capítulo 1 cineticamicrobiana

7/27/2019 Captulo 1 CineticaMicrobiana

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de metros cbicos, construidos en materiales tales como vidrio, acero al carbn, acero

inoxidable, etc. Cuentan con dispositivos para agitacin del medio de cultivo. Operan en

rgimen por lote, continuo o semicontinuo. Se puede adicionar al medio de cultivo, en

forma asptica, aire, cidos, antiespumante u otros lquidos.

La principal funcin de un fermentador es proporcionar y mantener las condiciones

ambientales impuestas por el sistema biolgico para la transformacin ptima y

econmica de las materias primas a productos.

La fermentacin se inicia con la inoculacin del medio de cultivo con el microorganismo

de inters. El inculo consiste de un volumen determinado de medio de cultivo en el que

se ha crecido previamente dicho microorganismo. La relacin del volumen de inculo a

volumen de fermentacin oscila normalmente entre el 5 y 10% v/v. En un proceso por

lote, la fermentacin termina hasta que la casi totalidad de la materia prima es

transformada a producto, el cual puede ser la biomasa misma, un metabolito primario o

uno secundario. El objetivo de toda fermentacin industrial es maximizar dicha

transformacin en el menor tiempo posible. En una fermentacin ocurren distintas

reacciones bioqumicas complejas.

La caracterizacin de cualquier proceso de fermentacin en el que los microorganismos

consumen las materias primas para reproducirse, mantenerse y formar productos,

requiere necesariamente del conocimiento de la estequiometra del proceso, de larelacin entre las materias primas y energa involucradas y de los rendimientos celulares.

En consecuencia, es necesario determinar, entre otras cosas, las distintas velocidades

que ocurren en el proceso (de crecimiento celular; de consumo de sustrato; de sntesis

del producto; de produccin de calor; etc.), de tal forma que sea posible tanto la

prediccin del comportamiento celular con fines de control, como el diseo, construccin

o implementacin del equipo de fermentacin.

1.2. CRECIMIENTO MICROBIANO.

La evolucin de una poblacin microbiana en pleno crecimiento se ajusta a las leyes de la

cintica clsica de evolucin poblatoria. Antes de describir dicha cintica, se explicar el

concepto "crecimiento celular". Como todo ser vivo, los microorganismos nacen, crecen,se reproducen y mueren. Para que un microorganismo d origen a otro, debe crecer

individualmente hasta llegar a un estado de madurez fisiolgica que le permita la

reproduccin. Desde este punto de vista, debe distinguirse entre "crecimiento individual" y

"crecimiento poblacional", este ltimo es consecuencia del primero.

En un cultivo microbiano debe distinguirse el crecimiento "sincrnico" del "asincrnico", el

primero indica una divisin o reproduccin de todos los individuos de una poblacin a un

mismo tiempo y el segundo a una divisin o reproduccin azarosa, con respecto al

tiempo, de los individuos que componen a la poblacin. El crecimiento sincrnico se da

bajo ciertas condiciones especiales de cultivo. Otro concepto igualmente til es el

denominado crecimiento "balanceado" o "desbalanceado", en aqul ocurre que las

velocidades de formacin de los componentes celulares (carbohidratos, lpidos,

protenas, etc.) conservan una proporcionalidad mantenida con respecto al tiempo,

mientras que en el desbalanceado, al menos un componente no conserva dicha

proporcionalidad1. En una fermentacin industrial, el crecimiento usualmente es evaluado

como "crecimiento poblacional asincrnico" y generalmente ocurre en forma balanceada

(adems del detrimento en la economa, es irrelevante cuantificar el crecimiento

individual, lograr una sincrona y desbalancear el crecimiento).

Los requisitos fundamentales para que se de el crecimiento son dos: i) la existencia de un

medio de cultivo que aporte los elementos nutritivos en todas sus formas (fuentes de C,


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3

N, S, P, O, etc.); ii) el establecimiento y mantenimiento de las condiciones fisicoqumicas

o ambientales necesarias (temperatura, pH, fuerza inica, potencial redox, etc.). Con

base en estos requisitos se puede establecer una clasificacin de los distintos tipos de

microorganismos. As por ejemplo, desde el punto de vista en que los microorganismos

obtienen la energa para su crecimiento se pueden clasificar en auttrofos y hetertrofos;

los auttrofos la obtienen a partir de fuentes de carbono inorgnicas (CO, CO2,

carbonatos, etc.) y los hetertrofos a partir de fuentes orgnicas tales como

carbohidratos, lpidos, aminocidos, etc. Otra clasificacin se basa en el consumo de unnutriente especfico; el oxgeno: los microorganismos que lo consumen durante y para su

crecimiento se denominan aerobios, mientras que los que crecen en su ausencia se

denominan anaerobios. Desde el punto de vista de las condiciones ambientales, los

microorganismos pueden clasificarse de acuerdo a su temperatura y pH ptimos de

crecimiento (psicrfilos, mesfilos y termfilos; acidfilos, neutros o alcalinfilos)2.

Desde un punto de vista industrial y con base en los distintos tipos de productos

obtenidos por va fermentativa (bebidas alcohlicas, alimentos fermentados en todas sus

variedades, antibiticos, enzimas, bioplagicidas, interfern, insulina humana, etc.), los

microorganismos ms importantes y con mayores perspectivas econmicas son los

hetertrofos, aerbicos, mesfilos, aunque los que han repercutido mayormente en

beneficio de la humanidad han sido sin duda los hetertrofos, anaerbicos mesfilos.

