biomedicina 2010
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1
INDICE
BIOMEDICINA
Caracterización molecular de cepas y vectores de Trypanosoma cruzi del Estado de Veracruz. ................. 85
Clonación de un fragmento del gene que codifica para la proteína NS3 de los 4 serotipos del virus dengue
............................................................................................................................................................... 54
Confirmacion diagnostica de Virus Del Papiloma Humano (VPH) en biopsias de cervix, mediante reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR). ........................................................................................................ 20
Detección de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae en especímenes genitourinarios mediante
PCR Múltiple .......................................................................................................................................... 49
Detección de clonas de Staphylococcus aureus meticilino resistentes (MRSA) en el Hospital Regional de
Alta Especialidad de Veracruz (HRV) ...................................................................................................... 26
Diagnóstico molecular de dengue .............................................................................................................. 32
Efecto del extracto polar de moussonia deppeana sobre la proliferación y la viabilidad de la línea celular
de cáncer de próstata lncaP. .................................................................................................................. 74
Efectos bioclínicos de la obesidad y la inducción de la diabetes en la rata Wistar hembra ......................... 79
Evaluacion de la eficiencia del metodo de conservacion de microorganismos en papel filtro .................... 11
Evaluación del efecto de catequina y epicatequina de theobroma cacao sobre las líneas mda-mb 231 y bt-
474 de cáncer de mama ........................................................................................................................ 45
Evaluación del efecto de oxiesteroles dietarios sobre el perfil de lípidos de la membrana plasmática en
hepatocitos de rata wistar. .................................................................................................................... 15
Evaluación del efecto del Ácido Linoleico Conjugado (CLA) dietario sobre el estrés oxidativo en ratas con
síndrome metabólico e hígado graso. ...................................................................................................... 3
Evaluación del potencial adyuvante de un toxoide derivado de Listeriolisina O sobre células presentadoras
de antígeno humanas............................................................................................................................. 94
Identificación de receptores de Angiotensina II y caveolina-1 en cordón umbilical y células endoteliales de
cordón umbilical (HUVECs) de pacientes preeclámpticas ....................................................................... 40
Identificación de una zona con alta seroprevalencia de infección por Trypanosoma cruzi en la zona centro
del Estado de Veracruz ........................................................................................................................... 89
Inmunopatogenia en 200 pacientes con dengue ...................................................................................... 36
Interleucina 17A e IL-17F, nuevos mediadores inflamatorios en la infección por virus del Dengue .............. 7
Mutaciones en genes asociados a resistencia a RIfampicina y Etambutol, en cepas de pacientes con
Tuberculosis Drogorresistente ............................................................................................................... 63
2
Numero de eosinofilos en mucosa esofógica de pacientes con esofagitis eosinofilica, esofagitis erosiva,
enfermedad por reflujo no erosivo y controles asintomático. Un estudio en pacientes mexicanos. ...... 69
Patron de susceptibilidad de microorganismos aislados en urocultivos en la unidad de servicios analiticos
de salud bioanalisis (usasb). Enero 2007, dicembre 2009 Xalapa Veracruz ............................................. 98
Variación de la respuesta a un estimulo doloroso en ratas Wistar con ansiedad inducida bajo un estimulo
externo. ................................................................................................................................................. 59
3
EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL ÁCIDO LINOLEICO
CONJUGADO (CLA) DIETARIO SOBRE EL ESTRÉS
OXIDATIVO EN RATAS CON SÍNDROME METABÓLICO E
HÍGADO GRASO
Yohevet Romero Sarmiento Alfonso Alexander Aguilera.
Ida Soto Rodríguez Agustín Arzaba Villalba
Hugo Sergio García Galindo
Estudiante de Maestría Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos Instituto Tecnológico de
Veracruz [email protected]
Marco teórico:
El hígado graso no alcohólico (HGNA) se
define como la acumulación de grasa
macrovesicular en el hígado que excede 5 al
10% del mismo que puede asociarse a grados
variables de inflamación lobulillar con o sin
fibrosis(1). Esta condición puede
desencadenar a una cirrosis hepática. El
síndrome metabólico y sus manifestaciones
clínicas como la obesidad y la diabetes son
los dos factores de riesgo más importantes
para desarrollar hígado graso.
Aproximadamente un 80% de las personas
obesas tienen hígado graso, en la gran
mayoría asociada a síndrome metabólico. La
resistencia a la insulina es el mecanismo
fisiopatológico de estas alteraciones y que
determina que la grasa se acumule fuera del
tejido adiposo. El estrés oxidativo es el otro y
segundo evento celular en su progresión a
esteatosis, esteatohepatitis y fibrosis, el cual
se define como la exposición inadecuada a
especies reactivas de oxígeno (ROS) y el
resultado del desequilibrio entre compuestos
prooxidantes y antioxidantes que conduce al
daño por muerte celular y tisular. En la
actualidad no existe tratamiento específico y
han sido utilizados aquellos que revierten el
estado de resistencia a la insulina. El
tratamiento dietoterapéutico juega un papel
fundamental. El ácido linoleico conjugado
(CLA) es una mezcla de isómeros del ácido
linoleico (cis-9, cis-12-octodecadienoico) que
poseen sus dobles enlaces en posición
conjugada (principalmente 9, 11 ó 10, 12), ha
sido considerado recientemente como
compuestos nutracéuticos, en los cuales el
CLA ha mostrado un amplio rango de efectos
4
biológicos: anticancerígenos, anti-
ateroscleróticos y antioxidantes.
Actualmente no se conoce el efecto dietario
que el CLA tiene sobre la inhibición del
desarrollo de hígado graso específicamente
sobre el estrés oxidativo hepático(5,6,7).
Planteamiento del problema:
El CLA ha sido utilizado para evaluar su
efecto dietoterapéutico sobre la
fisiopatología del síndrome metabólico en
modelos animales y humanos; aunque
existen estudios sobre el efecto que tiene en
el mecanismo de resistencia a la insulina, se
desconocen los efectos sobre los marcadores
celulares de estrés oxidativo como base
fisiopatológica del desarrollo del hígado
graso no alcohólico, en el cual participan las
enzimas alanin-aminotransferasa (ALT) y
apartato-aminotranferasa (AST) como
indicadoras de daño hepático y la superóxido
dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH-
PX) y compuestos reactantes al ácido
tiobarbituricos (TBARS) como indicadores de
la presencia de compuestos prooxidantes
hepáticos. En base a lo antes expuesto, el
planteamiento del problema se basa en el
siguiente cuestionamiento ¿cuál es el efecto
del CLA dietario sobre los marcadores de
estrés oxidativo en ratas con hígado graso
no alcohólico, como agente nutracéutico con
potencial dietoterapéutico?.
Objetivo General:
Evaluar el efecto del ácido linoleico
conjugado (CLA) dietario sobre los
marcadores de estrés oxidativo a nivel
tisular: superóxido dismutasa (SOD),
glutatión peroxidasa (GSH-PX) y compuestos
reactantes al ácido tiobarbiturico (TBARS) en
ratas con hígado graso, que muestre el
potencial dietoterapéutico en esta
enfermedad en un modelo animal.
Metodología:
Se realizó un estudio experimental en dos
etapas, primero se llevó a cabo la inducción
del síndrome metabólico e hígado graso en
ratas wistar macho recién destetadas,
utilizando sacarosa al 30% en agua para
beber (ad libitum) durante 9 semanas;
posterior al tratamiento experimental se
determinaron los marcadores de daño
hepático (AST y ALT) y análisis histológico
para el diagnóstico de esteatosis. La segunda
etapa consistió en la evaluación del efecto
del CLA bajo un diseño experimental
completamente al azar, formado por 4
grupos: testigo (T), experimental
(CLA)reciebiendo el aporte del compuesto en
estudio, Hígado graso (HG)recibend aporte
de aceite vegetal el cual es incapaz de
revertir a la normalidad a estos roedores y
en donde se mantienen las condiciones de
daño hepático y el grupo ingesta previa de
IP-CLA (el cual recibió CLA desde el inicio
ingesta de sacarosa simultáneamente al
tratamiento experimentación CLA). Se
determinaron los marcadores de estrés
oxidativo (SOD, GSH-PX y TBARS) en suero y
en homogenizado de hígado bajo el efecto
del CLA dietario para evaluar los efectos
sobre este mecanismo del hepatocito.
Resultados:
Se obtuvo la inducción de hígado graso en el
modelo utilizado caracterizado por el
aumento del peso corporal de los roedores y
los parametros metabólicos que caracterizan
al síndrome metabólico; se presentaron
5
alteraciones en los marcadores de daño
hepático tanto en suero como en el
homogenizado de tejido hepático. La AST y
AST mostraron concentraciones mayores en
el grupo Higado Graso (HG) (78.67 ± 3.62 U/L
vs 20.16 ± 1.81 U/L; p<0.05 y 68.11 ± 3.62
U/L vs 35.00 ± 0.81 U/L; p<0.05), asociado a
alteraciones histológicas hepáticas
compatibles con hepatomegalia y esteatosis
caracterizada por un aumento de vesiculas
de grasa y alteraciones del parenquima
hepatico como destrucción de los sinusoides
y la arquitectura del lobulillo hepático. El
efecto del CLA durante 7 semanas de
tratamiento experimental, mostró que las
enzimas antioxidantes aumentaron en el
grupo recibiendo el aporte del CLA con
respecto al grupo Higado Graso (HG) que se
mostraron disminuidos; para GSH-PX(11.915
± 0.463 U/mg prot. vs 8.930 ± 0.625 U/mg
prot; p<0.05)y para SOD(78.77 ± 6.56 U/mg
prot. vs 43.36 ± 17.5 U/mg prot; p<0.05). Los
niveles de éstas enzimas se mantuvieron
normales en el grupo que recibió una ingesta
previa de CLA con respecto al grupo Testigo
Sano, para GSH-PX(16.264 ±1.691 vs 17.983
± 1.150)y para SOD (80.09 ± 8.02 vs 92.00 ±
4.14). Los compuestos reactantes al acido
tiobarbíturico (TBARS) como indicador de
estrés oxidativo en suero e hígado fueron
normales en los roedores del grupo
recibiendo el aporte del CLA, mientras que
fueron significativamente mayores en el
grupo de roedores con hígado graso.
Discusión:
La acumulación de grasa en el hígado cambia
sus condiciones fisiológicas y metabólicas,
aumenta el acortamiento de las cadenas de
ácidos grasos en peroxisomas para su
posterior catabolismo en mitocondrias por
beta oxidación, todo ello genera especies
reactivas de oxigeno (ROS) como indicador
de estrés oxidativo celular, a la vez de una
marcada disminución de las enzimas
antioxidantes como la SOD y GSH-PX; sin
embargo algunos estudios muestran, que
algunos ácidos grasos dietarios como los
omega 3 influyen sobre la expresión de
genes que codifican para algunas enzimas y
receptores celulares(2,3,4). El CLA es un
regulador de la expresión de algunos genes
de resistencia a la insulina y pudiera estar
regulando la expresión de las enzimas de
estrés oxidativo, dado el aumento
encontrado de las mismas en los roedores
recibiéndolo como aporte de CLA dietario,
con respecto al grupo que desarrolló hígado
graso y que mantiene niveles muy bajos de
SOD y GSH-PX y aumento de especies
reactivas de oxígeno tanto en suero como en
el tejido hepático.
Conclusión:
El CLA dietario mostró un efecto benéfico
sobre los niveles de marcadores de hígado
graso (AST y ALT) y estrés oxidativo (SOD y
GSH-PX,) caracterizado por reversión a
concentraciones normales tanto en suero
como en tejido hepático de las enzimas con
actividad antioxidante estudiadas;
mostrando de esta forma, su potencial
dietoterapéutico como auxiliar en el
tratamiento de hígado graso en este modelo
animal de la enfermedad.
Referencias Bibliográficas:
1. Evan S.S, Mrak A.R. Imaging of
Hepatic Steatosis. Sem. Liv. Dis.
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6
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3. Harrison SA, Di Bisceglie AM.
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steatosis: Role of mitochondria and
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5. Morales SA, Arrese JM. Hígado graso
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7. Valera JMM. Enfermedad por hígado
graso no alcoholic, opciones
terapéuticas. 2006. Gastr. Latinoam.
17(2):191-193.
7
INTERLEUCINA 17A E IL-17F, NUEVOS MEDIADORES
INFLAMATORIOS EN LA INFECCIÓN POR VIRUS DEL
DENGUE Fatima del Rocío Sánchez Vega
César Iván Berzunza Huerta José Zarrabal Meza
Maria Teresa Martinez Cázares Aurora Parissi Crivelli
Héctor Vivanco Cid
Estudiante de Licenciatura INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MEDICO BIOLOGICAS UNIVERSIDAD
VERACRUZANA [email protected]
Marco teórico:
Los Flavivirus son un grupo de patógenos con
un alto impacto en la salud pública mundial,
debido a su amplia distribución y su
capacidad para causar enfermedades con
tasas elevadas de morbilidad y mortalidad
en humanos. Más de 75 diferentes Flavivirus
han sido identificados a la fecha y
aproximadamente la mitad de los mismos
son capaces de causar enfermedad en seres
humanos (1). Dentro de este género se ubica
el virus del Dengue, el cual es considerado un
patógeno re-emergente debido a que en las
últimas dos décadas, la incidencia de
enfermedades provocadas por este, han
aumentado a un ritmo alarmante. Más de
2500 millones de personas, es decir, más de
dos quintas partes de la población mundial
viven en zonas de riesgo para Dengue y más
de 100 países han informado de la presencia
de esta enfermedad en su territorio (2). La
Región de las Américas ha sido una de las
más afectadas por la forma clásica o fiebre
por Dengue y su forma más grave, el Dengue
Hemorrágico (DH). La enfermedad es
transmitida a humanos a través de la
picadura del mosquito Aedes aegypti, que es
el principal vector. Otras especies de Aedes
tales como A. albopictus y A. polynesiensis
también han sido implicados en la
transmisión. Pueden distinguirse cuatro
serotipos antigénicamente relacionados del
virus Dengue denominados como Dengue 1,
2, 3 y 4. La infección primaria se presenta en
un individuo no sensibilizado previamente o
bien en aquellos que ya han estado
expuestos al contacto previo con algún
serotipo y que contraen una nueva infección
(infección secundaria) con otro serotipo
diferente. La infección en el humano causa
un espectro de manifestaciones que van
desde sudoración, desarrollo de un cuadro
febril, el cual de manera relevante se asocia
con viremia, dolor de cabeza intenso,
mialgias, artralgias, exantema, hasta cuadros
más severos tales como DH o el síndrome de
choque por Dengue (SCHD), las cuales
8
constituyen las complicaciones más severas
(3,4). El DH y el SCHD son definidos por un
conjunto de manifestaciones clínico-
patológicas que comprenden: fiebre
continua durante 2 a 7 días, petequias,
prueba de torniquete positiva, equimosis,
tendencia a hemorragias que pueden ser de
leves a severas, trombocitopenia (100,000
células por mm3 o menos), aumento en la
permeabilidad vascular, hemoconcentración,
culminando en choque hipovolémico y la
muerte del paciente (5).
Planteamiento del problema:
La alarmante situación epidemiológica del
dengue en el mundo, aunado a la carencia de
una vacuna efectiva en contra del agente
etiológico de la enfermedad hacen necesario
enfocar los esfuerzos en investigación para
conocer más acerca de los mecanismos
inmunopatológicos implicados en la
infección e investigar sobre nuevos
biomarcadores y blancos terapéuticos que
permitan establecer nuevas estrategias de
seguimiento y control de las formas severas
de la enfermedad. Desde el punto de vista
inmunológico la infección por dengue en el
humano cursa con liberación de una cascada
de mediadores inflamatorios producidos por
elementos tanto de inmunidad innata como
por elementos de inmunidad adquirida. En el
presente trabajo se estudio por primera vez
la participación de dos isoformas de la
familia de citocinas conocidas como
Iinterleucina 17: IL-17A e IL-17F. La función
de estas dos citocinas ha comenzado a
estudiarse y clarificarse en el contexto de
una gran variedad de patologías que van
desde procesos autoinmunes, alergias,
cáncer y por supuesto, procesos infecciosos.
La familia de citocinas IL-17, incluye a seis
miembros descritos a la fecha denominados
como IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E
(también conocida como IL-25) e IL-17F,
siendo IL-17A el miembro mejor
caracterizado y más ampliamente estudiado
a la fecha (91-92). IL-17A, es una citocina
altamente proinflamatoria con diversas
funciones biológicas y secretada por
diferentes poblaciones de linfocitos T
activados incluyendo a linfocitos T CD8+,
linfocitos T CD4+ (células Th17), células T ; ;
y células T asesinas naturales (NKT),
eosinófilos, neutrófilos y monocitos (93-100).
Todos los miembros están relacionados
entre un 16-50% en su secuencia de
aminoácidos con IL-17A (101-104), siendo IL-
17F la de más alta homología. En infección,
se ha demostrado la participación de estas
citocinas en mediar una respuesta inmune
protectora contra patógenos intracelulares
típicos como Candida albicans, Listeria
monocytogenes, Salmonella entérica, así
como Mycobacterium tuberculosis.
Recientemente se ha demostrado su
participación en infecciones virales como
Hepatitis C y la mediada por el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (VIH) (57,58). A
la fecha no existen evidencias científicas en
la literatura que hayan estudiado la
participación de esta citocina en el contexto
de la infección por virus dengue tanto clásico
como hemorrágico.
Objetivo General:
Determinar la participación de las citocinas
inflamatorias IL-17A, IL-17F en el contexto de
la infección por virus del Dengue (dengue
clásico y dengue hemorrágico).
Metodología:
9
Tipo de estudio: Observacional, prospectivo,
transversal. Se analizaron muestra de suero
de pacientes con diagnóstico confirmado de
Dengue, las cuales se obtuvieron del
Laboratorio Estatal de Salud Pública durante
el periodo de Mayo a Noviembre del 2009.
Sueros de pacientes cursando Dengue
clásico (n=939), Dengue Hemorrágico
(n=292) o sujetos controles sanos (n=359),
fueron analizadas para determinar los
niveles séricos de citocinas como IL-17A, IL-
17F; Las citocinas fueron determinadas por
técnica convencional de ELISA (usando kits
comerciales de las marcas Peprotech y E-
bioscience). El Análisis estadístico de los
datos obtenidos entre los diferentes grupos
de estudio fue realizado con el programa
GraphPad Prism versión 5, empleando test
no paramétrico de MannWhitney.
Resultados:
Del total de las muestras con diagnostico
confirmado de dengue analizadas, 697 (74%)
dieron resultados positivos para ambas: IL-
17A e IL-17F, de las cuales, 454
correspondieron a dengue clásico y 243 a
dengue hemorrágico. Los resultados
cuantitativos mostraron una media de 728
pg/ml de IL-17A y 630 pg/ml de IL-17F para
el grupo de pacientes con diagnóstico clínico
de dengue clásico, valores que no fueron
muy diferentes a los encontrados en el grupo
de pacientes con dengue hemorrágico: 815
pg/ml para IL-17A y 654 pg/ml de IL-17F.
Ambos grupos de pacientes con dengue,
mostraron niveles de IL-17A e IL-17F
aumentados significativamente con respecto
a sujetos control sanos, sin evidencia de
infección aguda reciente o crónica (p=
0.0055). Los niveles de IL-17A en sujetos
sanos registraron un valor promedio de 153
pg/ml, mientras que para IL-17F, la
concentración promedio fue de 126 pg/ml.
De esta forma una elevación clara de ambas
isoformas de IL-17 es detectada durante la
infección activa por dengue.
Discusión:
Los resultados obtenidos en el presente
trabajo han permitido describir por primera
vez la participación de las citocinas
inflamatorias IL-17A e IL-17F en el contexto
de la infección por dengue. Un aumento
significativo en la concentración de ambas
citocinas, de entre 5 a 6 veces sobre los
niveles basales detectados en sujetos sanos
de la misma área endémica, pero sin datos
clínicos de infección reciente, fue evidente
en el curso de la infección activa por virus
dengue. El presente trabajo abre nuevas
preguntas sobre la participación de esos
mediadores inflamatorios en protección o en
la inmunopatogénesis de la enfermedad.
Conclusión:
Durante la infección por virus del dengue en
humanos es posible detectar niveles
elevados tanto de IL-17A como de IL-17F, lo
cual sugiere la participación de estos
mediadores durante la inmunopatología de
la enfermedad.
Referencias Bibliográficas:
1. Mukhopadhyay A. Structural perspective of the flavivirus life cycle. Nat Rev Microbiol. 2005. 3, 13–22.
2. Guzmán MG, Kourí G. Dengue: an update. Lancet Infect Dis. 2002.
10
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Ohmann. Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology. Microbes and Infection. 2000, 1041-1050.
4. Gubler DJ. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health,
social and economic problem in the 21st century. TRENDS in Microbiology. 2002. 10 (2).
5. Green S, Rothman A. Immunopathological mechanisms in dengue and dengue hemorrhagic fever. Curr Opin Infect Dis. 2006. 19 (5):429-36.
11
EVALUACION DE LA EFICIENCIA DEL METODO DE
CONSERVACION DE MICROORGANISMOS EN PAPEL
FILTRO
Vanesa Lopez Rosaldo
Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana Facultad de Bioanalisis
Marco teórico:
A lo largo del siglo XX la tradición
institucional de la investigación
microbiológica ha estado centrada en
brindar soluciones a problemas en los
campos de la salud dejando un invaluable
legado y un conjunto de colecciones de
microorganismos que constituyen la base de
futuras investigaciones. Es importante
entender que para el mantenimiento de los
cultivos deben permanecer puros y
homogéneos bajo condiciones que aseguren
la estabilidad microscópica, mascrocòpica,
bioquímica, fisiológica y genética. Hay gran
número de métodos descritos para la
preservación microbiana. Los criterios a ser
considerados para la selección del método
son la viabilidad, pureza, costos del proceso,
cantidad de cultivo (para la producción de
microorganismos) y frecuencia de uso. Las
colecciones de cultivo son organizaciones
que se ocupan de conservar
convenientemente cepas de
microorganismos, células superiores o
diversos materiales biológicos,
suministrándolos previa solicitud a
laboratorios de docencia e investigación. Las
primeras colecciones de cultivo que
aparecieron en el mundo fueron:
La de Praga en el siglo siglo XIX (KRAL) fue la
primera colección que contó con un catálogo
de microorganismos.
La más antigua es la de Lobaina en Bélgica
dedicada a la conservación de hongos.
La American Type Culture Collection (ATCC)
fue fundada en 1925.Actualmente existen
todavía varias colecciones de cepas
utilizables para el control de calidad. Algunos
ejemplos son:
-
Rockville, USA
Bacteria- Survey, Inglaterra
12
: Japanese Federation of Culture
Collection of Microorganism- Japón
CCTM: Colección Nacional – Lille,
Francia RIA: USSR Reseach Institute for
Antibiotics- Moscú, Rusia.
NCIB: Colección Nacional industrial –
Aberdeen, Escocia
DSM: Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen – Gottinger, Alemania
Servicios que prestan las colecciones de
cultivos: Recolección: Es el servicio
mas típico de una Colecciones de Cultivo. Las
colecciones reúnen cepas que les llegan a
través de distintos conductos, las conservan
convenientemente y las suministra previa
petición. Conservación: Es el trabajo
medular de las colecciones microbianas, las
cuales mantienen conservadas a los
microorganismos bajo diferentes métodos
entre ellos la liofilización como preservación
a largo plazo. Suministro de cepas
microbianas: Se hace por correo de
superficie, aéreo o mensajería, pero siempre
empaquetado correctamente
considerándolo como material
“potencialmente patógeno” Depósito de
cepas microbianas.1.- Depósito público:
Cualquier microbiólogo puede depositar una
cepa, que considere interesante, en la
colección. Esta cepa se incorpora en el
catálogo y puede suministrársela a cualquier
otro microbiólogo que la solicite.2.- Depósito
no público: Algunas Colección de Cultivo
reciben el nombramiento de Autoridad
Internacional de Depósito para fines de
patentes, de esta manera se garantiza la
descripción total y reproducción del proceso
patentado. Una vez conseguida la patente, la
cepa puede suministrarse previa autorización
escrita del propietario, aunque no figure en
el catálogo; Organización de Cursos,
Investigación y Asesoria.
