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UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA

INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS,

especialidade de Biologia Molecular

em Medicina Tropical e Internacional

ESTUDO DA ACTIVIDADE ANGIOGÉNICA NA NURSE

CELL DE Trichinella spiralis NO DECURSO DA

TRIQUINELOSE EM MODELO ROEDOR

Cláudia Alexandra Pen de Oliveira Freitas

2011

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA

INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL

ESTUDO DA ACTIVIDADE ANGIOGÉNICA NA NURSE

CELL DE Trichinella spiralis NO DECURSO DA

TRIQUINELOSE EM MODELO ROEDOR

Cláudia Alexandra Pen de Oliveira Freitas

Tese apresentada para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências Biomédicas, especialidade de Biologia

Molecular em Medicina Tropical e Internacional.

Orientadora:

Professora Doutora Silvana Belo

Co - orientadora

Professora Doutora Maria Amélia Grácio

2011

The most exciting phrase to hear in science,

the one that heralds new discoveries,

is not "Eureka!" but "hum…that's funny..."'

Isaac Asimov

C.Freitas

Para os meus pais e irmãs

que enchem o meu coração de alegria.

We took on things which people might think would take a year or two.

They weren't particularly hard.

What was hard was believing they weren't hard.

Edwin Herbert Land

Agradecimentos

v

Agradecimentos

À Professora Doutora Silvana Belo pela inestimável orientação científica, transmissão de

conhecimentos, dedicação, amizade e carinho prestadas em todas as fases deste trabalho. Por olhar com

espírito crítico, inteligência e perseverança para o desenho desta investigação. Por me guiar com confiança e

pragmatismo para bom porto. Pelas horas dedicadas a este trabalho, nomeadamente com a análise estatística.

À Professora Doutora Maria Amélia Grácio pela sua ajuda na definição do tema da tese, pela sua

exigência, disponibilidade, carinho e paciência. Muito obrigada pela prontidão com que sempre se

disponibilizou em me apoiar.

Ao Professor Doutor Celso Cunha, Coordenador do 2º Ciclo em Ciências Biomédicas, da Unidade

de Ensino e Investigação de Biologia Molecular, pela sua disponibilidade na fase de decisão do tema da tese,

pela colaboração no sucesso das marcações nucleares das técnicas de imunofluorescência e pela sua

compreensão nos momentos de dificuldade.

A todos os colaboradores da Unidade de Helmintologia e Malacologia Médica do Instituto de

Higiene e Medicina Tropical pela partilha do laboratório e pela ajuda prestada, nomeadamente ao Pedro

Ferreira, à Cátia Ferreira e à Teresa pelos cuidados com os ratos no biotério.

À Técnica Isabel Clemente por toda a ajuda na componente de infecção e abate dos animais

experimentais. Obrigada por ser uma pessoa tão disponível, acessível e prática. Obrigada pela atenção e pelo

carinho com que me recebeu e sempre me tratou ao longo dos meses.

A todos os professores que leccionaram as disciplinas III curso de Mestrado em Ciências Biomédicas

pelos ensinamentos, conselhos e pontos de vista. Obrigada por me fazerem crescer.

A todos os colegas do III Curso de Mestrado pelo apoio, amizade e companheirismo que

demonstraram ao longo destes anos.

Ao Dr. Mário Oliveira, Director de Serviço do Laboratório de Anatomia Patológica do Centro

Hospitalar de Lisboa Central - Hospital de São José, pela autorização para a elaboração da componente

histológica e imunocitoquímica no laboratório, e pela bibliografia cedida.

Agradecimentos

vi

Ao Técnico José Ferreira da Silva, Coordenador Técnico do Laboratório de Anatomia Patológica do

CHLC – HSJ, por impulsionar os mecanismos necessários para o desenvolvimento de um trabalho com esta

logística. Obrigada pelos conselhos científicos e pelos conselhos de amigo.

A todos os colegas do serviço de Anatomia Patológica do Centro Hospitalar de Lisboa Central -

Hospital de São José, pela disponibilidade e boa vontade em assegurar o trabalho laboratorial na minha

ausência, nomeadamente à Carla Lopes, Sónia Pêgas e Elsa Mesquita, e pelas palavras motivacionais e

manhãs de riso que me aquecem o espírito.

À Leonor Silva pela ajuda técnica e paciência com as lâminas de Verhoeff.

À Dr.ª Manuela Martins pela disponibilidade na avaliação das técnicas histoquímicas e

imunocitoquímicas e pelas palavras de incentivo.

O meu sincero obrigada a toda a equipa da Neuropatologia do Hospital de Santa Maria, por me terem

acolhido em sua casa e providenciado as condições necessárias ao sucesso do meu trabalho, em particular: ao

Professor Doutor José Manuel Ferro, director do Serviço de Neurologia do Centro Hospitalar Lisboa Norte -

Hospital de Santa Maria, por ter disponibilizado o laboratório de Neuropatologia para a realização das

técnicas de imunofluorescência; ao Professor Doutor Pimentel na qualidade de director do laboratório de

neuropatologia por me ter recebido tão cordialmente e com tanto gosto; à Ana Rita Silvestre pela amizade e

pelos ensinamentos e partilha com os procedimentos técnicos com a biópsia muscular.

Ao Professor Mamede de Carvalho, na qualidade de Investigador Principal da Unidade de

Neuromusculares do Instituto de Medicina Molecular, por me ter recebido e disponibilizado o acesso aos

métodos microscópicos de imagem da sua Unidade.

Ao Pedro Pereira, meu amigo e companheiro de bancada. Por me ter guiado e estabelecido as

parcerias que tornaram possível a realização da componente prática deste trabalho. Pelos seus ensinamentos

sobre o processamento da biópsia muscular, pela ajuda com as técnicas de imunofluorescência e pela captura

de imagens por microscopia confocal. Pelos artigos que discutimos que “não acrescentam aparentemente

nada mas nos trazem conforto”. Por manter o meu cérebro acordado e os meus níveis de motivação elevados.

Por tudo o que me dá sem pedir nada em troca. Obrigada pelo teu tempo. Obrigada pela tua amizade.

Obrigada por me lembrares o que é importante na vida.

Agradecimentos

vii

Ao Bruno Martins que me convenceu que esta era uma aposta “ganha-ganha”. Obrigada por

acreditares desde sempre nas minhas capacidades, por me fazeres ir mais além, por me ajudares a crescer

enquanto pessoa, por agilizares este percurso, por me fazeres rir de mim própria e por me mostrares que a

confiança supera o medo.

À Teresa Lacerda por ter feito esta jornada de mestrado comigo. Estivemos juntas na expectativa de

entrar no mestrado, nas tardes de aulas após um dia de trabalho, na ansiedade de superar os novos desafios,

no medo de trabalhar com os ratos no laboratório, nos altos e baixos das nossas investigações, trocando

ideias, técnicas e metodologias. Fomos literalmente companheiras no sangue, no suor e nas lágrimas.

Obrigada por estares sempre presente, no bom e no mau da minha vida. Obrigada pelo incentivo, doçura,

paciência, inspiração e sobretudo por me pores os pés na terra.

Ao Hugo Pereira pelas tardes de companhia a escrever, pela ajuda com os gráficos e os esquemas,

pelo excelente trabalho na legendagem das imagens e ajuda na medição das 845 nurse cells avaliadas, pela

compreensão por todos os dias de indisponibilidade. Obrigada pelo teu tempo, pelo apoio incondicional, pelo

teu carinho e pelas palavras de força e encorajamento.

Aos meus pais. A eles lhes devo tudo o que sou. Obrigada por terem suportado as minhas ausências e

sofrido comigo as minhas desilusões ao longo de todos os anos de estudo.

Às minhas irmãs pelos sorrisos, pela alegria que me oferecem e por me manterem com uma visão

positiva da vida. Serão sempre o meu maior motivo de orgulho.

Resumo

viii

Resumo

A triquinelose é uma zoonose parasitária que é transmitida aos humanos e animais, através

da ingestão de carne crua ou insuficientemente cozinhada, que contenha larvas infectantes de

Trichinella spp., sendo actualmente considerada uma doença emergente e/ou re-emergente.

O sucesso do parasitismo do nemátode Trichinella spiralis está intimamente ligado com o

processo de angiogénese, ou seja, a formação de novos vasos a partir de vasos pré-existentes.

Com o objectivo de estudar a actividade angiogénica na nurse cell de T. spiralis, realizaram-

se técnicas imunohistoquímicas e imunofluorescentes para o factor de crescimento endotelial

vascular (VEGF), molécula-1 de adesão celular endotelial a plaquetas (PECAM-1) e actina músculo

liso (AML), em tecido muscular de Rattus rattus infectado com T. spiralis.

Através destas técnicas observou-se marcação intensa no infiltrado inflamatório adjacente à

nurse cell e também na larva. Já o citoplasma da nurse cell apresentou uma marcação moderada.

Este padrão de marcação manteve-se desde os 45 até aos 120 dias após a infecção.

A avaliação da densidade vascular (PECAM-1) e da densidade da expressão de células

positivas para AML permitiu estabelecer uma correlação positiva entre o aumento da densidade

vascular e o número de dias de infecção. Adicionalmente estabeleceu-se uma correlação negativa

entre o aumento da densidade de células que expressam AML e o número de dias de infecção.

Os resultados indicam uma produção constante de VEGF pela larva, pelo citoplasma da

nurse cell e pelo hospedeiro (infiltrado inflamatório), durante todo período de infecção, levando à

formação de uma rede vascular crescente (com um aumento médio de 79% face ao controlo),

acompanhada de células murais que promovem a sua estabilização (com um aumento médio de

50% face ao controlo) com particular incidência no primeiro período estudado (45 a 55 dias).

Palavras-chave: Triquinelose, Trichinella spiralis, angiogénese associada a helmintas; VEGF,

maturação de vasos; densidade vascular.

Abstract

ix

Thesis title: Study of the Trichinella spiralis nurse cell angiogenic activity during Trichinellosis in

rodent models

Abstract

Trichinellosis is a parasitic zoonosis, transmitted to humans and animals through the ingestion of raw

or undercooked meat, containing infective larvae of Trichinella spp. This disease is

currently considered as emerging and / or re-emerging.

Nematode Trichinella spiralis success as a parasite is strongly related to the angiogenesis process,

that is, the formation of new vessels from pre-existing ones.

In order to study the angiogenic activity in T. spiralis nurse cell, immunohistochemistry and

immunofluorescence for vascular endothelial grow factor (VEGF), platelet/endothelial cell adhesion

molecule-1 (PECAM-1), and α- smooth muscle actin (SMAα) was performed on Rattus rattus muscular

tissue infected with T. spiralis.

Intense immunostaining of VEGF was observed in the surrounding inflammatory cell infiltrate and

larva. Moderate immunostaining was noted in the developing nurse cell cytoplasm. This pattern persisted

from day 45 to day 120 after initial infection.

Vessel density (PECAM-1) and positive cells for SMAα density were evaluated. A positive

correlation was found between vascular density and the number of days after the initial infection. A negative

correlation was established between the density of cells expressing AML and the number of days.

These results show that there is a constant production of VEGF by the larva, nurse cell cytoplasm

and the host (inflammatory infiltrate) during the full period of infection, which results in the formation and

enlargement of the vascular network (with an average increase of 79% comparing with the control),

accompanied by the maturation and stabilization of the vessels (with an average increase of 50% comparing

with the control), mainly in the first observed period (45-55 days).

