODUCTIONo b s e r v e d a number o f n s P E F - i n d u c e d e f f e c t s o n b i o l o g i c a l c e l l sa n d t i s s u e s , i n c l u d i n g a p o p t o s i s i n d u c t i o n a n d tumor r e g r e s s i o n t h e s i c p e f t o f a n c t r i c e f i n ac e c a n ba t h i g h e l e c t r i c f i e l d s , a s w e l l a s c a l c i u m m o b i l i z a t i o n , p l a t e l e t d e s c r i b e d i n s i m p l e s t t r b s nt h e c e l la g g r e g a t i o n a n d e nh a n c e d g e n e t r a n s c r i p t i o n a t l o w e r , c y t o p l a s m i s a c o n d u c t o r a n d t h e s u r r o u n d i n g p l a s m as u b l e t h a l e l e c t r i c f i e l d s . m e m b r a n e i S a n i n s u l a t i n g d i e l e c t r i c l a y e r . When c e l l s a r eWhen n s P E F s a r e b e l o w t h e p l a s m a m e m b r a n e ( P M ) p l a c e d i n a c o n d u c t i v e m ediu m b e t w e e n two e l e c t r o d e s a n dc h a r g i n g t i m e c o n s t a n t ( - 1 0 0 n s ) , e f f e c t s o n i n t r a c e l l u l a r a u n i p o l a r v o l t a g e p u l s e i s a p p l i e d t o t h e e l e c t r o d e s , t h em e m b r a n e s a r e a p p r e c i a b l e . T h u s , i t i s p o s s i b l e t o o b s e r v e r e s u l t i n g c u r r e n t c a u s e s a c c u m u l a t i o n o f e l e c t r i c a l c h a r g e s a te f f e c t s o n i n t r a c e l l u l a r s t r u c t u r e s ( m e m b r a n e s ) a n d f u n c t i o n s t h e c e l l m e m b r a n e a n d , c o n s e q u e n t l y , a v o l t a g e a c r o s s t h ew i t h o u t o b s e r v i n g e f f e c t s o n t h e P M . F o r J u r k a t o r H L - 6 0 c e l l s m e m b r a n e . I f t h e m e m b r a n e v o l t a g e e x c e e d s a c r i t i c a l v a l u e ,e x p o s e d t o l O n s o r 6 0 n s p u l s e s , m o b i l i z a t i o n o f c a l c i u m f r o m s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e s u r f a c e m e m b r a n e o c c u r w i t h t r a n s -i n t r a c e l l u l a r s t o r e s i s o b s e r v e d a t s i g n i f i c a n t l y l o w e r e l e c t r i c membrane pore f o r m a t i o n , a p r o c e s s known a sf i e l d s t h a n e l e c t r i c f i e l d s n e e d e d f o r PM e l e c t r o p o r a t i o n o r e l e c t r o p o r a t i o n [ 1 ] . I f t h e membrane v o l t a g e i s n o t e x c e s s i v et r a n s p o r t . H o w e v e r , a s t h e e l e c t r i c f i e l d a n d / o r t h e p u l s ed u r a t i o n a r e i n c r e a s e d , i t i s p o s s i b l e t o o b s e r v e e f f e c t s o n t h e a n d t h e d u r a t i o n o f t h e p u l s e i s l i m i t e d , membrane p o r a t i o nP M . T h u s , a s t h e p u l s e d u r a t i o n i n c r e a s e s t h e r e i s a c e l l t y p e - c a n b e r e v e r s i b l e a n d t h e c e l l s s u r v i v e . The t i m e r e q u i r e d t os p e c i f i c i n c r e a s e i n e f f e c t s a t t h e P M , a s w e l l a s o n i n t r a c e l l u l a r c h a r g e t h e s u r f a c e m e m b r a n e i s d e p e n d e n t u p o n p a r a m e t e r ss t r u c t u r e s a n d f u n c t i o n s . s u c h a s t h e c e l l d i a m e t e r ( D ) , r e s i s t i v i t i e s o f t h e c y t o p l a s mT o d e t e r m i n e n s P E F c h a r a c t e r i a s t i c s t h a t a r e ( P c ) a n d s u s p e n s i o n m e d i u m ( P a ) , a n d c a p a c i t a n c e o f t h er e s p o n s i b l e f o r t h e s e d i v e r s e c e l l r e s p o n s e s , w e d e s i g n e d s u r f a c e m e m b r a n e p e r u n i t a r e a ( c m ) . F o r a s p h e r i c a l c e l le x p e r i m e n t s t o d e t e r m i n e i f p u l s e d u r a t i o n , e l e c t r i c f i e l d , o r w i t h a s u r f a c e membrane t h a t i s an i d e a l d i e l e c t r i c ( n oe n e r g y d e n s i t y was t h e s t i m u l u s t h a t r e c r u i t e d r e s p o n s e s f r o m ofc e l l s t o n s P E F s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t n s P E F e f f e c t s a r e n o t l e a k a g e c u r r e n t s ) , w i t h a d i a m e t e r o f 1 0 p m , r e s i s t v i t i e s o fd u e t o d o s e e f f e c t s , b u t i n s t e a d f o l l o w a s c a l i n g l a w ( E t ) d e f i n e d c y t o p l a s m a n d m ediu m o f 1 0 0 o h m c m , a n d a m em br aneb y t h e p r o d u c t o f e l e c t r i c f i e l d ( E ) a n d p u l s e d u r a t i o n ( t a u , ) , c a p a c i t a n c e o f 1 u F / c m 2 , t h e c h a r g i n g t i m e c o n s t a n t ( c c ) i sw h i c h c a n b e d e r i v e d f r o m c i r c u i t e q u a t i o n s t h a t d e s c r i b e 7 5 n s [ 2 ] [ . c = ( p c + p a / 2 ) c m D / 2 ] . T h e c h a r g i n g t i m e c o n s t a n tm e m b r a n e c h a r g i n g f o r p u l s e s s h o r t c o m p a r e d t o t h e i s a m e a s u r e o f t h e t i m e r e q u i r e d f o r c ha r g e s w i t h i n t h e c e l lm e m b r a n e c h a r g i n g t i m e c o n s t a n t . F o r b o t h i n c r e a s e s i n t o r e d i s t r i b u t e i n s u c h a way a s t o s c r e e n o u t t h e i m p o s e de t h i d i u m h o m o d i m e r f l u o r e s c e n c e , w h i c h i s u s e d a s a m a r k e r f o r e l e c t r i c f i e l d . T h e r e f o r e , i t i s d u r i n g t h i s c h a r g i n g t i m e t h a tp l a s m a membrane e l e c t r o p o r a t i o n a n d / o r t r a n s p o r t , a n d t h e c e l l i n t e r i o r i s e x p o s e d t o t h e a p p l i e d p u l s e d e l e c t r i c f i e l di n c r e a s