1.2.1. LAS FUENTES NUTRICIAS.

La seleccin de las fuentes nutricias componentes de un medio de cultivo para la

produccin de un metabolito de inters, depender, entre otras cosas, del tipo de

microorganismo; de la finalidad de la produccin (fines comerciales o no); de si se

requiere de una rpida velocidad de crecimiento; del valor agregado del producto; etc.

Por esta razn, solo se har breve mencin de las distintas fuentes que se han utilizado a

escala industrial, sin entrar en detalle de las particularidades establecidas por la

investigacin bsica para la seleccin de sus materias primas.

1.2.1.1. FUENTE DE CARBONO.

Todas las fuentes nutricias son importantes, sin embargo, debido a la naturaleza orgnicadel proceso fermentativo, la fuente de carbono (FC) es la ms relevante. El carbono

contenido en la biomasa, en el producto o productos y en el bixido de carbono

producido, provienen de dicha fuente. De aqu su importancia. Puesto que las materias

primas representan del 30 al 50% del costo de produccin3, es muy importante la

seleccin adecuada de la FC. Entre las ms comnmente usadas se encuentran los

carbohidratos en sus distintas formas: hexosas (glucosa, fructosa, galactosa, etc.);

pentosas (xilosa, arabinosa y ribosas); disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa, etc.) y

polisacridos (almidones, celulosas, hemicelulosas, etc.). Una fuente muy importante de

carbohidratos es la melaza (de caa o de remolacha), la cual contiene cantidades

significativas de vitaminas, factores de crecimiento, micronutrientes y cantidades

pequeas de nitrgeno orgnico; por estas caractersticas y por ser un subproducto de la

industria azucarera, las melazas son una muy buena opcin para la industria defermentaciones. Algunos otros subproductos utilizados como fuentes de carbono son:

suero de leche, licores sulfticos, vinazas, etc. Entre las caractersticas ms importantes

que debe reunir una FC para utilizarse en un proceso fermentativo a escala industrial, se

encuentran las siguientes: i) abundante; ii) disponible; iii) de bajo costo; iv) de produccin

centralizada; v) alta miscibilidad en agua; vi) parcialmente oxidado; vii) de fcil

degradacin por parte del microorganismo; viii) que muestre altos rendimientos de

producto.


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1.2.1.2. FUENTE DE NITROGENO.

Despus del carbono, el nitrgeno es el elemento que normalmente se encuentra en

mayor concentracin en el medio de cultivo . Se utiliza en la sntesis de aminocidos, de

protenas, de purinas y pirimidinas (constituyentes de los cidos nucleicos), etc. Las

fuentes de nitrgeno (FN) generalmente se pueden clasificar en orgnicas e inorgnicas.

Entre las orgnicas sobresalen el agua de cocimiento de maz, harinas de pescado y de

soya, hidrolizados de protenas, etc.; mientras que en las inorgnicas sobresalen la urea,

nitratos, nitritos, sales de amonio y amoniaco lquido o gaseoso (en ciertos casos el

amoniaco, al usarse como FN, sirve como agente controlante del pH de fermentacin). La

seleccin de esta fuente sigue los mismos criterios establecidos para la FC.

1.2.1.3. FUENTES DE MACRO Y MICROELEMENTOS.

Los dems elementos necesarios para el crecimiento se pueden clasificar en macro y

microelementos, los primeros comprenden al fsforo, azufre, calcio, magnesio, hidrgeno

y oxgeno. Estos dos ltimos muy particulares, el hidrgeno, por ejemplo, generalmente

es tomado por el microorganismo con la fuente de carbono, mientras que el oxgeno,

necesario para la respiracin, tiene que ser adicionado al medio con el aire. Entre los

microelementos o micronutrientes (los que se requieren en muy pequeas

concentraciones) se encuentran el fierro, zinc, manganeso, cobre, vitaminas, etc. Losrendimientos de varios metabolitos primarios y secundarios se ven afectados por los

microelementos. Estos son importantes por distintas razones, entre las que se pueden

mencionar las siguientes: i) regulan las propiedades electrolticas y osmticas del interior

de las clulas; ii) actan como cofactores de algunas enzimas importantes; etc. A

diferencia de un medio de cultivo preparado en el laboratorio y a utilizar en la

investigacin bsica, en el que normalmente se utiliza agua destilada (o bidestilada) y

sales qumicamente puras, en la preparacin de un medio de cultivo industrial,

frecuentemente se requiere la adicin de los macronutrientes pero no la de los

micronutrientes, ya que estos pueden ser satisfechos a travs del agua de proceso (de la

red municipal, pozos, manantiales, lagos o ros) o a travs de las materias primas que no

son qumicamente puras.

1.2.1.4. FUENTE DE OXIGENO.

Este nutriente es muy importante para las fermentaciones aerbicas. A diferencia de los

dems, el oxgeno se tiene que estar suplementando continuamente en el medio por dos

razones principales: I) por el consumo por parte de los microorganismos (un cultivo en

pleno desarrollo puede consumir en pocos segundos 14 mg de oxgeno por litro); II) por

su baja solubilidad en medios de cultivo (no mayor a 14 ppm). La fuente comn de

oxgeno en una fermentacin es el aire, que por lo general se burbujea en el medio de

cultivo desde el fondo del fermentador. La transferencia de oxgeno desde las burbujas

del aire hasta el microorganismo, es una de las principales limitantes de la productividad

en una fermentacin, por lo que el biorreactor debe ser diseado para satisfacer la

mxima demanda por parte del m.o.