Planteamiento del problema:
¿Cual es la eficiencia o porcentaje de
recuperación que ofrece el método de
conservación de microorganismos en papel
filtro a 10 años de su realización en especies
bacterianas que forman el cepario
bacteriano de la facultad de Bioanálisis?
Objetivo General:
Evaluar la eficiencia o porcentaje de
recuperación del método de conservación de
papel filtro de los microorganismos
conservados en el cepario microbiano de la
facultad de Bioanalisis desde hace 10 años.
Metodología:
El trabajo metodológico se fundamenta en la
capacidad de los microorganismos
conservados en papel filtro de reactivar su
metabolismo en caldo nutritivo y permitir su
aislamiento e identificación morfológica y
bioquímica que a la ves de conocer la
eficiencia de conservación del metodo,
verificar que el nombre encontrado a la cepa
es el correcto. Se partió de un acervo de
viales que se tienen en el cepario de la
facultad de Bioanalisis las cuales se
seleccionaron con el requisito que tuvieran
como mínimo 10 años de conservación,
después se propagaron en caldos nutritivos,
se inocularon en medios de cultivo por estría
cruzada en donde se obtuvo la morfología
colonial, enseguida se les hizo la prueba
bioquímica en donde se obtuvo la
identificación taxonómica y se determino la
eficiencia en % de la
13
recuperación.1)SELECCIONAR CEPAS
CONSERVADAS EN PAPEL FILTRO(10 AÑOS
DE CONSERVACION)2)PROPAGACION EN
CALDOS DE CULTIVO.3)PRUEBAS DE
IDENTIFICACION.3.1)MORFOLOGIA
COLONIAL Y 3.2) BIOQUIMICAS. 4)
IDENTIFICACION
TAXONOMICA.5)DETERMINACION DE LA
EFICIENCIA EN % DE RECUPERACION
EN:5.1)PAPEL FILTRO. 5.2) ACEITE
MINERAL.5.3) CONGELACION EN GLICEROL.
Resultados:
A continuación se detallan los resultados
obtenidos del estudio de “evaluación de la
eficiencia del método de conservación de
microorganismos en papel filtro”, el cual se
realizó hace 10 años para la creación del
cepario microbiano de la facultad de
Bioanálisis. Se partió de un grupo de 85
viales conservados los cuales fueron
propagados para el aislamiento e
identificación de los microorganismos
conservados. VIALES CONSERVADOS QUE
FUERON REACTIVADOS Y MOSTRARON
CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO:N= 85.
41.17% SIN DESARROLLO Y 58.82% CON
DESARROLLO.TIEMPO DE RECUPERACION DE
LOS MICROORGANISMOS CONSERVADOS EN
PAPEL FILTRO: Durante la etapa de
recuperación de los microorganismos
conservados se observó que el 48% de ellos
mostró desarrollo en caldo de cultivo a las 24
horas de incubación, seguido del 38% que
mostró desarrollo a las 48 horas, finalmente
el 14% se reactivó mostrando crecimiento a
las 72 horas. DESARROLLO MICROBIANO
APARTIR DE LOS VIALES CONSERVADOS,
CLASIFICADOS DE ACUERDO A LA TINCION
DE GRAM: En relación al tipo de bacterias
que fueron reactivas posterior a su
conservación durante 10 años fue la
siguiente el 30% correspondió a bacteria
Gram positivas, mientras que el 70% fueron
Gram negativas y en donde el 28.57% fueron
Gram positivas que no tuvieron desarrollo y
el 71.42% son Gram negativas sin desarrollo.
Discusión:
Los resultados obtenidos muestran una
buena eficiencia del método de conservación
de microorganismos en papel filtro ya que
esta correspondió al 58.82%, no permitiendo
la recuperación del 41.17% de los viales
estudiados. Sin embargo, es importante
considerar que este método de conservación
es considerado a mediano o sea presentan
efectividad para aproximadamente 5 años
aproximadamente, por lo tanto el encontrar
una eficiencia de recuperación en
aproximadamente un poco mas de la mitad
de los cultivos muestra ciertas ventajas de
este método de conservación. Como se
puede observar este método mostró una
mayor eficiencia de conservación para
bacterias Gram negativas y para un número
considerable de especies principalmente de
la familia Enterobacteriaceae. Los resultados
de esta evaluación de la eficiencia del
método de conservación en papel filtro
muestra su factibilidad de aplicación técnica
y económica para la conservación de
microorganismos en el cepario microbiano;
aunado a lo anterior se pone de manifiesto
que hace 10 años de haber realizado el
método se cumplió con los objetivos
propuestos en el trabajo que antecede al que
a la fecha realizado.
Conclusión:
14
El método de conservación de
microorganismos en papel filtro demostró
que SI es posible recuperar bacterias tanto
Gram positivas como Gram negativas
después de 10 años de conservación. Los
resultados obtenidos en la evaluación de
este método nos sugiere que es útil para las
necesidades e infraestructura con que
cuenta la facultad de Bioanalisis, para poder
seguir utilizándolo en la conservación de
microorganismos para el apoyo académico y
del proceso enseñanza-aprendizaje de la
licenciatura en Química Clínica.
Referencias Bibliográficas:
1. Hernandez CH. F. “Experiencia en el
cultivo de bacterias” (Fecha de ingreso 30 de agosto del 2007) disponible en: http://med.unne.edu.ar/revista138.htm
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3. Ferradiz Santos Juan, Amador Romero Javier “MANUAL DE MICROBIOLOGIA” Unidad de calidad. Dirección área 11. INSALUD.MADRID 1999.
15
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE OXIESTEROLES DIETARIOS
SOBRE EL PERFIL DE LÍPIDOS DE LA MEMBRANA
PLASMÁTICA EN HEPATOCITOS DE RATA WISTAR. Rosa Isela Villaraus Cirilo
Ida Soto Rodríguez Alfonso Alexander Aguilera
Guillermo Hernández Díaz Hugo Sergio García Galindo
Docente y Profesional de la salud Facultad de Bioanálisis Campus Veracruz UNIVERSIDAD VERACRUZANA
Marco teórico:
El colesterol (colest-5-en-ßol) es un
metabolito esencial requerido en las
principales funciones biológicas, proporciona
la fuente bioquímica para la síntesis de
hormonas esteroides y para la biosíntesis de
la bilis y de las sales ácidas de ésta1. Los
organismos obtienen el colesterol a través de
la biosíntesis y de la dieta. La biosíntesis del
colesterol es un proceso que ocurre
principalmente en el hígado, glándulas
suprarrenales, ovarios y testículos de
mamíferos, los cuales muestran mayor
actividad biosintética. El colesterol también
es requerido en la formación de la estructura
de la membrana celular, junto con las
moléculas de los fosfolípidos forman la parte
integral de la capa bilipídica2, éste se inserta
dentro de la bicapa de la membrana con su
eje largo perpendicular al plano de la
membrana, previniendo la cristalización de
las cadenas acil de las grasas al ajustarse
entre ellas y modificando la actividad de las
enzimas enlazadas a la membrana3.
El colesterol es una molécula con un enlace
insaturado en la posición ∆;5-6 del núcleo del
esterol, por lo tanto es propenso para la
oxidación4. La molécula sufre una auto-
oxidación por el mecanismo de radicales
libres generando la formación de
hidroperóxidos y posteriormente oxidación
de varios productos, denominado
oxiesteroles. Estos productos de la oxidación
son un grupo de esteroles similares en
estructura al colesterol, pero contienen un
oxígeno funcional adicional como un grupo
hidroxilo, grupo epóxido o grupo cetona en
el núcleo del esterol o al extremo de la
cadena de la molécula5. Los oxiesteroles se
han asociado con la génesis de
enfermedades crónico degenerativas como
la aterosclerosis. Esta se caracteriza por daño
histológico de la estructura arterial por
acumulación de lípidos que contienen
colesterol oxidado como la LDL oxidada.
Asimismo, se han relacionado con procesos
mutagénicos y recientemente, con la
apoptosis o muerte celular programada6.
El consumo de oxiesteroles a través de la
dieta, es un factor asociado al desarrollo de
16
diversas patologías, por lo que se han
desarrollado trabajos experimentales en
modelos “in vitro”, principalmente en líneas
celulares puras de células conjuntivas,
musculares y nerviosas, en las cuales se ha
medido el efecto citotóxico del 7-
hidroxicolesterol y del 25-hidroxicolesterol5;
sin embargo, poco se sabe sobre su efecto
en modelos “in vivo”.
Planteamiento del problema:
¿Los oxiesteroles dietarios modifican el perfil
de lípidos de la membrana plasmática de los
hepatocitos?
Objetivo General:
Evaluar el efecto de oxiesteroles dietarios
sobre el perfil de lípidos de la membrana
plasmática en hepatocitos de rata Wistar.
Metodología:
Para analizar el efecto de los oxiesteroles se
diseñó un modelo experimental formando
por cuatro grupos con seis ratas Wistar
machos cada uno de cinco semanas de edad,
alojadas individualmente con un ciclo de
luz/obscuridad de 12 h a 25°C: a) grupo 1
(testigo), b) grupo 2 (POC´s+colesterol 1%), c)
grupo 3 (POC´s+colesterol 2%) y d) grupo 4
(colesterol 1%). Para la dieta experimental se
adquirió 1 Kg de colesterol puro. De esta
cantidad, 500 g se calentaron durante 90
días a 90°C, y se obtuvo una mezcla de
oxiesteroles (POC´s), la cual fue analizada por
cromatografía de gases (CG) para su
identificación y cuantificación. Para los
grupos experimentales se incorporó la
mezcla de POC´s 1% y 2% ó colesterol puro al
1% al alimento de mantenimiento molido
hasta formar una pasta homogénea para la
elaboración de croquetas. Al grupo testigo se
le administraron croquetas “placebo”. Todos
los animales recibieron su respectiva dieta
“ad libitum” durante ocho semanas. Se
registró el peso corporal y la presión arterial
(PA) de los animales al inicio y al término del
experimento. Al sacrificio de los animales se
obtuvieron muestras de hígado para extraer
las membranas plasmáticas por medio de
gradiente de Percoll así como muestras de
suero el cual, fue analizado utilizando
estuches de diagnóstico para colesterol,
glucosa, triglicéridos y LDL. Los lípidos de las
membranas plasmáticas de los hepatocitos
se obtuvieron por el método de Folch7 para
su identificación y cuantificación por CG
previa metilación.
Resultados:
El análisis de cromatografía de gases
realizado a la mezcla de oxiesteroles
formados por calentamiento para su
administración en las dietas de las ratas
Wistar mostró la presencia de los siguientes
oxiesteroles: 4β-hidroxicolesterol (3 464.67
ppm), 3,6-dione (7 555.99 ppm) 7β-
hidroxicolesterol (3 768.57 ppm), 7α–
hidroxicolesterol (25 327.27 ppm); 20-
hidroxicolesterol (4 475.64 ppm),
colestanotriol (6 909.38 ppm), 7-
cetocolesterol (8 928.22 ppm), 25-
hidroxicolesterol (3 919.52 ppm),
oxiesteroles no identificados (13 308.00
ppm) y colesterol (16 490.00 ppm). En
cuanto al peso corporal registrado de los
animales no hubo cambio significativo entre
los grupos experimentales y el testigo. Con
respecto a la presión arterial (PA), al inicio
del experimento los cuatro grupos de
animales mostraron la misma PA: grupo
17
testigo (166±6 mm/Hg), grupo
POC´s+colesterol 1% (167±4mm/Hg), grupo 3
POC´s+colesterol 2% (165±3mm/Hg), y grupo
colesterol 1% (159±4mm/Hg); sin embargo,
al final de la administración de las diferentes
dietas la PA de los grupos mostró diferencia
significativa entre los grupos experimentales:
grupo testigo (170±6 mm/Hg), grupo
POC´s+colesterol 1% (206±3mm/Hg), grupo 3
POC´s+colesterol 2% (210±4mm/Hg), y grupo
colesterol 1% (196±4mm/Hg). Al final del
experimento el perfil bioquímico de la
glucosa y de los triglicéridos no presentaron
cambios significativos entre los animales
alimentados con colesterol, POC´s+colesterol
1% y POC´s+colesterol 2% (93±4mg/dl) pero
si en relación con el grupo testigo.
Los parámetros de colesterol fueron
significativamente distintos entre los
animales alimentados con colesterol
(151±4mg/dl), POC´s+colesterol 1%
(97±2mg/dl) y POC´s+colesterol 2%
(99±3mg/dl) en relación con el grupo testigo
(126±7mg/dl) y en los niveles de LDL también
hubo cambios significativos en los grupos
experimentales de colesterol,
POC´s+colesterol 1% y 2%: (105±5mg/dl;
54±3mg/dl; 52±2mg/dl) respetivamente,
comparados con el grupo testigo
(61±1mg/dl). Con respecto al perfil de lípidos
en la membrana plasmática del tejido
hepático, la concentración y composición de
ácidos grasos saturados, monosaturados y
polinsaturados no mostró diferencias
significativas, entre los grupos
experimentales. Sin embargo, la
concentración del colesterol fue
significativamente mayor en el grupo de
animales alimentados con colesterol. Cabe
señalar que en los grupos POC´s+colesterol
1% y 2% además de disminuir los niveles de
colesterol, se identificó el 7 ceto-colesterol
en las membranas de los hepatocitos, lo que
permite suponer que los oxiesteroles son
capaces de incorporarse a la membrana
plasmática.
Discusión:
El aumento significativo de la PA en los
animales experimentales y de manera
particular en los alimentados con las dietas
POC´s±colesterol 1 y 2% obedece a que el
consumo dietario de oxiesteroles inhibe la
enzima óxido nítrico sintasa (ONS) encargada
de regular los niveles de óxido nítrico a nivel
del endotelio8. Los valores del colesterol
sérico disminuidos en los grupos
POC´s±colesterol 1 y 2% pudo deberse a que
los oxiesteroles inhiben la formación de la
hidroximetilglutaril CoA reductasa encargada
de regular el metabolismo del colesterol
endógeno9. Los niveles elevados de
triglicéridos en el grupos de animales
alimentados con POC´s+colesterol supone la
posibilidad que pueden tener los oxiesteroles
dietarios en la activación de enzimas que
promuevan la formación de ácidos grasos
libres lo que dar lugar a una dislipidemia
(SEO,2004)10. En ratas Wistar alimentadas
con oxiesteroles se ha observado trastornos
en el metabolismo de los quilomicrones
plasmáticos particularmente, el transporte
de LDL, debido a que alteran la fracción de
apolipoproteína de la LDL, facilitando la
oxidación de la LDL11. En el presente trabajo
la diferencia de los niveles de LDL en los
grupos POC´s+colesterol 1 y 2%, pudo
deberse al mismo efecto. En cuanto a la
composición de lípidos de la membrana
plasmática, los oxiesteroles no modifican la
18
cantidad y el tipo de ácidos grasos; sin
embargo, su incorporación puede afectar las
propiedades biofísicas de la membrana como
la permeabilidad a la glucosa en los
liposomas o un aumento en la transferencia
de albúmina en el endotelio por lo que se les
considera pro-aterogénicos. Asimismo
pueden modificar las proteínas embebidas
en la membrana y alterar su función como
receptores a biomoléculas específicas12.
Conclusión:
Conclusión: Los oxiesteroles se incorporan a
la membrana plasmática del hepatocito
promoviendo cambios en sus propiedades
biofísicas.
Referencias Bibliográficas:
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19
CONFIRMACION DIAGNÓSTICA DE VIRUS DEL
PAPILOMA HUMANO (VPH) EN BIOPSIAS DE CERVIX, MEDIANTE REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR). Salvador Contreras Huerta
Ivone Gomez Gonzalez Guadalupe Alcantar Garcia
Armando Mendez Perez
Docente y Profesional de la salud Facultad De Medicina. Uv Xalapa Departamento De Patologia
Experimental [email protected]
Marco teórico:
El Virus del Papiloma Humano (VPH) es uno
de los virus que se transmite con mayor
frecuencia por vía sexual. Al menos la mitad
de los hombres y mujeres sexualmente
activos contraerán el VPH en algún
momento de sus vidas. Este virus es
considerado inductor de neoplasias malignas
de tipo escamoso en el cervix uterino y esta
vinculado de forma directa con el cáncer
cervicouterino y de pene. Después del
cáncer de mama, el cáncer de cervix ocupa
el segundo lugar con una incidencia del
87% y es considerado por la Organización
Mundial de la Salud (OMS) como una de las
principales causas de muerte en el mundo,
cálculos estadísticos prevén en 40 años
pudiera alcanzar la cifra de un millón de
casos. En la actualidad se cuenta con
diversas metodologías capaces de
diagnosticar este padecimiento, siendo las
de mayor relevancia aquellas que involucran
al ADN viral; una de estas pruebas es la
denominada Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) la cual cuenta con un grado
de sensibilidad y especificidad alto. El
desarrollo de las técnicas de biología
molecular y su amplio uso en estudios
epidemiológicos ha permitido estimar que
entre un 2 y un 20 % de la población
femenina mundial es portadora oculta del
VPH en el cuello uterino. En la última década
se ha confirmado la relación etiológica entre
la infección por ciertos genotipos del VPH y
el cáncer de cuello uterino. En el campo de la
investigación básica, este hallazgo constituye
un nuevo modelo para estudiar el
mecanismo viral de la oncogénesis y en el
terreno de la epidemiología, la
carcinogénesis cervical es de gran
trascendencia. Aunque las pruebas de
histopatología aporten datos de lesión
indirecta, es necesario realizar el diagnostico
certero y oportuno de la presencia viral y la
tipificación del mismo, con la finalidad de
ayudar a disminuir el numero de infecciones
y por consiguiente el de casos mortales por
CaCu al impedir el desarrollo de la neoplasia.
Planteamiento del problema:
Se desconoce el porcentaje de casos
realmente positivos para VPH diagnosticados
20
por histopatología en biopsias de cérvix y la
identificación de los subtipos virales
circulantes en la región.
Objetivo General:
Confirmar la presencia de VPH en biopsias
cervicales mediante la técnica de PCR.
Metodología:
DISEÑO: Prospectivo, Transversal,
Comparativo y Observacional. UNIVERSO DE
ESTUDIO: Se estudiaran un total de 80
biopsias de cérvix con diagnóstico
histopatológico de lesión intraepitelial o
tumor infiltrante inducidos por el virus del
papiloma humano y un total de 20 biopsias
de cérvix sin lesion.
VARIABLES: Virus de papiloma humano
Subtipos viralesAmbas variables serán
medidas en escala nominal considerando
presencia o ausencia.
PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: Se
utilizarán biopsias de cérvix en bloques de
parafina tomadas previamente y
diagnosticadas por histopatología con lesión
intraepitelial de alto grado o carcinoma
escamoso invasor, se aislara el ADN para
realizar posteriormente amplificación por
PCR de la región L1 del papiloma virus con el
fin de obtener un segmento de 450 pares de
bases al someterse a electroforesis en gel de
agarosa 1 % en buffer de TBE 1X,
posteriormente y si las muestras son
positivas se realizara la tipificación
empleando enzimas de digestión según la
técnica de “polimorfismos en la longitud de
los fragmentos de restricción”(RFLP)
utilizando las enzimas RsaI, PstI, BamHI,
HaeIII e HinFI y los productos serán
analizados por electroforesis en geles de
agarosa al 1.5% con solución buffer TBE 1X.
Todos los productos amplificados por PCR y
digeridos por RFLP se visualizaran en un
transiluminador con luz ultravioleta.
ANALISIS DE LA INFORMACION: se
emplearan para la base de datos los
Software Office 2007 Excel y Statistica
versión 6.0, en primera instancia se realizara
un análisis estadístico univariado aplicando
tablas de frecuencias, gráficas circulares, de
barras, así como diagramas de cajas y
alambres. Posteriormente efectuaremos un
análisis divariado que consistirá en hallar las
posibles correlaciones del padecimiento.
Resultados:
Para la realización de este estudio se
utilizaron 80 muestras de biopsia de cérvix
provenientes de pacientes diagnosticados
con lesión viral por papiloma con edad
variable de 14 a 55 años y 20 muestras de
pacientes que se consideraron sanas con un
rango de edad de 20 a 41 años. En la
amplificación por PCR de la región L1 del
virus del papiloma, el grupo de casos tuvo
amplificación solo en el 77.5% (62 muestras),
el 22.5% (18 muestras) no amplifico. El grupo
control no tuvo amplificación tal y como se
esperaba. En la identificación del subtipo
viral por RFLP en las 62 muestras (100%) que
si amplificaron a la región L1, se observaron
6 expresiones virales las cuales se ordenaron
por frecuencia de la siguiente manera: el
subtipo 6 fue el de mayor frecuencia con
26% (16 casos), seguido del subtipo 11 con
23% (14 casos), subtipo 42 con 18% (11
casos), subtipo 16 con 16% (10 casos),
subtipo 33 con 9% (6 casos) y el subtipo 54
fue el de menor frecuencia con 8% (5 casos).
21
Al clasificarlos de acuerdo al grado de
oncogenicidad se obtuvo que el 25% (16
casos) corresponde a subtipos de alto grado
(VPH16 y 33) y el siguiente 75% (46 casos) a
los clasificados como de bajo grado (VPH6,
11, 42 y 54). Al analizar su distribución por
grupos de edades se encontró que los VPH
16 y 33 tienen mayor relevancia en el grupo
de edad de 21-27 años y nula presencia en el
grupo de 14-20 años, por su parte los VPH
6,11 y 42 tuvieron también mayor expresión
en el grupo de 21-27 años con cuatro casos
cada uno, en el grupo de 14-20 el VPH 11
mantuvo su expresión al igual que el VPH 6
en el grupo de 35-41 años. Al efectuar el
comparativo entre ambos métodos
(histopatológico/PCR) se notaron marcadas
diferencias, en primer lugar que de el total
(80 muestras) solo un 77.5% fue realmente
portador de VPH, segundo que el 43.75% (35
casos) considerados como de alto grado,
disminuyo a un 20% por PCR y el 56.25% (45
casos) catalogado como de bajo grado
aumento a un 57.5% por PCR al demostrarse
por RFLP que 1 caso considerado de alto
grado no lo era; finalmente un 22.5% resulto
no ser portador de virus y mucho menos ser
de alto grado.
Discusión:
El desconocimiento de este agente viral, la
poca atención de la gente a campañas de
prevención y diagnostico oportuno, aunado
al inicio temprano de la vida sexual, la
promiscuidad y no practicar el sexo seguro;
ha incrementado el numero de infecciones y
por consiguiente el numero de casos de
CaCu.Si bien es cierto la mayoría de estos
diagnósticos son efectuados por gente
especializada en citología e histopatología, es
claro también que existen errores humanos
que pudieran alterar un resultado y por
consiguiente su tratamiento, razón que
motivó a la realización de este trabajo; con la
finalidad de corroborar los diagnósticos
obtenidos por las técnicas antes
mencionadas junto con los reportados por
métodos moleculares como es el caso de
PCR. Tras comparar los resultados obtenidos
por ambos métodos (histopatología/PCR), se
muestra que el primer estudio tiene una
sensibilidad del 77% con margen de error del
23% tal y como se manifiesta en estudios
realizados por el Depto. de Anatomía
Patológica de la Universidad de la frontera
en Chile y por el Servicio de Anatomía
Patológica del Policlinico de España en sus
artículos titulados “Detection of human
papilloma virus in cytologic samples or
biopsies of the cervix y Correlación
diagnostica entre las displasias de cérvix y
detección por PCR del papiloma virus
humano, mostrando gran diferencia de las
pruebas realizadas por PCR que implican la
amplificación de un gen tardio (L1) del VPH
empleando ADN, que tienen una excelente
sensibilidad para detectar alteraciones
celulares no captadas por otros métodos
convencionales.