e s i n p h o s p h a t i d y l s e r i n e e x t e r n a l i z a t i o n m e a s u r e d b y i n t e n s i t y . A s i m p l e e l e c t r i c a l m o d e l f o r l i v i n g c e l l s p r e d i c t sA n n e x i n - V - F I T C f l u o r e s c e n c e , w h i c h i s a m a r k e r f o r p l a s m a t e n the e l e c t r i c p l d e l a f o nis c e l l s t h e s u b -m e m b r a n e l i p i d t r a n s l o c a t i o n , a t h r e s h o l d r e s p o n s e t o i n c r e a s e s t h a t when t h e e l e c t r i c p u l s e d u r a t i o n i s r e d u c e d i n t o t h e s u b -i n b o t h m a r k e r s e x h i b i t e d t h e s a m e E T v a l u e . T h i s l a w a l s o m i c r o s e c o n d r a n g e ( t i m e d o m a i n ) , t h e r e i s a n i n c r e a s i n gh o l d s t r u e f o r i n t r a c e l l u l a r e f f e c t s t h a t a r e m e a s u r e d o n p r o b a b i l i t y f o r e l e c t r i c f i e l d i n t e r a c t i o n s t o o c c u r a t t h e l e v e li s o l a t e d c e l l s a n d i n t a c t t i s s u e s . T h u s , t h e i n t r a c e l l u l a r o f c e l l s u b s t r u c t u r e s . S t a t e d a n o t h e r way ( f r e q u e n c ya c t i v a t i o n o f c a s p a s e p r o t e a s e s , w h i c h a r e t h e e x e c u t i o n e r s f o r d o m a i n ) , t h e o u t e r m e m b r a n e b e c o m e s i n c r e a s i n g l yp r o g r a m m e d c e l l d e a t h b y a p o p t o s i s , w a s i n d e p e n d e n t o f t h e t r a n s p a r e n t f o r o s c i l l a t i n g e l e c t r i c f i e l d s w h e n t h e a n g u l a re n e r g y d e n s i t y w h e n p u l s e s w e r e a p p l i e d a t 1 0 , 6 0 a n d 3 0 0 n s , f r e q u e n c y o f t h e o s c i l l a t i o n e x c e e d s a v a l u e g i v e n b y t h eb u t d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o E r . F u r t h e r m o r e , c a s p a s e a c t i v a t i o n i n v e r s e o f t h e c h a r g i n g t i m e .i n i n t a c t f i b r o s a r c o m a t u m o r s a t 3 0 0 n s w a s d i r e c t l yp r o p o r t i o n a l t o t h e e l e c t r i c f i e l d . F i n a l l y , f o r a p o p t o s i s markersThDeatntoDfnstrugteAiFrcOfcefand n s P E F - i n d u c e d c e l l d e a t h i n HCT116 c o l o n c a r c i n o m a S c i e n t i f i c R e s e a r c h , t h e A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y , O l d D o m i n i o nc e l l s , t h e E T s c a l i n g l a w was e x t e n d e d t o i n c l u d e p u l s e n u m b e r U n i v e r s i t y , a n d E a s t e r n V i r g i n i a M e d i ca l S c h oo l s u p p o r t e d t h i s w o r k .( n ) i n t o t h e e q u a t i o n ( E - u n ) .

1 - 4 2 4 4 - 0 0 1 9 - 8 / 0 6 / $ 2 5 . O O 2 0 0 6 IE E E 5 5 8


2/4

A l t h o u g h t h i s i s w e l l - k n o w n [ 3 , 4 ] , o n l y r e c e n t l y h a v e h i g h r e s u l t i n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + r e l e a s e f o l l o w e d b y c a p a c i t a t i v ef r e q u e n c i e s ( s h o r t d u r a t i o n s ) b e e n u s e d f o r a c h i e v i n g i n f l u x t h r o u g h s t o r e - o p e r a t e d c h a n n e l s i n t h e p l a s m ai n t r a c e l l u l a r e f f e c t s , e . g . , t h e e l e c t r o p o r a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e [ 1 7 , 2 3 ] . T h i s m i m i c s C a 2 + - m e d i a t e d s i g n a l i n gm e m b r a n e s . r e s p o n s e t h r o u g h l i g a n d s s u c h a s p u r i n e r g i c r e c e p t o r s [ 1 7 ,C o n v e n t i o n a l e l e c t r o p o r a t i o n ( E P ) u s i n g p u l s e d 2 3 ] , a n d t h r o m b i n i n h u m a n p l a t e l e t s [ 2 6 ] . E f f e c t s o n DNAe l e c t r i c f i e l d s 0 . 1 - 1 0 m i l l i s e c o n d ( m s ) i n d u r a t i o n a n d v o l t s a r e c o m p l e x . A p p l i c a t i o n s o f l o w e l e c t r i c f i e l d s a n d / o r s h o r tt o l o w k i l o v o l t s / c e n t i m e t e r i n a m p l i t u d e h a v e b e e n u s e d f o r p u l s e d u r a t i o n s i n n o n - i o n i c , i s o t o n i c b u f f e r , e n h a n c e g e n ed e c a d e s f o r t h e t r a n s i e n t e l e c t r o p o r a t i o n o f c e l l s t o a l l o w t h e e x p r e s s i o n f o l l o w i n g t r a n s f e c t i o n b y EP [ 1 6 , 1 7 ] . A t h i g h e re n t r y o f x e n o m o l e c u l e s t h r o u g h a q u e o u s c h a n n e l s o r p o r e s e l e c t r i c f i e l d s a n d / o r l o n g e r p u l s e d u r a t i o n s , DNA d a m a g e i s[ 1 , 5 ] . A l t h o u g h t h e p h y s i c a l n a t u r e o f t h e p o r e s i s n o t w e l l l i k e l y . F u r t h e r m o r e , e f f e c t s o n t h e p l a s m a m e m b r a n ec h a r a c t e r i z e d , t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s t h a t a l l o w p o t e n t i a l h a v e b e e n d e f i n e d w i t h a 5 n s r e s o l u t i o n d u r i n g ai n t r a c e l l u l a r d e l i v e r y o f m e m b r a n e i m p e r m e a n t m o l e c u l e s 6 0 n s p u l s e i n J u r k a t c e l l s [ 2 7 ] . W h i l e m e m b r a n e s i g n a l i n g i sw i t h g o o d c e l l s u r v i v a l a r e w e l l k n o w n . C o n d i t i o n s f o r u s u a l l y i n i t i a t e d b y l i g a n d s a c t i n g o n r e c e p t o r s , i t i s p o s s i b l eo p t i m a l e l e c t r o p o r a t i o n d e p e n d o n t h e w a v e f o r m , t h e t h a t n s P E F s i n i t i a t e a " l i g a n d l e s s " s i g n a l i n g f r o m t h e p l a s m ac o mp o s i t i o