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a) Yav.e .Rendimiento celular con base en los electrones disponibles en el sustrato (elsubndice "av" se refiere al trmino disponible traducido del ingls).

Para determinar el nmero de electrones disponibles en un sustrato dado, se determina

la cantidad de oxgeno necesaria para su combustin y se multiplica por 4 (4 electrones

requeridos para la reduccin de una molcula de oxgeno): este valor se denomina Yav.e/s,

por lo tanto:

Y YYav e

x s

av e s

./

. /

(3)

Ejemplo: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O

Para oxidar la glucosa se requieren de 6 moles de oxgeno, por lo que el Y av.e/s ser de 6

x 4 =24 av.e/mol de glucosa. Y si el rendimiento celular (Yx/s) de Penicillium chrysogenum

en glucosa es de 0.43 g/g, entonces:

Yav.e = 0.43x180/24 = 3.22 g clulas/av.e

b) Ykcal. Rendimiento celular basado en la energa total disponible en el medio, el cualqueda definido como:

Ykcala c

xH x H

*(4a) o Ykcal

a

cH

H

x

1

(4b)

en la que: Ykcal = g biomasa producida/kcal disponible

Ha = calor de combustin de la biomasa = 5.3* kcal/g de clulas.

Hc = calor generado por el catabolismo [=] kcal/l.

*) De acuerdo con los anlisis calorimtricos se ha propuesto el valor de

Ha mostrado.

El denominador de la ecuacin "4b" es la energa total disponible, es decir, la incorporada

al material celular y la gastada por el catabolismo.

El valor de Hc para procesos totalmente aerbicos en medios complejos y en ausenciade formacin de productos, puede calcularse multiplicando el oxgeno consumido"O2"por la cantidad de energa disponible por la reduccin del oxgeno "HO" (106 kcal/mol).

Hc = O2 * HO (5)

YYkcal a O OH H

1

2 /(6)

en la que: HO = generacin de calor basada en el consumo de oxgeno(106 kcal/mol de O2).

YO2 = rendimiento celular con base en el oxgeno [=] g cel/mol de O2.

Al tomar un valor de 1.0 g cel/g O2 (valor tpico) o 32 g cel/ mol O2, se obtiene un valor de

Ykcal = 0.1161 g cel/ Kcal disponible.

En la Tabla 1 se muestran valores de algunos rendimientos, mientras que en la Tabla 2

se muestran valores tpicos del coeficiente de mantenimiento celular con base en el

sustrato ms.


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Tabla 1 Valores tpicos de rendimientos.

MICROORGANISMO SUSTRATO Yx/s(g/g)

Yo2(g/g)

Ykcal(g/kcal)

INDISTINTOS Glucosa 0.5* 1.0* -Hidrocarburos 1.0* 0.5* -

Candida utilis Glucosa 0.53 1.37 0.126P. chrysogenum Glucosa 0.43 1.35 0.107

Saccharomyces cerevisiaeGlucosa 0.5 0.97 0.123

Candida utilis Acetato 0.36 0.7 0.092Candida utilis Etanol 0.68 0.61 0.112Klebsiella sp. Metanol 0.38 0.56 0.081

Methylococcus sp. Metano 1.01 0.29 0.104*) Valores promedios de microorganismos.

Tabla 2. Valores tpicos del coefic iente de mantenimiento celular ms .

MICROORGANISMO CONDICIONES DE CRECIMIENTO. ms(g/g/h).

Aerobacter cloacae Aerbico. Limitado por glucosa.

0.094Saccharomyces cerevisiae. Anaerbico. 0.036 -0.04Saccharomyces cerevisiae. Anaerbico + NaCl (1.0 Mol) 0.36Klebsiella aerogenes Aerbico 0.04Klebsiella aerogenes Anaerbico 0.5

1.4. ESTIMACION DEL CALOR METABOLICO.

Como toda reaccin bioqumica, el crecimiento celular ocurre en forma exotrmica, con

generacin de calor, el cual debe ser eliminado para mantener la temperatura constante y

evitar rendimientos y productividades bajas. En teora, la evolucin del calor metablico

puede calcularse de la diferencia entre el calor de combustin del sustrato consumido y la

suma de los calores de combustin del o los productos obtenidos (incluyendo la

biomasa). Cuando slo existe produccin de biomasa, dicha estimacin resulta

relativamente simple ya que el calor de combustin de las clulas toma valores entre 5.8

y 3.6 kcal/g clulas5,6

(este ltimo valor muy apropiado para levaduras).

La cantidad de calor que debe ser removida en un proceso de produccin de levaduras

cuya productividad es de 8 g cel/l/h, ser de 8 x 3.6 = 28.8 Kcal/l/h.

Otra forma de estimacin puede efectuarse considerando que la produccin de calor es

proporcional a la velocidad de consumo de oxgeno7:

QH = 0.124 QO2 (7)

en la que: QH [=] kcal/l/h.

QO2 [=] mMol O2/l/h.