Key words: Trichinellosis, Trichinella spiralis, parasitic helminth-associated angiogenesis, VEGF,

vessel maturation; microvessel density.

x

Índice Geral

Índice de figuras .............................................................................................................................. xiv

Índice de tabelas .............................................................................................................................. xvi

Índice de quadros ........................................................................................................................... xvii

Lista de abreviaturas e símbolos ................................................................................................. xviii

1 Introdução ........................................................................................................................ 3

1.1 Questões de investigação ................................................................................................... 5

1.2 Hipóteses teóricas .............................................................................................................. 6

1.3 Objectivo geral .................................................................................................................. 7

1.4 Objectivos específicos ....................................................................................................... 7

2 Revisão da literatura ..................................................................................................... 13

2.1 Triquinelose: biologia, epidemiologia, aspectos clínicos e tratamento ........................... 13

2.1.1 Classificação taxonómica e espécies ........................................................................................................... 14 2.1.2 Morfologia e fisiologia dos parasitas .......................................................................................................... 15 2.1.3 Ciclo de vida de Trichinella spp. ................................................................................................................ 18 2.1.4 Hospedeiros de Trichinella spp. ................................................................................................................. 20 2.1.5 Epidemiologia ............................................................................................................................................. 22 2.1.6 Sintomatologia da triquinelose ................................................................................................................... 24 2.1.7 Diagnóstico da triquinelose ......................................................................................................................... 26 2.1.8 Tratamento da triquinelose ......................................................................................................................... 28

2.2 Angiogénese .................................................................................................................... 29

2.2.1 O sistema circulatório: características e propriedades gerais ...................................................................... 29 2.2.2 Desenvolvimento da rede vascular ............................................................................................................. 29 2.2.3 Angiogénese fisiológica .............................................................................................................................. 30 2.2.4 Angiogénese patológica .............................................................................................................................. 34 2.2.5 Factores pró-angiogénicos e anti-angiogénicos .......................................................................................... 36

2.3 Angiogénese associada a helmintoses ............................................................................. 50

xi

2.4 Angiogénese em T. spiralis ............................................................................................. 55

2.4.1 A descoberta da rede vascular na superfície da cápsula de T. spiralis ........................................................ 55 2.4.2 A estrutura da rede vascular na nurse cell de T. spiralis ............................................................................. 57 2.4.3 O significado biológico da angiogénese em T.spiralis ............................................................................... 59 2.4.4 Factores que estimulam a produção da rede vascular na nurse cell de T. spiralis ...................................... 60 2.4.5 Angiogénese em T. spiralis: novos avanços, mais questões ....................................................................... 63

3 Material e métodos ........................................................................................................ 69

3.1 Caracterização do estudo ................................................................................................. 69

3.2 Amostra ........................................................................................................................... 69

3.3 Critérios de inclusão e exclusão ...................................................................................... 69

3.4 Modelo Animal ................................................................................................................ 70

3.5 Infecção experimental. ..................................................................................................... 72

3.5.1 Exame parasitológico pré infecção: método de Willis ................................................................................ 72 3.5.2 Obtenção de tecidos de roedor infectado com T. spiralis. .......................................................................... 72 3.5.3 Preparação da dose infectante e infecção dos ratos..................................................................................... 74

3.6 Controlo de peso dos animais experimentais................................................................... 75

3.7 Colheita de amostras ........................................................................................................ 76

3.7.1 Colheita de sangue ...................................................................................................................................... 76 3.7.2 Colheita dos tecidos musculares ................................................................................................................. 76 3.7.3 Controlo da infecção parasitária ................................................................................................................. 77

3.8 Procedimentos histológicos com os tecidos musculares ................................................. 77

3.8.1 Fixação ........................................................................................................................................................ 77 3.8.2 Processamento histológico .......................................................................................................................... 78 3.8.3 Inclusão em parafina ................................................................................................................................... 78 3.8.4 Microtomia ................................................................................................................................................. 78

3.9 Procedimentos histológicos com a biópsia muscular ...................................................... 80

3.9.1 Colheita de amostras para biópsia muscular ............................................................................................... 80 3.9.2 Orientação da biópsia muscular para congelação ....................................................................................... 80 3.9.3 Congelação das biópsias ............................................................................................................................. 81 3.9.4 Corte histológico em crióstato .................................................................................................................... 84

xii

3.10 Métodos e técnicas histoquímicas ................................................................................... 85

3.10.1 Coloração Hematoxilina - Eosina ............................................................................................................... 86 3.10.2 Coloração Giemsa modificado .................................................................................................................... 87 3.10.3 Coloração Verhoeff ..................................................................................................................................... 88

3.11 Métodos e Técnicas Imunocitoquímicas ......................................................................... 89

3.11.1 Anticorpos utilizados para localização de constituintes in situ. .................................................................. 90 3.11.2 Aferição da técnica imunocitoquímica ....................................................................................................... 90 3.11.3 Controlo da qualidade da imunomarcação: controlos positivos e negativos ............................................... 92 3.11.4 Procedimentos da técnica imunocitoquímica .............................................................................................. 92

3.12 Métodos e técnicas de imunofluorescência ..................................................................... 94

3.12.1 Aferição da técnica de imunofluorescência e controlos .............................................................................. 95 3.12.2 Procedimentos da técnica de imunofluorescência ....................................................................................... 96

3.13 Avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF....................................................... 97

3.14 Medição da densidade vascular e da densidade da expressão de actina músculo liso. ... 99

3.15 Análise estatística. ......................................................................................................... 103

4 Resultados ..................................................................................................................... 107

4.1 Peso total dos animais experimentais ............................................................................ 107

4.2 Monitorização da infecção parasitária ........................................................................... 108

4.3 Análise morfológica qualitativa ..................................................................................... 109

4.3.1 Avaliação histológica da preservação morfológica dos tecidos musculares ............................................. 109 4.3.2 Identificação histológica e quantificação de nurse cells de T. spiralis nos tecidos musculares ................ 111 4.3.3 Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas nas nurse cells de T. spiralis e áreas adjacentes 113

4.4 Estudo da expressão de VEGF ...................................................................................... 116

4.4.1 Localização morfológica do VEGF na nurse cell ..................................................................................... 116 4.4.2 Tipo de marcação ...................................................................................................................................... 116 4.4.3 Período de expressão do VEGF na nurse cell de T. spiralis ..................................................................... 116 4.4.4 Avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF ................................................................................ 118

4.5 Avaliação Histomorfométrica ........................................................................................ 122

4.5.1 Estudo da formação de novos vasos ......................................................................................................... 122 4.5.2 Estudo do recrutamento de células de músculo liso .................................................................................. 125

xiii

4.5.3 Correlação da expressão de VEGF, PECAM-1 e AML ............................................................................ 128

5 Discussão e conclusões ................................................................................................. 133

5.1 Monitorização da infecção parasitária ........................................................................... 133

5.2 Análise morfológica qualitativa ..................................................................................... 134

5.2.1 Preservação morfológica ........................................................................................................................... 134 5.2.2 Identificação histológica do parasita e quantificação de nurse cells ......................................................... 134 5.2.3 Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas ............................................................................ 134

5.3 Estudo da expressão de VEGF na nurse cell de T.spiralis ............................................ 135

5.3.1 Locais morfológicos onde é expresso o VEGF ......................................................................................... 135 5.3.2 Período de tempo em que é expresso o VEGF. ......................................................................................... 136 5.3.3 Relação entre a expressão de VEGF e o número de dias pós-infecção ..................................................... 136 5.3.4 Relação entre a intensidade e os locais de expressão de VEGF. ............................................................... 137

5.4 Estudo da formação de novos vasos .............................................................................. 139

5.4.1 Relação entre o aumento de vasos junto à nurse cell e o número de dias pós- infecção ........................... 139

5.5 Estudo do recrutamento de células de músculo liso ...................................................... 140

5.5.1 Relação entre as células que expressam AML e o número de dias pós-infecção ...................................... 140

5.6 Estudo da relação entre o VEGF, o número de vasos formados e a sua maturação ...... 143

5.7 Estudos futuros .............................................................................................................. 144

5.8 Considerações finais ...................................................................................................... 146

6 Referências bibliográficas ........................................................................................... 151

Anexos ............................................................................................................................................. 171

Anexo A. Soluções utilizadas nas técnicas Histoquímicas .............................................................. 171

Anexo B. Soluções utilizadas nas técnicas imunocitoquímicas e imunofluorescentes .................... 172

xiv

Índice de figuras

Figura 1. Morfologia de T. spiralis: fêmea e macho adultos, larva newborn e nurse cell. ................ 17

Figura 2. Morfologia de T. spiralis .................................................................................................... 17

Figura 3. Ciclo de vida de Trichinella sp. .......................................................................................... 19

Figura 4. Distribuição global de T.spiralis; T.pseudospiralis; T.papuae e T. zimbabwensis ............ 22

Figura 5. Distribuição global de T.nativa, T. brivoti, T. murrelli, T. nelsoni, Trichinella T6,T8,T9. 23

Figura 6. Correlação dos sintomas da triquinelose com o tempo de infecção. .................................. 25

Figura 7. Vasculogénese e angiogénese. ............................................................................................ 32

Figura 8. Interacção dos VEGFs com os seus três receptores e os tecidos que os expressam. .......... 41

Figura 9. Recrutamento de células murais e maturação dos vasos sanguíneos ................................. 45

Figura 10. Via hipotética utilizada pelos helmintas parasitas na indução de angiogénese. ............... 51

Figura 11. Desenho da rede vascular em músculo infectado com T. spiralis. ................................... 55

Figura 12. Injecção de tinta-da-china na rede vascular da nurse cell de T. spiralis. ......................... 56

Figura 13. Angiogénese e formação da nurse cell. ............................................................................ 56

Figura 14. Moldes anatómicos da rede vascular envolvente da nurse cell. ....................................... 58

Figura 15. Representação da rede vascular envolvendo a nurse cell de T. spiralis. .......................... 59

Figura 16. Mecanismos utilizados pelo parasita que estimulam a angiogénese ................................ 63

Figura 17. Modelo animal. ................................................................................................................. 71

Figura 18. Ratos mantidos no biotério do IHMT. .............................................................................. 71

Figura 19. Método de Willis .............................................................................................................. 72

Figura 20. Fixação do rato infectado à placa de dissecação. ............................................................. 73

Figura 21. Larvas de T. spiralis do masseter do rato infectado. ........................................................ 73

Figura 22. Avaliação da carga parasitária de músculo infectado com T.spiralis no triquinoscópio. 74

Figura 23. Larvas de T.spiralis do masseter do rato infectado. ......................................................... 74

Figura 24. Fragmentos de músculo parasitado com T.spiralis envoltos em pão para infecção oral. . 75

Figura 25. Controlo do peso dos ratos. .............................................................................................. 75

Figura 26. Tecidos musculares colhidos após o abate os ratos. ......................................................... 76

Figura 27. Cassetes histológicas com tecidos musculares para fixação. ........................................... 77

Figura 28. Corte histológico dos fragmentos de músculo. ................................................................. 79

Figura 29. Orientação das biópsias musculares em disco de cortiça para congelação. ..................... 81

Figura 30. Congelação de biópsia muscular em isopentano arrefecido com azoto líquido. .............. 82

Figura 31. Material de congelação das biópsias. ............................................................................... 83

Figura 32. Congelação das biópsias musculares. ............................................................................... 83

Figura 33. Corte das biópsias musculares em crióstato. .................................................................... 85

xv

Figura 34. Coloração de fibras elásticas com a solução de Verhoeff. ............................................... 89

Figura 35. Esquema das lâminas de controlo positivo utilizadas nas técnicas imunocitoquímicas... 91

Figura 36. Avaliação da expressão de VEGF por técnicas de imunofluorescência. .......................... 99

Figura 37. Metodologia utilizada na medição da densidade vascular e da densidade de AML. ..... 102

Figura 38. Evolução do peso dos ratos experimentais, entre o dia de infecção e o dia de abate. .... 107

Figura 39. Observação de músculo infectado com larvas de T.spiralis pelo triquinoscópio. .......... 108

Figura 40. Avaliação histológica qualitativa da preservação morfológica dos tecidos musculares. 110

Figura 41. Avaliação histológica qualitativa da preservação morfológica dos tecidos musculares. 110

Figura 42. Identificação histológica de nurse cells de T. spiralis nos tecidos musculares. ............. 112

Figura 43. Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas nas nurse cells de T. spiralis. .. 115

Figura 44. Expressão imunocitoquímica de VEGF nas nurse cells de T.spiralis. ........................... 117

Figura 45. Expressão imunofluorescente de VEGF nas nurse cells de T.spiralis. .......................... 118

Figura 46. Expressão imunocitoquímica de VEGF nas nurse cells de T. spiralis. .......................... 120

Figura 47. Expressão imunofluorescente de VEGF nas nurse cells de T. spiralis. ......................... 121

Figura 48. Expressão imunocitoquímica e imunofluorescente de VEGF nas nurse cells. .............. 122

Figura 49. Expressão imunocitoquímica de PECAM-1 nas nurse cells de T.spiralis. .................... 123

Figura 50. Expressão imunocitoquímica de PECAM-1 nas nurse cells de T.spiralis. .................... 124