Conclusión:
Después de haber realizado el presente
trabajo, de analizar los resultados y llevar
acabo el comparativo de los mismos en los
procedimientos que aquí se describieron
anteriormente, se concluye que:
• La prueba de Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR) conjuntamente con la
amplificación del gen tardío L1, constituye
una metodología útil y muy sensible para la
22
detección del Virus del Papiloma Humano,
además de confirmar el diagnóstico
citológico, colposcópico e histopatologico;
particularmente en lesiones intraepiteliales o
con atipias.
• El empleo de la técnica de
polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP) facilita la
identificación de los subtipos virales
causantes de las lesiones en el cérvix, ayuda
también a que el medico brinde de acuerdo a
sus conocimientos el tratamiento adecuado y
permita la detección temprana de
precursores graves del cáncer.
• Se espera que los estudios por ADN
de VPH con sus respectivos oligonucleótidos
(MY09/MY11) constituyan un método
racional para complementar el frotis de
Papanicolaou, la colposcopia y la
histopatología en nuestra entidad y ofrecer
así un sistema más preciso para el
diagnostico y valoración del riesgo
carcinógeno.
• Finalmente se pone a consideración
de las Instituciones de Salud y de sus
profesionales involucrados en este tema, el
uso de técnicas avanzadas como es el PCR-
RFLP para incorporarlos a sus laboratorios
como una herramienta más de apoyo
diagnostico y por consiguiente se sugiere la
preparación adecuada de su personal para
poder desarrollarlas.
Referencias Bibliográficas:
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25
DETECCIÓN DE CLONAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
METICILINO RESISTENTES (MRSA) EN EL HOSPITAL
REGIONAL DE ALTA ESPECIALIDAD DE VERACRUZ
(HRV) Miguel Ángel Ortiz Gil
María Elena Velázquez Meza Javier Paul Mora Domínguez Irma Gabriela Echániz Avilés
María Noemí Carnalla Barajas Elsa Lilia Mendiola Del Moral
Estudiante de Maestría Instituto Nacional de Salud Publica Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz (SSAVER) [email protected]
Marco teórico:
Antes del uso de antibióticos una bacteriemia causada por S. aureus producía una mortalidad de aproximadamente el 82%. Aun ahora este porcentaje sigue siendo elevado entre el 25-63%.(1) S. aureus produce exoproteinas que contribuyen a colonizar y causar enfermedad en el humano.(2) S. aureus meticilino resistente (MRSA), posee un elemento genético móvil llamado, casete cromosomal estafilocócico mec (SCCmec), que incluye al gen mecA,(3) el cual codifica para la proteína de unión a penicilina 2a (PBP2a) y determina la resistencia a todos los β-lactámicos.(4). Existen múltiples linajes clónales de MRSA como consecuencia de la transferencia horizontal del mecA.(5) Seis tipos de clonas pandémicas de MRSA han sido reportadas: Ibérica, Brasileña, Húngara, Nueva York/Japón, Pediátrica y EMRSA-16.(6). En México en el Instituto Nacional de Salud Pública, se han realizado estudios encaminados a conocer las clonas que
circulan en diversos hospitales de la república mexicana ( Hospitales del Distrito Federal, Guadalajara, Chihuahua, Monterrey y San Luis Potosí) y se ha documentado la presencia de la clona EMRSA-16(7) y la clona internacional multiresistente Nueva York/Japón(8),(9). Las 6 clonas pandémicas de MRSA posen características distintas en cuanto a sus factores de virulencia y resistencia antimicrobiana. La clona más predominante en este momento en México es la clona Nueva York/Japón que tiene la capacidad de propagarse, causar brotes y reemplazar las clonas existentes,(10) esto se debe a su alta capacidad de virulencia; entre los genes que posee se encuentran algunas enterotoxinas, las cuales le permiten causar entre otras cosas fascitis necrotizante.(11). También posee la toxina del síndrome de choque tóxico 1, que causa una gran variedad de síndromes clínicos, incluyendo el síndrome de choque tóxico e infecciones supurativas(12) y a esto se suma que es resistente a β- lactámicos y a una amplia gama de otros antibióticos.(13)
26
Planteamiento del problema:
La prevalencia de MRSA en México ha aumentado de forma progresiva en las tres últimas décadas, provocando la diseminación de cepas multiresistentes y altamente virulentas. Dada la importancia que representa este patógeno para la salud pública y debido a los cambios epidemiológicos y moleculares que se han venido produciendo, se ha planteado realizar un análisis de las clonas de MRSA que circulan en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz (HRV) y su perfil de resistencia antimicrobiana. La presencia de cepas de MRSA descendientes de clonas epidémicas favorece con frecuencia el desarrollo de brotes dentro de los hospitales, por lo cual se plantea la siguiente pregunta de investigación:¿Cuáles son las clonas de S. aureus meticilino resistente que circulan en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz?
Objetivo General:
Objetivo General: Identificar las clonas de S. aureus meticilino resistente que circulan en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz.
Metodología:
Estudio transversal prospectivo, se recolectaron cepas del HRV en un periodo comprendido de septiembre 2009 a julio 2010.Se realizó las pruebas de coagulasa, catalasa y cefoxitina.(14) La identificación de especie y susceptibilidad antimicrobiana se hizo por Sensititre®(15), (16). Para el análisis genotípico se utilizó la técnica de electroforesis de campos pulsados (PFGE).(17) Los resultados fenotípicos se analizaron con Excel 2010, mientras que los resultados del PFGE se analizaron de acuerdo a los criterios de Tenover 1995(18) y se realizó un dendrograma de coeficiente de
similitud con el programa (NTSys).(19)
Resultados:
En el periodo de estudio se colectaron un total de 99 cepas, las cuales fueron obtenidas de 8 diferentes servicios médicos, siendo el de mayor frecuencia medicina interna (53%) y el sitio de aislamiento más predominante fue el hemocultivo (35%). Los resultados fenotípicos mostraron que el 100% de las cepas fueron catalasa positiva, 92.6% fueron coagulasa positiva y 97% mostraron resistencia a cefoxitina. El 90% de las cepas fueron identificadas como MRSA, siendo estas sensibles a rifampicina, teicoplanina, trimetroprim/sulfametoxazol y vancomicina y resistentes al resto de los antimicrobianos probados. El análisis genotípico por PFGE mostró la presencia de los subtipos clónales (C28, C31 y C35) los cuales se encuentran relacionados con la clona Nueva York-Japón y el patrón (Ib) es un subtipo de la clona Ibérica.
Discusión:
En México, la incidencia de infecciones nosocomiales oscila entre 3.8 y 26.1 casos por cada 100 egresos; la mortalidad asociada con infecciones intrahospitalarias en promedio es 5% y para el 2001 ocupó la séptima causa de muerte.(20) Los recursos para el control de las infecciones por MRSA siguen siendo limitados y los MRSA son una de las principales causas de infección nosocomial en nuestro país, sin embargo, la magnitud del problema no se entiende completamente, ya que los datos tienden a provenir de grandes hospitales, mientras que gran parte de la población es atendida en centros comunitarios de salud que no cuentan con amplias instalaciones para realizar vigilancia microbiológica. En México los estudios demuestran un aumento en la prevalencia de los MRSA durante los últimos años, la Organización
27
Panamericana de la Salud (OPS) en el 2004 reportó una prevalencia de MRSA del 52%, la Asociación Panamericana de Enfermedades Infecciosas para 2006 reportó una tasa de MRSA de 32% y datos más recientes del 2008 procedentes del estudio TEST muestran una prevalencia del 48% de MRSA.(21) Por lo cual este estudio permitió establecer una vigilancia epidemiológica de las infecciones nosocomiales por MRSA en el HRV, mostrando que el 93% de los aislados fueron S. aureus con una prevalencia de resistencia a meticilina del 97%. Esta información difiere mucho con lo reportado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán” (INCMNSZ) durante 1981 a 1992, donde encontraron que el 8% de los aislados fueron S. aureus con una prevalencia de resistencia a meticilina menor a 20%. Sin embargo, estudios recientes muestran prevalencias muy similares entre el HRV y el INCMNSZ (2004 – 2005), donde indican una prevalencia de S. aureus superior a 50% en aislados con una tasa de resistencia a meticilina del 100%.(22). Estas prevalencias y resistencias antimicrobianas varían en cada hospital y dependen del control en el uso de antimicrobianos y del programa de vigilancia de infecciones nosocomiales. Este estudio evidencio la presencia de dos clonas MRSA pandémicas en el HRV, estableciendo que los patrones C28, C31 y C35 son subtipos de la clona Nueva York/Japón y el patrón Ib es un subtipo de la clona Ibérica. La importancia de este hallazgo radica en que la primera cepa de MRSA resistente a vancomicina (VRSA) perteneció al linaje Nueva York-Japón.(23),(24) Mientras que la clona Ibérica se disemino ampliamente en Europa(25),(26) y EEUU(27) y fue causante de severos brotes hospitalarios en estas regiones(28) y fue la primera cepa de S. aureus con resistencia intermedia a vancomicina (VISA)(29),(30),(31) y sensibilidad reducida a la teicoplanina.(32)
Conclusión:
La clona Nueva York/Japón ha sido identificada previamente en otros hospitales en México (norte y centro). Este es el primer reporte de esta clona al sur de México, lo que demuestra claramente su gran capacidad de expansión geográfica, multiresistencia y virulencia. Además por primera vez se evidencia la presencia de la clona Ibérica en México. La vigilancia epidemiológica molecular de las clonas de MRSA permiten tener un mayor entendimiento de la dinámica de distribución de las clonas responsables de infecciones en el HRV; conocimiento indispensable para la prevención, control y posible erradicación de este microorganismo.
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31
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DENGUE Armando Mendez Perez
: Salvador Contreras Huerta Mercedes Tepetla Peredo
Dolores Carranza Gonzalez
Investigador Departamento de Patologia Experimental Facultad de Medicina. UV Xalapa
Marco teórico:
A principios de 1990 el Dengue se convirtió
en uno de los 5 mayores problemas de salud
que aquejan a los países centroamericanos y
una de su variantes; el Dengue clásico es
una enfermedad viral que afecta las
regiones tropicales y subtropicales en el
mundo, predominantemente en áreas
urbanas y suburbanas, puede evolucionar
hacia sus formas graves de dengue
hemorrágico y shock asociado a dengue. Se
estima que existen anualmente 50 a 100
millones de nuevos casos infectados por
virus del dengue en el mundo y de los
cuales resultan 250,000 a 500,000 casos de
dengue hemorrágico y 24 muertes cada año
por lo cual se ha considerado un problema
serio de salud publica. El Dengue es un virus
RNA encapsulado y el mas prevalente de
los arbovirus en regiones subtropicales y
tropicales, genómicamente está constituido
por 11 kb y esta subdividido en 3 genes
que codifican proteínas estructurales (C,M
y E) y 7 genes que codifican proteínas no
estructurales. Hay 4 subtipos que inducen
inmunoprotección para el mismo subtipo
pero parcialmente en subsecuente infección
con otros serotipos. Esta generalmente
aceptado que una infección secundaria por
este flavivirus implica una respuesta Th2
importante que propicia incremento
notable en la formación de complejos
inmunes los cuales juegan un papel critico
en la patogenia de dengue hemorrágico y
shock. La infección por virus del dengue
implica un amplio espectro clínico desde
inaparente infección, resfriado común, fiebre
indeterminada, dengue clásico hasta la
expresión clínica mas grave correspondiente
a dengue hemorrágico o shock. El
diagnostico de certeza, inmediato y de
diferenciación del subtipo resulta
fundamental para el estudio etiológico,
clínico y control epidemiológico. La amenaza
del Dengue no se debe, ni se puede
enfrentar aisladamente en las actuales
condiciones mundiales. Los países
centroamericanos y en especial el nuestro
deben actuar de manera conjunta y
coordinada para solucionar este problema.
En el campo clínico el diagnostico por
laboratorio debe ser apoyado por las nuevas
tecnologías que permitan no solo detectar la
presencia del agente causal, sino mejor aun
32
tener una respuesta pronta en los sitios
donde se estén presentando los primeros
brotes.
Planteamiento del problema:
Se desconoce cuales son los subtipos virus
del Dengue presentes en una población y
cuales son los que propician el tipo
hemorrágico.
Objetivo General:
Confirmar la presencia del virus dengue por
medio de RT-PCR en 200 pacientes
clínicamente catalogados e identificar los
subtipos mediante Nested PCR.
Metodologia:
DISEÑO Prospectivo, Transversal,
Comparativo y Observacional.
UNIVERSO DE ESTUDIO: Se muestrearon 200
pacientes con diagnostico clínico de dengue
procedentes del Hospital Civil de Martínez
de la Torre, Casa de Salud de la UV en
Veracruz, Ver. Y Centro de Salud Carranza
de la SSA ubicado en la Colonia el Manglar
de Boca del Rio, con el consentimiento
aprobado. Los pacientes presentaron un
cuadro nosológico caracterizado por fiebre
de 39.2°C cefalalgia frontal, mialgias,
artralgias, dolor retroorbitario, anorexia y
eritema parcial. De estos 200 pacientes 17
cursaron con trombocitopenia, petequias,
hemorragia mucocutánea y tres de estos
pacientes con un cuadro de shock
progresivo. También se seleccionaron 100
muestras aparentemente sanas como
testigos.
VARIABLES: Dengue clásico: medida en
escala nominal considerando presencia o
ausenciaDengue hemorrágico: medida en
escala nominal considerando presencia o
ausenciaSubtipos 1, 2,3 y 4: medida en
escala nominal considerando presencia o
ausencia. PROCEDIMIENTO DE
RECOLECCION: Se obtuvo de cada uno de los
pacientes 7 c.c. de sangre, se centrifugó a
3500 rpm, se separó el plasma y se
almacenó en tubos de eppendorff a -70°C.
Se eliminaron eritrocitos mediante solución
de lisis y se separaron leucocitos. Del suero
y leucocitos se aisló RNA con método
tradicional. La transcripción en reversa se
realizó utilizando el amplicón D2-D1
especifico correspondiente a la región
génica Pre-M del virus. Se incluyó
transcriptasa inversa AMV ( avian
mieloblastosis virus). La cadena resultante
se sometió a PCR anidado mediante los
primers TS1, TS2, TS3y TS4 de los cuales se
esperaba obtener amplicones de 482, 119,
290 y 392 pb. Respectivamente.
ANALISIS DE LA INFORMACION: Las variables
estudiadas fueron Dengue clásico, Dengue
hemorrágico y subtipos 1, 2, 3 y 4, en
primera instancia se realizo un análisis
estadístico univariado aplicando tablas de
frecuencias, gráficas circular, de barras, así
como diagramas de cajas y alambres.
Posteriormente se efectuó un análisis
divariado que consistió en hallar las posibles
correlaciones del padecimiento.
Resultados:
En la Amplificación de la región D1-D2 por
RT-PCR, se observo que el 100% de las
muestras del grupo de casos fue positivo
33
para Virus dengue, en la determinación de
los subtipos virales para por NESTED PCR se
observaron las siguientes expresiones
medidas en porcentajes: subtipo viral T1
(0%) T2 (30%) T3 (15%) T4 (12.5% ) y en
combinaciones por reinfección T2-T1(2.5%)
T2-T3 (37.5%) Y T2-T4 (2.5%). Con ello se
logro identificar que el 42.5 % correspondió
a dengue hemorrágico y el 57.5 % para
dengue clásico.
Discusión:
El diagnostico molecular de dengue por
medio de RT-PCR y PCR anidado múltiple es
un análisis sumamente confiable en el
diagnostico de la enfermedad y
clasificación del subtipo viral. Este método
conduce a un diagnostico del dengue en su
fase aguda desde el primer día de
evolución aislando RNA viral del suero de
los pacientes en fase aguda o convalecientes,
para identificación de los 4 subtipos virales
; además de contribuir al diagnostico
etiológico también lo hace
significativamente en el control clínico y
diferenciación entre una entidad clínica
primaria o secundaria otorgando además
especificidad diagnostica del 98%.
Conclusión:
Entre las técnicas serológicas mas
comúnmente utilizadas es la captura de IgG
e IgM, por método de ELISA IgM es
detectable entre el día 3 y 5 en el 50% de
los pacientes en la fase aguda de la
enfermedad primaria o secundaria y
alcanza su pico durante 2 semanas y
declina hasta hacerse imperceptible a los 2
o 3 meses de evolución. El serodiagnóstico
de infección por dengue identificando IgG
anti viral durante meses no permite
diferenciar con certeza si la infección
corresponde a un brote primario o
secundario y con el inconveniente de
presentar reacción cruzada a antígenos
homólogos y heterólogos , por lo tanto no
es posible identificar si se trata de una
infección por algún otro de los 4 subtipos
virales o reacción cruzada a otro flavivirus.
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35
INMUNOPATOGENIA EN 200 PACIENTES CON
DENGUE Armando Mendez Perez
Salvador Contreras Huerta Mercedes Tepetla Peredo
Dolores Carranza Gonzalez
Investigador Departamento de Patologia Experimental Facultad de Medicina. UV Xalapa.
Marco teórico:
La infección por virus del dengue causa una
significativa morbilidad y mortalidad en los
países tropicales. Aunque inicialmente se
describió predominantemente en la infancia,
esta enfermedad se ha diseminado
actualmente en todos los grupos de edad,
con el primer reporte de pandemia en 1950
con este primer brote en el sureste
asiático. El virus del dengue pertenece al
género de flavivirus y se divide en 4
serotipos cada uno de ellos es capaz de de
ocasionar un espectro de expresión con un
rango amplio desde portadores
asintomáticos a una enfermedad febril con
cifras altas de temperatura, hasta una
discrasia hemorrágica con frecuencia
fatal.Las primeras manifestaciones clínicas
son entre 5 y 8 días post-inoculación, el
huésped desarrolla una viremia que dura
aproximadamente cinco días. Los síntomas
más frecuentes son: fiebre elevada 39-40ºC
intermitente bifásica, cefalea, mialgias,
artralgias, con dolor cervical y lumbar, dolor
retrocular, náuseas y/o vómito, dolor
abdominal. Los síntomas respiratorios (tos,
rinitis, faringitis) son frecuentes y se pueden
presentar erupciones cutánea maculo-
papular que aparece al comienzo de la fiebre
o coincide con un segundo pico febril a los 3-
5 días. Pueden observarse poliadenopatías,
granulocitopenia, linfocitosis relativa y
trombopenia En los casos severos de la
enfermedad (DH) Dengue hemorrágico
(SCHD) Síndrome de choque por dengue)
además del cuadro anterior se presenta
abruptamente hipotensión, déficit en la
perfusión tisular periférica y manifestaciones
hemorrágicas a distintos niveles siendo leves
en algunos casos o evolucionando
rápidamente hasta llegar a sufusiones en
piel, tubo digestivo, sistema nervioso,
aparato urinario y serosas con derrame
pleural siendo letal un 10-40 por ciento de
los casos. En el Dengue hemorrágico hay un
descenso del nivel de plaquetas por debajo
de 100.000/mm3 y un aumento del
hematocrito (hemoconcentración) En los
casos benignos o moderados, luego del
descenso de la fiebre, el resto de los
síntomas y signos retroceden recuperándose
36
espontanèamente pero en los casos severos
después de un descenso de la fiebre entre el
3º y el 7º día, el estado del paciente
empeora repentinamente, presentándose
cianosis, taquipnea, hipotensión,
hepatomegalia, hemorragias múltiples y falla
circulatoria. La situación es de corta
duración, pudiendo llevar a la muerte en 12
a 24 horas (1 a 10% de los casos) o a la
rápida recuperación luego del tratamiento
antishock. Existe aumento de la
permeabilidad vascular, hemoconcentración,
trombocitopenia, y deplección del
fibrinógeno (y del factor VIII, factor XII, etc.)
con concentración elevada de sus productos
de degradación.
A pesar de los avances en el estudio de la
respuesta inmunitaria del huésped a los
antígenos virales la patogénesis no es
exacta, aunque son varios los mecanismos
involucrados simultáneamente. Este trabajo
se inclina hacia el estudio de la función
polarizada y dominante de linfocitos CD4
en particular su variante Th2.
Planteamiento del problema:
Se desconoce el comportamiento de la
cinética inmunitaria en los 200 pacientes
con virus Dengue.
Objetivo General:
Realizar la cuantificación de las interleucinas
IL4, IL 9, CCL 18 y CCL 2 mediante método
de ELISA con anticuerpos monoclonales
recombinantes.
Metodología:
DISEÑO Prospectivo, Transversal,
Comparativo y Observacional.
UNIVERSO DE ESTUDIOSe estudiaron 200
muestras de suero con diagnostico clínico de
dengue confirmado por RT-PCR de pacientes
del Hospital Civil de Martínez de la Torre,
Casa de Salud de la UV en Veracruz, Ver. Y
Centro de Salud Carranza de la SSA ubicado
en Colonia el manglar en Boca del Rio. Los
pacientes cursaron con fiebre de 39.2°C,
cefalalgia frontal, dolor retroorbitario,
artralgias, mialgias y eritema cutáneo.
De estos 200 casos 17 cursaron con dengue
hemorrágico caracterizado por hemorragias
puntiformes en mucosa oral, pinguéculas,
púrpura e hipotensión. Como grupo control
se usaron 40 sueros de individuos
considerados sanos.
VARIABLES: Virus Dengue: medida en escala
nominal considerando presencia o
ausenciaIL4, IL 9, CCL 18 y CCL 2 : medición
cuantitativa en picogramos (pg).
PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: Se
obtuvieron 2 c.c. de suero de cada paciente
estos se conservaron a menos 70°C e
identificaron correctamente. Se llevo a
efecto la cuantificación de IL 4, IL 9, CCL 18
y CCL 2 mediante método de ELISA con
anticuerpos monoclonales recombinantes
marca R&D Systems. Para cada una de las
interleucinas se coloco una curva estándar,
terminada la reacción y formación de
complejos se realizo lectura de las muestras
a 450nm en lector de microplacas y se
obtuvieron lecturas derivadas de las
absorvancias mismas que fueron utilizadas
para hacer los cálculos expresados en
picogramos.
ANALISIS DE LA INFORMACION: Para la base
de datos se empleo el Software Office 2007
Excel donde se realizo un análisis estadístico
37
para cada interleucina por separado
obteniendo la media y realizando una
comparación con el grupo control, aplicando
gráficas de barras, así como diagramas de
cajas y alambres.
Resultados:
Se observaron cifras elevadas en pacientes
con dengue clásico de IL 4 28pg/ml (en
testigos 3.6 pg/ml), CCL 18 arrojo cifras de
1348 pg/ml en pacientes ( testigos
789pg/ml,) IL 9 en pacientes mostro cifras
de 265pg/ml (en controles 24 pg/ml.) y
CCL2 60pg/ml (testigos 79.3 pg/ml).
Discusión:
DISCUSION Y CONCLUSION: El primer
contacto del virus con el sistema inmune se
produce cuando se internaliza en células
dendríticas a nivel tisular. Estas células
procesadoras y presentadoras de antígenos
alojan las partículas virales en retículo
endoplásmico y endosomas donde RNA
viral interactúa con Toll 4 y se activa el
sistema inmunocompetente . Una vez que
estas líneas de células se activan liberan IL
4. Este mediador propicia por vía paracrina
transducción y transcripción en células
procesadoras y presentadoras de antígenos
de CCL 18, esta proteína es quimiotactico
de Linfocitos Th2 los cuales al activarse
sintetizan IL 9. CD 40L es expresado en
linfocitos TH2 y a través de este ligando
con CD40 en linfocitos B transcriben la
síntesis de IgM e IgG. Estas
inmunoglobulinas identifican antígenos
virales que forman complejos y dibujan un
tipo de lesión humoral mediada por
anticuerpos al unirse al RII gamma de
inmunoglobulina en plaquetas y endotelio
propiciando disfunción endotelial,
esfacelación y trombocitopenia, previa
fijación y activación del complemento.