Para el mismo proceso anterior, si el rendimiento celular con base en el oxgeno

consumido es de 1.2 g de clulas por cada gramo de oxgeno consumido, la Q O2 ser de

227.3 mMol O2/l/h, por lo que el calor metablico generado ser de 28.2 Kcal/l/h, cantidad

muy cercana a la obtenida con la otra forma de clculo.


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1.5. ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO.

El crecimiento microbiano puede expresarse como una reaccin qumica en la que los

reactivos son las fuentes de carbono, nitrgeno y oxgeno principalmente. As, puede

escribirse la reaccin general siguiente:

CasHbsOcsNds + NH3 + O2 CaxHbxOcxNdx + CapHbpOcpNdp + CO2 + H2O(8)

Sustrato Nitrgeno Clulas Producto

ecuacin en la que los caracteres griegos representan los coeficientes estequiomtricos y

los subndices a, b, c y d el nmero de tomos de carbono, hidrgeno, oxgeno y

nitrgeno en el sustrato (s), clulas (x) y producto (p) respectivamente. Dicha ecuacin,

es la base para la estimacin de los rendimientos generales tericos de fermentacin.

As, al conocer los valores de los coeficientes estequiomtricos de un determinada

ecuacin, se pueden calcular fcilmente los valores de Yx/s, Yp/s, YO2, etc., en la forma

especificada en el punto 1.3. La ecuacin 8 puede modificarse y/o simplificarse para los

siguientes casos: i) cuando la fuente de nitrgeno es diferente al amoniaco y ii ) paracuando no hay producto. Con fines didcticos se desarrollar la metodologa para estimar

la cantidad de oxgeno necesaria para formar una unidad de masa celular cuando no hay

formacin de producto (solo clulas) y cuando el sustrato tiene frmula estructural"CxHwOz". Desde este punto de vista, la ecuacin 8 se reduce y simplifica a:

aCxHwOz + bO2 + dNH3 Clulas + eCO2 + fH2O (9)

puesto que las clulas producidas contienen un determinado porcentaje de carbono,

nitrgeno, hidrgeno y oxgeno, al realizar los balances elementales para cada

componente se establecen las siguientes ecuaciones:

CARBONO 12ax = (g cel) %C/100 + 12e (10)

NITROGENO 14d = (g cel) %N/100 (11)

HIDROGENO wa + 3d = (g cel) %H/100 + 2f (12)

OXIGENO 16az + 16 bO2 = (g cel) %O/100 + 32e + 16f (13)Estas ecuaciones estn expresadas en unidades de masa.

Para facilitar el desarrollo matemtico se multiplica a la ecuacin 10 por 16/6; a la 11 por

48/28; a la 12 por 16/2 y a la 13 por 16/16; resultando:

(10) 32 e = 32 ax - 16 (g cel) C%/600 (14)

(11) 24 d = 48 (g cel) N%/2800 (15)

(12) 24 d = 16 (g cel) H%/200 + 16 f - 8 wa (16)

(13) 16 az + 16 bO2 = 16 (g cel) O%/1600 + 32 e + 16 f (17)

combinando 15 y 16 y sustituyendo 14 en 17 se obtienen respectivamente:

48 (g cel) N%/2800 = 16 (gcel) H%/200 + 16 f - 8 wa (18)

16 az + 16 bO2 = 16 (g cel) O%/1600 + 32 ax - 16 (g cel) C%/600 + 16 f (19)

despejando el trmino "16 f" de 18, sustituyendo el resultado en 19, arreglando y

simplificando se obtiene:

16 bO2 = a (32x + 16w/2 - 16z) + (g cel) 16 O%/1600 - 16 C%/600 + 48 N%/2800 - 16 H%/200 (20)


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9

Al aplicar a la ecuacin 9 el concepto de rendimiento celular con base en el sustrato

consumido y despejar a se obtiene:

a = g cel/(Yx/s Ms) (21)

en la que Ms es el peso molecular del sustrato. Sustituyendo 21 en 20 y arreglando se

obtiene:

16 16 2 21600 600

32800 200

2bO gCel x w zY Ms

O C N H x s

( ) / % % % %/

de la que finalmente se obtiene:

200

%

2800

%3

600

%

1600

%2/216

Y

1

/2

HNCO

MsY

zwx

sxO

(22)

en la que el inverso del YO2 es la cantidad de oxgeno necesaria por unidad de masa

celular expresada en gramos de oxgeno por gramo de clulas. Esta ecuacin fue

establecida por Mateles8

para calcular los requerimientos de oxgeno en una

fermentacin en la que se utilizan sustratos con frmula estructural "CxHwOz", en

ausencia de formacin de productos y con amoniaco como fuente de nitrgeno. Laecuacin 23 es la correspondiente a cuando se utiliza nitrato (NO3-) como fuente de

nitrgeno. Con estas dos ecuaciones, es posible calcular la cantidad de oxgeno

requerido por unidad de masa conociendo la composicin elemental del microorganismo

y del sustrato. Sin embargo, hay que recordar que el resultado es meramente terico y

que bien podr alejarse de la realidad.

200

%

1400

%3

600

%

1600

%2/216

Y

1

/2

HNCO

MsY

zwx

sxO

(23)

1.6. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO.