Figura 51. Expressão imunofluorescente de PECAM-1 nas nurse cells de T.spiralis. .................... 125

Figura 52. Expressão imunocitoquímica de AML nas nurse cells de T.spiralis. ............................ 126

Figura 53. Densidade de expressão imunocitoquímica de AML nas nurse cells de T.spiralis. ...... 127

Figura 54. Densidade vascular e da densidade de expressão de AML nas nurse cells. ................... 128

Figura 55. Aumento médio de área ocupado por PECAM-1 e AML nas nurse cells. ..................... 129

xvi

Índice de tabelas

Tabela 1. Regiões com infecções por Trichinella spp. documentadas .............................................. 24

Tabela 2. Grupos de ratos em estudo separados por dias de infecção ............................................... 71

Tabela 3. Avaliação histológica qualitativa da preservação morfológica dos tecidos musculares .. 109

Tabela 4. Identificação histológica de nurse cells de T. spiralis. .................................................... 111

Tabela 5. Quantificação de nurse cells de T. spiralis ...................................................................... 113

Tabela 6. Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas nas nurse cells de T. spiralis. ... 114

xvii

Índice de quadros

Quadro 1. Classificação taxonómica de Trichinella spp. ................................................................... 15

Quadro 2. Características epidemiológicas e hospedeiros de Trichinella spp. e genótipos............... 21

Quadro 3. Definição de casos para triquinelose humana. .................................................................. 28

Quadro 4. Inibidores da angiogénese em uso corrente na prática clínica .......................................... 48

Quadro 5. Especificidade da imunomarcação dos anticorpos primários utilizados. .......................... 90

Quadro 6. Anticorpos primários utilizados nas técnicas imunocitoquímicas. ................................... 92

Quadro 7. Anticorpos primários utilizados nas técnicas de imunofluorescência. ............................. 95

Quadro 8. Anticorpo secundário utilizado nas técnicas de imunofluorescência. ............................... 95

Quadro 9. Características corante nuclear utilizado nas técnicas de imunofluorescência. ................ 95

Quadro 10. Scores da avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF ....................................... 98

Quadro 11. Avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF por técnicas imunocitoquímicas.119

xviii

Lista de abreviaturas e símbolos

ºC Graus Célsius

% Fracção ou percentual em massa ou em peso (%p)

µm2 Micrometros quadrados

Ang “Angiopoietin” (angiopoietina)

BMP “Bone morphogenetic protein”

CEs Células epiteliais

CK “Creatine kinase” (Creatinina cinase)

EUA Estados Unidos da América

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

Dll4 “Delta-like ligand 4”

DNA “Deoxyribonucleic acid, (Ácido desoxirribonucleico)

EGF “Epidermal growth factor” (Factor de crescimento epitelial)

FGF2 “Fibroblast growth factor” (Factor de crescimento de fibroblastos básico)

FDA “Food and Drug Administration”

FVIII Factor de Von Willebrand

g Gramas

HIF-1 “Hypoxia-inducible factor-1” (Factor indutor de hipóxia-1)

HIF-1α “Hypoxia-inducible factor-1α” (Factor indutor de hipóxia 1-alfa)

HIF-1β “Hypoxia-inducible factor-1β” (Factor indutor de hipóxia 1-beta)

Igs Imunoglobulinas

IC Imunocitoquímica

IF Imunofluorescência

IL Interleucina

mL Mililitros

mm Milímetros

MMP Metaloprotease

mRNA “Messenger Ribonucleic acid” (Ácido ribonucleico mensageiro)

mtATP “Mitochondrial Adenosine Triphosphate” (Trifosfato de adenosina mitocondrial)

xix

NaCl Cloreto de Sódio

nm Nanómetros

PDGF “Platelet-derived growth factor” (Factor de crescimento derivado das plaquetas)

PDGFR “Platelet-derived growth factor receptor” (Receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas)

PECAM-1 “Platelet/endothelial cell adhesion molecule-1” (Molécula-1 de adesão celular endotelial a plaquetas)

PIGF “Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein” (Factor de crescimento placentar)

RTK “Tyrosine Kinase receptor” (Receptores tirosina – cinases)

SMAα/AML “α-Smooth muscle actin” (Actina músculo liso)

SPSS “Statistical Package for the Social Sciences”

TGF-β “Transforming growth factor beta” (Factor de transformação do crescimento beta)

TNF ”Tumor necrosis factor”

TSL “Trichinella spiralis larvae”

TSP-1 “Thrombospondin-1” (Trombospondina-1)

VEGF “Vascular endothelial growth factor” (Factor de crescimento endotelial vascular)

VEGFR “Vascular endothelial growth factor receptor” (Receptor do factor de crescimento endotelial vascular)

VPF “Vascular permeability factor” (Factor de permeabilidade vascular)

1 Introdução

Capítulo 1 – Introdução

3

1 Introdução

Angiogénese, o processo de formação de novos vasos a partir de vasos pré-existentes, tem

um papel essencial no sucesso do parasitismo do nemátode T. spiralis. Este processo decorre

aquando da formação e manutenção da nurse cell: uma consequência única da associação da larva

parasita infectante (L1) com a célula muscular hospedeira (miócito), que protege o parasita da

resposta imune do hospedeiro e permite o seu crescimento. A nurse cell pode ser encarada como

uma estratégia de parasitismo de longa duração, em que os novos vasos garantem ao parasita as

condições de que necessita para sobreviver, fornecendo-lhe nutrientes e oxigénio, e facilitando o

transporte de produtos de excreção. A nurse cell pode sobreviver no hospedeiro humano mais de 40

anos e, em alguns casos, durante toda a vida de outros mamíferos.

Os estudos sobre a angiogénese foram iniciados há mais de um século, focando-se sobretudo

na proliferação tumoral e metastização. A biologia e os mecanismos moleculares da angiogénese

tumoral mostram algumas analogias com a angiogénese associada aos helmintas, indicando que

potencialmente alguns parasitas, como T. spiralis poderão ter a capacidade de iniciar processos que

estimulem a angiogénese (pró-angiogénicos).

A coincidência de processos da angiogénese e formação da nurse cell ocorre por

reprogramação da expressão genética do hospedeiro pela L1 (Despommier, 1993). A nurse cell é

formada por uma cápsula de colagénio rodeada por uma rede de vasos de tipo capilar, aumentados

(Humes & Akers, 1952; Despommier, 1990; Baruch & Despommier, 1991), de morfologia simples,

complexa e hipercomplexa (Baruch & Despommier, 1991), e infiltrado celular inflamatório. Foram

encontradas evidências de que o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), um importante

factor pró-angiogénico, desempenha um papel essencial na angiogénese de T. spiralis,

permanecendo sobre expresso durante o período de infecção (Capó et al., 1998). Adicionalmente,

existem estudos que indicam que as células inflamatórias adjacentes à nurse cell contribuem para a

produção de VEGF (Shariati et al., 2009). Está no entanto por esclarecer a expressão de factores


4

pró-angiogénicos pelo parasita. Por outro lado, sabe-se que o VEGF é responsável pela iniciação da

vascularização, embora por si só origine vasos instáveis e imaturos. A transição de uma rede no

estado activo, em crescimento, para o estado quiescente, estável e funcional, requer a maturação dos

vasos, isto é, a associação de perícitos e células do músculo liso que lhes confiram essa estabilidade

(Carmeliet, 2003). Há pouca informação disponível que elucide se a rede vascular da nurse cell é

tendencialmente estável, madura e quiescente (como na angiogénese fisiológica) ou permeável,

irregular e activa como no caso dos tumores (Bergers & Benjamin, 2003; Semela & Dufour, 2004).

O conhecimento da actividade angiogénica da nurse cell de T. spiralis poderá dar um

importante contributo para a descoberta e/ou utilização de fármacos inibidores da angiogénese, bem

como para o desenvolvimento de abordagens preventivas e terapêuticas para a triquinelose, e para

outras doenças que, à partida, não parecem relacionadas.

A triquinelose é uma zoonose, com distribuição mundial, causada por nemátodes do género

Trichinella. A infecção humana ocorre após o consumo de carne insuficientemente cozinhada, de

animais domésticos ou selvagens, que contenham a larva infectante de Trichinella spp.

A triquinelose tem uma distribuição cosmopolita, sendo encontrada em todos os continentes

com excepção da Antártica (Pozio & Murrell, 2006). A triquinelose em humanos é vista como uma

doença alimentar emergente ou re-emergente no mundo, particularmente em países da Europa

Oriental. Em Portugal, a prevenção e controlo desta doença é regulamentada através do

Regulamento (CE) n.º 854/2004 do parlamento e do conselho europeu, de 29 de Abril de 2004, que

“estabelece as regras específicas de execução dos controlos oficiais de produtos de origem animal

destinados ao consumo humano”, e o Regulamento (CE) nº 1665/2006 que “estabelece regras

específicas sobre os controlos oficiais de triquinas na carne”. A nível internacional a

Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação, a Organização Mundial da Saúde,

a Organização Mundial da Saúde Animal e a Comissão Internacional de triquinelose, têm realizado

recomendações no sentido de estabelecerem ou re-estabelecerem programas de


5

prevenção e controlo encorajando a investigação desta doença potencialmente letal (Dupouy-Camet

& Murrell, 2007).

Apesar dos avanços científicos sobre a compreensão da biologia do parasita existem poucos

trabalhos desenvolvidos que elucidem sobre a angiogénese da nurse cell de T. spiralis. Para que

seja possível interferir com a formação da rede circulatória, com o objectivo de controlar ou

eliminar a doença, parece razoável, primeiro que tudo, compreender a actividade angiogénica num

modelo animal, e a partir daí, delinear uma estratégia terapêutica que mostre o sucesso da inibição

angiogénica por comparação com os estudos iniciais do modelo animal.

Neste contexto o domínio de investigação deste trabalho incidiu em três temas: 1) estudo da

expressão de factores pró-angiogénicos (VEGF) que promovem e/ou mantêm a angiogénese; 2)

estudo da formação de novos vasos e 3) o estudo da maturação dos novos vasos.

1.1 Questões de investigação

Como ponto de partida são elencadas as questões que se pretendem endereçar neste estudo:

1. Quais são os locais morfológicos onde é expresso o VEGF na nurse cell de T. spiralis?

2. Durante quanto tempo é expresso o VEGF na nurse cell de T. spiralis?

3. Existe uma relação entre a expressão de VEGF e o número de dias pós-infecção?

4. Existe uma relação entre a intensidade da expressão de VEGF e os locais de expressão

do VEGF na nurse cell de T. spiralis?

5. Existe uma relação entre o aumento de vasos junto à nurse cell e o número de dias pós-

infecção?

6. Existe uma relação entre as células que expressam actina músculo liso (AML)

(indicativo de maturação dos vasos) e o número de dias pós-infecção?

7. Existem relações entre os factores VEGF, número de vasos formados e maturação de

vasos?


6

1.2 Hipóteses teóricas

1. VEGF é expresso no citoplasma da nurse cell e no tecido inflamatório adjacente.

2. VEGF é expresso durante todo o período de infecção de T.spiralis no hospedeiro.

3. A expressão de VEGF diminui com o número de dias pós-infecção, o que é indicativo de

uma dependência maior de VEGF aquando a formação inicial dos vasos.

4. VEGF é expresso com mais intensidade nas células inflamatórias do que na nurse cell.

5. Há um aumento de vasos junto à nurse cell nos primeiros dias pós – infecção, seguido de

uma estabilização do número de vasos.

6. O número de células que expressam músculo liso aumenta com os dias pós – infecção,

indicando maturação dos vasos com o decorrer da triquinelose.