Conclusión:
DISCUSION Y CONCLUSION: El primer
contacto del virus con el sistema inmune se
produce cuando se internaliza en células
dendríticas a nivel tisular. Estas células
procesadoras y presentadoras de antígenos
alojan las partículas virales en retículo
endoplásmico y endosomas donde RNA
viral interactúa con Toll 4 y se activa el
sistema inmunocompetente . Una vez que
estas líneas de células se activan liberan IL
4. Este mediador propicia por vía paracrina
transducción y transcripción en células
procesadoras y presentadoras de antígenos
de CCL 18, esta proteína es quimiotactico
de Linfocitos Th2 los cuales al activarse
sintetizan IL 9. CD 40L es expresado en
linfocitos TH2 y a través de este ligando
con CD40 en linfocitos B transcriben la
síntesis de IgM e IgG. Estas
inmunoglobulinas identifican antígenos
virales que forman complejos y dibujan un
tipo de lesión humoral mediada por
anticuerpos al unirse al RII gamma de
inmunoglobulina en plaquetas y endotelio
propiciando disfunción endotelial,
esfacelación y trombocitopenia, previa
fijación y activación del complemento.
Referencias Bibliográficas:
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acceso 20 febrero 2004] URL
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http://geosalud.com/enfermedades
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39
IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORES DE ANGIOTENSINA II Y CAVEOLINA-1 EN CORDÓN UMBILICAL Y CÉLULAS
ENDOTELIALES DE CORDÓN UMBILICAL (HUVECS) DE
PACIENTES PREECLÁMPTICAS José Arnold Gonzalez Garrido
Aracely Lopez Monteon Ángel Ramos Ligonio
José Rubén García Sánchez Guillermo Manuel Ceballos Reyes
Enrique Méndez Bolaina
Estudiante de Doctorado Centro de Investigaciones Biomédicas Universidad Veracruzana
Marco teórico:
La preeclampsia es un desorden específico
que afecta al 5% de las enzimas hepáticas
todos los embarazos y es reconocida
clínicamente por la presencia de
hipertensión (HTA), aumento de y un bajo
conteo de plaquetas (síndrome HELLP),
proteinuria (presencia de proteínas en la
orina) y edema, que ocurre después de la
vigésima semana.1En algunos casos la
preeclampsia progresa a algo más serio
conocido como eclampsia, la cual conlleva al
coma o la muerte materno-fetal. Cuando la
preeclampsia no progresa a eclampsia puede
dejar secuelas tales como fallo renal, ruptura
hepática, retardamiento del crecimiento
intrauterino y muerte fetal intrauterina2,3.
Las causas de la preeclampsia no son
conocidas, pero existe evidencia de estar
asociada a la activación y disfunción
endotelial, muchas investigaciones han
demostrado mediante marcadores
endoteliales una probable asociación,
proponiendo un incremento en la circulación
de los niveles del factor de Von Willebrand,
Angiotensina II (Ang II), endotelina y
fibronectina.4 El sistema renina-angiotensina
(encargado de la regulación de la presión
arterial), realiza su función a través de la Ang
II y sus receptores AT1 y AT2, los cuales
están implicados en distintos procesos como
el desarrollo y diferenciación celular.5En
1953 se observo en la membrana celular de
células endoteliales la presencia de
invaginaciones, las cuales se denominaron
como “caveolas”.6,7 Estudios posteriores
encontraron la presencia de proteínas en las
caveolas, denominándolas caveolinas (Cav),
describiéndose tres tipos Cav-1, -2 y -3.
Dentro de las caveolinas destaca la cav-1 por
tener funciones importantes para la caveola
como; direccionar la formación de caveola y
ser un inhibidor inespecífico de proteínas
tirosina cinasa (mediante su péptido definido
en el aminoácido 82-101, CSP-1), por lo que
40
la cav-1 podría tener un papel importante en
la disfunción endotelial que se presenta en la
preeclampsia
Planteamiento del problema:
Debido a que la preeclampsia es una
enfermedad de la que se desconocen sus
causas de origen, y se asocia a una activación
y disfunción endotelial, el enfoque de este
trabajo es evidenciar la disfunción a nivel de
los receptores de Ang II y observar si existe
un cambio en la expresión de la Cav-1, la cual
es un inhibidor inespecífico de proteínas
cinasas.
Objetivo General:
Determinar la expresión de las proteínas
AT1, AT2 y Cav-1 en el cordón umbilical y
células endoteliales del cordón de mujeres
embarazadas con preeclampsia.
Metodologia:
Tipo de Estudio: Investigación Básica
Recolección de Muestras. Se realizó un
estudio experimental con cordones
umbilicales de pacientes eutócicos y
preeclámpticos donados por el Hospital
General Córdoba, Veracruz, llevado a cabo
de Agosto de Octubre de 2009 a Marzo de
2010. Se realizaron cultivos de endotelio de
cordón umbilical de pacientes eutócicos y
preeclámpticos, se transportaron de 2 a 4
cordones umbilicales frescos en solución de
transporte. Los cordones se procesaron en
campana de flujo laminar, se extrajeron las
células endoteliales, las cuales fueron
resuspendidas en Medio Suplementado y
fueron sembradas en caja de cultivo de 75
cm2, se incubaron y se observó su
crecimiento de 5 a 6 días posteriores a su
obtención, manteniéndose en crecimiento
hasta confluencia celular. Una vez obtenido
los cultivos se realizaron ensayos de
inmunocitoquímica para caracterizar al
endotelio a través de la identificación del
factor Von Willebrand, el cual es expresado
solo por células endoteliales y
megacariocitos.Inmunocitoquímica de
proteínas AT1, AT2 y Cav-1 en HUVECs Una
vez caracterizado el endotelio se realizaron
los ensayos de inmunocitoquímica indirecta
para observar la inmunoexpresión de las
proteínas AT1, AT2 y Cav-1, utilizando
anticuerpos contra cada una de las
proteínas, posteriormente se utilizó un
anticuerpo secundario acoplado a FITC y
TRIC. Se realizo el conteo de pixeles en el
programa IPLab 3.6.5 y los datos se
sometieron a un análisis estadístico. Western
Blot en el cordón umbilical. Se realizó el
análisis de la expresión de los receptores de
Ang II en el cordón umbilical de embarazos
eutócicos y preeclámpticos. Se realizó la
extracción de proteína de los cordones
umbilicales y se cuantificó la proteína
mediante el método de lowry. Se realizó el
Western Blot en condiciones
desnaturalizantes para identificar la
presencia de las proteínas AT1, AT2, Cav-1 y
GAPDH mediante el uso del anticuerpo anti-
AT1 (1:200), AT2 (1:200), Cav-1 (1:500) y
GAPDH (1:3000) (Santa Cruz Biotechnology).
Se realizó el revelado de las membranas por
la reacción de la Diaminobencidina (DAB),
identificándose la presencia de las proteínas.
Se realizó un análisis densitométrico de los
Blots en el programa Labworks 4.0, estos
experimentos fueron realizados por
triplicado y se sometió a un análisis
estadístico en el programa Prism 5.0. Para
evidenciar las diferencias estadísticas por
41
medio de p 0.05.
Resultados:
En el análisis de la expresión de las proteínas
AT1, AT2 y Cav-1 en el cordón umbilical. Se
encontró que el receptor AT1 está presente
en una mayor expresión en los cordones de
preeclampsia en comparación con los
cordones eutócicos. Al analizar su expresión
en las HUVECs se encontró AT1 está presente
en una mayor expresión en HUVECs de
preeclampsia en comparación con las
HUVECs eutócicas observándose en el
análisis diferencias estadística de p<0.05. En
la expresión del receptor AT2 se encontró un
aumento en la expresión en los cordones de
preeclampsia en comparación con los
cordones eutócicos observándose en el
análisis densitométrico una diferencia
estadística de p<0.05. Al analizar su
expresión en HUVECs se encontró que el
receptor AT2 está presente en una mayor
proporción en las HUVECs de preeclampsia
en comparación con las HUVECs eutócicas,
encontrándose diferencias significativas. En
la expresión de Cav-1 no se encontró
ninguna diferencia en cordones eutócicos o
preeclámpticos, al analizar la expresión de
Cav-1 en las HUVECs no se encontró ninguna
diferencia en su expresión, tanto en las
HUVECs eutócicas o preeclámpticas. En
ambos análisis no se encontraron diferencias
significativas.
Discusión:
Se han realizado estudios que han
evidenciado en la preeclampsia la
implicación de los receptores de Ang II en
tejido placentario, mostrando que el
receptor AT1 se encuentra disminuida su
expresión, debido a una baja participación de
la placenta en la disfunción causada por la
preeclampsia,9 por otra parte nosotros
realizamos la evaluación de la expresión de
los receptores en el cordón umbilical de
pacientes con embarazos eutócicos y
preeclámpticos, donde se observó que los
receptores AT1 y AT2 en el cordón umbilical
de preeclampsia se encuentra aumentada su
expresión con respecto al cordón eutócico,
sin embargo, fue evidente el incremento en
la expresión del receptor AT2 en
comparación con el receptor AT1 en ambos
cordones, donde se ha descrito que la
expresión del receptor AT2 es importante en
el desarrollo y diferenciación celular,
asociando su aumento en la expresión en
tejidos neonatales.10 Aunque, a pesar de
que el cordón contiene una variedad de
células, al evaluar la expresión de estos
receptores en el cultivo de endotelio de
cordón umbilical se encontró que la
expresión de los receptores de Ang II se
mantiene de la misma forma que en el
cultivo celular. Lo cual nos permite sugerir
que el endotelio mantiene la expresión del
tejido al cultivo.La proteína Cav-1 que es
parte de la caveola, y dentro de este está
contenido el péptido de anclaje de Cav-1
definido en el aa 82-101, el cual es un
inhibidor inespecífico de cinasas y de gran
importancia en el funcionamiento celular.11
La expresión de la Cav-1 no mostro
diferencias en los cordones eutócicos o
preeclámpticos, además de que se realizo su
búsqueda en endotelio en cultivo, en los
cuales se mantuvo la misma expresión que
en el cordón umbilical. Se ha propuesto que
el desarrollo de la hipertensión en la
preeclampsia resulta del daño endotelial
generalizado y/o falta de equilibrio en la
42
producción y/o acción de agentes
vasoactivos, dentro de estos agentes
determinantes se encuentra la Ang II que
lleva a cabo su acción a través de sus
receptores AT1 y AT2, de los cuales, el
receptor AT1 se ha descrito que participa en
la vasoconstricción y que el receptor AT2 es
un antagonista del receptor AT1, el cual se
une directamente formando un
heterodímero que inhibe la función de
vasoconstricción de receptor AT112, en
nuestros resultados observamos que en el
endotelio preeclámptico la expresión de
estos receptores se encuentra aumentada en
comparación con el endotelio eutócico,
evidenciando la disfunción endotelial en el
endotelio preeclámptico. Por otra parte, se
ha descrito que el CSP-1 es un inhibidor
inespecífico de tirosinas cinasas13, al realizar
los ensayos para detectar la presencia de la
Cav-1 encontramos que no hay cambios en la
expresión de esta proteína tanto en el
endotelio eutócico como preeclámptico, por
lo cual al aumentar “in vitro” el CSP-1 nos
permitirá en un futuro próximo evaluar su
desempeño en un endotelio eutócico y
preeclámptico
Conclusión:
De acuerdo a nuestro objetivo general que
fue determinar la expresión de las proteínas
AT1, AT2 y Cav-1 en la preeclampsia
encontramos un aumento en la expresión de
las proteínas AT1 y AT2 tanto en el cordón
umbilical completo como en las HUVECs. Por
otra parte la expresión de Cav-1 no mostró
diferencias en su expresión en el cordón
umbilical completo ni en las HUVECs de
pacientes con embarazos eutócicos y
preeclámpticos.
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44
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CATEQUINA Y
EPICATEQUINA DE THEOBROMA CACAO SOBRE LAS
LÍNEAS MDA-MB 231 Y BT-474 DE CÁNCER DE
MAMA Melissa Hernández Martínez . Ivonne María Olivares Corichi
Guillermo Manuel Ceballos Reyes José Rubén García Sánchez
José Arnold Gonzalez Garrido
Estudiante de Maestría E.S.M. SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN INSTITUTO
POLITÉCNICO NACIONAL [email protected]
Marco teórico:
A nivel mundial, el cáncer de mama es la
neoplasia más común entre las mujeres,
reportándose 411,000 muertes al año a
causa de esta enfermedad y
correspondiendo al 10.5% de todos los
nuevos casos de cánceres registrados [1].El
cáncer de mama se define como una
proliferación acelerada, desordenada y no
controlada de las células que forman la
glándula mamaria. En México, se estima que
doce mujeres mueren diariamente a causa
de esta neoplasia [2].Hoy en día se sabe que
el cáncer de mama es una enfermedad
multifactorial donde genes encargados de la
regulación del ciclo celular, genes supresores
de tumor y genes involucrados en el
crecimiento y diferenciación celular
muestran alteraciones. Si bien, es indudable
la participación de los mecanismos
genéticos, las modificaciones epigenéticas
están emergiendo rápidamente como
alteraciones que ocurren en las primeras
fases de la tumorogenesis y que juegan un
papel importante en el desarrollo y la
progresión del tumor [3].
Actualmente existe un gran número de
evidencias que señalan a la dieta como un
elemento clave en la prevención del cáncer
de mama [4]; de hecho, efectos quimio
preventivos de los componentes
fitoquímicos de frutas y hortalizas han sido
detectados, así como su capacidad de activar
genes silenciados por alteraciones
epigenéticas [5] y su posible capacidad de
modular eventos celulares como son la
apoptosis, la diferenciación y el ciclo celular
[6].Uno de los fitoquímicos más
representativos e intrigantes son los
polifenoles; una familia de compuestos que
45
se han propuesto como una posible
terapéutica contra el cáncer [7]. Entre estos
polifenoles tenemos a los flavonoides, que
incluyen los monómeros de Catequina y
Epicatequina, los cuales se les relaciona con
las propiedades antineoplásicas, sin embargo
los mecanismos moleculares involucrados
con estos efectos son poco entendidos.
Planteamiento del problema:
Debido a que los flavonoides han sido
propuestos como una posible terapia en la
carcinogénesis, la pregunta a resolver está
enfocada en determinar si los flavonoides
Catequina y Epicatequina en su forma
monomérica presentan efectos anti-
proliferativos en las líneas celulares MDA
MB-231 y BT-474 provenientes de cáncer de
mama.
Objetivo General:
Evaluar el efecto de Catequina y
Epicatequina sobre la proliferación celular y
la inducción de apoptosis en las líneas MDA
MB-231 y BT-474 provenientes de cáncer de
mama.
Metodologia:
Tipo de estudio: Investigación básica.
Reactivos: Catequina y Epicatequina se
obtuvieron de SIGMA Aldrich. Fueron
disueltos en metanol a una concentración de
10 mM y almacenados a -20oC. MTT (3-[4,5-
Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-
tetrazolium bromide) se disolvió en DMEN
sin rojo de fenol y se almaceno a 4oC. Líneas
celulares: Se emplearon las líneas celulares
provenientes de carcinoma de mama; BT-474
(ductal) crecida en DMEN AVANZADO,
suplementado con 10% de suero fetal bovino
(FBS) y la línea MDA MB-231(lobulillar)
crecida en DMEN Alto en glucosa y
suplementado con 7.5% de FBS. Ambas
líneas se mantuvieron a 37oC, 5% de CO2 y
95% de humedad. Ensayos de viabilidad
celular. Las líneas celulares MDA MB-231 y
BT-474 (1X103, 5X103 y 1X104) fueron
sembradas en cajas de 96 pozos y se
mantuvieron por 24 hrs en condiciones de
cultivo. Posteriormente las células fueron
incubadas con epicatequina y catequina
(100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 y 450 µM)
por 72 hrs. La viabilidad celular fue
determinada empleando el reactivo de MTT
y de acuerdo al protocolo estándar. Curvas
dosis respuesta fueron construidas con los
resultados obtenidos y la concentración
inhibitoria 50 (CI50) fue determinada.Efecto
de la mezcla Epicatequina-Catequina sobre la
viabilidad celular. Las líneas celulares MDA
MB-231 (1x104 células) fueron sembradas en
caja de 96 pozos y se dejaron reposar 24 hrs.
Las células fueron incubadas con la mezcla
Epicatequina-Catequina [350 µM de cada
flavonoide] por un periodo de 72 hrs. La
viabilidad celular fue determinada cada 24
hrs empleando el reactivo de MTT y de
acuerdo al protocolo estándar. Como un
control del efecto de cada flavonoide;
Epicatequina y Catequina fueron empleados
individualmente y sus efectos sobre la
viabilidad fueron determinados como se
menciono anteriormente. Determinación de
apoptosis por fragmentación de ADN. Las
células MDA MB-231 y BT-474 (1x106)
fueron sembradas y se mantuvieron por 24
hrs en condiciones de crecimiento.
Posteriormente, se cambio el medio por
DMEN claro en la presencia de los
compuestos fenólicos (350 µM). Cada 24 hrs
las células fueron recolectadas y el ADN fue
46
obtenido. Las células fueron lizadas, el DNA
fue obtenido por precipitación y su análisis
se realizó a través de electroforesis en geles
de agarosa al 2%.Análisis estadístico. Los
ensayos de proliferación celular fueron
realizados por cuadruplicado, se realizaron
dos veces y se analizaron con el programa
estadístico GraphPad Prism versión 5.
Resultados:
Con el objetivo de evaluar el efecto
antineoplásico de Catequina y Epicatequina
sobre las líneas MDA MB-231 y BT-474 se
realizaron ensayos de proliferación celular,
para lo cual, se sembraron diferente número
de células de ambas líneas celulares en
presencia de los compuestos fenólicos a
diferentes concentraciones (ver material y
métodos).Los ensayos de proliferación
celular mostraron que la línea MDA MB-231
presentó un efecto inhibitorio en su
proliferación celular con ambos flavonoides,
dicho efecto fue dependiente de la
concentración e independiente del número
de células. Al evaluar la proliferación de la
línea celular BT-474 bajo estas condiciones
no se observó efecto alguno. Con los datos
obtenidos con Catequina y Epicatequina
sobre la proliferación celular en la línea MDA
MB-231 se calculó la Concentración
Inhibitoria 50 (CI50) obteniendo un valor de:
350 µM para ambos compuestos. Con el
objetivo de observar si Catequina y
Epicatequina administrados en combinación
producían un mayor efecto, se realizaron
ensayos de proliferación celular con la línea
MDA MB-231 (ver material y métodos). Los
resultados obtenidos mostraron un mayor
efecto inhibitorio en la presencia de esta
mezcla de flavonoides, este resultado
sugiere la existencia de diferentes
mecanismos de acción de estos flavonoides.
Este resultado abrió la posibilidad de
estudiar un posible efecto de esta mezcla en
la línea celular BT-474, los ensayos de
proliferación celular en la línea BT-474 y la
mezcla de flavonoides mostraron un efecto
inhibitorio. Para evaluar el posible
mecanismo de acción de estos flavonoides,
la línea celular MDA MB-231 se creció en
presencia de epicatequina, catequina y la
mezcla (ver material y métodos). El ADN fue
obtenido y analizado electroforéticamente
en geles de agarosa al 2 %. Los resultados
obtenidos mostraron que Catequina,
Epicatequina y la mezcla inducen una
fragmentación del ADN indicativa de
apoptosis. Similares resultados fueron
obtenidos en la línea BT-474 cuando la
mezcla de flavonoides fue empleada.
Discusión:
En el presente estudio se demostró la acción
antiproliferativa de los monómeros de
Catequina y Epicatequina en las líneas
celulares MDA MB-231 y BT-474
provenientes de cáncer de mama. Si bien, un
efecto inhibitorio sobre la proliferación
celular de MDA MB-231 fue observado con
ambos flavonoides, un mayor efecto fue
detectado cuando una mezcla de ambos
flavonoides fue utilizada. Interesantemente,
el efecto inhibitorio en la línea celular BT-474
solo fue observado cuando la mezcla de
ambos flavonoides fue empleada. Es
importante señalar, que si bien, hoy en día la
gran mayoría de los estudios son orientados
a los polímeros de estos compuestos [8], en
este trabajo presentamos las propiedades
antineoplásicas de estos monómeros. Por
47
otro lado, los resultados obtenidos en el
análisis del ADN bajo estas condiciones,
mostraron una fragmentación característica
indicadora de la presencia de apoptosis,
sugiriendo como un posible mecanismo de
acción la inducción de muerte celular
programada en la célula tumoral por parte
de estos monómeros.
Conclusión:
Los ensayos de proliferación celular
muestran que los monómeros Catequina y
Epicatequina tienen un efecto inhibitorio
sobre la proliferación celular independiente
del número de células en la línea MDA MB-
231.La combinación de los compuestos
fenólicos produjo un mayor efecto en la
inhibición del crecimiento de la línea celular
MDA MB-231.El efecto antineoplásico de
Catequina y Epicatequina en la línea celular
BT-474 solo fue observado cuando una
mezcla de estos flavonoides fue utilizada.El
análisis electroforético del ADN de células
MDA MB-231 y BT-474 tratadas con
catequina y epicatequina sugiere a la
apoptosis como un posible mecanismo de
acción de estos flavonoides.
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48
DETECCIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS Y NEISSERIA
GONORRHOEAE EN ESPECÍMENES GENITOURINARIOS
MEDIANTE PCR MÚLTIPLE. Salvador Contreras Huerta
Armando Mendez Perez Yuritzi Alejandra Sandoval Hernandez
Martha Lucero Mirafuentes Merino Julio Cesar Baizabal Rebolledo
Docente y Profesional de la salud DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA EXPERIMENTAL FACULTAD DE
MEDICINA. UV XALAPA. [email protected]
Marco teórico:
Las infecciones de transmisión sexual (ITS)
figuran entre las principales causas de
enfermedad en el mundo. Durante los
últimos 20 años su importancia se ha
acrecentado debido a su relación con graves
problemas del aparato reproductor. Aunque
la magnitud exacta del problema no es bien
conocida, en los países industrializados al
menos 1 de cada 100 personas consulta por
una ITS, anualmente. En los países en
desarrollo las ITS figuran entre los cinco
motivos más frecuentes de consulta en los
servicios de salud y cada año más de 333
millones de personas en el mundo adquieren
una ITS, la mayoría de las cuales son
previsibles y curables. En muchos casos,
estas infecciones permanecen asintomáticas
y sin tratamiento, con riesgo de contagio a
otros individuos y con la posibilidad de
ocasionar serios problemas de salud,
incluyendo la infertilidad. Previamente, las
ITS de mayor relevancia eran sífilis y
gonorrea, sin embargo en la actualidad el
agente de mayor importancia es Chlamydia
trachomatis (CT). Este agente infeccioso
causa cerca de 90 millones de nuevos casos
de infección genital por año, seguido de
gonorrea que ocasiona 60 millones de
nuevos casos por año. En la mayoría de los
individuos de uno u otro sexo la infección
genital por CT suele ser asintomática. Sin
embargo, en 30% de mujeres que presentan
cervicitis se ha observado desarrollo de
salpingitis. Asimismo, se puede aislar CT
hasta en 50% de las mujeres con enfermedad
pélvica inflamatoria.6 Esta situación es
preocupante porque la infección tubaria
puede degenerar en obstrucción
permanente y a consecuencia de ello
producir infertilidad, o cuando se ocasiona
obstrucción parcial puede presentarse
embarazo ectópico.7 La infección por
Neisseria gonorrhoeae (NG) es también
causa de salpingitis e infertilidad. Por otra
parte, las úlceras genitales ocasionadas por
infecciones bacterianas constituyen
condiciones de riesgo para la transmisión del
49
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y
del virus del papiloma humano (VPH), y por
lo tanto para el SIDA y el cáncer cérvico-
uterino.
En hombres la uretritis gonocóccica o
clamidiásica puede ser asintomática hasta en
30% de los casos. Se ha observado que la
infección subclínica crónica puede degenerar
en prostatitis, epididimitis, estenosis de
uretra y de los conductos deferentes, con el
riesgo de esterilidad por azoospermia.En
vista de la importancia que las ITS tienen
para la salud pública y personal es necesario
conocer su frecuencia y características de
presentación. En México se ha documentado
que la prevalencia de infección por CT en el
tracto genital inferior varía entre 3.3 y
28.4%, y la de gonorrea entre 2.8 y 11.6%,
dependiendo de la población muestreada y
de la metodología utilizada para el
diagnóstico.