La seleccin de las distintas materias primas (fuentes de C, N, P, H, S, etc.) y laoptimizacin de la composicin del medio de cultivo que garantice la mxima

transformacin a producto en el menor tiempo posible (mxima economa) no es un

asunto sencillo, ya que, en teora, involucra buena parte de desarrollo experimental.

Existen ciertas metodologas para la seleccin de las materias primas y la optimizacin

de la composicin de medios de cultivo como la de Box y Wilson9, el mtodo del factor

simple de Pilat y colaboradores10

y la de cultivo continuo empleada por Mateles y Battat11

y Goldberg y colaboradores12

, a las cuales se remite al lector. No obstante, si se

considera que la composicin elemental de los microorganismos no vara

significativamente durante el crecimiento (valores tpicos de C, H, O, N y S como

porcentaje de materia seca son de 45, 7, 33, 10 y 2.5 respectivamente), se puede obtener

una primera aproximacin de la composicin de los medios tomando en cuenta las

siguientes recomendaciones13

:

1. Determinar experimental o bibliogrficamente, la composicin elemental para la

biomasa.

2. Seleccionar las materias primas que aportarn el nitrgeno, los macro y

microelementos.

3. Calcular el rendimiento para las materias primas seleccionadas, dividiendo el

porcentaje contenido en la materia prima del elemento que aportan, entre el

porcentaje contenido en las clulas.


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4. Establecer la concentracin celular que se desee alcanzar.

5. Estimar la cantidad de la materia prima dividiendo la concentracin celular que se

desea alcanzar entre el rendimiento de dicha materia prima.

Ejemplo: Se desea crecer un microorganismo que contiene 6% de nitrgeno hasta

alcanzar una concentracin celular de 10 g/l. Se selecciona el sulfato de amonio

[(NH4)2SO4] como fuente de nitrgeno. Esta materia prima contiene 21.2% de nitrgeno,

por tanto, su rendimiento ser: Y = 21.2/6 = 3.5 g cel/g de sulfato de amonio. Por lo que lacantidad de sulfato de amonio necesaria ser de: 10/3.5 = 2.85 gramos de (NH4)2SO4 por

litro de medio. Esta cantidad aporta la cantidad mnima de nitrgeno necesaria para

alcanzar los 10 gramos de clulas por litro que se especificaron.

El sulfato de amonio adems de funcionar como fuente de nitrgeno, puede funcionar

tambin como fuente de azufre. Por tal motivo, en el ejemplo anterior se tendr que

verificar si con la cantidad calculada para aportar el nitrgeno necesario se satisfacen las

necesidades de azufre. De ser positiva la respuesta, entonces el sulfato de amonio

satisface a la vez las necesidades de nitrgeno y azufre. De ser negativa, tendr que

seleccionarse y calcularse la cantidad de otra materia prima que complemente las

necesidades de azufre que no cubri el sulfato de amonio.

En la tabla 3 se muestran rendimientos celulares para algunas materias primas, con laconsideracin de una composicin elemental particular de un microorganismo.

Conviene aclarar que el valor mostrado para la glucosa en dicha tabla, se multiplic por

0.6 al considerar que en un proceso aerbico el 60% del carbono es incorporado a

biomasa y el otro 40% es liberado como CO2 para la captacin de energa (prcticamente

en todas las fermentaciones industriales la fuente de carbono proporciona la energa para

crecimiento y el carbono para sntesis de material celular y productos).

Esta primera aproximacin tiene el inconveniente de considerar como constantes la

composicin del microorganismo, del medio y de las condiciones ambientales, lo cual no

es totalmente cierto.

Tabla 3. Ejemplos de rendimientos celulares de distin tas materias primas.

Elemento % del elemento en lasclulas. (promedio).

Materia primaseleccionada.

Rendimiento Y.g cel/g mat. prima.

1) C 48 glucosa 0.52) N 6 (NH4)2SO4 3.53) P 2.5 K2HPO4 7.14) S 0.3 (NH4)2SO4 80.7

5) Mg 0.2 MgSO4 1006) Ca 0.5 CaCl2.2H2O 54.47) Fe 0.2 FeSO4 100.58) Cu 0.01 CuSO4 25409) Mn 0.005 MnSO4 650010) Mo 0.0002 NaMoO4 219000

1.7. MODELOS PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO.

Los estudios necesarios para investigar el efecto que sobre el crecimiento microbiano

presentan las condiciones ambientales, el tipo y concentracin de las fuentes nutritivas y

las caractersticas de transferencia de masa del sistema, se podran realizar en una forma

totalmente emprica a travs de un sinnmero de condiciones experimentales que cubran

todas las combinaciones posibles, presentndose los resultados como una serie de


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13

sksmax

(26)

la diferencia entre una y otra ecuacin radica en la precisin de los valores de las

constantes obtenidas, sobre todo, al sustituir valores pequeos de concentracin de

sustrato residual s.

Tabla 5. Modelos cinticos no estructurados ms comnmente utilizados.Modelo de Monod.

= maxs

s ks

Modelo de Konak.d

dsK max

p ( )

Modelo de Contois.

= maxs

Ax s

Modelo de Tessier. max s k1 exp( / )

Modelo de Moser.

= maxs

s k

r

r

s

r

Modelo de Powel.

m a x s p

s

s k k

Modelo logstico.d x

d tx x x

x x

m a x m a x

m a x m a x

( / )

( / )

1

1

Inhibicin por Producto.