7. Se o parasita necessita de novos vasos que lhe permitam receber oxigénio e excretar

produtos metabólicos, há a produção de factores angiogénicos (VEGF) pela nurse cell,

bem como pelo hospedeiro (tecido inflamatório). Essa expressão deve ocorrer com mais

intensidade no início da infecção, quando as células endoteliais dos novos vasos estão

em produção. Como resultado haverá uma formação crescente de vasos sanguíneos. Essa

produção de vasos deverá estabilizar com o decorrer da infecção. Com o avançar da

infecção os novos vasos formados tenderão a perder a dependência de VEGF,

diminuindo a intensidade da expressão, e aumentando a expressão de AML, indicando

que os novos vasos se encontram em maturação, com associação de perícitos, de modo a

formar uma rede estável que permita ao parasita a manutenção do parasitismo durante

muitos anos. Ou seja, com o decorrer dos dias de infecção haverá menos expressão de

VEGF (por maturação das novas células endoteliais formadas), mais vasos formados e

mais expressão de AML (por maturação dos vasos com aumento de perícitos)

De modo a responder às questões de partida e a comprovar as hipóteses teóricas, o presente

estudo teve como objectivos:


7

1.3 Objectivo geral

Estudar a actividade angiogénica na nurse cell de T. spiralis, em diversas fases do ciclo de

vida do parasita (45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 e 120 dias pós-infecção), utilizando uma

combinação de abordagens histológicas em modelo roedor.

1.4 Objectivos específicos

1. Caracterizar a expressão do factor de crescimento endotelial eascular (VEGF) na nurse

cell de T. spiralis, no contexto da morfologia e histologia, em diversas fases do ciclo de

vida do parasita (45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 e 120 dias pós-infecção), em modelo

roedor, mediante a avaliação semi quantitativa de técnicas imunocitoquímicas e

imunofluorescentes.

2. Quantificar os novos vasos formados pelo processo de angiogénese, na nurse cell de T.

spiralis, em diversas fases do ciclo de vida do parasita (45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90

e 120 dias pós-infecção), em modelo roedor, mediante a avaliação histomorfométrica

(medição da densidade vascular), utilizando técnicas imunocitoquímicas e

imunofluorescentes.

3. Quantificar a expressão de células de músculo liso na nurse cell de T. spiralis, em

diversas fases do ciclo de vida do parasita (45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 e 120 dias

pós-infecção), em modelo roedor, mediante a avaliação histomorfométrica (medição da

densidade de células que expressam actina músculo liso), utilizando técnicas

imunocitoquímicas.

4. Correlacionar a densidade vascular, a densidade de células que expressam actina

músculo liso e a expressão do factor de crescimento endotelial vascular, com as diversas

fases do ciclo de vida de T. spiralis (45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 e 120 dias pós-

infecção), em modelo roedor.


8

Para atingir os objectivos propostos para esta tese de dissertação, foram constituídos sete

capítulos. O primeiro capítulo com uma introdução geral sobre o tema, incluindo um

enquadramento teórico dos assuntos tratados e uma abordagem ao interesse da angiogénese em T.

spiralis e onde são colocadas as questões de investigação, as hipóteses teóricas a que se procura

responder e os objectivos que enunciam o que se pretende fazer para obter resposta às questões de

investigação.

O segundo capítulo com uma revisão da literatura, relativa às informações e à investigação

realizada em áreas próximas do alvo deste trabalho, distribuída por quatro secções: a primeira com

uma breve revisão da biologia, epidemiologia, aspectos clínicos, diagnóstico e tratamento da

triquinelose; a segunda com os conceitos básicos da vasculogénese e angiogénese, bem como o seu

papel no contexto neoplásico e não neoplásico; a terceira, e por se tratar de uma área de

investigação directamente relacionada com o tema deste trabalho, com a identificação de alguns

trabalhos realizados por outros investigadores na área da angiogénese associada a helmintoses e a

quarta com a descrição das investigações de angiogénese em T. spiralis, com particular destaque

para uma síntese dos principais resultados obtidos por outros autores que são considerados

relevantes para o presente trabalho.

O terceiro capítulo dedicado a material e métodos utilizados no trabalho, fundamentando os

instrumentos escolhidos em função das hipóteses formuladas.

O quarto capítulo destinado à apresentação dos resultados obtidos, por referências às

hipóteses e previsões iniciais, sendo descritos os métodos utilizados para o tratamento dos dados e

os testes estatísticos aplicados. Este capítulo incluirá também as relações dos resultados obtidos

com as previsões iniciais.

O quinto capítulo com a discussão e conclusões, constituindo uma reflexão sobre os

resultados encontrados. Este capítulo abordará eventuais limitações do trabalho, e perspectivas para

trabalhos futuros.


9

O sexto capítulo com as referências bibliográficas. Por fim, encontram-se os anexos que

foram referenciados no texto.

O presente estudo integrou-se na linha de investigação “Helmintoses humanas, diagnóstico e

epidemiologia” da Unidade de Helmintologia e Malacologia Médicas / Unidade de Parasitologia e

Microbiologia Médicas, do Instituto de Higiene e Medicina Tropical.

11

2 Revisão da literatura

Capítulo 2 – Revisão da literatura

13

2 Revisão da literatura

2.1 Triquinelose: biologia, epidemiologia, aspectos clínicos e tratamento

A triquinelose é uma doença causada por parasitas nemátodes do género Trichinella a qual

ocorre após ingestão de carne, crua ou insuficientemente cozinhada, contendo larvas infectantes do

parasita. A transmissão vertical para a descendência também se pode verificar em alguns animais,

nomeadamente em furões, porquinhos-da-índia e ratos (Webster & Kapel, 2005).

São conhecidas oito espécies de Trichinella, muitas delas com reservatórios naturais em

animais silváticos. Os humanos podem adquirir a infecção a partir de várias fontes, tais como a

carne de cavalos, de caça selvagem, de pássaros e até de répteis. No entanto, o consumo de carne de

porco doméstico e/ou produtos derivados são a fonte de infecção mais comum (Pozio, 2005).

A prevalência da triquinelose humana está globalmente estimada em 11 milhões (Dupouy-

Camet, 2000), sendo a sua distribuição mundial, é encontrada em todos os continentes, com

excepção da Antártica, onde não existem estudos epidemiológicos que permitam concluir sobre a

prevalência destes nemátodes (Pozio & Murrell, 2006).

Devido à importância zoonótica da infecção, diversos países têm direccionado os seus

esforços no controlo e/ou eliminação de Trichinella da cadeia alimentar. Até à década de oitenta do

século passado havia o consenso geral de que a triquinelose estava em declínio, como resultado do

aumento do controlo e inspecção na maioria das regiões. A persistência da doença estava sobretudo

associada a condições de pobreza, poucas condições sanitárias e determinados hábitos na criação de

animais. Nos anos 80 e 90 (século XX) verificou-se o ressurgimento da triquinelose. Alguns dos

aumentos de triquinelose mais expressivos verificaram-se na Europa, onde o consumo de carne de

javali e de cavalo têm tido um papel relevante nas últimas três décadas (Gottstein et al., 2009).

Actualmente, a expansão da triquinelose na Europa é associada a diversos factores de carácter

social, económico e político, por exemplo, a adesão à União Europeia dos países de leste onde

existe o hábito de alimentar os animais com carnes de outros animais (Pozio, 2001; Cuperlovic et

al., 2005) . Estas alterações levaram a uma redução da eficácia do controlo veterinário na produção


14

de carne animal. Na América Latina e na Ásia foram observadas as mesmas influências

socioeconómicas, tendo sido reportados centenas de casos humanos, sendo alguns letais (Dupouy-

Camet & Murrell, 2007).

Como consequência da emergência/re-emergência da triquinelose na Europa, a União

Europeia implementou um programa de monitorização para porcos, cavalos, animais de caça e

outras espécies selvagens (EFSA, 2007) e a Comissão Europeia implementou o regulamento (CE)

nº 1665/2006 que “estabelece regras específicas sobre os controlos oficiais de triquinas na carne”,

de modo a melhorar a segurança alimentar dos consumidores europeus.

Para além da morbilidade e mortalidade causadas pela doença, a triquinelose representa um

problema económico e social, numa sociedade cada vez mais globalizada. Desta forma, torna-se

essencial o desenvolvimento de investigação que aumente o conhecimento epidemiológico e

biológico da doença, e a implementação de programas de controlo e prevenção desta parasitose.

2.1.1 Classificação taxonómica e espécies

Os estudos da sistemática, facilitados por ferramentas moleculares, bioquímicas e

biológicas, permitiram verificar que o género Trichinella apresenta duas divisões: as espécies que

formam uma cápsula de colagénio (enquistamento) quando invadem as células musculares (cinco

espécies e quatro genótipos), e as espécies onde não ocorre a formação desta cápsula (três espécies)

(Pozio & Murrell, 2006; Gottstein et al., 2009; Pozio et al., 2009). A classificação taxonómica de

Trichinella encontra-se no Quadro 1.


15

Quadro 1. Classificação taxonómica de Trichinella spp.

Adaptado de NCBI Taxonomy Browser, 2011

Filo: Nematoda

Classe: Enoplea

Subclasse Enoplia

Ordem Trichocephalida

Família: Trichinellidae

Género: Trichinella

Espécies:

Espécies que formam cápsula

T. spiralis (T1)

T. nativa (T2)

T. britovi (T3)

T. murrelli (T5)

T. nelson (T7)

T. T6

T. T8

T. T9

T. T12

Espécies que não formam cápsula

T. pseudospiralis (T4)

T. papuae (T10)

T. zimbabwensis (T11)

No género Trichinella, T. spiralis é o maior agente causal de infecção humana (Pozio &

Murrell, 2006). Faz parte do grupo que forma cápsulas no tecido muscular hospedeiro, juntamente

com T. nativa (inclui o genótipo T. T6), T. britovi, T. murrelli, T. nelson, e genótipos T. T8 (muito

similar a T. britovi), T9 (filogeneticamente relacionado com T. murrelli) e T12. Este grupo tem em

comum o facto de apenas parasitarem mamíferos. O grupo onde não ocorre a formação de cápsula é

constituído por três espécies: T. pseudospiralis, T. papuae e T. zimbabwensis e parasitam

mamíferos, pássaros e alguns répteis (Pozio & Murrell, 2006; Gottstein et al., 2009).

2.1.2 Morfologia e fisiologia dos parasitas

Os parasitas adultos de T. spiralis são delgados e cilíndricos. Os machos são menores,

medindo entre 1,4 e 1,6 mm de comprimento e possuindo um diâmetro de cerca de 40 a 60 µm. As

fêmeas medem entre 3 e 4 mm de comprimento e cerca de 36 µm de diâmetro (Roberts, 2005).


16

A boca conduz ao esófago que se encontra na parte muscular e no esticosoma. O ânus é

terminal em ambos os sexos. No macho, o testículo tem uma secção ascendente e forma uma

vesícula seminal. A extremidade posterior do macho é provida de apêndices copuladores por onde

sai a parede da cloaca, quando em protusão para a cópula. Na fêmea o esticosoma ocupa o terço

anterior, a vulva localiza-se junto ao esófago e existe um único ovário. O útero ocupa quase a

totalidade da cavidade corporal. A porção posterior do útero acolhe os ovos em desenvolvimento

(com cerca de 30 µm de diâmetro) enquanto a porção anterior contém embriões (Roberts, 2005).

As larvas recém nascidas (newborn) têm um tamanho médio de 111 µm de comprimento e

7 µm de diâmetro. A extremidade anterior é arredondada com uma identação terminal que

representa a boca. Tem uma estrutura de estilete bucal com movimentos de protusão e retracção.

Por trás da boca existe um bulbo esofágico pouco diferenciado que se une a uma coluna de núcleos,

correspondentes a células não diferenciadas. Há ainda um primórdio de esticosoma. Neste estado

não é possível identificar o sexo (Roberts, 2005; Dupouy-Camet & Murrell, 2007).

As larvas contidas no tecido muscular (L1) medem cerca de 1mm de largura por 35-38 µm

de diâmetro, estando tipicamente enroladas em espiral. A L1 é uma fase avançada da newborn.

Neste estado é possível diferenciar os sexos pela disposição que ocupa o primórdio genital e o

intestino: nos futuros machos estas estruturas cruzam-se, enquanto nas futuras fêmeas encontram-se

paralelas. Quando libertadas no estômago as larvas apresentam movimentos de extensão e

enrolamento contínuos (Roberts, 2005). Alguns aspectos da morfologia de T.spiralis são mostrados

na Figura 1e na Figura 2.


17

Figura 1. Morfologia de T. spiralis: fêmea e macho adultos, larva newborn e nurse cell. A) fêmea adulta de T. spiralis medindo 3mm x 36 µm. Observam-se larvas formadas no útero. B) macho adulto medindo 1.5mm x 36 µm. Os apêndices copuladores são visíveis na extremidade posterior. C) Larva newborn medindo 70 x 7 µm. D) nurse cell de formato elíptico com larva enrolada em espiral. A a C adaptado http://www.Trichinella.org/. D- coloração Azul de Toluidina a 2% (Original de C. Freitas).