n o f t h e m e d i u m i n w h i c h t h e c e l l s a r e s u s p e n d e d , m e m b r a n e , a s w e l l a s f r o m i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s .a n d t h e c e l l t y p e [ 1 , 6 ] . T h e s e p u l s e s h a v e m i n i m al e f f e c t s R e s p o n s e s f r o m o n e o r m o r e o f t h e s e n s P E F - r e c r u i t e do n i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s [ 7 ] . T h i s m e t h o d h a s b e e n u s e d t a r g e t s l e a d t o a p o p t o s i s s i g n a l i n g b y m i t o c h o n d r i a l -t o i n t r o d u c e g e n e s i n t o c e l l s f o r g e n e t h e r a p y . An a p p r o a c h m e d i a t e d m e c h a n i s m s a n d c e l l d e a t h i n c u l t u r e d c e l l s [ 1 5 ]c a l l e d e l e c t r o c h e m o t h e r a p y o r e l e c t r o p o r a t i o n t h e r a p y a n d t u m o r t i s s u e s [ 1 4 , 1 6 , 1 7 ] . I n g e n e r a l , t h e s e e f f e c t s( E P T ) , i s a m e t h o d t o d e l i v e r p o o r l y p e r m e a b l e a p p e a r t o b e t u n a b l e . A t r e l a t i v e l y l o w e l e c t r i c f i e l d s a n dc h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s , s u c h a s b l e o m y c i n i n t u m o r c e l l s p u l s e d u r a t i o n s , i t i s p o s s i b l e t o e n h a n c e c e l l f u n c t i o n si n v i v o t h a t c a n b e a p p r o p r i a t e l y o r i e n t e d b e t w e e n t w o t h r o u g h p a t h w a y s t h a t a c t i v a t e a n d a g g r e g a t e h u m a ne l e c t r o d e s [ 8 - 1 0 ] . B o t h e l e c t r o p o r a t i o n a n d EP T a r e p l a t e l e t s [ 2 6 ] , i n d u c e l i p o l y s i s i n i s o l a t e d r a t a d i p o c y t e s [ 2 8 ] ,d e p e n d e n t o n e l e c t r i c e f f e c t s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f t h e e n h a n c e e x p r e s s i o n o f t r a n s f e c t e d g e n e s [ 1 6 , 1 7 ] , o r d e l a yc e l l s o r t i s s u e s . c e l l d i v i s i o n t r a n s i e n t l y w i t h c o n t i n u e d s u r v i v a l o f aW e h a v e b e e n a b l e t o g e n e r a t e much s h o r t e r s u b p o p u l a t i o n o f c e l l s [ 2 9 ] . A t r e l a t i v e l y h i g h e l e c t r i c f i e l d s ,e l e c t r i c a l p u l s e s i n t h e n a n o s e c o n d r a n g e ( 1 0 t o 3 0 0 n s ) a n d i t i s p o s s i b l e t o t e r m i n a t e c e l l f u n c t i o n t h r o u g h p a t h w a y s t h a te l e c t r i c f i e l d i n t e n s i t i e s a s h i g h a s 3 5 0 k V / c m [ 1 1 - 1 9 ] . W e d e l e t e c e l l s i n c u l t u r e a n d t i s s u e s b y p r o g r a m m e d c e l l d e a t h ,r e f e r t o t h e s e p u l s e s a s n a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s o r i n c l u d i n g a c t i v a t i o n o f a p o p t o s i s c a s c a d e s [ 1 4 - 1 7 ] . T h u s ,n s P E F s . O v e r t h e p a s t s e v e r a l y e a r s , we h a v e a n a l y z e d t h e a p p l i c a t i o n s o f n s P E F p r o v i d e a new a p p r o a c h t o p h y s i c a l l ye f f e c t s o f n s P E F o n l i v i n g c e l l s a n d t i s s u e s i n v i t r o , e x v i v o , t a r g e t p l a s m a a n d i n t r a c e l l u l a r s t r u c t u r e s a n d m o d u l a t e c e l la n d i n v i v o . NsPEF c o n d i t i o n s d e f i n e d h e r e , a r e d i s t i n c t l y b e h a v i o r a n d f a t e . F u r t h e r m o r e , a p p l i c a t i o n o f n s P E F s t od i f f e r e n t t h a n e l e c t r o p o r a t i o n p u l s e s , n o t o n l y i n t h e i r t u m o r s p r o v i d e s a p o t e n t i a l c a n c e r t h e r a p y . E f f e c t s o ft e m p o r a l a n d e l e c t r i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , b u t a l s o i n t h e i r n s P E F s t o i n h i b i t f i b r o s a r c o m a t u m o r g r o w t h a n d r e d u c ee f f e c t s o n i n t a c t c e l l s a n d t i s s u e s . E l e c t r o p o r a t i o n p u l s e s a n d t u m o r s i z e [ 1 4 , 1 6 - 1 7 ] , a n d m o s t r e c e n t l y , t o c a u s e s h r i n k a g en s P E F , r e s p e c t i v e l y , e x h i b i t d i f f e r e n t e l e c t r i c f i e l d s t r e n g t h s a n d e v e n c o m p l e t e e l i m i n a t i o n o f m e l a n o m a t u m o r s [ 2 1 ] ,( 1 - 5 k V / c m 3 v s . 1 0 - 3 5 0 k V / c m 3 ; d i f f e r e n t p u l s e d u r a t i o n s h a v e e n c o u r a g e d u s t o c o n t i n u e t o i n v e s t i g a t e n s P E F s a s a( 0 . 1 - 2 0 m i l l i s e c o n d s v s . 1 - 3 0 0 n a n o s e c o n d s ) ; d i f f e r e n t p o t e n t i a l t h e r a p e u t i c a n d / o r a s a b a s i c s c i e n c e t o o l t o r e v e a le n e r g y d e n s i t i e s ( j o u l e s / c m 3 v s . m i l l i j o u l e s / c m 3 ) , a n d p o w e r c e l l b e h a v i o r s t o e x t e r n a l s t i m u l i .( 5 0 0 W v s . 