= maxs

s k

k

p ks

p

p

Inhibicin por sustrato.

m a x s i

s

s k k s 2

Doble limitacin.

m a x sL

L O

s

s k

C

C k 2

Tabla 6. Constante de saturacin de la ecuacin de Monod para algunosmicroorganismos y materias primas.

MICROORGANISMO SUSTRATO Ks(mg/l).

E. coli. Glucosa 0.068 a 4.0Candida utilis. Glicerol 4.5Candida utilis. Oxgeno 0.45 a 0.042

Saccharomyces cerevisiae. Glucosa 25

1.7.1. CINETICA DE CRECIMIENTO.

La cintica clsica de evolucin poblatoria establece que la velocidad instantnea de

crecimiento (dN/dt) es proporcional al nmero de individuos presentes:

dN/dt N (27)

al eliminar la proporcionalidad de la ecuacin anterior se obtiene:

dN/dt = N (28)

en la que: N = nmero de individuos presentes.

dN/dt = velocidad instantnea de crecimiento.

= velocidad especfica de crecimiento.

En esta ecuacin, el trmino N puede ser sustituido por su sinnimo "X" para el caso del

crecimiento microbiano (masa total microbiana). La definicin de se obtiene de dichaecuacin:


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14

1

X

dX

dt(29)

En una fermentacin en lote, la biomasa total X evoluciona con el tiempo como se

observa en la Figura 1 (es fcil demostrar que, para este caso particular, la concentracin

celular "x", definida como la relacin X/V, evoluciona con el mismo perfil).

La razn de que en dicha figura (1) no se muestre la fase de adaptacin o "lag" ni gran

parte de la "estacionaria", es porque van en contra de la productividad. En lasfermentaciones industriales debe garantizarse que el inculo del fermentador de

produccin debe estar perfectamente adaptado al medio de cultivo y a las condiciones

fisicoqumicas y ambientales establecidas en dicho fermentador.

tiempo

Observando detalladamente la figura anterior, en las etapas tempranas de la

fermentacin, en la que la masa o concentracin celular es baja y en la que el "alimento"

disponible para el microorganismo es suficientemente grande (bajo condiciones

favorables para la divisin celular), el crecimiento celular no tiene barreras que lo limiten,

por tal razn, se puede considerar que la velocidad especfica de crecimiento es

constante y mxima en esta etapa. Bajo esta consideracin (o bajo aquellas

circunstancias que impongan que sea constante), se puede resolver la ecuacin 29obtenindose:

ln (x/x0) = max t o ln (x/x0) = t (30)

Esta es la razn por la cual cuando el crecimiento de un cultivo por lote se grfica en

papel semilogartmico se pueda calcular la "max" con la pendiente de la parte recta

obtenida con los primeros tiempos de fermentacin. Con ayuda de este tipo de grfica se

puede establecer, de manera aproximada, la duracin de la fase de crecimiento

exponencial.

Figura 1. Curva de crecimientomicrobiano en unafermentacin sumergida y enote, en la que se muestra lavelocidad instantnea decrecimiento a tiempos distintos.


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De acuerdo a la cintica clsica de evolucin poblatoria, despus de un tiempo dado, la

velocidad de crecimiento de una poblacin disminuye continuamente con el tiempo hasta

llegar a cero. Las cuestiones fundamentales a contestar son bsicamente dos: cul es el

intervalo de tiempo durante el cual la poblacin crece a su mxima velocidad? y cul o

cuales son las razones de dicha disminucin?.

Cuando se crecen microorganismos en medios con una sola fuente de carbono y energa,

ambas preguntas estn estrechamente relacionadas, teniendo una misma explicacin.

Las causas por las que la velocidad disminuye de su valor mximo son bsicamente dos:

el agotamiento del sustrato y la naturaleza de la forma de cultivo (por lote), en la que el

medio ambiente va cambiando con el tiempo (p. ej. la acumulacin continua de detritos

en el medio producidos por el m.o.).

A pesar de los comentarios anteriores, la velocidad especfica de crecimiento puntual a

cualquier tiempo de un cultivo por lote, puede ser calculada mediante la ecuacin 29,

como se observa en la figura 2.

La ecuacin 30 sirve para definir el concepto de tiempo de duplicacin (td), que es el

intervalo de tiempo en el que se alcanza el doble de la masa celularque se tena a un

tiempo dado:

td = ln 2/max o td = ln 2/ (31)Existe un trmino semejante al td, el tiempo de generacin (tg), solo que este no se refiere

a la duplicacin de la masa celularsino al nmero de individuos. Ambos tiempos pueden

considerarse iguales cuando la naturaleza del crecimiento es asincrnica.

1.7.1.1. EFECTO DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES (TEMPERATURA Y pH)SOBRE LA VELOCIDAD ESPECIFICA DE CRECIMIENTO .

Los efectos que presentan la temperatura (T) y el pH sobre la son muy semejantes. Tal

comportamiento se aprecia en la Figura 3. En ambos casos se observa que existe una

meseta o intervalo de T y pH en el que la es mxima y constante, y fuera de dicho

intervalo la velocidad disminuye hasta llegar a cero (para los extremos). Para el caso de

la temperatura, las zonas fuera de la meseta se pueden denominar como de "activacin"

y de "inactivacin", esta ltima solo es importante durante la esterilizacin de un medio.