Figura 2. Morfologia de T. spiralis

A) Macho adulto; B) Fêmea adulta; C) Larva newborn; D) larva muscular. Adaptado de http://www.Trichinella.org

A B C D


18

2.1.3 Ciclo de vida de Trichinella spp.

O ciclo de vida de todas as espécies do género Trichinella (Figura 3) ocorre num único

hospedeiro. Após a ingestão de carne contendo larvas de Trichinella, estas são libertadas no

estômago do novo hospedeiro pelo processo de digestão, atingem o duodeno e vão penetrar nas

células epiteliais colunares do intestino delgado. O desenvolvimento para a forma adulta (de L1 a

L5) ocorre em aproximadamente 48 horas após a infecção. Depois da cópula, o macho morre ou é

eliminado e a fêmea inicia a produção de larvas. Cinco a sete dias após a infecção a fêmea começa a

libertar novas gerações de larvas (newborn). A libertação de larvas newborn continua pelo menos

por uma a duas semanas, conforme a resposta imune do hospedeiro. Este processo afecta a

viabilidade das larvas adultas, resultando na sua expulsão contínua (Dupouy-Camet & Murrell,

2007; Gottstein et al., 2009). Algumas larvas newborn são eliminadas pelas fezes. Porém a maioria

migra directamente para os capilares sanguíneos ou linfáticos do hospedeiro, através dos quais são

transportados para os seus locais preferenciais (músculos oxigenados). Deixando os capilares, as

larvas newborn penetram no tecido muscular esquelético. Estudos experimentais mostraram que a

penetração ocorre cerca de 10 minutos após a injecção directa de newborn nos músculos

(Despommier et al., 1975). As larvas newborn desenvolvem-se para a forma infectante (L1) em

cerca de 15 dias, crescendo nas fibras musculares, sem realizar qualquer muda, (Gottstein et al.,

2009). Por esta ocasião, enrolam-se em espiral e são envolvidas por uma cápsula fibrosa (produto

da reacção do hospedeiro), de forma elíptica e com o eixo orientado no sentido das fibras

musculares (a nurse cell) (Dupouy-Camet & Murrell, 2007). Nas nurse cells musculares, as larvas

podem sobreviver durante anos, potencialmente durante toda a vida do seu hospedeiro (Fröscher et

al., 1988; Kumar et al., 1990). A calcificação da cápsula de colagénio e das larvas das nurse cells

pode ocorrer ao fim de algum tempo, dependendo do hospedeiro, da sua resposta imune e da

espécie ou género de Trichinella. As larvas mantêm este estado hipobiótico até serem ingeridas por

um novo hospedeiro. Nesta situação ocorre a libertação das larvas no estômago e o primeiro estado


19

larvar chega ao duodeno onde sofre quatro mudas completando a sua diferenciação (Gottstein et al.,

2009)

Figura 3. Ciclo de vida de Trichinella sp.

A)Fontes principais de infecção humana (inclui porcos, cavalos, javalis, cães, morsas, raposas e ursos). B) Ciclo de vida de Trichinella sp. 1- Após a ingestão de carne crua ou insuficientemente cozinhada contendo larvas de Trichinella sp. ocorre a libertação das larvas no estômago do hospedeiro; 2- as larvas penetram na mucosa do intestino delgado e atingem o estado adulto em 48 horas ocorrendo a cópula do macho e fêmea; 3- as fêmeas libertam as larvas newborn na linfa e/ou sangue; 4- as larvas são transportadas através do sangue até às células músculo esqueléticas onde penetram activamente; 5-as larvas crescem até ao estado infectante formando-se a nurse cell; 6- após um período de tempo pode ocorrer a calcificação da nurse cell. Adaptado (Gottstein et al., 2009) e www.iss.it/site/Trichinella/index.asp.

2.1.3.1 Células hospedeiras (nurse cells)

O mecanismo pelo qual as larvas newborn penetram nas células musculares não está

completamente definido. Pensa-se que o mecanismo envolve enzimas (Despommier et al., 2005).

Existem, no entanto, evidências morfológicas que sugerem que as larvas saem dos capilares e se

encostam à célula muscular adjacente, quebrando o sarcolema e entrando na célula muscular.

Quando as larvas entram nos músculos causam danos, primeiro nos capilares e depois nas células

musculares. As proteínas específicas do músculo, como a creatinina cinase (CK) e a mioglobina são

libertadas em grande quantidade (Capó et al., 1998).


20

As larvas enrolam-se dentro da nurse cell e iniciam um processo rápido de crescimento que

dura cerca de 15 dias (Gottstein et al., 2009). Os primeiros cinco dias de formação da nurse cell

envolvem a perda das estruturas e funções contrácteis normais da célula muscular. O núcleo das

células infectadas aumenta de volume atingindo o tamanho máximo ao fim de oito dias. Cada nurse

cell contém cerca de 40 núcleos derivados de miócitos (Despommier et al., 1991). No décimo dia

após a entrada das larvas no músculo inicia-se a formação de uma cápsula acelular, que forma a

camada externa da nurse cell. Esta cápsula continua a engrossar até ao dia 26, e é sobretudo

formada por colagénio tipo IV e tipo VI (Polvere et al., 1997). Aproximadamente sete dias após a

entrada das larvas no músculo inicia-se a angiogénese que leva ao desenvolvimento de uma rede

circulatória imediatamente adjacente à cápsula de colagénio. Pela resposta inflamatória do

hospedeiro forma-se um infiltrado inflamatório à volta da nurse cell que é, na sua maioria,

constituído por células mononucleares controladas por interleucina 10. O metabolismo da L1 é

anaeróbio, pelo que o parasita tem de constantemente segregar proteínas, de forma a manter a nurse

cell diferenciada (Capó et al., 1998).

A nurse cell protege o parasita da resposta imune do hospedeiro, permite o seu crescimento,

e possibilita-lhe a sobrevivência, durante vários anos, até ser ingerida por outro hospedeiro.

2.1.4 Hospedeiros de Trichinella spp.

O género Trichinella tem um leque alargado de hospedeiros. Mundialmente foram

identificadas infecções em cerca de 150 espécies de mamíferos, bem como em pássaros e répteis

(Bolas-Fernandez & Wakelin, 1989; Pozio, 2005). Foram ainda referenciados casos de peixes como

hospedeiros (Moretti, 1997) apesar de em estudos experimentais não ter sido comprovada a sua

susceptibilidade (Pozio & Rosa, 2005). As espécies de Trichinella diferem na especificidade dos

hospedeiros e na resistência a temperaturas e condições ambientais. Estes factores determinam a

distribuição e tolerância fisiológica de cada espécie. O Quadro 2 resume as principais características

epidemiológicas, hospedeiros e resistência ao congelamento de Trichinella spp. e genótipos.


21

Quadro 2. Características epidemiológicas e hospedeiros de Trichinella spp. e genótipos.

Adaptado (Gottstein et al., 2009).

Espécies ou genótipo Distribuição geográfica Hospedeiros

Principal fonte de infecção em humanos

Resistência das larvas ao congelamento

Espécies que formam cápsula

T. spiralis Cosmopolita Mamíferos domésticos e silváticos

Cavalos e porcos domésticos e silváticos

Sim,nos músculos dos cavalos

T. nativa Regiões do ártico e sub-ártico, América, Ásia e Europa

Carnívoros silváticos Ursos e morsas Sim, em músculos de carnívoros

Trichinella T6 Canadá, Alasca, montanhas rochosas e dos apalaches dos EUA.

Carnívoros silváticos Carnivoros Sim, em músculos de carnívoros

T. brivoti Zonas temperadas da Europa e Ásia, Norte e Oeste de África

Mamíferos silváticos e raramente em porcos domésticos

Javalis selvagens, porcos domésticos, cavalos, raposas e chacais

Sim, em carnívoros e músculos de cavalos

Trichinella T8 África de Sul e Namíbia Carnívoros silváticos Não documentado Não

T. murrelli EUA e Sul do Canadá Carnívoros silváticos Ursos e cavalos Não

Trichinella T9 Japão Carnívoros silváticos Não documentado Não

T. nelsoni Este e Sul de África Mamíferos silváticos Porco do Mato e porco vermelho

Não

Trichinella T12 Argentina Pumas Não documentado Desconhecido

Espécies que não formam cápsula

T.pseudospiralis Cosmopolita Mamíferos silváticos, pássaros, porcos domésticos

Porcos domésticos e selvagens

Não

T.papuae Papúa Nova Guiné, Tailândia

Porcos selvagens, Crocodilos de água salgada

Porcos selvagens Não

T. zimbabwensis Zimbabué, Moçambique, Etiópia e África do Sul

Crocodilos do Nilo, lagarto-monitor

Não documentado Não

Alguns dos hospedeiros, como os humanos e os roedores, podem ser susceptíveis à infecção

por diversas espécies de Trichinella (Pozio et al., 1992a; Oivanen et al., 2002). Outros, como os

ratos e os porcos, não mostram a mesma susceptibilidade à infecção, por exemplo Trichinella nativa

tem pouca capacidade infectante nestes hospedeiros (Pozio et al., 1992a).

O género Trichinella mantém-se na natureza mediante a transmissão de parasitas entre

hospedeiros. Devido à selectividade de hospedeiros, podem ocorrer dois tipos de infecção: o ciclo


22

silvático, relacionando-se com hospedeiros que habitam áreas florestais e ambientes remotos, e o

ciclo doméstico, onde os hospedeiros coexistem em zonas habitadas por humanos (Murrell & Pozio,

2000).

2.1.5 Epidemiologia

Os parasitas do género Trichinella estão amplamente difundidos no mundo. Trichinella spp.

foi detectada em animais domésticos e/ou selvagens em todos os continentes, com excepção da

Antártica, onde não existem registos (ou estudos) da presença destes parasitas (Pozio & Murrell,

2006). A Figura 4 e a Figura 5 ilustram a distribuição mundial das várias espécies de Trichinella e

alguns dos seus genótipos.

Figura 4. Distribuição global de T.spiralis; T.pseudospiralis; T.papuae e T. zimbabwensis

Legenda: Tpa- T. papuae; TpsN- T. pseudospiralis da América do Norte; TpsP- T.pseudospiralis da Europa e Ásia; TpsA- T. pseudospiralis da Tasmânia; Tsp -T. spiralis; Tzi - T. zimbabwensis. Adaptado (Gottstein et al., 2009) e www.iss.it/site/Trichinella/index.asp


23

Figura 5. Distribuição global de T.nativa, T. brivoti, T. murrelli, T. nelsoni, Trichinella T6,T8,T9.

Legenda: Tna- T. nativa; Tb- T. britovi; Tm - T. murrelli; Tne- T. nelsoni; T6- T. genótipoT6; T8-T. genótipo T8; T9-T. genótipo T9. Adaptado (Gottstein et al., 2009) e www.iss.it/site/Trichinella/index.asp

A maioria das espécies, com excepção de T. spiralis parasita predominantemente animais

selvagens. Pode ocorrer uma alteração dos animais selvagens para os domésticos quando não se

verifica uma segregação adequada da produção animal e selvagem. Deste modo, os ciclos

domésticos e selváticos podem ocorrer tanto independentemente como interactivamente (Pozio,

2007).

A ocorrência de triquinelose em humanos está estritamente relacionada com práticas

alimentares culturais, incluindo o consumo de carne crua ou insuficientemente cozinhada de

diferentes origens animais. Desta forma, a maioria dos dados epidemiológicos recolhidos sobre

triquinelose, em animais domésticos e/ou selvagens, está relacionada com surtos em humanos

(Pozio, 2007).

Estudos relativos ao ano de 2007 (Pozio, 2007) documentam a infecção em humanos em 55

países, sendo que em alguns destes a triquinelose afecta apenas minorias e turistas com práticas

alimentares diferentes das nativas (os habitantes nativos dessas regiões não consomem algumas

espécies de animais ou carne crua). A infecção por Trichinella spp. foi documentada em animais


24

domésticos, sobretudo em porcos, em 43 países, e em animais selvagens, em 66 países.