Planteamiento del problema:
No se dispone de información exacta sobre
la prevalencia de Chlamydia trachomatis y
Neisseria gonorrhoeae identificada por PCR
Múltiple en especímenes genitourinarios.
Objetivo General:
Detectar y determinar la prevalencia de
Chlamydia trachomatis y Neisseria
gonorrhoeae mediante PCR Múltiple en
especímenes genitourinarios.
Metodología:
DISEÑO Prospectivo, Transversal,
Comparativo y Observacional.
UNIVERSO DE ESTUDIO: Se muestrearon 40
pacientes con edades variables (18-50 años)
y de ambos sexos (28 femeninos y 12
masculinos) con diagnostico presuntivo de
ITS por clamidia y gonococo. Cada uno de los
pacientes incluidos en este estudio otorgo su
consentimiento y proporciono información
personal así como de inicio de vida sexual y
numero de parejas. Se incluyeron también
20 individuos considerados sanos que
sirvieron como grupo control para realizar la
validación del estudio.
VARIABLES: Chlamydia trachomatis: medida
en escala nominal considerando presencia o
ausenciaNeisseria gonorrhoeae: medida en
escala nominal considerando presencia o
ausencia.
PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: La
recolección del material biológico se efectuó
de varias formas, en mujeres se obtuvo
muestras de orina y de secreción vaginal, en
varones fue raspado uretral, secreción
purulenta y de orina según las condiciones
de cada paciente. Concluida la recolección
las muestras fueron rotuladas y procesadas
de inmediato. Para la obtención de ADN se
realizaron lavados de las secreciones y
centrifugados de las orinas, se obtuvo en
todos los casos un botón celular el cual fue
sometido a lisis nuclear, una vez liberado el
ADN se purifico con lavados de etanol
absoluto, 96% , 70% y se solubilizo con NaOH
0.8mM.El ADN de cada una de las muestras
fue amplificado por PCR Múltiple mediante
el uso de dos pares de iniciadores KL1/KL2 y
HO1/HO3 específicos para clamidia y
gonococo respectivamente. Concluida la
amplificación se efectuó electroforesis en
geles de agarosa al 1.5% en buffer de TBE 1X
para la identificación de productos.
50
ANALISIS DE LA INFORMACION: Las variables
estudiadas fueron Chlamydia trachomatis y
Neisseria gonorrhoeae, en primera instancia
se realizo un análisis estadístico univariado
aplicando tablas de frecuencias, gráficas
circular, de barras, así como diagramas de
cajas y alambres. Posteriormente se efectuó
un análisis divariado que consistió en hallar
las posibles correlaciones del padecimiento.
Resultados:
En la Amplificación por PCR Múltiple con los
iniciadores KL1/KL2 y HO1/HO3, se observo
que de los 40 casos sospechosos para ITS 24
(60%) fueron positivos para Chlamydia
trachomatis, 8 (20%) para Neisseria
gonorrhoeae, 4(10%) para ambas entidades
y 4(10%) resultaron negativas. Para el grupo
control no hubo amplificación tal y como se
esperaba.En la distribución por sexo se
identifico que el grupo femenino tuvo
amplificación para Chlamydia trachomatis en
15 casos (37.5%), 5 casos (12.5%) para
Neisseria gonorrhoeae y 4 casos (10%) para
ambas entidades; por su parte el grupo
masculino presento 9 casos (22.5%) para
Chlamydia trachomatis y 3 casos (7.5%) para
Neisseria gonorrhoeae. Por su parte el grupo
de edades con mayor numero de casos para
ambas patologías fue el de 27 a 36 años con
un 45% y de estos el 22% cuenta con mas de
una pareja sexual y el 13% no cuenta con una
pareja estable.
Discusión:
Los resultados de este estudio demuestran
que la tasa de individuos con riesgo de
contraer o que cursan cualquiera de estas
dos patologías infecciosas es muy alto. Las
cifras encontradas en mujeres y hombres
pueden ser comparables con las descritas en
la literatura al demostrarse que el grupo
femenino es el más comprometido y por
consiguiente el mas afectado.En nuestro
estudio la mayor prevalencia de infección es
la descrita para C trachomatis y con un
porcentaje menor la combinación de ambas
entidades patológicas.
Respecto a los varones los resultados indican
una menor prevalencia tanto de gonorrea
como de clamidiasis. Como se mencionó en
México no existen datos que revelen la
estadística de casos diagnosticados por PCR
Multiple para C.trachomatis y para N.
gonorrhoeae ya que la mayoría de los
estudios han utilizado como marcador de
infección la presencia de las bacterias en
secreciones genitales, identificadas a través
de diversas técnicas con diferente
sensibilidad y especificidad. Considerando
que esta investigación constituye una de las
primeras que se realizan con iniciadores
específicos para ambas entidades utilizando
como indicador de infección la presencia de
ADN de las mismas.
Conclusión:
Con lo expuesto anteriormente queda de
manifiesto que el uso de pruebas especificas
y de alta sensibilidad como el PCR Múltiple
permiten identificar de manera rápida y
efectiva a N gonorrhoeae y C trachomatis,
generando un diagnostico oportuno que
permite prevenir fundamentalmente las
secuelas en el aparato reproductor causando
infertilidad en ambos sexos y disminuir la
gravedad de las infecciones. A su vez este
procedimiento es relevante con fines
diagnósticos, con el propósito de definir la
epidemiología de las infecciones de
51
transmisión sexual y para determinar la
susceptibilidad antimicrobiana.
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.
53
CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GENE QUE
CODIFICA PARA LA PROTEÍNA NS3 DE LOS 4 SEROTIPOS
DEL VIRUS DENGUE Laura Mónica Álvarez Rodríguez
Méndez-Bolaina Enrique Ramos-Ligonio Angel
Aracely López-Monteon
Estudiante de Doctorado Universidad Veracruzana Centro de Investigaciones Biomédicas
Marco teórico:
El dengue es un padecimiento infeccioso
viral de tipo agudo y de distribución mundial
causado por cualquiera de los cuatro
serotipos del virus del dengue (DEN1, DEN2,
DEN3 y DEN4), el cual es transmitido al
humano por la picadura de la hembra
hematófaga del mosquito del género Aedes
(1). La infección por cualquiera de los 4
serotipos del virus puede provocar cuadros
clínico variados que van desde una forma
asintomática hasta ciertas manifestaciones
clínicas, y aún causar la muerte.
Básicamente, se reconocen tres cuadros
clínicos: la fiebre del dengue o dengue
clásico (FD), la fiebre hemorrágica por
dengue o dengue hemorrágico (FHD) y el
síndrome de choque por dengue (SCD) (2).
Este virus posee un RNA el cual codifica para
una poliproteína que es procesada por
proteasas tanto de origen viral como celular
dando origen a 10 proteínas, 3 estructurales
(C, prM, E) y 7 no estructurales (NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5 (3).
El tratamiento para la infección del dengue
solo se basa en aliviar síntomas relacionados
con la enfermedad, ya que no existen
agentes terapéuticos específicos para
eliminar al virus (4). Por este motivo, el
desarrollo de vacunas contra el dengue se ha
convertido en una prioridad a nivel mundial,
para prevenir epidemias tanto en países
endémicos como no endémicos. La
Organización Mundial de la Salud (OMS)
menciona que una vacuna contra el dengue
debe brindar protección de larga duración
frente a la infección por cualquiera de los 4
serotipos del dengue (5). Las técnicas de
biología molecular han permitido la
clonación de genes que codifican para
proteínas del virus, esto nos proporciona la
oportunidad de evaluar posibles
inmunógenos que podrian ser buenos
candidatos a vacunas. En el ser humano, la
respuesta inmune contra el virus del dengue
ha sido muy variada y está dirigida frente a
diversos epitopos de las proteínas víricas.
Estos epitopos, específicos para cada
serotipo, pueden utilizarse para el diseño y
54
creación de vacunas tretavalentes que
protejan hacia los 4 serotipos. Las proteínas
no estructurales, como NS1 y NS3, se han
reportado como buenos inmunógenos, por
lo que las hace buenos candidatos en el
desarrollo de vacunas contra el dengue (6).
Planteamiento del problema:
A pesar de la gran incidencia del dengue en
el mundo y de su grave situación, no se
dispone de vacunas preventivas ni fármacos
antivirales específicos para el tratamiento
del dengue. En la actualidad, existen
proyectos en desarrollo que intentan
construir vacunas recombinantes que
expresen las proteínas externas de todos los
serotipos. La mayoría de las vacunas se han
preparado utilizando partículas virales
inactivas o modificadas. Las vacunas
producidas exclusivamente a partir de las
proteínas virales externas sintetizadas en
bacterias son más seguras dado que, sin el
ácido nucleico viral, no puede ocurrir
contaminación de la vacuna por partículas
infectivas. Sin embargo, las dificultades en
desarrollar una vacuna efectiva se centran en
el requisito indispensable de una vacuna
tetravalente protectora contra los cuatro
serotipos. Se sabe que anticuerpos presentes
en un individuo que ha sufrido FD
representan un factor de riesgo para FHD,
facilitando la entrada a la célula del serotipo
reinfectante. Por lo tanto, una inmunización
parcial con una vacuna monovalente
implicaría un riesgo aumentado en el
individuo vacunado de sufrir una forma más
severa de enfermedad ante una infección
con alguno de los otros tres serotipos.
Tomando en cuenta todo lo anterior, y a que
la proteína NS3 es el principal antígeno del
virus dengue (VD) y que posee en su mayoría
epitopes para células T, en el presenta
trabajo se propuso la construcción de una
proteína recombinante de cada serotipo con
la finalidad de utilizarlos como candidatos a
vacunas.
Objetivo General:
Clonar un fragmento del gene que codifica
para la proteína NS3 de los 4 serotipos del
virus dengue.
Metodologia:
Es un estudio experimental. Se utilizó la línea
celular C6/36 de Aedes albopictus infectada
con los cuatro serotipo del virus dengue para
aislar el RNA viral mediante el método de
TRizol (7). El RNA fue inmediantamente
retrotranscrito a cDNA. El cDNA se empleo
como molde para amplificar un fragmento
del gen de la proteína NS3 del virus dengue
mediante PCR utilizando oligonucleótidos
serotipo-específicos (8). Los productos de
PCR de cada serotipo se ligaron de manera
independiente en el vector de clonación pCR
2.1 TOPO. Con el DNA plasmídico de cada
una de las clonas de cada serotipo se
realizaron reacciones de restricción con la
enzima Eco RI para identificar la liberación de
los fragmentos de NS3. Con la finalidad de
expresar los fragmentos de NS3 de cada
serotipo, éstos, se subclonaron en el vector
de expresión pGEX-5X-1 el cual fue
linearizado con la enzima Eco RI. Las clonas
obtenidas se crecieron para la extracción del
DNA plasmídico por lisis alcalina,
posteriormente fueron sometidas a
reacciones de restricción y los fragmentos
fueron analizados en geles de agarosa al 1%
teñidos con bromuro de etidio. Para
55
identificar la expresión del gen de la proteína
NS3 se utilizaron las clonas positivas al
fragmento de cada serotipo. Brevemente, se
realizaron cultivos no inducidos e inducidos
con IPTG, se realizaron extractos celulares
los cuales se analizaron mediante geles de
poliacrilamida al 10% y teñidos con azul de
coomassie. Finalmente se comprobó la
expresión del fragmento del gen de la
proteína NS3 de los cuatro serotipo
mediante Western Blot (WB) utilizando un
Ab policlonal dirigido contra GST.
Resultados:
De las reacciones de ligación de cada uno de
los fragmentos de NS3 de cada serotipo del
VD en el vector pCR 2.1 TOPO, se selecciono
una clona que mostro la liberación de un
fragmento de 597, 596, 590 y 598 pb para el
serotipo DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4
respectivamente. Los fragmentos de cada
una de estas clonas se subclonaron en el sitio
Eco RI del plásmido pGEX-5X-1 para obtener
la proteína recombinante. Este plásmido
tiene la característica de que la proteína sale
fusionada a la GST, lo que facilita su
purificación por afinidad. Se obtuvieron
varias clonas positivas para cada serotipo,
seleccionadas a través de la liberación del
fragmento correspondiente, sin embargo,
simultáneamente se realizaron ensayos de
expresión piloto con IPTG debido a que la
ligación se realizo con una sola enzima de
restricción se corría el riesgo de que los
fragmentos estuvieran en orientación
contraria y esto diera lugar a la pérdida del
marco de lectura abierto. De las clonas
analizadas, se obtuvó una clona positiva para
el serotipo DEN1, DEN2, DEN3 y tres clonas
positivas para el serotipo DEN4, todas ellas
expresaron una proteína de 49 kDa (22 kDa
correspondiente al fragmento NS3 y 27 kDa
correspondientes a la GST). Para comprobar
la expresión de la proteína recombinante se
realizo un WB con un anticuerpo policlonal
anti-GST observándose el reconocimiento de
la proteína recombinante del peso esperado.
Discusión:
Debido al impacto actual del dengue en todo
el mundo y su diseminación, ha aumentado
el interés en el desarrollo de una vacuna
contra el dengue que sea segura, eficaz y que
induzca protección de por vida hacia los
cuatro serotipos. Los avances en las técnicas
de biología molecular han facilitado el
desarrollo de vacunas recombinantes contra
diferentes virus, lo que ha permitido la
producción de proteínas a gran escala. La
mayoría de los esfuerzos se han enfocado a
producir vacunas utilizando la proteína E,
mientras que también se han utilizado las
proteínas no estructurales del virus (NS) (9).
La proteína NS3 se puede considerar como
una posible candidato para el diseño de una
vacuna debido a que constituye la fuente
principal de epitopes de células CD4 + y CD8+
(10, 11). En principio, es factible realizar una
vacuna contra el VD ya solo causa infección
aguda y la replicación del virus es
efectivamente controlada después de 3 a 7
días de viremia. Sin embargo los individuos
que se han recuperado de una infección por
VD, son inmunes al reto con el mismo
serotipo pero no a otros serotipos del VD
(12). Los problemas en el desarrollo de una
vacuna contra el VD son que no se
comprende aun la patogénesis del FHD, así
como la ausencia de un modelo animal para
la enfermedad. Se sabe que los anticuerpos
56
pre-existentes contra el VD son un factor de
riesgo para desarrollar FHD, por lo tanto, una
vacuna efectiva deberá ser tetravalente y
necesita prevenir la infección provocada por
los cuatro serotipos el VD (13).
Conclusión:
Los resultados nos permiten concluir que
tenemos las proteínas recombinantes
correspondientes a la proteína NS3 del VD de
cada serotipo, lo cual nos permitirá utilizarla
como antígeno tetravalente en el modelo de
ratón, la efectividad del candidato a vacuna
se realizará comparando la respuesta
inmune inducida por la vacuna con el perfil
de inmunidad protectora desarrollada en
una infección natural.
Referencias Bibliográficas:
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58
VARIACIÓN DE LA RESPUESTA A UN ESTIMULO
DOLOROSO EN RATAS WISTAR CON ANSIEDAD
INDUCIDA BAJO UN ESTIMULO EXTERNO. Victor Manuel Duran Sainz
Rosa María Torres Hernández Rosa María Alvarez Santaman
Pedro Gutierrez Aguilar
Estudiante de Licenciatura Facultad de Medicina Veracruz Universidad Veracruzana
Marco teórico:
La ansiedad se define como un estado de
malestar caracterizado por intranquilidad,
expectación aprehensiva y aumento de la
vigilancia en ausencia de un estimulo
desencadenante; que se manifiesta también
reacciones autonómicas, como la
sudoración, taquicardia, alteraciones
gastrointestinales, tensión muscular e
insomnio, entre otras. Cuando un individuo
se enfrenta a una situación de peligro se
puede observar un conjunto de cambios
conductuales y vegetativos orientado a
contender de manera adecuada con dicha
situación. Entonces, la ansiedad puede
definirse como uno de los procesos
cerebrales directamente involucrados en la
sobrevivencia de diferentes especies
animales, especialmente de aquellas que por
su naturaleza son víctimas de los
depredadores. La definición más aceptada
de dolor la que indica que es una experiencia
subjetiva acompañada de componentes
sensoriales y emociones desagradables y que
frecuentemente está descrito en función de
la magnitud del daño con el que se asocia. El
término que involucra al conjunto de
mecanismos por los cuales el estímulo
nocivo periférico es transmitido al sistema
nervioso central (SNC) se denomina
nocicepción.3
Cuando un animal se enfrenta a un
depredador, con frecuencia se puede
observar que su primera reacción es escapar
para evitar que lo captures. Si no puede
escapar, entonces la respuesta
predominante es mantenerse inmóvil, esta
respuesta es directamente relacionada con la
naturaleza del estímulo adverso; cuando
éstos se enfrentan a un estímulo
perturbador localizado, como un electrodo o
una fuente de luz, despliegan un patrón
conductual especifico dirigido a ocultar este
estímulo. Esta conducta se conoce como
conducta defensiva de enterramiento, y
depende de la disponibilidad de material
59
para enterrarse.4. El tipo de respuestas
observada en los animales de laboratorio se
agrupan en tres categorías.A) Músculo-
esqueléticas; B) Autonómicas y C)
Conductuales (psíquicas) que incluyen:
agresividad, vocalización, forcejeo y escape.
Se considera que estas últimas son las más
útiles desde el punto de vista experimental y
se estima que representan una integración
central del estímulo original.5Teniendo en
cuenta la subjetividad del dolor y la similitud
de esta experiencia en la mayoría de los
seres dentro de la filogenia, los estudiosos
del dolor han tratado de determinar
parámetros comunes de evaluación, de ahí
que numerosas investigaciones se hayan
enfocado en el examen de las conductas
asociadas al dolor, las que se catalogan como
una serie de comportamientos con los que el
animal comunica a su ambiente que está
padeciendo una experiencia nociceptiva.En
consecuencia, dentro de los variados
modelos animales que existen para el
estudio del dolor, existen los que se basan en
la producción controlada de dolor por
medios químicos o mecánicos, precisando
determinadas características de la
estimulación nociceptiva, como intensidad,
localización, frecuencia, duración y se
evalúan las respuestas dadas a dicha
estimulación. Generalmente se analizan la
latencia de respuesta del retiro o de la huida
de la estimulación progresiva que inflinge el
daño; dicha latencia tiene una relación
inversamente proporcional a la intensidad de
la estimulación nociceptiva, también se
presentan conductas de huida, saltos o
ataque con el objetivo claro de disminuir las
fuentes del dolor.6Existen diversas razones
por las que resulta importante identificar la
ansiedad y la depresión: la ansiedad
disminuye el umbral y la tolerancia al dolor;
ambas se asocian con la magnificación de los
síntomas médicos; la depresión se acompaña
de pobre respuesta al tratamiento. Así
mismo, el malestar emocional se ha asociado
con la manifestación de síntomas físicos a
través de la activación autonómica del
estado de alerta o la exacerbación de los
síntomas existentes.7
Planteamiento del problema:
¿ Cual es la respuesta al estimulo doloroso
en la rata winstar en estado de ansiedad en
comparación del estado normal?
Objetivo General:
Determinar la respuesta al estimulo doloroso
en la rata winstar en estado de ansiedad en
comparación del estado normal
Metodología:
Se realizó un estudio transversal,
comparativo, experimental y prospectivo.
Con autorización del Comité de Ética e
Investigación de la Facultad de Medicina.
Criterios de inclusión ser ratas con peso
entre 150 a 300 mg (cuadro 1), que no hayan
recibido medicamentos en un lapso de una
semana mínimo. De los criterios de no
inclusión abarcara a ratas que estén
embarazadas, que no tengan algún miembro,
o que hayan recibido medicamentos en un
lapso de una semana.Se eligieron al azar las
ratas que formaron parte del grupo A (n =
10) y el grupo B (n = 10). Habiendo elegido al
grupo A se inició colocándolas
individualmente en un recipiente con agua
hasta una altura de 30 cm, a temperatura
ambiente, durante 10 minutos.
Posteriormente se les colocó una pinza de
60
caimán adecuada para el estudio en la base
de la cola y se registró la vocalización,
forcejeo y si intentaron o no escapar en un
estado basal, a los 10 y 20 minutos; se llevó a
cabo el procedimiento con la pinza de
caimán en las ratas del grupo B. Análisis
estadísticos: La significancia estadística se
determino mediante el análisis de las
variables ordinales con la prueba de χ2.
Resultados:
A la presencia de intento de escape de las
ratas del grupo A (100%) en comparación a
las del grupo B (30%) (p<0.01), La
vocalización en estado basal de las ratas del
grupo A fue predominantemente Alta (70%)
mientras que en el grupo B fue de intensidad
Media (70%)(NS). El forcejeo en el grupo A
tuvo un predomino de intensidad alta (70%)
y el grupo B (45%) (p<0.01).A los 10 minutos
después de repetir el estimulo la vocalización
de intensidad media en el grupo A el 70% el
grupo B el 90%(p<0.01); el forcejeo se vio
proporcionalmente equiparado con una
intensidad predominantemente media en el
grupo A con el 90% y el grupo B con 80%. A
los 20 minutos después del estimulo
doloroso, la vocalización media del grupo A
(70%) mientras que el grupo B (50%),
(p<0.01); el forcejeo en el grupo A fue
predominantemente de intensidad media
(90%) y en el grupo B de (60%), (p<0.01)
Discusión:
Los estudios de la Dra. Guadalupe Jiménez-
Velázquez y colaboradores5 donde su
población demostró tener un incremento de
la nocicepción mediante el registro por el
modelo PIFIR (del inglés “Pain-Induced
Functional Impairment Model in the Rat”);
estos a su vez descubrieron una relación
entre la ansiedad mesurada bajo el tiempo
que tarda el roedor con la “Conducta
defensiva de enterramiento” y la percepción
del dolor nociceptivo.Los datos recaudados
señalan que las ratas del grupo B poco a
poco fueron equiparando a las ratas del
grupo A con respecto a la vocalización y al
forcejeo, esto podría darse a interpretar al
dolor como propio mecanismo ansiogénico.
Conclusión:
Este estudio muestra que un aumento en la
ansiedad aumenta la percepción de la
nocicepción inducida tras un estimulo
doloroso, mostrando una relación entre
estos factores.
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62
MUTACIONES EN GENES ASOCIADOS A RESISTENCIA A
RIFAMPICINA Y ETAMBUTOL, EN CEPAS DE PACIENTES
CON TUBERCULOSIS DROGORRESISTENTE Betzaida Cuevas Córdoba
Roberto Zenteno Cuevas Aremy Cuellar Sánchez
Beatriz Buentello Volante
Estudiante de Doctorado Instituto de Salud Pública / Doctorado en Ciencias Biomédica Universidad
Veracruzana [email protected] [email protected]
Marco teórico:
La tuberculosis (TB) es una enfermedad
remergente causada por bacterias del
género Mycobacterium. De acuerdo a la
Organización Mundial de la Salud (OMS) en
2007 se reportaron 9.27 millones de casos
nuevos, 13.7 millones de casos prevalentes y
1.78 millones de defunciones1. Uno de los
factores que han dificultado el manejo y
control clínico de la TB a nivel mundial es la
drogorresistencia (TB-DR), la OMS estima
que el 20% de los casos de TB son resistentes
a un antibiótico y el 5.3% son resistentes a
isoniacida y rifampicina, es decir
multidrogorresistentes (TB-MDR)2.
Tradicionalmente, el diagnóstico
confirmatorio de la TB-DR requiere de 4 a 9
semanas, favoreciendo su dispersión al
permitir el contagio a los contactos del
paciente 3-5. En contraparte, el empleo de
nuevas técnicas en biología molecular,
permiten desarrollar novedosos métodos
diagnósticos de TB-DR, altamente sensibles
específicos y rápidos. El diagnóstico de
resistencia a Rifampicina es de suma
importancia debido a su fuerte asociación
con la resistencia a Isoniacida, por lo cual se
considera como marcador de TB-MDR3.