1 8 0 M W ) . T h u s , n s P E F c a n b e f i v e t o s i x o r d e r s o f T h e d i v e r s i t y o f c e l l r e s p o n s e s t o n s P E F sm a g n i t u d e s h o r t e r w i t h e l e c t r i c f i e l d s a n d p o w e r s e v e r a l e n c o u r a g e s u s t o d e t e r m i n e m e c h a n i s m s a n d s i t e s o f a c t i o no r d e r s o f m a g n i t u d e h i g h e r a n d e n e r g y d e n s i t i e s w i t h i n b i o l o g i c a l c e l l s . I t i s c l e a r t h a t s p e c i f i c i t y f o r l e t h a lc o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n EP p u l s e s . I n a d d i t i o n t o t h e u n i q u e a n d n o n - l e t h a l n s P E F a c t i o n s d e p e n d o n t h e p u l s e d u r a t i o n ,s h o r t d u r a t i o n a n d r a p i d r i s e t i m e , n s P E F a r e e x c e p t i o n a l e l e c t r i c f i e l d a n d p u l s e n u m b e r . I n t h e r e s u l t s d e s c r i b e d h e r e ,b e c a u s e t h e y a r e v e r y l o w e n e r g y a n d e x t r e m e l y h i g h p o w e r . we h a v e f o cu s e d o n n s P E F c o n d i t i o n s t h a t l e a d t o e f f e c t s o nT h u s , t h e y a r e m e a s u r a b l y n o n - t h e r m a l i n v i t r o [ 2 0 ] a n d i n t h e p l a s m a m e m b r a n e , a s w e l l a s o n a p o p t o s i s m a r k e r s a n dv i v o [ 2 1 ] . H o w e v e r , t h e m o s t i m p o r t a n t d i f f e r e n c e s a r e i n s u r v i v a l i n c e l l s a n d t u m o r t i s s u e s t o b e t t e r u n d e r s t a n d t h eb i o l o g i c a l r e s p o n s e s t h a t a r e d u e t o i n c l u s i o n o f i n t r a c e l l u l a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p u l s e d u r a t i o n , e l e c t r i c f i e l d a n d p u l s ee f f e c t s t h a t a r e m a i n l y a b s e n t i n E P . n u m b e r . T h e r e s u l t s i n d i c a t e a s c a l i n g r u l e t h a t h e l p sWhen t h e e l e c t r i c p u l s e d u r a t i o n i s r e d u c e d i n t o t h e u n d e r s t a n d t h e s e r e l a t i o n s h i p s a n d s h e d l i g h t o n as u b - m i c r o s e c o n d r a n g e a n d t h e p u l s e r i s e - t i m e i s f a s t , t h e r e g e n e r a l i z e d m e c h a n i s m o f a c t i o n t h a t c a n e x p l a i n b i o l o g i c a li s a n i n c r e a s i n g l i k e l i h o o d f o r e l e c t r i c f i e l d s t o m o d i f y c e l l r e s p o n s e s t o n s P E F s .s u b s t r u c t u r e s . NsPEFs h a v e b e e n s h o w n t o p e n e t r a t e l i v i n g I I . R E S U L T Sc e l l s w i t h o u t m e a s u r a b l e e f f e c t s o n t h e p l a s m a membrane R e l a t i o n s h i p b e t w e e n p u l s e d u r a t i o n a n d e l e c t r i c f i e l d o nu s i n g v i t a l s t a i n s ( p r o p i d i u m i o d i d e , e t h i d i u m h o m o d i m e r , o r p l a s m a m e m b r a n e i n t e g r i t y u s i n g f l o w c y t o m e t r y a n d e t h i d i u mc a l c e i n ) , w h i l e m o d i f y i n g i n t r a c e l l u l a r s t r u c t u r e s i n c l u d i n g h o m o d i m e r - ] a s a m a r k e r i n H L - 6 0 c e l l s : I n o r d e r t o d e f i n e t h eg r a n u l e s i n h u m a n p e r i p h e r a l e o s i n o p h i l s [ 1 1 ] , e n d o p l a s m i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p u l s e n u m b e r a n d e l e c t r i c f i e l d we f i r s tr e t i c u l u m [ 1 7 , 2 2 , 2 3 ] , a n d DNA [ 2 4 , 2 5 ] . E f f e c t s o n t h e E R a n a l y z e d p l a s m a m e m b r a n e e f f e c t s d e f i n e d b y e t h i d i u m

5 5 9


3/4

h o m o d i m e r ( E t H d ) u p t a k e i n t o HL-60 c e l l i n c e l l N s P E F - i n d u c e d c e l l d e a t h i n H C T 1 1 6 c o l o n c a r c i n o m as u s p e n s i o n s i n c u v e t t e s a t t h r e e d i f f e r e n t p u l s e d u r a t i o n s a n d c e l l s f o l l o w s t h e s c a l i n g r u l e t h a t i n c l u d e s p u l s e n u m b e r . T h u s f a rv a r i o u s e l e c t r i c f i e l d s . E t H d i s u s e d a s a m a r k e r f o r p l a s m a d a t a i n d i c a t e t h a t t h e s c a l i n g r u l e h o l d s f o r c e l l s t h a t g r o w i nm e m b r a n e i n t e g r i t y a n d d o e s n o t e n t e r c e l l s u n t i l t h e p l a s m a s u s p e n s i o n . T o d e t e r m i n e i f a d h e r e n t c e l l s r e s p o n dm e m b r a n e i s b r e a c h e d . A t 3 0 0 ns p u l s e s w e r e v a r i e d b e t w e e n a c c o r d i n g t o t h e s c a l i n g r u l e , we d e t e r m i n e d i f c e l l s u r v i v a l1 2 a n d 6 0 k V / c m ; a t 6 0 n s p u l s e s w e r e v a r i e d b e t w e e n 1 8 a n d c o u l d b e p r e d i c t e d b y t h e s c a l i n g r u l e i n HC T 1 1 6 c o l o n6 0 k V / c m , a n d a t l O n s p u l s e s w e r e v a r i e d b e t w e e n 2 6 a n d c a r c i n o m a c e l l s . C e l l s w e r e e x p o s e d t o v a r i o u s n u m b e r s o f3 0 0 k V / c m . C e l l s w e r e a n a l y z e d b y f l o w c y t o me t r y 1 0 - 1 5 p u l s e s a t 6 0 n s ( 1 0 - 5 0 p u l s e s ) o r 3 0 0 n s p u l s e s ( 5 - 3 0 p u l s e s )m i n u t e s p o s t - p u l s e . F o r s i n g l e p u l s e s , e t h i d i u m h o m o d i m e r w i t h e l e c t r i c f i e l d s o f 6 0 k V / c m . C e l l s w e r e a n a l y z e d f o r c e l lf l u o r e s c e n c e b e c a m e s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n n o n - p u l s e n u m b e r u s i n g a C o u lt e r c o u n t e r 2 4 h o u r s p o s t p u l s e . F o r t h eb a c k g r o u n d f l u o r e s c e n c e a t 1 8 , 2 6 , a n d 3 0 0 k V / c m f o r 3 0 0 , 6 0 n s p u l s e a b o u t 5 0 0 0 o f t h e c e l l s s u r v i v e d a f t e r 5 0 p u l s e s .6 0 , a n d l O n s p u l s e s , r e s p e c t i v e l y . T h u s , h i gh e r e l e c t r i c f i e l d s T h e p r o d u c t o f t h e E t a u i n c l u d i n g t h e p u l s e n u m b e r w a sw e r e r e q u i r e d a s t h e p u l s e d u r a t i o n w a s d e c r e a s e d . I t a p p e a r s 1 8 0 , 0 0 0 . F o r 3 0 0 n s p u l s e s 5 0 0 o s u r v i v a l o c