Aproximadamente 40 países do mundo correspondem a pequenas ilhas ou estados cuja fauna,

doméstica ou selvagem não permite às espécies de Trichinella circular entre animais. Não existem

dados específicos relativos à prevalência de infecção por Trichinella spp. em 92 países (Tabela 1).

A prevalência da triquinelose humana está globalmente estimada em 11 milhões (Dupouy-

Camet, 2000), estando calculada uma taxa de mortalidade de 0,2%. Contudo, o número de infecções

não corresponde à totalidade dos casos, não só por falta de recolha de informação, mas também por

desconhecimento da doença e falhas na aplicação de testes serológicos adequados (Pozio, 2007).

Tabela 1. Regiões com infecções por Trichinella spp. documentadas

Dados em animais domésticos, selvagens e em humanos. Adaptado (Pozio, 2007)

Região

Em animais Em

humanos domésticos selvagens

África 3 13 7

América 5 3 5

Ásia 9 14 18

Europa 24 34 23

Pacífico 2 2 2

Total 43 66 55

2.1.6 Sintomatologia da triquinelose

A fase aguda da doença é provocada por parasitas adultos (fase entérica ou intestinal) e

usualmente manifesta-se numa fase inicial, através de sinais e sintomas leves e não específicos, tais

como o desconforto súbito e generalizado, dores de cabeça, febre, calafrios e, ocasionalmente,

alterações gastrointestinais.

A migração das larvas newborn e a sua entrada nas células musculares (fase parentérica ou

muscular) induz à maioria das consequências patológicas. De uma forma geral, a febre ocorre

durante oito a dez dias, podendo persistir no caso de a doença ser severa. Outros sintomas clínicos

incluem o edema facial (característico da triquinelose e tipicamente peri-orbital); dores musculares

e astenia severa com a duração de várias semanas. Podem também ocorrer tonturas e náuseas


25

transitórias. Apesar de menos comuns, podem ser observadas diarreia e hemorragias da conjuntiva

(Dupouy-Camet & Murrell, 2007). A penetração das larvas noutros tecidos que não os músculos

esqueléticos, dá origem a sequelas mais graves. Em muitos casos de infecção severa ou moderada é

observado o envolvimento cardiovascular, podendo originar miocardite A Figura 6 correlaciona os

sintomas da triquinelose com o tempo de infecção.

O estado crónico da doença inclui outras complicações como a encefalite e infecções

secundárias (broncopneumonia e septicemia), que geralmente ocorrem numa fase tardia da infecção

(Gottstein et al., 2009).

Figura 6. Correlação dos sintomas da triquinelose com o tempo de infecção.

A intensidade das cores está relacionada com a severidade da doença. Adaptado de http://www.Trichinella.org.

Os sintomas da triquinelose variam com a espécie de Trichinella, os tecidos invadidos, o

estado físico do hospedeiro e com o número de larvas ingeridas, sendo que o último se encontra

fortemente correlacionado com a severidade da doença, podendo variar entre o assintomático (se o

hospedeiro ingerir um número reduzido de parasitas) e a fatalidade (Gottstein et al., 2009).

Não está definida a dose mínima de parasitas infectantes que causam doença em humanos.

Estima-se que aproximadamente 100 a 300 larvas de T. spiralis sejam suficientes para iniciar a


26

doença, e que 1000 a 3000 larvas resultem numa forma severa da mesma (Dupouy-Camet &

Murrell, 2007). Contudo, estas estimativas não têm base experimental.

Na infecção de Trichinella spp. a humanos, foram implicadas as espécies T. spiralis, T.

nativa, T. britovi, T. nelsoni, Trichinella T6 e T. murrelli (Kapel, 2000; Pozio & Zarlenga, 2005). É

aceite que a gravidade da infecção varia com as espécies (Pozio et al., 1992b; Bruschi & Murrell,

2002). No entanto, não é possível estabelecer uma relação de causalidade entre a espécie infectante

e a sintomatologia uma vez que a dose infectante é desconhecida. A capacidade infectante das

espécies, apresenta-se como o motivo para a variação da gravidade das infecções.

O índice de capacidade reprodutiva compara o número de larvas presentes nos músculos,

com o número de larvas ingeridas pelo hospedeiro (Pozio, 2000). Estudos em ratos mostraram que

tanto T. spiralis como T. pseudospiralis estabelecem infecções, porém o índice de capacidade

reprodutiva para T.spiralis é quatro vezes superior ao de T. pseudospiralis (Pozio et al., 1992b).

Em humanos, T.spiralis é o maior agente causal de triquinelose originando formas mais

severas da doença do que as resultantes de T. brivoti. Este facto pode estar relacionado com o

número de larvas que as fêmeas de ambas as espécies produzem [T. spiralis produz um número

mais elevado de larvas (Kapel, 2000) do que T. brivoti (Pozio et al., 1993)].

As infecções por T.murrelli parecem mais propícias a provocar reacções na pele e menos

propícias a provocar edema facial (Dupouy-Camet et al., 2001). Já T. pseudospiralis parece dar

origem a sintomas com maior durabilidade (Jongwutiwes et al., 1998; Ranque et al., 2000).

2.1.7 Diagnóstico da triquinelose

2.1.7.1 Diagnóstico em animais

A inspecção de carne para a detecção de larvas de Trichinella spp. tem como objectivo

prevenir a triquinelose em humanos, não prevenindo a infecção.

A detecção de larvas de Trichinella spp. em carne para consumo humano (por exemplo,

porco e cavalo), é realizada através de testes directos em amostras de músculos postmortem, de


27

acordo coma legislação relativa à inspecção sanitária. Este controlo visa a prevenção da doença em

humanos e não a mitigação do risco de infecção do próprio animal (Gamble et al., 2000).

Esta abordagem é também utilizada na monitorização da infecção em animais selvagens

(que podem ser reservatórios de Trichinella spp.) de forma a determinar a prevalência da infecção

nesta e o risco da introdução da infecção nos animais domésticos.

Na detecção de larvas nas amostras musculares devem ser utilizados métodos de elevada

sensibilidade sendo que a metodologia aplicada deve ter em conta a dimensão da amostra, o tipo de

músculo e o método específico usado (Nöckler & Kapel, 2007).

Para a inspecção sistemática da carne animal destinada a consumo humano, os testes devem

ter a sensibilidade e especificidade suficientes para detectar pelo menos uma a três larvas por grama

de carne. Acima deste valor a infecção constitui um problema de saúde pública (Nöckler & Kapel,

2007).

A avaliação de amostras utilizando um triquinoscópio deixou de ser recomendada devido ao

facto de ser difícil detectar larvas não capsuladas como T. pseudospiralis (Nöckler & Kapel, 2007).

O método mais utilizado actualmente é a digestão péptica do tecido muscular, mediante a análise de

um conjunto de amostras (Gamble et al., 2000).

Para estudos moleculares todas as espécies devem ser identificadas ao nível de espécie ou

genótipo, já que não existem características morfológicas específicas de cada espécie. Um dos

métodos mais usados é o Multiplex-PCR que identifica de forma inequívoca a espécie da larva e

que permite, numa só reacção, a identificação de sete genótipos de Trichinella sp. (Zarlenga et al.,

2001).

Podem ser aplicados testes serológicos em animais, para estudos epidemiológicos e de

vigilância (Gamble et al., 2004), não substituindo os métodos directos, onde são avaliadas as

carcaças individuais (Gamble et al., 2000).


28

2.1.7.2 Diagnóstico em humanos

O diagnóstico da triquinelose deve basear-se em três critérios principais: sintomatologia

clínica (reconhecimento dos sintomas e sinais da triquinelose); resultados laboratoriais (avaliação

da eosinofilia e enzimas musculares e/ou detecção de larvas em biópsia muscular) e investigação

epidemiológica (identificação da fonte e origem da infecção). O Centro Europeu de Prevenção e

Controlo das Doenças emitiu uma definição de casos para ser usada quando existe a suspeita de

triquinelose humana (Quadro 3).

Quadro 3. Definição de casos para triquinelose humana.

De acordo com o Centro Europeu de Prevenção e Controlo das Doença. Caso provável qualquer pessoa com critérios clínicos e uma ligação epidemiológica; Caso confirmado qualquer pessoa com critérios laboratoriais e critérios clínicos nos últimos dois meses. Adaptado (Dupouy-Camet & Murrell, 2007)

Critérios Pré requisitos e classificação de casos

Clínicos Pelo menos três dos seis sintomas:

Febre, dores musculares, sintomas gastrointestinais, edema facial, eosinofilia, hemorragias da retina, sub-linguais ou sub-conjuntivas.

Laboratoriais Pelo menos um dos dois testes laboratoriais:

Biópsia muscular com demonstração de larvas de Trichinella no tecido; testes serológicos ELISA ou Western blot para avaliação da produção de anticorpos no soro.

Epidemiológicos Pelo menos um de três:

Consumo de carne parasitada (comprovado laboratorialmente); consumo de produtos animais parasitados (comprovado laboratorialmente); associação epidemiológica a um caso humano por exposição a uma fonte comum de infecção (confirmado laboratorialmente).

2.1.8 Tratamento da triquinelose

A terapia deve ser iniciada o mais cedo possível, após o diagnóstico da infecção. Os

fármacos administrados aos doentes incluem anti-helmínticos e glucocorticoesteroides. Os anti-

helmínticos são os principais fármacos usados no tratamento da triquinelose e incluem albendazole

(Zentel; Smith-Kline Beecham) e mebendazole (Vermox; Janssen Pharmaceutica, Beerse,

Belgium).

A terapia anti-helmíntica é eficaz se administrada nos três primeiros dias após infecção

(Kocicka, 2000), já que auxilia a eliminação das larvas de Trichinella spp. no tracto gastrointestinal,

prevenindo a invasão muscular posterior. O efeito da terapia anti-helmíntica num estado mais


29

avançado da doença está mal esclarecido. Porém, como regra geral, quanto mais tarde for prescrito

o tratamento, maior é a probabilidade das larvas estarem enquistadas nos músculos. Nesta

circunstância os parasitas podem sobreviver no hospedeiro causando mialgias persistentes,

independentemente do tratamento (Pozio et al., 2001). Consequentemente, nos casos de infecção

avançada, a terapia deve ser administrada por maiores períodos de tempo.

2.2 Angiogénese

2.2.1 O sistema circulatório: características e propriedades gerais

Todos os animais multicelulares conhecidos necessitam de oxigénio para completar o seu

ciclo de vida (Fenchel & Finlay, 1995).

Animais menos complexos, obtêm o oxigénio por difusão simples do ar, como o nemátode

Caenorhabditis elegans que é formado por menos de 1000 células, (Van Voorhies & Ward, 2000;

Semenza, 2007; Haddad & Yu, 2008). A Drosophila melanogaster (vulgarmente conhecida por

mosca da fruta) desenvolveu um mecanismo que conduz o ar a partir de pequenas aberturas

(espiráculos), localizadas no intertegumento, para um sistema de tubos traqueais que conduzem o

oxigénio e realizam trocas gasosas com os tecidos circundantes (Mockett et al., 1999; Affolter &

Caussinus, 2008; Haddad & Yu, 2008).

Animais mais complexos, como os vertebrados, necessitam de um sistema circulatório mais

organizado, que garanta a distribuição, a todas as partes do corpo, de oxigénio e nutrientes, bem

como o escoamento de dióxido de carbono, produtos de excreção e outros metabolitos, podendo

desta forma atingir um maior porte. Esse sistema é o sistema circulatório vascular e linfático

(Roman & Weinstein, 2000; Conway et al., 2001; Eichmann, 2005; Haddad & Yu, 2008;

Karamysheva, 2008; Dennis et al., 2011).

2.2.2 Desenvolvimento da rede vascular

Nas primeiras fases de desenvolvimento, os embriões adquirem os seus nutrientes por

difusão, uma vez que o sistema vascular ainda não se encontra desenvolvido (Noden, 1989).


30

Contudo, como o limite de difusão do oxigénio é limitado (100 a 200 micrómetros) (Eichmann,

2005) a formação do sistema circulatório vascular nos vertebrados tem de ocorrer muito cedo no

desenvolvimento embrionário (Rossant & Hirashima, 2003; Coultas et al., 2005; Eichmann, 2005;

Karamysheva, 2008). Deste modo, de uma forma ordenada e sequencial, o embrião transforma-se

rapidamente num organismo vascular, e a sua sobrevivência passa a depender de uma rede de vasos

complexa (Conway et al., 2001).