Por otro lado el Etambutol se recomienda
para tratar infecciones especialmente en
personas con VIH, Diabetes Mellitus, o
antecedentes de abandono o recaída6,7; la
probabilidad de resistencia a este fármaco es
más baja que otras drogas, por lo cual se
incluye en el tratamiento primario de países
con una tasa elevada de resistencia primaria
a otro fármaco de primera línea7. Es bien
sabido que los bacilos de Mycobacterium son
desarrollan resistencia mediante mutaciones
en genes específicos; aunque dichos
mecanismos moleculares están parcialmente
descritos, la resistencia a rifampicina (Rifr) y
etambutol (Etar), se ha asociado a
mutaciones en los genes rpoB y embB
respectivamente3,6. Sin embargo, el
porcentaje en que se presentan los tipos y
localizaciones de dichas mutaciones es
variable entre zonas geográficas.
63
Planteamiento del problema:
Veracruz es uno de los estados que presenta
más casos de TB-DR a nivel nacional. El
prolongado tiempo de espera para su
diagnóstico favorece la implementación de
tratamientos farmacológicos generalizados,
inespecíficos, poco efectivos y más costosos.
Con menor probabilidad de curación y mayor
riesgo de contagio, lo cual incrementa la DR
y hace de este un fuerte problema social,
económico y de salud. En contraposición, los
recientes avances tecnológicos del campo
molecular permiten la incorporación de
nuevas técnicas que proporcionan
información sobre las mutaciones que
explican la DR en las cepas de
Mycobacterium del estado; permitiendo el
desarrollo a mediano plazo de
procedimientos de diagnóstico molecular
específicos, sensibles y rápidos, así como
evaluar la utilidad, efectividad, validez y
seguridad local de emplear métodos
diagnósticos aprobados en otros países.
Objetivo General:
Realizar una caracterización genética de las
cepas DR de Mycobacterium tuberculosis
presentes en Veracruz, identificando
mediante secuenciación, la frecuencia de
mutaciones en regiones de genes rpoB y
embB, que ocasionan resistencia a
Rifampicina y Etambutol respectivamente;
en relación al contexto epidemiológico del
paciente.
Metodología:
Estudio observacional en el cual se
recolectaron 114 aislados TB-DR entre los
años 2007-2010 provenientes del
Laboratorio Estatal de Salud Pública del
Estado de Veracruz (LESP), de los cuales 88
fueron aptos para realizar el estudio. A partir
de los bacilos se realizó: extracción de ADN,
amplificación por Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) los genes; rpoB (266pb) y
embB (260pb), secuenciación por
electroforesis capilar (Applied Biosystems
3500) y análisis de mutaciones (Sequencing
Analysis y SeqScape) A nivel molecular se
identificó: codón de mutación, tipo de
cambio de base y tipo de mutación.
Mediante el resumen clínico y el reporte de
perfil de farmacorresistencia proporcionado
por el LESP se obtuvieron datos
epidemiológicos del paciente portador del
bacilo como: resistencia a fármacos, edad,
sexo, comorbilidad, toxicomanías, tiempo de
evolución de de TB y tipo de tratamiento.
Finalmente se realizaron análisis estadísticos
de asociación entre las mutaciones presentes
en el genoma del bacilo y las variables
epidemiológicas del paciente portador de
TB-DR.
Resultados:
Se analizaron 88 cepas del mismo número de
pacientes, la media de edad fue de 45 años
(±15) con rango de 15 a 87años. En cuanto al
género, el 66% fueron hombres y el 34%
mujeres, con una razón de masculinidad de
H:M 1.96:1. Respecto a la drogorresistencia
el 68.1% (60) fueron Rifr y 58% (51) Etar.
Para el análisis de cepas Rifr se secuenciaron
60 fragmentos de 266pb del gen rpoB (codón
478-564), incluyendo la región reportada
como portadora del mayor número de
mutaciones asociadas a resistencia a
Rifampicina (codón 507 al 533). En el 10% de
los aislados no se encontraron cambios de
64
base en el fragmento analizado; sin
embargo, el 90% presentaron mutaciones no
sinónimas en 4 codones (516, 522, 526, 531),
las cuales se explican por 10 cambios de
base. La mutación encontrada con mayor
frecuencia fue en el codón 531 (70%), con un
cambio de base en el nucleótido 163 de
C→;T ó G, cambiando de aminoácido de Ser
a Leu ó Trp.
Se realizó análisis estadístico de X2 y Test
exacto de Fisher para buscar asociación
entre la mutación S531L,W del gen rpoB
respecto a las otras variables. Se encontró
asociación con alta significancia estadística
(p=0.01) entre dicha mutación y la
resistencia a Estreptomicina, la cual
posiblemente se explique por la relación en
el mecanismo de acción de ambos fármacos.
A cerca de las cepas Etar, se secuenciaron 51
fragmentos de 260pb del gen embB (codón
264-349), incluyendo al codón 306 que es
donde se reporta el mayor número de
mutaciones asociadas a resistencia a
Etambutol, encontrando que en más del 60%
no se identificaron mutaciones en el
fragmento analizado. Por otro lado, el 40%
de las cepas analizadas presentaron
mutaciones no sinónimas ubicadas en 3
codones (306, 328, 330), las cuales se
explican por 6 cambios de base. La mutación
encontrada con mayor frecuencia fue en el
codón 306 (31.4%), con cambios de base en
los nucleótidos 128 de A→; G, o 130 de
G→;C,A ó T, ocasionando el cambio de Met a
Val o Iso. Tras el análisis estadístico de X2 y
Test exacto de Fisher se observó que todas
las cepas que presentaron mutación M306V,I
en gen embB fueron resistentes >3 fármacos
y ninguna cepa monorresistente o
birresistente presentó dicha mutación,
encontrando asociación con alta significancia
estadística (p=0.01) entre esta mutación y la
mulltirresistencia, específicamente con la
resistencia a Isoniacida (p=0.37). Pese a
realizar análisis de asociación de las
mutaciones rpoB 531 y embB 306 con
variables como: sexo, jurisdicción de
residencia, diabetes, alcoholismo,
drogadicción y tipo de tratamiento, no se
encontró significancia estadística en ningún
caso.
Discusión:
Un alto porcentaje de cepas presentaron
mutaciones en la región caliente del gen
rpoB (90%), lo cual concuerda con lo
reportado en otros países6,8-11; sin
embargo, 6 cepas no presentaron
mutaciones del codón 478 al 564, lo cual tal
vez sugiere otro mecanismo de resistencia
para este fármaco. Según los resultados
obtenidos, una prueba de diagnóstico
molecular con una sensibilidad del 95%
requeriría el diseño de 10 sondas distintas, lo
cual incrementaría su costo. Por otro lado, la
utilización de la prueba comercial INNO-LiPA
Rif TB, incluye sondas para las mutaciones:
D516V,H526D,Y y S531L12; considerando los
resultados de este estudio hubiera generado
una sensibilidad máxima de 75% o menor en
función de los cambios de nucleótidos que
originaron el cambio de aminoácido,
generando un alto porcentaje de falsos
negativos.
Este hecho resalta la importancia de
describir las mutaciones presentes en una
región antes de implementar un sistema de
diagnóstico. Respecto a la resistencia a
Etambutol, la mutación del codón 306 se
observó en el 31.4%, a diferencia de lo
65
reportado en otros países como Moroco en
Sudáfrica con un 42.3%13 ó China en donde
esta mutación se presentó en el 62.2% de las
cepas14,; lo cual refleja que la región
secuenciada está poco conservada en
Veracruz, abriendo la pauta para extender la
búsqueda de mutaciones buscar río arriba o
en otros genes asociados al operón como
embA y embC, con la finalidad de
incrementar la sensibilidad y especificidad de
futuras pruebas moleculares para el
diagnóstico de resistencia a dicho fármaco.
En este sentido, la mutación en el codón 306
de embB parece ser por sí sola, un posible
marcador de resistencia a múltiples
fármacos, lo cual concuerda con lo reportado
por otros autores que sugieren que
mutaciones en dicho codón parecer proveer
a la cepa de ventajas para desarrollar
resistencia ante Isoniacida y Rifampicina,
siendo más común que desarrollen
multidrogorresistencia y drogorresistencia
extrema15., o como sugieren otros autores
podría incrementar la habilidad de la cepa
para la transmisión entre sujetos16.
Conclusión:
El porcentaje de mutaciones identificadas en
los aislamientos para rpoB y embB fue
menor a lo reportado por otros países (531
rpoB=40-75%, y 306 embB=40-60%),
evidenciando la necesidad de realizar este
tipo de estudios para el diseño de
herramientas de diagnóstico molecular de
TB-DR altamente sensibles y específicas. Así
mismo, los resultados encontrados abren la
posibilidad de utilizar la mutación embB 306
como marcador de MDR, en cepas de TB de
Veracruz.
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PACIENTES CON ESOFAGITIS EOSINOFÍLICA, ESOFAGITIS
EROSIVA, ENFERMEDAD POR REFLUJO NO EROSIVO Y
CONTROLES ASINTOMÁTICO. UN ESTUDIO EN
PACIENTES MEXICANOS. Eli De la Cruz Patiño
Maura Torres Aguilera : Peter Gruber Pagola
Isabel Ruíz Juarez Federico Roesch Dietlen
José María Remes Troche
Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana Instituto de Investigaciones Medico
Biológicas [email protected] [email protected]
Marco teórico:
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del incremento de una entidad denominada
Esofagitis eosinofilica (EEo), la cual se
caracteriza por que en población adulta
afecta a hombres de raza blanca y que
frecuentemente sufren de disfagia y/o
pirosis refractaria. El diagnóstico de esta
entidad se basa en un incremento en el
recuento de eosinófilos que infiltran la
mucosa esofágica ( >20 eosinofilos por
campo de alto poder). Sin embargo, otras
condiciones como la Enfermedad por Reflujo
Gastroesofágico (ERGE) también puede
producir un incremento en el número de
eosinófilos en la mucosa esofágica, aunque
el punto de corte en esta condición no está
bien definido, e incluso en algunas
poblaciones se sugiere añadir otros
parámetros (hallazgos anatomo patológicos
característicos: formación micro abscesos de
eosinófilos y capas superficiales de
eosinófilos frecuentemente asociados a
zonas desprendimiento de zonas de necrosis
de células escamosas) para establecer el
diagnostico de EEo, esto debido a un amplio
margen de concentración de eosinófilos en
las diferentes poblaciones estudiadas . La
EEo se ha asociado antecedentes de atopia,
sin embargo la fisiopatología aun es
desconocida.
Planteamiento del problema:
La EEo es un padecimiento emergente,
ocasiona altos costos a los sujetos
68
afectados, ya que los síntomas no son
específicos por lo que habitualmente suele
hacerse el diagnostico con ERGE refractario,
la EEo es una de las causas principales de
disfagia, y pirosis, ocasionando un impacto
elevado en la calidad de vida. La población
mexicana esta frecuentemente expuesta a
enfermedades parasitarias, que ocasionan
un incremento en el número de eosinófilos a
nivel sanguíneo, y es probable que este
antecedente sea un factor que ocasione un
aumento en la concentración de eosinófilos
en la mucosa del tracto digestivo. Se ignora
si el conteo de eosinófilos en la mucosa
esofágica en nuestro medio es similar a lo
reportado en otras poblaciones.
Objetivo General:
evaluar de forma prospectiva el número de
eosinófilos (a gran aumento) presentes en la
mucosa esofágica de pacientes con EEo,
Esofagitis Erosiva, Enfermedad por Reflujo
No Erosiva (ERNE) y en un grupo de sujetos
considerados como controles asintomáticos
Metodología:
Se trata de un estudio observacional,
transversal, analítico, cegado simple, donde
se incluyeron sujetos adultos de forma
consecutiva que, previo consentimiento
informado, y evaluación clínica inicial, fueron
sometidos a endoscopia gastrointestinal alta,
en el periodo comprendido del entre Agosto
2008 y Diciembre de 2009, a los cuales se
les realizo toma de biopsia de la mucosa
esofágica de todos los sujetos de estudio (8
fragmentos, 4 de esófago proximal y 4 de la
porción distal del esófago), las cuales fueron
posteriormente procesados de forma
convencional y teñidos con hematoxilina
eosina. Según los datos clínicos,
endoscópicos y anatomo-patológicos se
clasificaron a los sujetos en los siguientes
grupos: GRUPO A (GA), sujetos con síntomas
de ERGE 3 veces por semana y Esófago
normal endoscópicamente (ERNE); GRUPO B
(GB), sujetos con síntomas de ERGE 3 veces
por semana y Esofagitis Erosiva grado A-o B
de los Ángeles; GRUPO C (GC), sujetos sin
síntomas de ERGE y Esófago
endoscópicamente normal (Controles
Sanos); GRUPO D: Diagnóstico definido de
EEo (sintomatología asociada a >20
Eosinófilos en campo de alto poder, sin
respuesta a terapia anti secretora. Las
biopsias fueron analizadas por un patólogo
gastrointestinal cegado. Se realizó el conteo
de eosinofilos que infiltraron la mucosa
esofágica en 10 campos de alto poder (40x) y
se realizo el análisis mediante estadística
descriptiva.
Resultados:
Se incluyeron 124 sujetos en el grupo con
ERNE, 35 con Esofagitis Erosiva , 16 controles
y 6 casos de EEo. No hubo diferencias en
cuanto al genero y la edad en los grupos A, B
y C, pero los pacientes con EEo fueron
mayores ( p<0.05). En el Grupo A con 124
sujetos (70 femenino), edad promedio 44.8
(13 - 40), presento un media de numero de
eosinófilos en el esófago próxima de 0 (0-0)
y en el distal de 3.5 (2-5); en el Grupo B se
incluyeron a 35 sujetos (14 femenino), con
edad media 49.6 (26-58) con una media de
eosinófilos en esófago proximal de 0 (0-0), y
5 (3-7) en el distal; En el Grupo C se
incluyeron 16 sujetos (5 femenino) edad
media 49.2, con 0 (0-0) eosinófilos en la
porción distal y 0 (0-0) en la distal; en el
69
Grupo D se incluyeron 6 sujetos (1 femenino)
edad media 60.25, con un conteo de
eosinófilos de 18 (18-22) en la porción
proximal y de 25 (20-37) en la porción distal
Discusión:
En nuestro estudio cabe destacar la ausencia
de infiltración eosinófilica en el área próxima
del esófago tanto en el grupo control,
sujetos con ERNE y ERGE erosivo (Grupos A,
B y C), en contraste con los sujetos con EEo
donde la concentración media de eosinófilos
en la porción proximal fue elevada y muy
similar al conteo de eosinófilos de la
porción distal del esófago, este hallazgo es
similar a lo encontrado en otros países,
donde incluso han protocolizado las toma de
biopsias de esófago a diferentes niveles para
evitar falsos positivos. Si bien en porción
distal del esófago del grupo con ERNE y con
ERGE erosiva hubo infiltración eosinófilica,
los rangos se mantuvieron
considerablemente inferiores de los rangos
de sujetos con EEo, diversos estudios
realizados en otras poblaciones han
demostrado que la terapia anti secretora
reduce el conteo de eosinófilos en estos
sujetos. Cabe destacar que en sujetos sin
sintomatología (grupo control) no hubo
infiltración de eosinófilos en ninguna sección
del esófago.
Conclusión:
Este estudio demuestra que normalmente en
población mexicana no debe de existir
infiltración por eosinofilos en la mucosa
esofágica. En las variantes de la ERGE, puede
existir infiltración esoinofilica de bajo grado.
La existencia de infiltración esosinófilica
tanto en sujetos con ERGE erosivo como
ERNE se localiza solo en porción distal del
esófago, la cual se encuentra en contacto
directo con el agresor (reflujo acido y/o no
acido) responsable de la lesión hística a la
mucosa que conlleva a la infiltración y
reacción inmunológica secundaria local y
circunscrita. El promedio de conteo de
eosinófilos en la mucosa esofágica de los
pacientes con EEo mexicanos, es menor que
lo reportado en otras poblaciones.
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72
EFECTO DEL EXTRACTO POLAR DE MOUSSONIA
DEPPEANA SOBRE LA PROLIFERACIÓN Y LA VIABILIDAD
DE LA LÍNEA CELULAR DE CÁNCER DE PRÓSTATA
LNCAP. : Cynthia Fernández Pomares
. Miguel Ángel Domínguez Ortiz . Enrique Juárez Aguilar
. Omar Muñoz Muñiz Myriam Bravo Ávila
María Elena Hernández Aguilar
Estudiante de DoctoradoUniversidad Veracruzana Dependencia: Instituto de Neuroetología
[email protected] [email protected]
Marco teórico:
El cáncer es una de las causas más
importantes de morbilidad y mortalidad
alrededor del mundo.1 En el 2008 la
neoplasias malignas fueron la tercera causa
de muerte entre la población mexicana,
siendo el carcinoma prostático la neoplasia
con mayor incidencia en los hombres2. Esta
enfermedad se desarrolla debido a
alteraciones en los genes responsables del
control del ciclo celular, en consecuencia, las
células cancerosas proliferan
descontroladamente e invaden otros
órganos del cuerpo.3. La incidencia del
cáncer está fuertemente relacionada con el
estilo de vida y alimentación de cada país.
Datos epidemiológicos muestran que
individuos que migran a otro país, tienen la
misma incidencia de cáncer que los
habitantes originarios del país al que
emigró;4. Dato sumamente importante que
sugiere que el ambiente es un factor más
determinante en el desarrollo del cáncer que
el mismo fondo genético del individuo.5.
Además, estos estudios también indican que
poblaciones que poseen una alimentación
rica en frutas y vegetales tienen una menor
incidencia de cáncer.6
Planteamiento del problema:
A pesar de todos los avances en la
investigación sobre el cáncer, actualmente
no se cuenta con un tratamiento cien por
ciento efectivo, es por ello que se ha
encontrado en la fitoterapia una alternativa
prometedora para combatir este mal, puesto
que existen compuestos fitoquímicos
capaces de prevenir y combatir el cáncer,
tales como el licopeno del tomate, el
resveratrol de la uva, la quercetina de la
guayaba y la curcumina de la cúrcuma.7 Con
fundamento en lo anterior, el presente
73
estudio evaluó el efecto del extracto de
Moussonia deppeana sobre la proliferación y
la viabilidad de la línea celular de cáncer de
próstata LNCaP.
Objetivo General:
Evaluar el efecto del extracto polar de
Moussonia deppeana (H2O/EtOHMd) sobre
la línea celular de carcinoma prostático
LNCaP.
Metodologia:
Obtención del extracto. La planta M.
deppeana fue recolectada en el mes de
noviembre en el Municipio de Coatepec,
Veracruz. El extracto polar se obtuvo
mediante maceración de 300 g de la parte
aérea de la planta (hojas y tallos) en una
mezcla de etanol: agua 1:1 v/v.Análisis
Fitoquímico. La identificación cualitativa de
los metabolitos presentes en el extracto se
realizó mediante cromatografía en capa fina,
utilizando como agentes reveladores luz UV,
CoCl2, FeCl3 (para flavonoides), ácido
perclórico (para esteroles) y solución de
Dragendorff (Bi(NO3)3/KI/CH3COOHpara
alcaloides). Además, se realizó un análisis en
Resonancia Magnética Nuclear de protón (H1
RMN) para la identificación la naturaleza
química de los compuestos presentes en el
extracto.Determinación de la capacidad
antioxidante. La capacidad antioxidante del
extracto se determinó por el método de
DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracilo) (Brand-
Williams modificado por Miliauskas, 2004). El
DPPH es un radical libre que es estabilizado
por los antioxidantes presentes en el
extracto. La reacción es evaluada mediante
el espectro visible donde se aprecia una
disminución en la absorbancia (517 nm)
proporcional a la reducción del DPPH.
Contenido total de polifenoles. Se determinó
el contenido total de polifenoles utilizando el
reactivo de Folin-Ciocalteu. Las sales de
molibdeno y tungsteno presentes en el
reactivo son reducidas por los antioxidantes
del extracto formando óxidos de molibdeno
y tungsteno de color azul intenso. La
absorbancia obtenida en el
espectrofotómetro a 765 nm es
directamente proporcional al contenido de
polifenoles, el cual es reportado como
miligramos de ácido gálico por gramo de
peso del extracto seco (mg GAE/g dw).
Determinación del poder reductor. El poder
reductor se evaluó mediante el método de
Oyaizu, 1986.8. La capacidad antioxidante es
determinada por la reducción del ión Fe+3 a
Fe+2, reacción colorimétrica que es
cuantificable en el espectrofotómetro a 700
nm. Cultivo de la línea celular LNCaP. La línea
celular de carcinoma prostático de humano,
derivada de metástasis del nodo linfático
supraclavicular, fue mantenida en medio
RPMI suplementado con suero fetal bovino
al 8%, a 37º C en atmósfera de CO2 al 5%. Es
productora de fosfatasa ácida prostática
humana y de antígeno prostático específico.
Posee receptores a andrógenos y
estrógenos.Ensayos de Proliferación celular.
Las células fueron sembradas en cajas de 96
pozos a una densidad de 5022 cel/pozo,
incubándose por 48 horas en las condiciones
anteriormente descritas. Posteriormente las
células fueron tratadas con diferentes
concentraciones del extracto H2O/EtOHMd
(62.5, 125, 187.5, 250, 500 y 1000 µg/ml)
utilizando como vehículo DMSO (Dimetil
sulfóxido) a un volumen final del 0.25%.
Finalmente la proliferación de las células fue
74
evaluada a diferentes tiempos de incubación
con el extracto (24, 48, 72 y 96 hrs) por el
ensayo de Metil tiazol tetrazolium (MTT)
descrito por Mossman, 1983.9 Brevemente,
los cultivos son incubados con MTT (5
mg/ml) por 4 hrs a 37oC y 5% de CO2,
finalmente los cristales de formazán
obtenidos son disueltos con DMSO y la
absorbancia de dicha solución es
cuantificada en un lector de ELISA a 570 nm.
Para diferenciar el efecto antiproliferativo de
un posible efecto citotóxico en este ensayo,
se determinó la viabilidad de los cultivos
tratados mediante la tinción con azul de
tripano y el conteo directo en cámara de
Neubauer.Ensayo de citotoxicidad. Las
células fueron sembradas a una densidad de
10000 cel/ pozo en una placa de 96 pozos y
se incubaron 72 hrs a 37º C y 5% de CO2.
Una vez que el cultivo alcanzó la confluencia,
se aplicó el extracto H2O/EtOHMd a
diferentes concentraciones (62.5, 125,
187.5, 250, 500 y 1000 µg/ml). La viabilidad
celular fue evaluada a las 48 hrs post-
tratamiento mediante el ensayo de MTT.
Finalmente se determinó la concentración
inhibitoria (IC50).Análisis estadístico. Los
datos de los ensayos de proliferación y
citotoxicidad se analizaron con un ANOVA de
dos vías con ranqueo de datos y prueba post-
hoc de Tukey en el programa JMP 6, los
resultados se expresan como el porcentaje
promedio de proliferación o viabilidad,
respectivamente, en relación con el valor
más alto obtenido por el control en el
tiempo. La determinación de la IC50 se
realiza con un ajuste no linear en el
programa Sigma Plot 10.0. Cada ensayo se
realizó por triplicado.