c u r r e d w i t h 5 o rt h a t n s P E F e f f e c t s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e a s d e t e r m i n e d 1 0 p u l s e s . T h e 1 0 - p u l s e c o n d i t i o n h a s a v a l u e o f 1 8 0 , 0 0 0 .b y E t H d c an b e e s t i m a t e d b y t h e p r o d u c t o f t h e e l e c t r i c f i e l d T h u s , t h e s c a l i n g r u l e h o l d s f o r c e l l d e a t h i n a d h e r e n t c e l l s[ E i n k V / c m ) a n d p u l s e d u r a t i o n [ I o r t a u i n n s ) . a n d i s e x t e n d e d t o i n c l u d e p u l s e n u m b e r . F u r t h e r m o r e , c e l lE f f e c t s o f n s P E F s o n p l a s m a m e m b r a n e s t r u c t u r e s i n d e a t h w a s p u l s e n u m b e r - d e p e n d e n t a t b o t h p u l s e d u r a t i o n s .J u r k a t c e l l s : I n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h i s s c a l i n g r e l a t i o n s h i p C a s p a s e a c t i v a t i o n i n f i b r o s a r c o m a t u m o r s e x p o s e d t o n s P E F s e xw a s s p e c i f i c t o H L - 6 0 c e l l s , we t e s t e d a r a n g e o f e l e c t r i c v i v o f o l l o w s t h e s c a l i n g r u l e . T o d e t e r m i n e i f t h e s c a l i n g r u l e h e l df i e l d i n t e n s i t i e s , a t t w o d i f f e r e n t p u l s e d u r a t i o n s , a n d f o r t u m o r t i s s u e s , we g r e w f i b r o s a r c o m a t u m o r s i n m i c e ,a n a l y z e d J u r k a t c e l l s f o r E t H d f l u o r e s c e n c e a n d A n n e x i n - V - r e m o v e d t h e m a n d t r e a t e d t h e m i n c u v e t t e s w i t h 5 p u l s e sF I T C - f l u o r e s c e n c e u s i n g f l o w c y t o m e t r y . A n n e x i n - V - F I T C - 3 0 0 n s a n d v a r i o u s e l e c t r i c f i e l d s b e t w e e n 1 8 a n d 6 0 k V / c m .f l u o r e s c e n c e i s u s e d a s a m a r k e r f o r p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( P S ) A f t e r p u l s i n g , t u m o r t i s s u e s w e r e i nc u b a t e d i n c e l l c u l t u r ee x t e r n a l i z a t i o n . P S i s a l i p i d t h a t i s o n t h e i n n e r l e a f l e t o f t h e m e d i a i n a c e l l c u l t u r e i n c u b a t o r f o r 3 h o u r s , h o m o g e n i z e d ,p l a s m a m e m b r a n e l i p i d b i l a y e r o f n o r m a l n o n - a p o p t o t i c a n d t h e n a n a l y z e d f o r c a s p a s e e n z y m e a c t i v i t y u s i n g ac e l l s . J u r k a t c e l l s w e r e e x p o s e d t o s i n g l e p u l s e s o f l O n s ( 2 6 - p e p t i d e s u b s t r a t e t h a t f l u o r e s c e s w h e n c l e a v e d ( D E V D ) . A t3 0 0 k V / c m ) , o r 6 0 n s ( 1 6 - 6 0 k V / c m ) a t d i f f e r e n t e l e c t r i c 1 8 , 2 6 , 4 0 a n d 6 0 k V / c m , E v a l u e s w e r e ( x l O O O ) 5 . 4 , 7 . 8 , 1 2 ,f i e l d s . C e l l s w e r e e x p o s e d t o n s P E F s i n t h e p r e s e n c e o f E t H d a n d 1 8 r e s p e c t i v e l y . C a s p a s e a c t i v i t y w a s d i r e c t l ya n d a f t e r p u l s i n g , w e r e i n c u b a t e d w i t h A n n e x i n - V - F I T C ( 1 0 p r o p o r t i o n a l t o t h e e l e c t r i c f i e l d a n d i n c r e a s e d a s t h e E t a um i n u t e s ) b e f o r e a n a l y s i s b y f l o w c y t o m e t r y . F o r 1 O n s p u l s e s , v a l u e i n c r e a s e d . F u r t h e r m o r e , t h e c a s p a s e i n c r e a s e w a st h e t h r e s h o l d f o r f l u o r e s c e n c e o f b o t h m e m b r a n e m a r k e r s i n d e p e n d e n t o f e n e r g y d e n s i t y a s i t w a s f o r c a s p a s ew a s a b o u t 1 5 0 k V / c m w i t h a n E t a u v a l u e o f 1 5 0 0 . A t 6 0 n s a c t i v a t i o n i n H L - 6 0 c e l l s .t h e t h r e s h o l d f o r b o t h m e m b r a n e m a r k e r s w a s a b o u t 2 6 I I I . D I S C U S S I O Nk V / c m w i t h a n E t au v a l u e o f 1 5 6 0 . T h u s , t h e s c a l i n g r u l e T h e d a t a p r e s e n t e d a b o v e i n d i c a t e t h a t n s P E F - i n d u c e dh e l d t r u e f o r t w o d i f f e r e n t c e l l t y p e s a n d f o r t w o d i f f e r e n t e f f e c t s f o l l o w a s c a l i n g r u l e i n c e l l s a n d s o l i d t u m o r s t h a te f f e c t s t h a t w e r e d e t e r m i n e d a t t h e p l a s m a m e m b r a n e . i n c l u d e t h e p r o d u c t o f t h e p u l s e d u r a t i o n a n d e l e c t r i c f i e l d .NsPEF e f f e c t s o n c a s p a s e a c t i v a t i o n i n H L - 6 0 c e l l s i n T h i s i s d e s c r i b e d i n m o r e d e t a i l e l s e w h e r e [ 1 7 ] a n d h a s b e e nv i t r o a r e i n d e p e n d e n t o f e n e r g y d e n s i t y : T o d e t e r m i n e i f t h e c o n s i d e r e d i n s i m u l a t e d m o d e l s [ 3 0 , 3 1 ] . T h i s r u l e s a p p l i e ss c a l i n g l a w i n c l u d e d a f a c t o r f o r e n e r g y d e n s i t y , we t o c e l l s i n c u l t u r e , a s w e l l a s t u m o r t i s s u e , a n d d e f i n e s e v e n t sc o m p a r e d d i f f e r e n t p u l s e d u r a t i o n s a t e l e c t r i c f i e l d s t h a t t h a t a r e r e l a t e d t o m e m b r a n e c h a r g i n g . B o t h c o n v e n t i o n a le q u a l i z e d e n e r g y d e n s i t y a n d a n a l y z e d a c e l l r e s p o n s e t h a t i s p l a s m a m e m b r a n e e l e c t r o p o r a t i o n - a nd n s P E F - m e d i a t e dn o t d i r e c t l y r e l a t e d t o a p l a s m a m e m b r a n e e f f e c t . W e e