A formação de vasos sanguíneos pode ocorrer segundo dois mecanismos que se desenrolam

em sequência: a vasculogénese e a angiogénese (Risau, 1997; Conway et al., 2001; Carmeliet,

2005; Coultas et al., 2005).

A vasculogénese refere-se aos eventos iniciais que ocorrem no crescimento vascular

embrionário levando à formação de vasos sanguíneos de novo e in situ, e de plexos capilares

primitivos, através da agregação de angioblastos, precursores de células endoteliais que constituem

os vasos sanguíneos (Risau, 1995; Risau & Flamme, 1995). À medida que o embrião se desenvolve,

torna-se necessário transportar oxigénio e nutrientes para um número crescente de células,

percorrendo distâncias cada vez maiores, ocorrendo desta forma uma remodelação da primeira rede

vascular formada. O crescimento subsequente do plexo primitivo, a formação de novos vasos a

partir dos vasos pré existentes e a remodelação destes vasos primitivos numa rede vascular madura,

é referido como angiogénese (Risau, 1997; Conway et al., 2001; Carmeliet, 2005; Eichmann, 2005;

Semenza, 2007; Karamysheva, 2008).

2.2.3 Angiogénese fisiológica

Para que seja possível aumentar o fluxo de sangue nos tecidos em crescimento, o plexo

vascular primário expande-se significativamente, através da ramificação e remodelação

(arteriogénese) dos capilares pré-existentes, transformando-se numa rede vascular organizada

(Carmeliet, 2005; Karamysheva, 2008). A angiogénese corresponde assim, à formação de vasos

sanguíneos a partir de células endoteliais pré-existentes (Conway et al., 2001; Carmeliet, 2005;

Eichmann, 2005; Semenza, 2007; Karamysheva, 2008).


31

A angiogénese é um mecanismo complexo que envolve vários processos tais como a

proliferação, migração, ramificação e regressão das células endoteliais dos vasos sanguíneos

existentes, e o recrutamento diferencial de células de suporte do endotélio, como as células do

músculo liso e os perícitos (Folkman & D'Amore, 1996; Carmeliet & Jain, 2000; Adams & Alitalo,

2007).

O processo inicia-se com a destruição da parede dos vasos pré-existentes para remoção das

células murais (perícitos e células do músculo liso). Em seguida a matriz extracelular é degradada

por numerosas enzimas (metaloproteases) e as membranas das células endoteliais remodeladas. As

células do estroma circundante criam uma nova matriz extracelular que gera um ambiente propício

à migração e proliferação de células endoteliais. Quando atingem um número suficiente, a divisão

das células endoteliais é bloqueada e estas formam uma estrutura tubular. Segue-se o recrutamento

de células murais para a superfície do endotélio à volta dos quais se formam as paredes dos vasos

sanguíneos (Papetti & Herman, 2002; Waxman, 2007). A vasculatura capilar do saco vitelino é

remodelada com o início do batimento cardíaco. Os capilares fundem-se em vasos maiores, artérias

e veias (Karamysheva, 2008). As veias são rodeadas por células de músculo liso, e os capilares

rodeados por perícitos (Ferrara & Kerbel, 2005). A rede vascular secundária que se forma é

altamente organizada e hierarquizada, originando um sistema vascular circulatório maduro, estável,

e funcional (Carmeliet, 2005) A Figura 7 resume os mecanismos de vasculogénese e de

angiogénese.


32

Figura 7. Vasculogénese e angiogénese.

Pela vasculogénese formam-se os vasos sanguíneos “de novo” (plexo primitivo) através da agregação de angioblastos (precursores de células endoteliais). A formação de novos vasos a partir dos vasos pré existentes e a remodelação destes vasos primitivos numa rede vascular madura corresponde à angiogénese. O crescimento do plexo primitivo inicia-se com a destruição da parede dos vasos pré-existentes para remoção das células murais. A matriz extracelular é degradada e gera um ambiente propício à migração e proliferação de células endoteliais. Forma-se uma estrutura tubular e ocorre o recrutamento de células murais para a superfície do endotélio que leva à maturação das ramificações formadas. Adaptado (Waxman, 2007).

A angiogénese fisiológica também é desencadeada pela inflamação e a hipóxia. As células

endoteliais dos vasos sanguíneos estão normalmente em estado quiescente. Quando o nível de

oxigénio de um tecido se encontra alterado, as células vasculares endoteliais respondem com

inflamação ou angiogénese, ocorrendo a remodelação vascular com formação de novos vasos

(Imhof & Aurrand-Lions, 2006). Os vasos formados apresentam estrutura e função normais,

contrariamente ao verificado na formação de vasos tumorais (Semenza, 2009).

A hipóxia estimula a activação de uma proteína (Factor Indutor de Hipóxia-1- HIF-1). HIF-

1 é um heterodímero formado pela junção de duas subunidades, o factor indutor de hipóxia 1-alfa

(HIF-1α) e o factor indutor de hipóxia 1-beta (HIF-1β). Enquanto o HIF-1β é expresso


33

constitutivamente em todos os tecidos, o HIF-1α é activado em condições de hipóxia. HIF-1α induz

a expressão de diversos genes (por exemplo, actuando como promotor), tais como o VEGF (Semela

& Dufour, 2004; Semenza, 2009).

Há uma relação estreita entre a activação das células endoteliais, aquando da angiogénese, e

o sistema imunitário inato. Células endoteliais activadas medeiam o recrutamento e activação de

células sanguíneas quando ocorre uma lesão focal. Por outro lado, as células inflamatórias

(particularmente macrófagos, mastócitos e neutrófilos) influenciam o comportamento das células

endoteliais através de vários mecanismos, tais como a libertação de proteases e factores

angiogénicos (por exemplo VEGF) para a matriz extracelular (Mueller & Fusenig, 2004; Imhof &

Aurrand-Lions, 2006). Verifica-se assim uma associação entre a inflamação e a estimulação da

angiogénese.

Nos adultos, os processos de formação e crescimento de novos vasos são activados somente

em condições muito específicas, tais como a cicatrização das feridas, o crescimento de órgãos e o

ciclo éstrico (angiogénese fisiológica).

No ciclo reprodutivo feminino ocorre mensalmente o desenvolvimento de folículo ovariano

e alterações proliferativas endometriais que requerem grande demanda de nutrientes e oxigénio,

associadas a alterações significativas da vasculatura. Durante o ciclo há a proliferação de novos

capilares que promovem o crescimento folicular, a ovulação, o desenvolvimento do corpo lúteo,

mas logo em seguida os vasos regridem, sugerindo que as actividades de indução e inibição da

angiogénese são coordenadas. Diversos estudos demonstraram que o VEGF é expresso nos ovários,

e que a inibição do VEGF suprime a angiogénese luteal e atrasa o desenvolvimento folicular,

levantando a possibilidade do desenvolvimento de estratégias para manipular a fertilidade (Stouffer

et al., 2001).

A regulação da angiogénese é fundamental para o organismo porque, quer a formação de

vasos em excesso, quer o seu desenvolvimento insuficiente, conduzem a patologias sérias

(Carmeliet, 2003; Jain, 2003; Karamysheva, 2008), algumas discutidas em seguida.


34

2.2.4 Angiogénese patológica

Chama-se angiogénese patológica à remodelação contínua da rede vascular devido a padrões

de crescimento e regressão descontrolados, que tornam a sua estrutura e funções anormais (Jain,

2003).

O crescimento de vasos de forma descontrolada tem um grande impacte na saúde, e

contribui para a patogénese de muitas doenças (Papetti & Herman, 2002; Carmeliet, 2003;

Carmeliet, 2005). Talvez por isso, nas últimas décadas, as investigações sobre angiogénese têm

despertado um enorme interesse junto da comunidade científica. Indiscutivelmente, a hipótese de

que o conhecimento da angiogénese pode levar a estratégias de cura do cancro e outras patologias,

tem sido uma grande inspiração para vários investigadores (Folkman, 1971).

Publicações alemãs mostram que há mais de um século os investigadores, como o

patologista Rudolf Virchow, observaram que o crescimento tumoral pode ser acompanhado por um

aumento da vascularização, sugerindo que os novos vasos têm um papel importante na patogénese

do cancro. Em 1928, J.C. Sandison descreveu uma técnica que permitia a observação in vivo do

crescimento dos vasos sanguíneos na orelha de coelhos (Ferrara, 2002). Esta metodologia foi

utilizada em 1939 por Gordon Ide e colaboradores da Universidade de Rochester, no estudo da

correlação entre o crescimento de tumores e o aumento da vascularização (Ide et al., 1939).

Em 1948 Isaac Michaelson propôs a possibilidade da existência de um “factor x”

estimulante da proliferação vascular da retina, associado à diabetes. Estes resultados ganharam

maior expressão quando, no final da década de 60 do século passado, Melvin Greenblatt e Philippe

Shubick da Escola Médica de Chicago e Robert Ehrmann e Mogens Knoth da Escola Médica de

Harvard publicaram, em separado, estudos demonstrando que as células tumorais libertam um

factor angiogénico, estimulando a formação de novos vasos sanguíneos (Ferrara, 2002).

A associação entre angiogénese e o cancro é, no entanto atribuída a Judah Folkman (1933-

2008), que, em 1971, se tornou primeiro investigador a afirmar, que o crescimento dos tumores


35

estava directamente implicado no desenvolvimento de uma rede vascular (Folkman et al., 1971) e a

propor a utilização de inibidores da angiogénese para o tratamento do cancro (Ferrara, 2002).

A angiogénese é essencial para o crescimento e desenvolvimento de diversas neoplasias, e

para a formação de metástases. Inicialmente os tumores são avasculares e dependem do fenómeno

de difusão passiva para a sua sobrevivência e crescimento (Plank & Sleeman, 2003). Alguns

tumores podem manter-se dormentes, não se observando a formação de vasos. Os tumores

avasculares podem encontrar-se num equilíbrio entre a proliferação de células neoplásicas e a sua

destruição pelo sistema imunitário, e por apoptose (Marme & Fusenig, 2007). É aceite que sem o

fornecimento de sangue, as dimensões de um nódulo tumoral não podem exceder 1 a 2mm3

(Folkman et al., 1971). Quando o tumor avascular atinge esta dimensão, a concentração de oxigénio

diminui e as células iniciam a produção de factores angiogénicos, para que a expansão do nódulo

tumoral seja suportada por um fornecimento de oxigénio e nutrientes adequados.

Desde os primeiros estudos sobre angiogénese que se têm vindo a caracterizar os

mecanismos moleculares que levam a alterações angiogénicas nas células tumorais. Ainda que estes

mecanismos não sejam completamente conhecidos, o momento em que ocorre uma alteração no

balanço entre factores anti e pró-angiogénicos, parece ser o responsável pelo tumor ganhar a

capacidade de induzir o desenvolvimento de uma nova vasculatura e a passagem da fase de

dormência para a fase angiogénica (Adams & Alitalo, 2007). O ponto de início da

neovascularização tumoral é denominado de “angiogenic switch” (Plank & Sleeman, 2003; Adams

& Alitalo, 2007; Karamysheva, 2008). Em termos gerais, os níveis de factores anti-angiogénicos

(inibidores) e pró-angiogénicos (activadores) determinam o estado quiescente ou angiogénico de

uma célula endotelial (Bergers & Benjamin, 2003).

Ao contrário da angiogénese fisiológica, em que os novos vasos sanguíneos rapidamente

amadurecem e se tornam estáveis, na angiogénese tumoral o processo ocorre descontroladamente.

Como consequência, há um constante crescimento de novos vasos que originam uma vasculatura


36

própria, irregular, tortuosa, dilatada e frequentemente, com um fluxo sanguíneo desadequado

(Bergers & Benjamin, 2003; Semela & Dufour, 2004).

Ainda que historicamente a patologia mais conhecida associada à angiogénese seja o cancro,

outras doenças que têm vindo a ser associadas a este mecanismo ao longo dos anos (Carmeliet,

2003), nomeadamente a psoríase (Folkman, 1972), artrite (Luttun et al., 2002), obesidade (Rupnick

et al., 2002), endometriose (LeCouter et al., 2001), e doenças infecciosas [patógenos que expressam

genes angiogénico (Meyer et al., 1999), induzem programas de angiogénese (Harada et al., 2000)

ou transformam células endoteliais (Barillari & Ensoli, 2002)]. Adicionalmente, o crescimento

insuficiente de vasos e a regressão anormal de vasos estão associados a isquemia cardíaca e cerebral

(Krupinski et al., 1994), doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (De La Torre,

2002)) e osteoporose (Yin et al., 2002).