Para la zona de activacin la dependencia entre y la temperatura es del tipo de la

ecuacin de Arrhenius:

A e E RTa / (32)

Con base a lo anterior, el microbilogo elige la temperatura y el pH ptimos para el

microorganismo, pero el Ingeniero debe tomar en consideracin otras caractersticas

como son el consumo de energa, la cantidad de calor metablico que se generar,

probabilidades de contaminacin, etc.

1.7.2. CINETICA DE FORMACION DE PRODUCTO.

De acuerdo a Gaden15, las fermentaciones se pueden clasificar en tres tipos distintos deacuerdo a la formacin de producto: i) asociada al crecimiento; ii) no asociada al

crecimiento; iii) parcialmente asociada al crecimiento (Figura 4).

El modelo ms ampliamente utilizado para describir la cintica de formacin de producto,

es el de Luedeking y Piret16,17

, el cual matemticamente establece lo siguiente:

dp/dt = dx/dt + x (33)


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ecuacin que al ser multiplicada por "1/x" y al sustituir en ella las definiciones de la

velocidad especfica de crecimiento y de formacin de producto, da origen a:

qp = + (34)

esta ltima ecuacin representa una lnea recta al graficar qp (la velocidad especfica de

formacin de producto) VS , cuya pendiente y ordenada al origen son y respectivamente (figura 5). Los valores de estas constantes son los que darn origen a

las distintas clasificaciones de las fermentaciones respecto a la formacin de producto:asociada al crecimiento = 0 y 0; no asociada al crecimiento = 0 y 0;parcialmente asociada y distintos de cero.

Figura 2. Representacingrfica del crecimiento y de lavelocidad especfica de

crecimiento en unafermentacin por lote.

Figura 3. Efecto de latemperatura y del pH sobre lavelocidad especfica decrecimiento de unmicroorganismo creciendosobre un sustrato determinado.


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1.7.3. CINETICA DE CONSUMO DE SUSTRATO.

Puesto que el sustrato se utiliza para la sntesis de material celular (crecimiento), para el

mantenimiento de las funciones vitales del microorganismo (mantenimiento) y para la

sntesis del producto (produccin), al efectuar un balance de masa para el sustrato se

obtiene:

Figura 4. Clasificacin deGaden de los procesosFermentativos. a) Formacin deproducto asociada alcrecimiento; b) Formacin noasociada al crecimiento; c)Formacin parcialmenteasociada al crecimiento.

Figura 5. Modelo de Luedekingy Piret.


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(- ds/dt)tot =1 1

( )/ /Y

dx

dtm x

Y

dp

dtx s gs

p s

(35)

en la que (- ds/dt)tot es la velocidad instantnea de consumo de sustrato y el trmino "ms"

es el consumo de sustrato para mantenimiento celular sin que exista crecimiento (ya

definido en la seccin 1.3). Si se multiplica la ecuacin anterior por "1/x" se obtiene:

qs = 1 1( )/ /Ym

Yq

x s g

s

p s

p (36)

en la que qs es la velocidad especfica de consumo de sustrato. Para obtener los

parmetros de la ecuacin 36, basta con linearizar la misma y de la pendiente y la

ordenada se calculan dichos parmetros. As, al graficar (qs - qp/Yp/s) VS se pueden

obtener "(Yx/s)g" y "ms".

Cuando no hay formacin de producto el clculo es ms sencillo, como puede observarse

en la figura 6.

Figura 6. Representacingrfica del balance de masapara el sustrato: a) conformacin de producto y Yp/sconocido; b) sin formacin deproducto.


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1.8. BIBLIOGRAFIA

1. Aiba, S. A., E. Humphrey, and N. F. Millis. 1973. Biochemical Engineering. 2nd. Ed.

Academic Press, New-York.

2. Moat, A. G. 1979. Microbial Physiology. John Wiley & Sons. New-York. Chichester.

Brisbane. Toronto.

3. Moo-Young, M. 1977. The economics of SCP production. Process Biochem.

12(4):6-10.

4. Pirt, S. J. 1975. Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwell Scientific

Publications.

5. Crueger, W. and A. Crueger. 1989. Biotechnology: A Textbook of Industrial

Microbiology. 2nd. Edition. Sinauer Asociates, Inc. Sunderland, Ma.

6. Atkinson, B. and F. Mavituna. 1983. Biochemical Engineering and Biotechnology

Handbook. The Nature Press.

7. Wang, D. I. C., C. L. Cooney, A. L. Demain, P. Dunnill, A. E. Humphrey and M. D.

Lilly. 1979. Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley & Sons, Inc. New-

York. U. S. A.

8. Mateles, R. I. 1971. Calculation of oxygen required for cell production. Biotech.

Bioeng. 13:581-582.

9. Box, G. E. P. and K. B. Wilson. 1951. On the experimental attainment of optimum

conditions. J. Royal Statistical Society. 13(1):1-45.

10. Pilat, P., J. Votruba, P. Dobersky and A. Prokop. 1976. Application of mathematical

optimization methods in microbiology. Folia Microbiol. 21:391-405.

11. Mateles, R. I. and E. Battat. 1974. Continuous culture used for media optimization.

Appl. Microbiol. 28:901-905.

12. Goldberg I. and Z. Er-el. 1981. The Chemostat: An efficient technique for mediumoptimization. Process Biochem. 16 (Oct-nov):2-8.