Resultados:
Las pruebas cualitativas para la identificación
de metabolitos revelaron la presencia de
alcaloides, esteroles y polifenoles en el
extracto polar de M. deppeana. La
resonancia magnética nuclear (1H RMN)
muestra señales en la región de 6.5 a 8 ppm,
lo que sugiere la existencia de compuestos
de tipo aromático. El extracto también
mostró adecuados niveles de activad
antioxidante y poder reductor, además de un
alto contenido de polifenoles. Por otra parte,
las células tratadas con EH2O/EtOHMd a las
concentraciones de 250, 500 y 1000 µg/ml
tuvieron un porcentaje de proliferación
menor al alcanzado por el cultivo sin
tratamiento a las 48, 72 y 96 hrs (F(6,83)=
101.15, P < 0.05, r2= 0.96). Sin embargo, la
observación microscópica reveló una
diferencia en la densidad y morfología de los
cultivos tratados con el extracto a las
concentraciones de 500 y 1000 µg/ml, donde
se aprecia a las células redondeadas y con
núcleo picnótico, lo cual indica que el
extracto polar tiene un efecto citotóxico a
esas dosis. Por otro lado, las células tratadas
con dosis menores (62.5 a 250 µg/ml) no
muestran diferencia morfológica aparente
respecto al cultivo sin tratamiento, sin
embargo se puede apreciar una disminución
en la densidad celular dependiente de la
dosis y del tiempo de tratamiento. Para
corroborar los resultados se evaluó el
porcentaje de viabilidad celular por tinción
con azul de tripano durante el ensayo de
proliferación celular, donde se aprecia una
disminución en el porcentaje de viabilidad de
las células tratadas solo con las dosis más
altas del extracto. En el ensayo de
citotoxicidad se apreció una disminución en
el porcentaje de viabilidad de los cultivos
tratados con el extracto respecto a las
75
células sin tratamiento de forma dosis
dependiente, donde la dosis inhibitoria del
50% de la población (IC50) fue de 222.667
µg/ml. El análisis microscópico muestra
diferencias morfológicas sólo en los cultivos
tratados con dosis de 500 y 1000 µg/ml.
Discusión:
El extracto polar de M. deppeana posee
actividad antiproliferativa y citotóxica sobre
la línea celular LNCaP, efectos que son
dependientes de la dosis y del tiempo de
tratamiento. El análisis fitoquímico del
extracto y los ensayos de actividad
antioxidante, revelan la presencia de
compuestos polifenólicos, los cuales pueden
ser responsables de los efectos del extracto
sobre la vida y el crecimiento del cultivo,
esto de acuerdo a lo reportado con otros
compuestos de esta misma naturaleza,
mismos que podrían actuar a nivel molecular
regulando la expresión de los genes
implicados en estos procesos.(10-12)
Conclusión:
Estos resultados nos sugieren un gran
potencial del extracto de M. deppeana como
agente anticancerígeno, por lo cual es de
suma importancia evaluar el potencial
antiproliferativo de este extracto sobre otras
líneas celulares, caracterizar el tipo de
muerte celular, los mecanismos moleculares
y los compuestos químicos por medio de los
cuales ejerce su efecto antineoplásico.
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76
.EFECTOS BIOCLÍNICOS DE LA OBESIDAD Y LA INDUCCIÓN
DE LA DIABETES EN LA RATA WISTAR HEMBRA Areli Olazo Marinero
José Arnold González-Garrido Octavio Maldonado-Saavedra
Aracely López-Monteon Guillermo Manuel Ceballos-Reyes
Enrique Méndez-Bolaina
Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana Facultad de Ciencias Químicas
(Orizaba, Veracruz) [email protected] [email protected]
Marco teórico:
La obesidad es la enfermedad nutricional
más prevalente en los países industrializados
y está experimentando un incremento
significativo en los países en vías de
desarrollo. Numerosos estudios
epidemiológicos evidencian que la esperanza
de vida en los obesos es reducida y su
morbilidad es elevada, siendo un problema
de Salud Pública. Además de ser un factor de
riesgo para desarrollar diabetes mellitus 2
(DM2), hipertensión arterial y otras
enfermedades crónicas.1El Índice de Masa
Corporal (IMC) es el resultado de dividir el
peso en kilogramos por el cuadrado de la
talla en metros (kg/m2), es una indicación
simple de la relación entre el peso y la talla,
se utiliza frecuentemente para identificar
sobrepeso y obesidad.2,3La Organización
Mundial de la Salud (OMS) define el
sobrepeso como un IMC>25 kg/m2, y la
obesidad como un IMC>30 kg/m2. Según la
norma oficial mexicana (NOM-043-SSA2-
2005) la obesidad es la enfermedad
caracterizada por el exceso de tejido adiposo
en el organismo.3,4Enfermedades
relacionadas con la obesidad Complicaciones
respiratorias, hepatobiliares, del aparato
locomotor, enfermedades cardiovasculares,
cáncer, DM2 y síndrome metabólico,
etc.4,5,6La DM es un de trastorno
metabólico, que afecta a diferentes órganos
y tejidos, se caracteriza por hiperglicemia. La
diabetes es una enfermedad crónica que
aparece cuando el páncreas no produce
insulina suficiente o cuando el organismo no
utiliza eficazmente la insulina que
produce.7,8,9Clasificación de la diabetes
según la OMSDM1, DM2 y Diabetes
gestacional.8La DM2 representa el 90% de
los casos mundiales y se debe en gran
medida a un peso corporal excesivo, a la
inactividad física, entre otras.8,9Órgano
importante para el metabolismo de los
carbohidratos
77
El hígado, es la mayor víscera del ser
humano. Pesa aproximadamente 1.5 kg, es
de color rojo-oscuro, situado en la parte
superior derecha de la cavidad abdominal,
justo debajo del diafragma. Ayuda en el
metabolismo de los carbohidratos, lípidos y
triglicéridos.10,11La forma de diagnosticar
esta enfermedad, es a través de los signos y
síntomas, aunque, en ocasiones es
asintomática, por lo que para confirmar o
descartar su presencia se han desarrollado
pruebas del tipo estímulo-respuesta,11 como
la prueba de tolerancia a la glucosa.12,13
Planteamiento del problema:
La diabetes espontánea entre los animales es
relativamente común. El primer caso fue
descrito en 1851 en un primate. En la
mayoría de los roedores, la diabetes es de
origen genético y se acompaña de
obesidad.14,15Características generales de
la rata Wistar. Esta caracterizada anatómica,
fisiológica y genéticamente, se reproduce
fácilmente, son animales muy adaptables,
fáciles de cuidar y manejar. Es posible
producirlas libres de gérmenes y
enfermedades, , con lo cual se reduce la
principal variable no controlada.16Efectos de
la dieta La abundancia calórica parece
facilitar el desarrollo de la obesidad y la
diabetes en los seres humanos. En algunos
roedores también se ha demostrado que los
factores ambientales contribuyen a la
presentación de este síndrome.17,18
Diabetes inducida La inducción de la diabetes
se ha logrado por diversos medios. En 1889,
Von Mering y Minkowski produjeron
diabetes experimental en perros mediante la
remoción quirúrgica del páncreas.Existen
diferentes modelos que van desde la
pancreatomía hasta la utilización de
productos químicos.19,20,21 La
estreptozotocina (STZ) (2-desoxi-2-
([metil(nitroso)amino]carbonilamino)- β;-D-
glucopiranosa, sintetizada por la
Streptomycetes achromogenes, utilizada
para inducir la DM1 como la 2, según el
momento de la inyección, la dosis empleada
y frecuencia de inyección.22,23
Objetivo General:
Analizar los efectos de la obesidad y la inducción
de la diabetes en los valores de glucosa,
colesterol y triglicéridos en rata Wistar hembra.
Metodologia:
Para el desarrollo de este trabajo se
utilizaron ratas Wistar hembra, con un peso
de 200 a 220 g, divididas en 3 grupos (n=5):•
Grupo control, las cuales se
mantuvieron con alimento normal y acceso
libre a agua. • Grupo de ratas obesas, a las
cuales se les mantuvo con alimento
hipercalórico y acceso libre a agua.•
Grupo diabético (ratas obesas y/o
diabéticas), las cuales recibieron STZ, vía ip,
(65 mg/kg de peso/0.5 mL de citrato de
sodio-pH 4.5) para alcanzar una
concentración de glucosa en plasma de 14
mmol/L o mayor.El valor de glucosa se
obtuvo utilizando un glucómetro digital
Bayer Health Care™, mediante punción en la
pata de la rata, la muestra de sangre se
colocó en la tira reactiva (biosensor de
glucosa oxidasa), los valores fueron
reportados en mg/dL. Para determinar los
niveles séricos de colesterol y triglicéridos se
realizo una punción cardiaca, las muestras
fueron analizadas en el Laboratorio de
Análisis Clínicos-FCQ-UV. Los datos se
78
presentaron como la media±de. Para la
expresión gráfica y el análisis estadístico de
resultados se utilizaron los programas Prism
3.02 e InStat 3.05, respectivamente; y una
ANOVA para establecer diferencias significativas
(p<0.05).
Resultados:
Al comparar los pesos de las ratas en
diferentes tiempos: inicial, intermedio y final,
los efectos más significativos fueron a partir
de las ratas obesas intermedias (210.4±8.6)
vs. control (203±9.2) (p<0.001), al comparar
a las ratas obesas diabéticas intermedias
(209±6.6) vs. control (203±9.2) (p<0.001), al
comparar a las obesas finales (229.7±6.6) vs.
control (223.7±10) (p<0.001), comparando
también las obesas finales (229.7±6.6) contra
las obesas diabéticas finales (190±14)
(p<0.05). Aunque se observo disminuido el
peso en las obesas diabéticas debido a los
efectos de la diabetes por la STZ, al
compararla vs. control (223.7±10) (p<0.001).
En los resultados obtenidos para el valor de
glucosa se observaron cambios significativos
partir de las muestras intermedias, al
comparar las ratas obesas intermedias
(129.8±2) vs. control (56±1) y contra las
obesas diabéticas intermedias (199.6±4.7)
(p<0.001), al comparar al grupo obeso final
(143.2±2.8) vs. control (56±0.8) y vs. grupo
obeso diabético final (251±39.4)
(p<0.001).En el nivel de colesterol en sangre
los cambios se observaron en la semana 8
comparando las ratas obesas (98.2±2.3) vs.
control (97.8±1.6) (p>0.05, no significativa),
pero al comparar las ratas obesas diabéticas
finales (103.6±3) vs. control (97.8±0.8)
(p<0.05).Para los niveles de triglicéridos
observamos cambios significativos
comparando las obesas intermedias
(71.4±3.6) vs. control (36.2±1.9) (p<0.001),
comparando obesas diabéticas intermedias
(79.4±2.3) vs. control (36.2±1.9) (p<0.001). Al
comparar a las obesas finales (77±2.7) vs.
obesas diabéticas finales (82±1.2) y vs.
control (37.2±2.3) (p<0.001). Al comparar las
dimensiones del hígado de las ratas obesas
diabéticas finales (5.9±0.3) vs. control
(5.1±0.4) (p<0.01), comparando obesas
finales (8.7±0.4) vs. control (7.4±1) (p<0.01),
al comparar las obesas diabéticas finales
(9.4±0.06) vs. control (7.4±1) (p<0.01), para
el tamaño y peso del páncreas no se
observaron diferencias significativas
(p>0.05).
Discusión:
El presente modelo fue diseñado para
observar los efectos de la diabetes inducida
por STZ y para encontrar una asociación
entre la reducción del peso de los animales,
el peso relativo del hígado y el páncreas en
ratas Wistar hembra. En este estudio, se
utilizó STZ en una dosis de 65 mg/kg.26 Esta
reportada la utilización de 90 mg/kg por vía
ip en ratas. Los niveles de glucosa, colesterol
y triglicéridos en sangre, tanto el peso
corporal, así como las mediciones al hígado y
páncreas se registraron para poder observar
los efectos, el cual demostró que la STZ fue
eficaz para producir hiperglucemia
grave.25,19,30En los animales tratados con
STZ se observó la pérdida de peso debido a
los efectos deletéreos de STZ que causa la
alquilación del ADN y produce
hiperglucemia.26,31El hígado de los
animales tratados con STZ, se observo un
aumento en su peso(hipertrofia) cuando los
animales del grupo obeso diabético fueron
comparados vs. control, a pesar de que el
79
peso de todos los animales del grupo tratado
con STZ se observó disminuido.
Probablemente debido a la acumulación de
triglicéridos que conducen al agrandamiento
del hígado debido a la afluencia cada vez
mayor de ácidos grasos en el hígado inducida
por hipoinsulinemia, así como la obesidad y
la baja capacidad de excreción de
lipoproteínas del hígado como resultado de
una deficiencia de síntesis de la
apolipoproteína B.27,28,31El peso del
páncreas en el grupo obeso diabético no
mostró ningún cambio respecto al
tratamiento con STZ. La disminución en el
peso corporal y la tendencia a la disminución
de peso del páncreas podría atribuirse a la
alteración y desaparición de los islotes
pancreáticos y la destrucción selectiva de las
células productoras de insulina.25,29Se
puede concluir que la STZ a través de su
acción directa alquilante puede causar
necrosis celular y la destrucción selectiva de
las células beta pancreáticas causando
hiperglucemia, en una dosis de 65 mg/kg.
Además, la producción de la diabetes por STZ
y la hipoinsulinemia causan cambios en el
peso corporal de los animales obesos
diabéticos. También se puede concluir que la
reducción en el peso corporal se asoció con
aumento del peso relativo del hígado aunque
el peso del páncreas no fue afectado, se
observó una tendencia a la disminución en el
peso y tamaño de este último.
Conclusión:
Se evidenció que existe una relación entre la
dosis de STZ y la inducción de diabetes
estable en ratas. Los parámetros evaluados
demostraron una alteración dependiente
tanto de la STZ, como del peso corporal de
cada uno de los modelos, se vieron afectados
algunos órganos por la selectividad de la STZ.
Finalmente, se concluyó que empleando una
dosis de 65 mg/kg de STZ en ratas Wistar
hembra obesas, se indujo en los animales
diabetes que afecto de forma significativa los
órganos internos importantes en el
metabolismo (hígado y páncreas) y los
niveles séricos de triglicéridos, colesterol y
glucosa, por lo que podría ser empleado
como herramienta para evaluar el efecto de
la obesidad y la DM2.
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82
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS Y VECTORES
DE TRYPANOSOMA CRUZI DEL ESTADO DE VERACRUZ. Jesús Torres Montero Daniel Guzmán Gómez
Aracely López Monteon Eric Dumonteil
Angel Ramos Ligonio
Estudiante de Doctorado Centro De Investigaciones Biomédicas Universidad Veracruzana [email protected]
Marco teórico:
La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis
Americana es una enfermedad infecciosa
que se encuentra ampliamente diseminada y
es considerada como un problema
importante de salud pública que afecta a
toda América Latina 1. De 16-18 millones de
individuos son infectados por T. cruzi en
América Central y Sudamérica 2.El agente
causal de la enfermedad es el protozoario
hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi),
y su principal mecanismo de transmisión es
el vectorial, por insectos de la familia
Reduviidae, siendo el principal género
Triatoma. La prevalencia de esta enfermedad
se relaciona con el subdesarrollo y la
pobreza. Conocer si los vectores contienen al
parásito, indica el riesgo en el que la
población está expuesta de padecer la
infección por T. cruzi por habitar en zonas
endémicas en convivencia con el agente
vector. Con el apoyo de la biología molecular
se ha logrado diagnosticar y clasificar a T.
cruzi en líneas filogenéticas, incluyendo
distintos linajes 3, 4. De la misma manera la
identificación taxonómica en el vector
utilizando el análisis de espaciadores del
transcrito interno (ITS) del DNA ribosomal
(DNAr), donde los ITS-1 diferencia complejos
y los ITS-2 diferencía especies 5. La
identificación taxonómica del vector, se
realiza mediante el análisis del segundo
espaciador del transcrito interno del DNAr
(ITS-2), revelando diferentes haplotipos y
facilitando la taxonomía del vector 6.
Planteamiento del problema:
T. cruzi es un parásito protozoario, agente
etiológico de la enfermedad de Chagas,
considerada una enfermedad crónica, el
parásito es transmitido por insectos
triatominos (chinches) que se distribuyen en
distintas regiones geográficas de América
latina. Conocer si los vectores contienen al
parásito, indica el riesgo en el que la
población está expuesta de padecer la
infección por T. cruzi por habitar en zonas
endémicas en convivencia con el agente
vector. Recientemente se ha clasificado a T.
cruzi en líneas filogenéticas, las cuales
incluyen distintos linajes. Debido a la gran
diversidad genética que presenta hoy en día
el parásito es necesario clasificar a T. cruzi y
estudiar los hábitats en donde éste se
83
localice para proponer estrategias de control
del vector y de la misma enfermedad, con el
fin de obtener una correlación entre la
heterogeneidad de cepas y su tropismo
tisular (presentación clínica de la
enfermedad), y por otra parte, el conocer la
clasificación de los vectores, distribución en
la zona e identificar la presencia de T. cruzi
en ellos representa un acercamiento de gran
alcance epidemiológico para determinar los
ciclos de transmisión de las diversas
poblaciones del parásito entre los vectores y
especies mamíferas.
En base a lo anterior es de vital importancia
realizar la tipificación molecular de cepas de
T. cruzi aisladas de vectores colectados que
circulan en localidades rurales de la zona
centro del estado de Veracruz para contar
con una información más certera sobre la
epidemiología de la enfermedad en la
región; así como herramientas para la
predicción y vigilancia entomológica de la
enfermedad que permitan a las autoridades
de salud intervenir de forma más eficiente.
Objetivo General:
Identificar y caracterizar molecularmente la
(s) cepa (s) del parásito Trypanosoma cruzi y
al vector Triatoma dimidiata presentes en
localidades rurales de la zona centro del
estado de Veracruz.
Metodología:
Es un estudio de tipo experimental. Se
recolectaron vectores en comunidades
rurales, para la identificación y
caracterización de T. cruzi, y para la
clasificación de los vectores. Se recolectaron
vectores de 13 localidades rurales del
Municipio de Tezonapa perteneciente al
estado de Veracruz a los cuales se les realizó
lavado intestinal. A partir de la muestra
obtenida se diagnosticó el agente infeccioso
T. cruzi mediante la amplificación del kDNA
mediante ensayos de PCR y se caracterizó el
linaje (I-II) del parásito a las muestras que
salieron positivos a T. cruzi. Por otro lado, a
partir de las extremidades de los vectores se
extrajo DNA y con éste se caracterizó
taxonomicamente a T. dimidiata presente en
la zona; mediante (ITS-2) empleando el
metodo de la PCR.
Resultados:
Se encontraron 297 vectores, de los cuales
224 (75.42%) se recolectaron en lugares
intradomiciliares, 58 (19.52%) en lugares
peridomiciliares, 3 (1.01 %) en lugares
silvestres y 12 (4.05 %) de ellos se desconoce
su procedencia. Resultaron 41 (13.80%)
vectores positivos de un total de 297
analizados. Los 41 muestras positivas a T.
cruzi corresponden al linaje I del parásito.
Los 297 vectores pertenecen al grupo 2
dentro de la clasificación filogenética
utilizando como marcador al ITS-2.
Discusión:
En base a los análisis y resultados obtenidos,
observamos que el parásito está presente en
la región y por lo consiguiente que el hombre
adquiera la enfermedad. El linaje I de T. cruzi
encontrado concuerda con estudios
generados mediante el análisis de
marcadores genéticos (RAPD); formando un
grupo homogéneo para los ciclos domésticos
y selváticos sobre el área geográfica de
México. No así el linaje II característico de los
ciclos domésticos en Argentina, Brasil, Bolivia
84
y Chile. A pesar de que los vectores
analizados pertenecen al grupo 2 (que junto
con el grupo 3 se encuentra presente en
México) dentro de la clasificación
filogenética, no deja de ser importante ya
que se pueden presentar híbridos debido a la
migración del vector ó al mismo hombre
llevando consigo al vector; incluso al
parásito, creando nuevos híbridos tanto para
el vector como para T. cruzi al adaptarse a
nuevos habitas y huéspedes. Incluso llegar a
infestar lugares si no se tiene el control
adecuado de los vectores, lo que provocaría
posibles infecciones. El análisis por PCR es
costoso sin embargo presenta buenos
resultados a diferencia de la microscopia
óptica.
Conclusión:
Se encontró la presencia de Trypanosoma
cruzi en vectores colectados en zonas rurales
del Municipio de Tezonapa, sugiriendo una
transmisión vectorial activa del parasito en
estas localidades rurales, El linaje I de T. cruzi
encontrado concuerda con estudios
realizados por otros grupos donde se ha
observado que es el que predomina en
distintos estados del país. Por otra parte, los
vectores corresponden al grupo 2 dentro de
la clasificación filogenética. Estos resultados
sugieren una convivencia estrecha con el
vector representando así un riesgo potencial
para la transmisión del parásito, por lo que
es necesario implementar nuevos programas
de control contra el vector que permitan
asegurar la calidad de vida de los habitantes
de estas comunidades.
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85
IDENTIFICACIÓN DE UNA ZONA CON ALTA
SEROPREVALENCIA DE INFECCIÓN POR TRYPANOSOMA
CRUZI EN LA ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ : Daniel Guzmán Gómez
Aracely López Monteon Eric Dumonteil
Angel Ramos Ligonio
Estudiante de Doctorado Universidad Veracruzana Centro de Investigaciones
Biomé[email protected] [email protected]
Marco teórico:
La enfermedad de chagas o tripanosomosis
americana es causada por el parásito
protozoario Trypanosoma cruzi (T. cruzi).
Esta enfermedad representa un problema de
salud pública en América latina, en donde la
organización Mundial de la salud estima que
aproximadamente 60 millones de personas
esta en riesgo de adquirir la infección y 9-12
millones de personas están infectadas (1). En
México, la enfermedad de chagas es
endémica en varias regiones, pero estos
datos permanecen subestimados, esta
información limitada no es disponible acerca
de la epidemiología de la enfermedad (2,
3).El Estado de Veracruz, es una de las
regiones donde la endemicidad de la
infección por T. cruzi es poco establecida,
posee un total de 7 millones de personas y es
dividido en 11 jurisdicciones sanitarias, varias
especies de Triatominos han sido
encontrados en el estado, incluyendo
algunos con una alta capacidad vectorial,
tales como Triatoma dimidiata o T.
pallidipenis (4). También la presencia de
infección por T. cruzi ha sido documentada
en varias poblaciones humanas. De acuerdo
a la encuesta nacional de seroprevalencia en
los años 80’s, Veracruz fue uno de los
estados en México con alta seroprevalencia
en la población general (≤; 3.0 %) (5).
También se ha documentado la infección por
T. cruzi en donadores de banco de sangre en
la ciudad de Orizaba, Ver. (6). Y casos de
cardiomiopatía chagásica crónica se han
observado en las jurisdicciones sanitarias de
Poza Rica Veracruz (7). Otros estudios de la
distribución de la infección en diferentes
jurisdicciones sanitarias del estado de
Veracruz indican que la infección por T. cruzi
puede estar ausente en jurisdicciones tales
como Coatzacoalcos, Orizaba y Martínez de
la Torre, y una alta seroprevalencia fue
observada en las jurisdicciones de Tuxpan y
Pánuco (2.8% y 1.6% respectivamente) y en
la jurisdicción de Córdoba (1.3%). Además, la
detección de la infección por T. cruzi en
niños menores de 18 años de edad (1.8-
5.2%) sugiere la presencia de una trasmisión
86
activa del parásito en estas mismas
jurisdicciones (4).
Planteamiento del problema:
Como se detalló, la enfermedad de Chagas
forma parte de las enfermedades infecciosas
presente en el estado de Veracruz, pero su
importancia y dinámica de transmisión
permanece desconocido. Dada la
importancia en salud pública de esta
enfermedad en las Américas, es de suma
importancia llevar a cabo un estudio
epidemiológico inicial que proporcioné datos
claves y actualizados sobre la magnitud del
impacto de la enfermedad de Chagas y los
riesgos de transmisión en diferentes
poblaciones y regiones del estado, utilizando
una metodología rigorosa y pruebas
diagnosticas bien establecidas.
Objetivo General:
Actualizar los datos seroepidemiológicos de
la infección por T. cruzi en la zona centro del
Estado de Veracruz.