f f e c t s a r e d e t e r m i n e d b y m e m b r a n e c h a r g i n g . H o w e v e r , c e l li n v e s t i g a t e d c a s p a s e a c t i v a t i o n i n H L - 6 0 c e l l s . S i n g l e p u l s e s r e s p o n s e s t o t h e t w o p a r a d i g m s a r e d e f i n e d b y d i f f e r e n tw e r e d e l i v e r e d t o H L - 6 0 c e l l s i n s u s p e n s i o n f o r 1 0 , 6 0 , o r r u l e s . F i r s t , n s P E F s a r e i n d e p e n d e n t o f e n e r g y d e n s i t y a n d3 0 0 n s w i t h e l e c t r i c f i e l d s o f 1 5 0 , 6 0 a n d 2 6 k V / c m , a r e t h u s n o n - t h e r m a l . M o r e i m p o r t a n t l y , d i f f e r e n c e s b e t w e e nr e s p e c t i v e l y , w h i c h w e r e a d j u s t e d t o e q u a l i z e t h e e n e r g y t h e t w o PEF c o n d i t i o n s a r e f u r t h e r d e f i n e d b y i n c l u s i o n o fd e n s i t y ( 1 . 7 j o u l e s / c m 3 ) f o r a l l c o n d i t i o n s . F o r e a c h n s P E F p l a s m a m e m b r a n e a n d i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e c h a r g i n gc o n d i t i o n , t h e E t a u v a l u e i s i n d i c a t e d a s t h e p r o d u c t o f d e t e r m i n e d f o r n s P E F s , b u t o n l y p l a s m a m e m b r a n e c h a r g i n ge l e c t r i c f i e l d ( E ) a n d p u l s e d u r a t i o n ( I o r t a u ) . A t a c o ns t an t f o r c o n v e n t i o n a l e l e c t r o p o r a t i o n . T h u s , e f f e c t s o n m e m b r a n ee n e r g y d e n s i t y t h e m a g n i t u d e o f t h e e f f e c t o n c a s p a s e i n t e g r i t y d e f i n e d b y e t h i d i u m h o m o d i m e r u p t a k e a n da c t i v a t i o n w a s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e p r o d u c t E t a u . p h o s p h a t i d y l s e r i n e e x t e r n a l i z a t i o n a r e n o t s u r p r i s i n g .T h u s , n s P E F - i n d u c e d c a s p a s e a c t i v a t i o n i s i n d e p e n d e n t o f I n t e r e s t i n g l y , h o w e v e r , a r e e f f e c t s t h a t a r e n o t i m m e d i a t e l yt h e e n e r g y d e n s i t y a n d r e l a t e s m o r e s p e c i f i c a l l y t o t h e p u l s e a s s o c i a t e d w i t h m e m b r a n e c h a r g i n g , s u c h a s c a s p a s ed u r a t i o n a n d t h e e l e c t r i c f i e l d . T h u s , g r e a t e r c a s p a s e a c t i v a t i o n . C a s p a s e a c t i v a t i o n i n c u l t u r e d c e l l s a n d t u m o r sa c t i v a t i o n w a s o b s e r v e d a s t h e E t a u i n c r e a s e d . T h i s s u g g e s t s t h e n a p p e a r s t o b e d u e t o m e m b r a n e c h a r g i n g . F u r t h e r m o r e ,t h a t , l i k e e f f e c t s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e , c a s p a s e a c t i v a t i o n c e l l s u r v i v a l i n HCT1 1 6 c e l l s f o l l o w e d t h i s r u l e i n d i c a t i n g ,i s r e l a t e d t o c h a r g i n g e v e n t s a t m e m b r a n e s , e i t h e r a t t h e t h a t c e l l d e a t h b y a p o p t o s i s i s a l s o d e t e r m i n e d b y m e m b r a n ep l a s m a m e m b r a n e a n d / o r a t i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s . c h a r g i n g .

5 6 0


4/4

T h e s c a l i n g r u l e was s h o w n t o i n c l u d e p u l s e [ 1 6 ] S J B e e b e , J W h i t e , P F B l a c k m o r e , Y D e n g , K S o m e r s , a n d KHn u m b e r f o r d e m i s e o f HC T1 1 6 c e l l s . T h i s i s c u r i o u s b e c a u s e S c h o e n b a c h . " D i v e r s e e f f e c t s o f n a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s o n c e l l st h i s w o u l d b e e xp e ct ed to include a "dos e" f a c t o r t h a t w o u l d a n d t i s s u e s , " D N A C e l l B i o l , v o l . 2 2 ( 1 2 ) , p p 7 8 5 - 9 6 D e c 2 0 0 3 .[ 1 7 ] S J B e e be , P F B l a c k m o r e , J W h i t e , R P J o s h i , a n d KH S c h o e n b a c h ,i n c l u d e a n e n e r g y d e n s i t y t e r m , w h i c h wa s s h o w n t o b e " N a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s m o d u l a t e c e l l f u n c t i o n t h r o u g hu n i m p o r t a n t f o r n s P E F s . T h u s , t h e i n c l u s i o n o f p u l s e n u m b e r i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m s , " P h y s i o l . M e a s . , v o l . 2 5 ( 4 ) ,i n t o t h e s c a l i n g r u l e s r e q u i r e s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . p p 1 0 7 7 - 9 3 , A u g 2 0 0 4 .[ 1 8 ] E H H a l l , KH S c h o e n b a c h , a n d S J B e e b e , " N a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i cAs work c o n t i n u e s w i t h n s P E F s , w e s t r i v e t o f i e l d s i n d u c e d i r e c t e l e c t r i c e f f e c t s a n d b i o l o g i c a l e f f e c t s o n human c o l o nd e c r e a s e t h e p u l s e d u r a t i o n a n d i n c r e a s e t h e e l e c t r i c f i e l d s . c a r c i n o m a c e l l s , " D N A C e l l B i o l , v o l . 2 4 ( 5 ) , p p 2 8 3 - 2 9 1 , M a y 2 0 0 5 .T h u s , f o r a I n s p u l s e , e x t r e m e l y h i g h e l e c t r i c f i e l d s w i l l b e [ 1 9 ] S J B e e b e a n d KH S c h o e n b a c h , " N a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s : Ar e q u i r e d t o i n d u c e a p o p t o s i s . I t r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d i f n e w s t i m u l u s t o a c t i v a t e i n t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g , " J B i o m e d a n d B i o t e c h , v o l .