13. Dostalek, M., L. Haggstrom, and N. Molina. 1972. Optimization of biomass

production from methanol. IN: Fermentation Technology Today. G. Terui Ed. Soc.

of Ferment. Tech. Japan.

14. Russell, T. W. F. and M. M. Denn. 1972. Introduction to Chemical Engineering

Analysis. Wiley, New-York.

15. Gaden, E. L. 1959. Fermentation process kinetics. J. Biochem. Microbiol. Technol.

Eng. 1:413-429.

16. Luedeking, R. and E. L. Piret. 1959. J. Biochem. Microbiol. Technol. Engng. 1:393.

17. Bailey, J. E. and D. F. Ollis. 1986. Biochemical Engineering Fundamentals. 2nd.Ed. Academic, Press.


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1.9. Nomenclatura

A = Constante cintica del modelo de Contois [=] M/M o contante de Arrenuis.

C% = Porcentaje en peso de carbono de un microorganismo.

CL = Concentracin de oxgeno disuelto [=] ML-3

Ea = Energa de activacin para el crecimiento celular [=] KcalMol-1

FC = Fuente de carbono

FN = Fuente de nitrgeno

H% = Porcentaje en peso de hidrgeno de un microorganismo.

Ha = Calor de combustin de la biomasa [=] kcalM-1

Hc = calor generado por el consumo de oxgeno [=] KcalMol-1

HO= calor generado por el consumo de oxgeno [=] KcalMol-1

K = Constante cintica del modelo de Konak o de Tessier

kO2 = Constante de saturacin de oxgeno [=] ML-3

kp = Constante de inhibicin por producto [=] ML-3

ks = Constante de inhibicin por sustrato [=]ML-3

mO2= Velocidad especfica de consumo de sustrato para mantenimiento [=] M/M/t

Ms = Peso molecular del sustrato.

ms = Velocidad especfica de consumo de sustrato para mantenimiento [=] M/M/t

N = Nmero de individuos

N% = Porcentaje en peso de nitrgeno de un microorganismo.

O% = Porcentaje en peso de oxgeno de un microorganismo.p = Concentracin de producto o constante cintica del modelo de Konank

ppm= partes por milln

QH = calor metablico [=]KcalL-3

t-1

QO2 = velocidad de consumo de oxgeno [=]ML-3

t-1

qp = Velocidad especfica de formacin de producto

qs = Velocidad especfica de consumo de sustrato [=] MM-1

L-3

= Coeficiente estequiomtrico de la ecuacin (8), o constante cintica de la ec. 33

r = Constante cintica del modelo de Moser

R = constante universal de los gases [=] 1.9872 Kcal/Mol K

s = concentracin de sustrato [=] ML-3

(s)m= Sustrato consumido para mantenimiento [=] M

(s)p = Sustrato consumido para formacin de producto [=] M

(s)tot= Sustrato total consumido [=] M


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(s)x= Sustrato consumido para crecimiento [=]M

T = Temperatura de crecimiento [=] K

td = Tiempo de dilucin [=] t

tg = Tiempo de generacin [=] t

V = Volumen de cultivo [=] L3

w = Nmero de tomos de oxgeno de un sustrato dado.

x = Concentracin celular y nmero de tomos de carbono de la frmula CxHwOz

para un sustrato dado.

X = Biomasa total [=] M

Yav.e= Rendimiento celular Con base en los electrones disponibles

Ykcal= Rendimiento celular Con base en la energa total disponible [=] M kcal-1

YO2 = Rendimiento celular Con base en oxgeno [=] M/M

Yp/s= Rendimiento celular de producto Con base en el sustrato [=] M/M

Yx/s= Rendimiento celular Con base en el sustrato [=] M/M(Yx/s)g = Rendimiento celular en base sustrato, para crecimiento verdadero [=] M/M

z = Nmero de tomos de oxgeno de un sustrato dado.

1.9.1. Griegas



= Coeficiente estequiomtrico de la ecuacin (8)




= Velocidad especfica de crecimiento [=] t-1

max = Velocidad especfica de crecimiento mxima [=] t-1


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1. CRECIMIENTO MICROBIANO Y CINTICA DE FERMENTACIONES. ................... 1

1.1. INTRODUCCION. ............................................................................................................. 11.2. CRECIMIENTOMICROBIANO. ..................................................................................... 2

1.2.1. LAS FUENTES NUTRICIAS. ..................................................................................... 3

1.3. RENDIMIENTOSYCOEFICIENTESDEMANTENIMIENTO. .................................... 51.4. ESTIMACIONDELCALORMETABOLICO. ................................................................. 7

1.5. ESTEQUIOMETRIADELCRECIMIENTOMICROBIANO. ......................................... 81.6. DISEODEMEDIOSDECULTIVO. .............................................................................. 91.7. MODELOSPARAELCRECIMIENTOMICROBIANO. .............................................. 10

1.7.1. CINETICA DE CRECIMIENTO. .............................................................................. 13

1.7.2. CINETICA DE FORMACION DE PRODUCTO. ..................................................... 15

1.7.3. CINETICA DE CONSUMO DE SUSTRATO............................................................ 17

1.8. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................. 191.9. NOMENCLATURA............................................................................................................... 20

1.9.1. Griegas ..................................................................................................................... 21

capítulo 1 cineticamicrobiana

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