Metodología:
Es un estudio de tipo experimental y
observacional. Diecinueve localidades rurales
pertenecientes a los municipios de Tezonapa
y Amatlán en la jurisdicción de Córdoba y
del municipio de Tierra Blanca en la
jurisdicción de Cosamaloapan. En cada
localidad rural se informó acerca de la
enfermedad de Chagas mediante el apoyo de
las Unidades Medicas Rurales (IMSS-
Oportunidades), y los participantes
interesados donaron una muestra de sangre,
previo consentimiento informado. A partir
de las muestras se obtuvo el suero de cada
uno de los pacientes, se recolectaron un
total de 654 muestras que se utilizaron para
la identificación de anticuerpos especificos
para T. cruzi utilizando cuatro diferentes
ensayos: dos ensayos de ELISA utilizando
extractos crudos del parásito, un ensayo de
ELISA utilizando una proteína recombinante,
un ensayo de inmunofluorescencia (IFI) y un
análisis de Western blot (6). Un cuestionario
corto fue aplicado a los participantes acerca
del conocimiento del vector y de aspectos
clínicos generales.
Resultados:
De los 654 sueros colectados, la mayoría
provenía de mujeres (61%). Todas las
muestras fueron tamizadas para la presencia
de anticuerpos contra T. cruzi, con un total
de 110 muestras positivas con al menos dos
pruebas, con una seroprevlaencia del 16.8%
(IC 95%=14.2-19.9%). Ciento cinco muestras
dieron resultados positivos a tres pruebas y
44 fueron positivos solo para una prueba
(IFI). Las dos pruebas de ELISA y la IFI fueron
congruentes con índices kappa de hasta 0.99
± 0.005, sin embargo el Western blot mostro
una baja sensibilidad (κ;= 0.56 ± 0.05%).
Adicionalmente, los pacientes que fueron
positivos mencionaron que identificaban al
insecto vector (78.5%) al contrario de los
pacientes negativos (66%).Los análisis de
distribución geográfica de la infección por T.
cruzi, mostraron que la infección se
concentro en 11 de las 13 localidades del
municipio de Tezonapa con una
seropositividad del 28.9%. El porcentaje más
alto de infección se observó en las
localidades de Caxapa (61.5%) y las Josefinas
(40%), mientras que de las 5 localidades del
municipio de Tierra Blanca, solamente
tuvieron casos positivos las localidades de El
87
Moral y Amatlán. Las diferencias observadas
pueden ser atribuidas a factores ambientales
tales como tipo de vegetación, uso de tierra,
humedad y posiblemente a la separación
geográfica de las dos áreas por montañas. La
ausencia de infección por T. cruzi en Tierra
Blanca fue asociada a la pérdida de
vegetación y humedad, y la alta infección en
Tezonapa fue asociada con la presencia de
vegetación tropical.
Discusión:
El proposito de este estudio fue la
actualización de la información
epidemiológica por la infección de T. cruzi en
la región central del estado de Veracruz. Las
muestras fueron analizadas con cuatro
ensayos diagnósticos. La concordancia entre
las dos ELISAs y la IFI fue alta, lo cual
representa una alta credibilidad de los
resultados. Por el contrario, el ensayo de
Western blot parece tener una baja
sensibilidad porque este solo confirma una
limitada proporción de los casos que
resultaron ser positivos con los otros
ensayos. Este bajo reconocimiento del
Western blot ha sido observado en previos
estudios en el estado de Morelos, México, en
el cual solamente el 20 % de los casos
positivos por ELISA fueron confirmados (10),
y en un estudio con muestras de donadores
de sangre en Orizaba, Veracruz (6).
Este reconocimiento puede ser debido a un
pobre reconocimiento de los antígenos
desnaturalizados y sugiere que el Western
blot puede ser un método no apropiado para
la confirmación de la infección por T. cruzi.
Por su parte, la alta concordancia entre los
ensayos basados sobre las cepas Y y H1, las
cuales pertenecen a diferentes linajes, y
conjunto con otros estudios, muestran un
excelente reconocimiento en ensayos
basados con una variedad de fuentes de
antígenos con sueros de pacientes en México
(11, 12).Sobre la base de dos o mas ensayos
positivos, se detectó un promedio de
seroprevalencia a la infección por T. cruzi de
16.8 % (IC95%= 14.2-19.9%) en esta área de
estudio, la cual es considerablemente mas
alta que en estudios previos. Se han
reportado en esta jurisdicción rangos de
seroprevalencia van de 1.3% en la población
general y de 1.8% en niños menores de 18
años, sin embargo, el tamaño de las
muestras es mucho mas pequeño y las
localizaciones geográficas no se han
especificado y puede haber diferencias por
este hecho (4, 8). Interesantemente, no se
han reportado casos en niños en la
jurisdicción de Cosamaloapan (4), y nuestros
datos parecen confirmar esta observación ya
que no se detectaron casos en el municipio
de Tierra blanca perteneciente a la
jurisdicción de Cosamaloapan. Sin embargo,
se encontró una alta seroprevalencia en la
jurisdicción de córdoba, particularmente en
el municipio de Tezonapa, el cual tiene un
promedio significativo de elavada infección
en niños. Sobre los datos de un rango de
transmisión vertical ≤; 10% (13), nosotros
calculamos arriba de 3.4 % de recién nacidos
infectados por via congénita y posiblemente
mas casos relacionados a la familia (14).
Basado a un total de mil nacimientos por
año, esto podría corresponder
aproximadamente a 35 niños infectados
congénitamente en el municipio de
Tezonapa. Nuevamente estos resultados son
muchos mas altos que los reportados en el
noreste del estado de Veracruz, donde
ningún caso de infección congénita fue
88
encontrado en donde la seroprevalencia a la
infección por T. cruzi en mujeres
embarazadas fue de 3.5 % (15).
Conclusión:
El promedio de seroprevalencia de infección
por T. cruzi fue de 16.8 %, y se identificó al
municipio de Tezonapa como un región
hiperendemica, con rangos de
seroprevalencia mayores del 45% en la
población infantil. Estos rangos de
transmisión elevados pueden asociarse con
una transmisión congénita y vectorial, en
donde estudios adicionales tendrán que
realizarse para ayudar a identificar estos
procesos de transmisión.
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90
EVALUACIÓN DEL POTENCIAL ADYUVANTE DE UN
TOXOIDE DERIVADO DE LISTERIOLISINA O SOBRE
CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO HUMANAS : Diana Magali Viveros Luna
: Alfredo Domínguez López Leonardo Daniel Enríquez-Tenorio
: Roberto Lagunes Torres Carmen Sofia Silva Cañetas
Héctor Vivanco-Cid.
Estudiante de Licenciatura Instituto De Investigaciones Medico Biologicas Universidad Veracruzana
[email protected] [email protected]
Marco teórico:
Uno de los aspectos clave en vacunación, es
la identificación de estrategias para
incrementar la inmunogenicidad de
antígenos. El uso de moléculas adyuvantes y
acarreadores es sin duda, la estrategia más
empleada en vacunación para tal fin. Los
adyuvantes son a menudo necesarios para
crear vacunas eficientes al actuar de una
forma no-específica, mediante la activación
de uno o más componentes del sistema
inmune innato, promoviendo inflamación de
bajo grado y de esta forma potenciando la
respuesta hacia el antígeno de interés. El
conocer los mecanismos por los cuales estos
actúan, así como la evaluación de aspectos
básicos tales como la seguridad de su
empleo en modelos experimentales animales
y posteriormente en el humano, son
aspectos muy importantes cuando se
estudian nuevas moléculas candidatos a ser
considerados como adyuvantes y/o
acarreadores.
En años recientes, una molécula producida
por el patógeno intracelular Gram-positivo
Listeria monocytogenes (LM) denominada
Listeriolisina O (LLO), ha cobrado gran interés
en el campo de investigación enfocado a la
identificación de nuevos adyuvantes y
moléculas acarreadoras. LLO es una toxina
formadora de poros, con la capacidad de
unirse a membranas celulares a través de
colesterol (1). Algunas estrategias se han
utilizado para incluir a LLO en innovadoras
formulaciones vacunales experimentales. Se
ha utilizado para facilitar el acceso de
proteínas pasajeras hacia el citosol de células
presentadoras de antígeno profesionales
(APCs), básicamente para inducir respuestas
de linfocitos CD8 in vivo e in vitro. (2-3).
Además de esto, LLO ha sido empleada
también como una molécula acarreador para
incrementar la inmunogenicidad de
antígenos del virus de inmunodeficiencia
humana, (4) antígenos tumorales (5) y
antígenos modelo tales como ovoalbúmina
entre otras (2). En todas estas propuestas la
administración conjunta de LLO en
combinación con el antígeno de interés (ya
91
sea como proteínas de fusión o bien como
formulaciones de liposomas que encapsulan
ambos: LLO + antígenos pasajeros) ha
permitido incrementar la inmunogenicidad
de los antígenos de interés, con vigorosa
respuesta celular (CD4 y CD8), así como una
notable respuesta inmune humoral.
Planteamiento del problema:
Una de las limitantes del uso de toxinas
bacterianas como moléculas adyuvantes, lo
es el potencial riesgo que representa su
actividad biológica en la administración a
seres humanos. LLO posee actividad
citotóxica sobre múltiples estirpes celulares
cuando esta es empleada en altas
concentraciones. En el modelo murino, la
inyección vía intravenosa de esta toxina,
produce un efecto letal cardiotóxico en
ratones (22). Este efecto adverso está
asociado a la propiedad citolítica de la
molécula, la cual provoca una destrucción
masiva de globulos rojos, así como daño
sobre tejidos de múltiples órganos blancos
(corazón, hígado y riñón entre otros). Con la
finalidad de explorar si en ausencia de la
propiedad citolítica, LLO aún puede ser un
adyuvante-acarreador efectivo en
vacunación, en el presente trabajo se generó
y evaluó los efectos de una mutante no lítica
de LLO (denominada como detoxLLO), sobre
células presentadoras de antígenos humanas
(Celulas Dendríticas y macrófagos humanos),
enfocándose sobre los parámetros de
maduración de células dendríticas y
producción de citocinas inflamatorias.
Objetivo General:
Evaluar los efectos de una mutante no lítica
de Listeriolisina O (detoxLLO) en la
maduración de células dendríticas a través
del análisis de la expresión de moléculas
coestimuladoras CD80, CD86, CD40 y la
expresión de MHC clase II, así como evaluar
el efecto de detoxLLO en la producción de
mediadores inflamatorios como el Factor de
Necrosis Tumoral alfa (TNF-α;), IL-1 e IL-6 en
macrófagos humanos.
Metodología:
Tipo de estudio: Básico, experimental. El gen
de Listeriolisina O ha sido clonado dentro del
vector de expresión pET29 por reacción en
cadena de la polimerasa. El gen de
Listeriosina fue modificado en su porción
carboxi-terminal por medio de un protocolo
estándar de mutagénesis dirigida por
oligonucleótidos y PCR. La porción conocida
como región de unión a colesterol
(“Cholesterol Binding Domain”) fue
modificada, insertando tres mutaciones en
los codones que codifican para los
aminoácidos Cisteína en posición 484,
Triptofano 491 y Triptofano 492 de la
proteína madura. Se procedió a realizar la
expresión y purificación de la proteína
detoxLLO y la proteína LLO nativa para ser
usada como control o referencia. La
expresión de las proteínas se realizó
transformando la cepa BL21 con los vectores.
Las bacterias fueron crecidas en medio LB
con kanamicina, se adicionó IPTG para
promover la expresión de los plásmidos. Las
bacterias fueron cosechadas y sonicadas
para liberar las proteínas recombinantes. Se
realizó la purificación de las proteínas con
una matriz de afinidad de iones níquel (Ni-
NTA agarose beads, Qiagen). Se aislaron
células mononucleares de sangre periférica
humana mediante gradiente de densidad
92
empleando Ficoll-hypaque y se sembraron
en botellas de cultivo celular de 75 cm2
estériles. Mediante adherencia al plástico se
separaron los monocitos de las células no
adherentes. Las células dendríticas
inmaduras se obtuvieron al incubar los
monocitos humanos purificados, en
presencia de GM-CSF 200 ng/mL e IL-4 50
ng/mL durante 7 días a 37OC con 20 mL de
medio RPMI suplementado suero fetal
bovino al 10%. Para la obtención de
macrófagos humanos, los monocitos
purificados por adherencia fueron incubados
con medio RPMI 1640 con suero fetal de
bovino descomplementado al 10% y suero
humano al 2%. Las células se incubaron a
37°C y 5% CO2 durante 6 días. Células
dendríticas inmaduras (500,000) fueron
estimuladas con 500 ng/ml de detoxLLO o
LLO nativa durante 24 horas en placas de
cultivo de 24 pozos. Las células fueron
recolectadas y centrifugadas a 1500 rpm
durante 5 minutos. Las células se
resuspendieron en 100 µl de solución de
bloqueo y se incubaron a 4 C durante 1 hora.
Posteriormente las células se incubaron con
los siguientes anticuerpos monoclonales
anti-CD80-FITC, anti-CD86-PE y anti-CD40-
FITC y contra moléculas del MHC clase II en
solución de tinción y analizarlas por medio
de citometría de flujo. Determinación de
citocinas inflamatorias en el sobrenadante
de macrófagos humanos estimulados con
detoxLLO: Macrófagos humanos (500,000
células) fueron estimulados con 500 ng/ml
de detoxLLO, LLO nativa o con 100 ng/mL de
LPS de E. coli como control positivo, durante
24 horas en placas de 24 pozos. Al término
de este tiempo se recuperaron los
sobrenadantes y fueron congelados a -20 C
hasta analizar la producción de citocinas
proinflamatorias: TNF-alfa, IL-1 e IL-6 por
técnica de ELISA.
Resultados:
Al comparar la proteína nativa LLO y el
toxoide generado (detoxLLO), ambas
moléculas indujeron significativos niveles de
citocinas inflamatorias humanas en
macrófagos humanos con una tendencia de
detoxLLO a inducir niveles más elevados de
mediadores inflamatorios. La producción de
TNF-alfa alcanza su pico máximo de
producción (1620 pg/ml de TNF-alfa) a las 24
horas en macrófagos estimulados con 500
ng/ml de LLO nativa. La misma concentración
de detoxLLO (500 ng/ml) indujó niveles
superiores de TNF-alfa a las 24 horas (1830
pg/ml de TNF-alfa. La producción de IL-1 a
las 24 horas en macrófagos estímulados con
LLO nativa registró un valor promedio de
1200 pg/ml, niveles inferiores a los
obtenidos para los macrófagos estimulados
con detoxLLO (1546 pg/ml). Para IL-6 los
valores obtenidos fueron muy similares entre
ambas proteínas (880 pg/ml para
macrófagos estimulados con LLO nativa, y
960 pg/ml de detoxLLO). Al comparar ambas
proteínas por su potencial de inducir la
maduración de células dendríticas humanas,
se observó un aumento en la expresión de
las moléculas co-estimuladoras CD80, CD86,
CD40 y MHC clase II para las 24 horas, en
comparación con células dendríticas
humanas sin estimular. La expresión de estos
marcadores fue mayor en las células
estimuladas con detoxLLO que las
estimuladas con la preparación de LLO
nativa, aunque la intensidad media de
fluorescencia fue menor a la registrada por
células dendríticas humanas estimuladas con
93
100 ng/ml de Lipopolisacarido.
Discusión:
Los resultados obtenidos en el presente
trabajo permiten confirmar que la capacidad
de inducir la activación de células del sistema
inmune innato humanas de la proteína LLO,
es independiente de su actividad citolítica. El
toxoide generado en el presente trabajo
(detoxLLO), conserva sus propiedades
inmunogénicas, con ligera tendencia a
promover una mayor cantidad de
mediadores inflamatorios en macrófagos
humanos estimulados durante 24 horas. De
igual forma que para los mediares
inflamatorios, detoxLLO conserva su
capacidad de inducir la expresión de
marcadores de maduración celular en células
dendríticas humanas, uno de los aspectos
claves que se sabe, permiten el inicio de la
inmunidad adquirida. Es probable que las
tendencias observadas de mayor producción
de mediadores inflamatorios y una mayor
expresión de moléculas de coestimulación,
se expliquen por su reducción en su
potencial citotóxico per se, lo cual permitiría
que un mayor número de células en cultivo,
sobrevivieran por más tiempo en el cultivo y
por tanto siguieran produciendo una mayor
cantidad de mediadores inflamatorios en el
sobrenadante o una mayor expresión de
moléculas de coestimulación en las células
en cultivo.
Conclusión:
El toxoide generado a partir de la molécula
Listeriolisina O nativa, conserva sus
propiedades inmunogénicas, al inducir la
activación de células presentadoras de
antígeno humanas a secretar mediadores
inflamatorios como TNF-alfa, IL-1 e IL-6, así
como la expresión de moléculas de
coestimulación como CD80, CD86, CD40 y
MHC clase II, lo cual abre la posibilidad de
utilizar esta molécula como un adyuvante
eficaz y seguro en vacunación.
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provides systemic protection against
94
PATRON DE SUSCEPTIBILIDAD DE MICROORGANISMOS
AISLADOS EN UROCULTIVOS EN LA UNIDAD DE
SERVICIOS ANALITICOS DE SALUD BIOANALISIS
(USASB). ENERO 2007, DICEMBRE 2009 XALAPA
VERACRUZ. Jose de Jesus Daniel López Muñoz
Claudia Belen Ortega Planell Omar Lagunes Merino Andy Arceo Rodríguez
Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana Facultad de Bioanálisis
[email protected] [email protected]
Marco teórico:
Las infecciones del tracto urinario se definen como un grupo de condiciones que tienen en común la presencia de un número significativo de bacterias en la orina. Las infecciones agudas de las vías urinarias se pueden subdividir en dos grandes categorías anatómicas: la infección de las vías superiores (uretritis, cistitis y prostatitis) y la infección de las vías superiores (pielonefritis aguda, absceso renal y perinéfrico). En la mayor parte de los casos, el crecimiento de 101 unidades formadoras de colonias por mililitro (ml), puede ser clínicamente importante especialmente en niños y en especímenes obtenidos por catéter urinario; cualquier crecimiento patógeno es considerado clínicamente importante si fue obtenido por aspiración supra púbica. La infección del tracto urinario puede ser recidivante, que pueden ser recaídas o reinfecciones. La recaída se refiere a la reactivación de la infección con el mismo
microorganismo que estaba presente antes de iniciarse el tratamiento, es decir se debe a la persistencia del microorganismo en el tracto urinario. La reinfección es un nuevo efecto con un microorganismo diferente de la bacteria original, aunque en ocasiones puede ser el mismo agente bacteriano. El uso indiscriminado de antibióticos por parte de la población, ha causado el incremento de la resistencia de diversos agentes causales de IVU. La resistencia bacteriana es un tema trascendental en salud pública dado que es de vital importancia el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana encaminados a la orientación para la elaboración de esquemas de tratamiento eficaces. La flora de los pacientes hospitalarios es muy distinta a la de la comunidad, esto se debe a la multirresistencia presentada por los agentes causales de enfermedades en los pacientes hospitalizados y a la modificación de la flora debido a la colonización por microorganismos propios de la flora nosocomial de gran patogenicidad. Los
95
microorganismos que se aíslan con mayor frecuencia son los bacilos Gram negativos y los estafilococos. De acuerdo a diversos estudios realizados en nuestro país, las bacterias Gram negativas son las responsables de las IVU y los antimicrobianos evaluados con mayor porcentaje de susceptibilidad son el ceftibuten y la netilmicina en cambio, la ciprofloxacina, trimetoprim-sulfametoxazol, amikacina y la levofloxacina representaron los antibióticos con mayor resistencia (Barriga Angulo y cols. 2008). En un estudio llevado a cabo en el Instituto Nacional de Pediatria (2002) no se encontraron diferencias significativas en la resistencia de bacterias Gram negativas y el uso de ciprofloxacina, cefepime y ceftriaxona.
Planteamiento del problema:
De acuerdo a cifras reportadas por diversos estudios, la incidencia anual de infecciones en vías urinarias es de 0.5 a 0.7 casos por paciente. En Norteamérica, cada año se enferman ocho millones de personas, representando 100, 000 ingresos hospitalarios. En México, la morbilidad debido a las IVU se encuentra dentro del tercer lugar, solo por debajo de las infecciones respiratorias y diarreicas. En cuanto al ambiente hospitalario, las IVU contribuyen la etiología de las infecciones nosocomiales y se asocia con las insuficiencia renal crónica. Por esta razón, se hace necesaria la determinación de la susceptibilidad de los agentes causales de IVU, con la finalidad de conocer el patrón de resistencia/sensibilidad en la población que acude a la Unidad de Servicios Analíticos de Salud Bioanálisis (USABS).
Objetivo General:
Determinar la susceptibilidad de diferentes antibióticos en microorganismos aislados de
urocultivos en el USASB de agosto del 2008 a diciembre del 2009.
Metodología: El tipo de estudio fue observacional,
descriptivo y transversal. Se llevó a cabo en
la Unidad de Servicios Analíticos de Salud
Bioanálisis, durante el periodo de agosto del
2008 a diciembre del 2009 una evaluación de
138 muestras de urocultivos.Se estudiaron
138 muestras de las cuales 34 fueron
positivas. Los aislamientos fueron
caracterizados a nivel de género y especie
con base a las técnicas reco-mendadas por la
Sociedad Americana de Microbiología. Con
respecto a la sensibilidad se utilizaron
diferentes antimicrobianos: Cefalotina,
Netilmicina, Nitrofurontoina, Amikacina,
Ampicilina, Carbenicilina, Meropenem, Acido
Nalidixico, Trimeto/Sulfame,Pefloxacina,
Cefotoxima, Cefoperaxone, Gentamicina,
Nitrofurontoia. Para la determinación de la
susceptibilidad antimicrobiana, se llevaron a
cabo los procedimientos recomendados por
el Instituto de Estándares de Laboratorios
Clinicos (CLSI) de Estados Unidos de América,
utilizando la técnica de difusión con sensi-
discos (Kyrbi-Bauer) en agar de Müeller
Hinton.Para el análisis de los datos se
elaboró una base de datos en el programa
Microsoft Excel 2007® y posteriormente se
realizó estadística descriptiva para calcular
frecuencias absolutas y relativas.
Resultados:
Fueron un total de 231(100%) muestras de
urocultivos, se obtuvieron 163(70.56%)
positivas y 68(29.43%) negativas; los
microorganismos que se aislaron con mayor
frecuencia fueron los siguientes: Klebsiella
96
oxytoca, Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Proteus vulgaris, Pantoea agglomerans,
Pseudomonas sp, Staphylococcus
saprophyticus, Enterococcus faecalis.
Discusión:
Más del 95 % de la IVU son causadas por bacilos gram negativos y entre ellos las entero bacterias, de las cuales Escherichia coli es la más frecuente. En este estudio Escherichia coli es reconocida como el microorganismo que se aisló con mayor frecuencia. El porcentaje de aislamiento de Escherichia coli es similar a los resultados publicados por autores internacionales de estudios sobre prevalencia de microorganismos bacterianos en urocultivos tales como Hooton TM. The current management strategies for community-acquired urinary tract infection.Otras bacterias aisladas en fueron Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Enterobacter agglomerans, Pseudomonas sp. La existencia del incremento de cepas resistentes a la ampicilina convierte a esta droga en una opción menos eficaz para el tratamiento de la IVU.
Conclusión:
Según los resultados obtenidos de nuestro estudio, se corrobora de acuerdo con otros estudios, que la mayor frecuencia de infección de vías urinarias se da en el sexo femenino. Claramente observamos que el microorganismo responsable de la mayor parte de los casos de IVU es la Escherichia coli, sin embargo encontramos otros no tan frecuentes, como Klebsiella, Proteus y Enterobacter.De acuerdo con los antibióticos utilizados para realizar nuestras pruebas el antibiótico que mostro mayor sensibilidad en las bacterias fue amikacina ya que presentaron un alto margen de seguridad
para uso empírico y teniendo en cuenta el costo-beneficio podrían ser una herramienta útil a la hora de tomar una decisión terapéutica. La elección de un antibiótico para el tratamiento de la infección de vías urinarias requiere un conocimiento de las bacterias más frecuentes y su perfil de resistencia bacteriana. La ampicilina debe ser eliminada como opción terapéutica inicial dada la alta tasa de resistencia que presentan los patógenos más frecuentes.
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