c o n d i t i n s c a n b ereaced t o ause c el deat byapotosis. 4 ! , p p 2 9 7 - 3 0 0. 2 0 0 5 .c o n d i t i o n s c a n b e r e a c h e d t o c a u s e c e l l d e a t h b y a p o p t o s i s . [ 2 0 ] AG P a k h a m o v , A P h i n n e y , J A s h m o r e , K W a l k e r , J F K o l b , S K o n o ,H o w e v e r , o t h e r c e l l r e s p o n s e s , s u c h a s c a l c i u m m o b i l i z a t i o n , K H S c h o e n b a c h , a n d MR M u r p h e y , " C h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o t o x i c e f f e c t sd o n o t r e q u i r e s u c h h i g h e l e c t r i c f i e l d s [ 2 2 , 2 3 ] . T h u s , i t i s o f h i g h i n t e n s i t y , l O n s d u r a t i o n e l e c t r i c a l p u l s e s , " I E E E T r a n s a c t i o n s o nl i k e l y t h a t s i g n a l t r a n s d u c t i o n e v e n t s c a n b e t r i g g e r e d b y P l a s m a S c i e n c e , v o l . 3 2 ( 4 ) , p p 4 1 5 7 9 - 1 5 8 6 , 2 0 0 4 .nsPEFs with durations s h o r t . A s c a l i [ 2 1 ] R N u c c i t e l l i , U P l i q u e t t , X C h e n , W F o r d , R J S w a n s o n , S J B e e b e , J FnsPEFs w i t h d u r a t i o n s s o s h o r t . A s c a l i n g l a w r e m a i n s t o be K o l b , a n d KH S c h o e n b a c h , " N a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s c a u s ed e t e r m i n e d f o r p u l s e d u r a t i o n s t h a t a r e s u f f i c i e n t l y s h o r t t o m e l a n o m a s t o s e l f - d e s t r u c t , " B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n . , v o l . 3 4 3 ( 2 ) ,d i m i n i s h o r e x c l u d e m e m b r a n e c h a r g i n g . N e v e r t h e l e s s , t h e p p : 3 5 1 - 6 0 , M a r 5 , 2 0 0 6 .n s P E F s c a l i n g r u l e f o r p u l s e d u r a t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y w i l l [ 2 2 ] P T V e r n i e r , Y S u n , L M a r c u , S S a l e m i , C M C r a f t , a n d MA G u n d e r s e n ,

f a c i l i t a t e t r a n s l a t i o n of responsesdetermined f o r cells i n " C a l c i u m b u r s t s i n d u c e d b y n a n o s e c o n d e l e c t r i c p u l s e s , " B i o c h e m B i o p h y sf a c i l i t a t e t r a n s l a t i o n o f r e s p o n s e s d e t e r m i n e d f o r c e l l s i n R e s C o m m u n , v o l . 3 1 0 ( 2 ) , p p 2 8 6 - 9 5 , O c t 1 7 , 2 0 0 3 .c u l t u r e t o t i s s u e s i n v i v o . [ 2 3 ] J A W h i t e , P F B l a c k m o r e , K H S c h o e nb a ch , a n d S J B e eb e . " S t i m u l a t i o nI V . R E F E R E N C E S o f c a p a c i t a t i v e c a l c i u m e n t r y i n H L - 6 0 c e l l s b y n a n o s e c o n d p u l s e d e l e c t r i c

[ 1 ] J C W e a v e r . I n : B r o n z i n o , J D , e d i t o r . T h e B i o m e d i c a l E n g i n e e r i n g f i e l d s , " J B i o l C h e m . 2 0 0 4 ; v o l . 2 7 9 ( 2 2 ) , p p 2 2 9 6 4 - 7 2 . Ma y 2 8 , 2 0 0 4 [ E p u bH a n db o o k . B o c a R a t o n , F l o r i d a , C R C P r e s s a n d IEEE P r e s s p p 1 4 3 1 - 1 4 4 0 Ma r 1 6 , 2 0 0 4 ] .( 1 9 9 5 ) . [ 2 4 ] N C h e n , KH S c h o e n b a c h , J F K o l b , J R S w a n s o n , AL G a r n e r , J Y a n g ,[ 2 ] KS C o l e . " E l e c t r i c I m p e d a n c e o f M a r i n e E g g M e m b r a n e s , " T r a n s R P J o s h i , a n d S J B e e b e , " L e u k e m i c c e l l i n t r a c e l l u l a r r e s p o n s e s t oF a r a d a y S o c v o l . 2 3 , p p 9 6 6 ( 1 9 3 7 ) . n a n o s e c o n d e l e c t r i c f i e l d s , " B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n , v o l . 3 1 7 ( 2 ) , p p[ 3 ] HP S c h w a n . " E l e c t r i c C h a r a c t e r i s t i c s o f T i s s u e s ; A S u r v e y , " B i o p h y s i k . 4 2 1 - 7 , A p r 3 0 , 2 0 0 4 .v o l . 1 , p p 1 9 8 - 2 0 8 ( 1 9 6 3 ) . [ 2 5 ] M S t a c e y , J S t i c k l e y , P F o x , V S t a t l e r , KH S c h o e n ba c h, S J B e e b e , a n d[ 4 ] HP S c h w a n . I n : C h i a b r e r a A , N i c o l i n i C , S c h w a n H P , e d i t o r s . ES B u e s c h e r . D i f f e r e n t i a l e f f e c t s i n c e l l s e x p o s e d t o U l t r a - S h o r t , H i g hI n t e r a c t i o n s B e t w e e n E l e c t r o m a g n e t i c F i e l d s a n d C e l l s . N e w Y o r k a n d I n t e n s i t y E l e c t r i c F i e l d s : C e l l s u r v i v a l , DNA d a m a g e , a n d c e l l c y c l eL o n d o n : P e r g a m o n . p p 7 5 - 9 7 ( 1 9 8 5 ) . a n a l y s i s , " M u t a t i o n R e s . v o l . 5 4 2 ( 1 - 2 ) , p p 6 5 - 7 5 , D e c 9 , 2 0 0 3 .[ 5 ] U Z i m m e r m a n , U F r i e d r i c h , H M u s s a u e r , P G e s s n e r , K H a m e l , a n d V [ 2 6 ] S J B e e b e , JA W h i t e , P F B l ac k m o r e , a nd KH S c h o e n b a c h ,S u k h o r u k o v . " E l e c t r o m a n i p u l a t i o n o f M a m m a l i a n C e l l s : F u n d a m e n t a l s a n d " N a n o s e c o n d P u l s e d E l e c t r i c F i e l d s M i m i c N a t u r a l C e l l S i g n a lA p p l i c a t i o n , " IEEE T r a n s P l a s m a S c i e n c e , v o l . 2 8 , p p 7 2 - 8 2 ( 2 0 0 0 ) . T r a n s d u c t i o n M e c h a n i s m s , " IEEE I n t e r n a t i o n a l Power M o d u l a t o r[ 6 ] C S D j u z e n o v a , U Z i m m e r m a n n , H F r a n k , VL S u k h o r u k o v , E R i c h t e r , C o n f e r e n c e P r o c e e d i n g , S a n F r a n c i s c o , C A , Ma y 2 3 - 2 6 , 2 0 0 4 .a n d G F u h r , " E f f e c t o f m e d i u m c o n d u c t i v i t y a n d c o m p o s i t i o n o n t h e u p t a k e [ 2 7 ] W F r e y , JA W h i t e , R O P r i c e , P F B l a c k m o r e , R P J o s h i , R N u c c i t e l l i , S Jo f p r o p i d i u m i o d i d e i n t o e l e c t r o p e r m e a b i l i z e d m y e l o m a c e l l s , " B i o c h i m B e e b e , KH S c h o e n b a c h , a n d J F K o l b , " P l a s m a m e m b r a n e V o l t a g e C h a n g e sB i o p h y s A c t a , v o l . 1 2 8 4 , p p 1 4 3 - 5 2 ( 1 9 9 6 ) . D u r i n g N a n o s e c o n d P u l s e d E l e c t r i c F i e l d E x po s u r e , " B i o p hy s i c a l J , v o l . 9 0 ,[ 7 ] T R G o w r i s h a n k a r , AT E s s e r , Z V a s i l k o s k i , K C S m i t h , a n d J C W e a v e r , p p 3 6 0 8 - 3 6 1 5 2 0 0 6 ." M i c r o d o s i m e t r y f o r c o n v e n t i o n a l a n d s u p r a - e l e c t r o p o r a t i o n i n c e l l s w i t h [ 2 8 ] S J B e e b e a n d P F B l a c k m o r e , u n p u b l i s h e d .o r g a n e l l e s , , " B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n . ; v o l . 3 4 1 ( 4 ) , p p 1 2 6 6 - 7 6 . Ma r [ 2 9 ] E H H a l l , KH S c h o e n b a c h , a n d S J B e e b e , u n p u b l i s h e d .2 4 2 0 0 6 [ E p u b J an 3 1 2 0 0 6 ] . [ 3 0 ] R P J o s h i , Q H u , KH S c h o e n b a c h , a n d S J B e e b e , " E n e r g y - l a n d s c a p e -[ 8 ] SB Dev a n d GA H o f m a n n . " E l e c t r o c h e m o t h e r a p y - - a n o v e l m e t h o d o f m o d e l a n a l y s i s f o r i r r e v e r s i b i l i t y a n d i t s p u l s e - w i d t h d e p e n d e n c e i n c e l l sc a n c e r t r e a t m e n t , " C a n c e r T r e a t R e v v o l . 2 0 , p p 1 0 5 - 1 5 ( 1 9 9 4 ) . s u b j e c t e d t o a h i g h - i n t e n s i t y u l t r a s h o r t e l e c t r i c p u l s e , " P h y s R e v E S t a t[ 9 ] GA H o f m a n n , SB D e v , S D i m m e r , a n d GS N a n d a , " E l e c t r o p o r a t i o n N o n l i n S o f t M a t t e r P h y s . v o l . 6 9 ( 5 P t 1 ) , 0 5 1 9 0 1 . [ E p u b Ma y 0 4 , 2 0 0 4 ] .t h e r a p y : a new a p p r o a c h f o r t h e t r e a t m e n t o f h e ad a n d n e c k c a n c e r , " . IEEE [ 3 1 ] Q H u , S V i s w a n d n a m , R P J o s h i , KH S c h o e n b a c h , S J B e e b e , a n d P FT r a n s B i o m e d Eng v o l . 4 6 , p p 7 5 2 - 9 ( 1 9 9 9 ) . B l a c k m o r e , " S i m u l at i o n o f t r a n s i e n t m e m b r a n e b e h a v i o r i n c e l l s s u b j e c t e d[ 1 0 ] LM M i r a n d S O r l o w s k i . " M e c h a n i s m s o f e l e c t r o c h e m o t h e r a p y , " A d v t o h i g h i n t e n s i t y , u l t r a s h o r t e l e c t r i c f i e l d s , " P h y s R e v E , v o l . , 7 1 ( 3 P tD r u g D e l i v R e v . , v o l . 3 5 , p p 1 0 7 - 1 1 8 ( 1 9 9 9 ) . 1 ) : 0 3 1 9 1 4 . [ E p u b Ma r 2 9 , 2 0 0 5 ] .[ 1 1 ] KH S c h o e n b a c h , S J B e e b e , a n d E S B u e s c h e r . " I n t r a c e l l u l a r E f f e c t o fU l t r a s h o r t P u l s e s , " J B i o e l e c t r o m a g n e t i c s v o l . 2 2 , p p 4 4 0 ( 2 0 0 1 ) .[ 1 2 ] KH S c h o e n b a c h , S K a t s u k i , RH S t a r k , ES B u e s c h e r , a n d S J B e e b e .B i o e l e c t r i c s - "New A p p l i c a t i o n s f o r P u l s e d P o w e r T e c h n o l o g y , " IEEET r a n s P l a s m a S c i e n c e , v o l . 3 0 ( 1 ) p p 2 9 3 - 3 0 0 ( 2 0 0 2 ) .[ 1 3 ] KH S c h o e n b a c h , R P J o s h i , J F K o l b , N C h e n , M S t a c e y , PF B l a c k m o r e ,ES B u e s c h e r , a n d S J B e e b e , I n v i t e d P a p e r , " U l t r a s h o r t E l e c t r i c a l P u l s e sO p e n a N e w G a t e w a y i n t o B i o l o g i c a l C e l l s , " P r o c . I E E E , v o l . 9 2 , p p 1 1 2 2 -1 1 3 7 , 2 0 0 4 .[ 1 4 ] S J B e e b e , PM F o x , L J R e c , ES B u e s c h e r , K S o m e r s , a n d KHS c h o e n b a c h , " N a n o s e c o n d P u l s e d E l e c t r i c F i e l d ( n s P E F ) E f f e c t s o n C e l l sa n d T i s s u e s : A p o p t o s i s I n d u c t i o n a n d Tumor G r o w t h I n h i b i t i o n , " IEEET r a n s . P l a s m a S c i . v o l . 3 0 I s s u e : 1 P a r t : 2 , p p 2 8 6 - 2 9 2 , F e b 2 0 0 2 .[ 1 5 ] S J B e e b e , PM F o x , U J R e c , L K W i l l i s , a n d KH S c h o e n b a c h ." N a n o s e c o n d , h i g h - i n t e n s i t y p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s i n d u c e a p o p t o s i s i nh u m a n c e l l s , " FA SEB J , v o l . 1 7 , p p l 4 9 3 - 1 4 9 5 , 2 0 0 3 .

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