Torna-se claro que o desenvolvimento e maturação de vasos novos é extremamente

complexo e que a coordenação de processos requer uma activação sucessiva de diversos receptores

e ligandos, e um ajuste de sinais inibitórios (Ferrara et al., 2003).

2.2.5 Factores pró-angiogénicos e anti-angiogénicos

Apesar da maioria dos vasos do organismo adulto se manter quiescente, as células

endoteliais retêm a capacidade de se dividir rapidamente, em resposta a estímulos fisiológicos, que

podem resultar na activação da angiogénese (Carmeliet & Jain, 2000; Karamysheva, 2008).

A existência de factores que estimulam o crescimento vascular, e que desse modo permitem

o crescimento tumoral, foi proposta há várias décadas. As investigações têm permitido estudar os

genes e caracterizar moléculas e vias de sinalização envolvidas na estimulação do crescimento dos

vasos sanguíneos. Actualmente a angiogénese é reconhecida como um processo não só tumoral,

mas também fisiológico e associado a outras patologias não tumorais, tais como o parasitismo por

alguns helmintas. Exemplo disso é o factor de crescimento endotelial vascular, que foi identificado

nos anos 80 (século XX), e que é hoje reconhecido como um regulador essencial do crescimento de

vasos normais e anormais (Ferrara et al., 2004; Marme & Fusenig, 2007).


37

De todos os factores que estimulam a angiogénese, é hoje aceite que a chave na regulação da

angiogénese é a cascata que está associada à via de sinalização induzida pelo factor de crescimento

endotelial vascular A-VEGF-A- (Ho & Kuo, 2007; Karamysheva, 2008). Contudo, uma série de

outros reguladores da remodelação do sistema vascular são de grande importância: a via

Angiopoietin (Ang)-Tie; a via Ephrin B2-EphB4, a via Notch - gene Delta-like ligand 4 (Dll4); o

factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGFB)-PDGFRβ, e o factor de transformação do

crescimento beta (TGF-β) (Adams & Alitalo, 2007).

Considerando o âmbito deste estudo, a revisão bibliográfica incidirá sobre o VEGF enquanto

regulador chave da angiogénese e sobre o recrutamento de células de suporte e maturação dos

vasos. Desta forma, é realizada uma revisão muito breve sobre a selecção de células endoteliais para

criação de novos capilares e o estabelecimento da identidade arterial e venosa.

2.2.5.1 Sinalização pelo factor de crescimento endotelial vascular - VEGF

Diversos investigadores contribuíram para a descoberta do VEGF, o primeiro factor de

crescimento vascular a ser caracterizado. Atribui-se a Serger et al. a identificação do “factor de

permeabilidade vascular”(VPF), proposto como um factor mediador da permeabilidade dos vasos

sanguíneos tumorais em 1983 (Senger et al., 1983); e a Ferrara e Henzel a identificação de VEGF

em 1989 (Ferrara & Henzel, 1989). No mesmo ano, Connolly et al. revelaram que VPF e VEGF

eram a mesma molécula, sendo actualmente, por vezes, utilizados como sinónimos.

2.2.5.2 Efeito biológico do VEGF

Em condições in vitro o VEGF estimula o crescimento de células endoteliais vasculares

derivadas de artérias, veias e vasos linfáticos, por acção directa (Tischer et al., 1991; Ferrara et al.,

2004). É também um indutor de angiogénese em diversos modelos experimentais in vivo (Ferrara &

Henzel, 1989). Adicionalmente induz a angiogénese em modelos in vitro, promovendo a invasão de

células endoteliais em géis de colagénio e a formação de estruturas do género de capilares (Pepper


38

et al., 1994) e em condições “in vitro” previne a apoptose das células endoteliais na ausência de

meio (Gerber et al., 1998).

O efeito do VEGF manifesta-se de forma diferenciada em animais adultos e em

desenvolvimento: a sua inibição resulta em alterações apoptóticas em ratos recém-nascidos,

enquanto que em ratos com mais de quatro semanas não tem praticamente efeito. Isto pode dever-se

à menor maturidade do sistema vascular sanguíneo nos ratos recém nascidos, uma vez que as

células endoteliais dos novos vasos sanguíneos (que ainda não sofreram maturação), têm uma

elevada dependência de VEGF (Benjamin et al., 1999; Karamysheva, 2008). Supõe-se que um dos

eventos chave que resulta na perda da dependência de VEGF é a formação da parede vascular, com

recrutamento dos perícitos (Karamysheva, 2008).

O VEGF também regula a permeabilidade (Senger et al., 1983), o que define o seu

importante papel na resposta inflamatória e noutros processos patológicos, como na angiogénese

tumoral em que ocorre um aumento da permeabilidade vascular, o que contribui para a penetração

de células tumorais nas redes vasculares e para as metástases (Karamysheva, 2008).

O VEGF tem efeitos na hematopoiese, aumentando a produção de linfócitos B e células

mielóides imaturas (Lyden et al., 2001).

O VEGF tem um papel fundamental na angiogénese fisiológica e patológica. A título de

exemplo, na vasculogénese e angiogénese embrionária (Ferrara et al., 1996), no crescimento

neonatal, por exemplo no desenvolvimento renal (Gerber et al., 1999), na ovulação e gravidez, e em

situações tumorais (como descrito para a angiogénese fisiológica e tumoral).

Diversas células têm a capacidade de activar a síntese de VEGF-A em resposta a diferentes

estímulos tais como alterações metabólicas [hipoxia (investigadores demonstraram o aumento da

expressão de mRNA de VEGF em condições de baixa concentração de oxigénio (Dor et al., 2001) e

hipoglicémia], hormonais (estrogénios), moléculas pró inflamatórias e desordens genéticas; diversas

citocinas e factores de crescimento tais como o factor de crescimento epitelial (EGF), o factor de


39

crescimento de fibroblastos básico (FGF), o factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF),

entre outros (Shibuya, 2003; Karamysheva, 2008).

2.2.5.3 VEGF-A e os receptores VEGFR-1 e VEGFR-2

De todos os genes conhecidos o VEGF-A é o que está melhor estudado, sendo considerado o

mais importante já que parece mediar a sinalização básica da angiogénese (Veikkola et al., 2001).

Frequentemente, VEGF-A é também designado só por VEGF ou VPF.

VEGF-A pertence à superfamília de genes reguladores de angiogénese que inclui o factor de

crescimento derivado das plaquetas (PDGF), o VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, e o factor de

crescimento placentar (PIGF). O splicing alternativo do gene VEGF-A produz quatro isoformas, a

mais importante e dominante das quais é VEGF-A 165 -contém 165 aminoácidos- (Karamysheva,

2008).

Uma característica importante das isoformas de VEGF, é a capacidade de ligar-se à

heparina, presente em proteínas da superfície celular ou da matriz extracelular. O gradiente de

concentração heparina-VEGF-A165 promove a proliferação, migração, sobrevivência, diferenciação,

formação das estruturas tubulares e estabelecimento das estruturas vasculares que são necessárias

para os processos morfogenéticos da vasculogénese e angiogénese (Adams & Alitalo, 2007;

Karamysheva, 2008). Isto inclui todos os passos que levam à formação de estruturas tubulares:

vasodilatação, degradação da matriz extracelular, migração e proliferação de células endoteliais;

indução do “angiogenic switch”, secreção de metaloproteases da matriz (MMP2, MMP9 e MT1-

MMP) que facilitam a invasão vascular (Bergers & Benjamin, 2003).

Os factores de crescimento da família VEGF exercem a sua actividade biológica por

interacção com receptores específicos. Foram identificados três receptores transmembranares,

pertencentes à superfamília de receptores tirosina – cinases (RTK), que se ligam a diferentes

factores de crescimento de VEGF: VEGFR-1 (FLT1), VEGFR-2 (Flk1/KDR) e VEGFR-3 (FLT4)

(De Vries et al., 1992; Weidner, 1995; Karamysheva, 2008) e dois receptores acessórios,


40

Neuropilina-1 e Neuropilina-2, associados à amplificação de sinal (Karamysheva, 2008). Os

receptores de VEGF são proteínas com um domínio transmembranar. A região extracelular do

VEGF é formada por sete domínios do tipo imunoglobulina (IG I a VII) e a região intracelular exibe

actividade tirocina - cinase. O domínio tirosina - cinase nestes receptores é separado por dois

fragmentos, TK-1 e TK-2 (Karamysheva, 2008).

VEGF-A é um ligando que é secretado por células não endoteliais e que interage com os

receptores VEGFR-1 (Flt-1 em ratinho) e VEGFR-2 (KDR ou Flk-1 em ratinho) que são expressos

no endotélio.

VEGFR-1 foi o primeiro receptor de VEGF a ser descoberto, na década de 90 do século

passado, e ainda hoje as suas funções específicas estão em debate. Julga-se que o passo inicial que

desencadeia a activação dos receptores, quando ocorre a interacção com os ligandos de VEGF, é

uma dimerização seguida de autofosforilação em resíduos de tirosina, que poderão ser os

responsáveis pela regulação da actividade cinásica dos receptores de VEGF (Veikkola et al., 2001).

A activação dos receptores pelo VEGF desencadeia a activação de uma cascata de sinalização que

envolve uma grande diversidade de proteínas. A importância desta ligação ainda não se encontra

totalmente esclarecida, carecendo de estudos adicionais (de Freitas et al., 2009).

Estudos de inactivação genética apontam como funções prováveis para o VEGFR-1, uma

regulação negativa da actividade de VEGF-A. A ausência do receptor Flt1 em ratinhos conduz à

morte de embriões entre os 8.5 e 9.5 dias de desenvolvimento in útero, devido ao crescimento

excessivo e desorganização dos vasos sanguíneos (Fong et al., 1999).

Originalmente os locais de ligação do VEGF foram identificados na superfície das células

endoteliais vasculares (Jakeman et al., 1993). Posteriormente (Figura 8) comprovou-se a presença

dos seus receptores (VEGFR) em células hematopoiéticas, tais como monócitos e macrófagos (Shen

et al., 1993).

O papel do VEGFR-2 na angiogénese embrionária e na hematopoiese é evidente pela

ausência de vasculogénese, e pela incapacidade de se desenvolverem ilhas sanguíneas e vasos


41

sanguíneos organizados, em ratinhos com ausência do receptor Flk-1 resultando na sua morte in

útero entre os 8.5 e os 9.5 dias de desenvolvimento (Shalaby et al., 1995). Nestes ratinhos, o

processo de vasculogénese é alterado e a hematopoiese encontra-se ausente. Estes dados sugerem a

existência de progenitores comuns de VEGFR-2 para células endoteliais e hemangioblastos, como

referido previamente (Karamysheva, 2008).

É actualmente aceite que o VEGFR-2 é o principal mediador da acção biológica de VEGF-

A sobre as células endoteliais. Através da interacção com VEGFR-2, o VEGF induz a fosforilação

de diversas proteínas responsáveis pela proliferação, migração, crescimento, permeabilidade e

sobrevivência das células endoteliais (Marme & Fusenig, 2007; Karamysheva, 2008)

A expressão de VEGFR-3 encontra-se restrita à linfagénese.

Figura 8. Interacção dos VEGFs com os seus três receptores e os tecidos que os expressam.

VEGFR-1 e VEGFR-2 localizam-se na membrana das células endoteliais dos vasos sanguíneos. A expressão de VEGFR-3 ocorre nas células endoteliais dos vasos linfáticos. A sinalização por VEGF ocorre sobretudo através do receptor tirosina – cinase do VEGFR-2 localizado nas membranas das células endoteliais. PIGF, um ligando de VEGFR-1 específico, só mostra aumento de vascularização em situações patológicas (Carmeliet, 2003) e em metástases primárias tumorais (Shibuya, 2006).VEGF-C é a molécula chave da regulação da linfagiogénese (morfogénese dos vasos linfáticos), sinalizando através do receptor VEGFR-3 localizado nas células endoteliais (Veikkola et al., 2001; Adams & Alitalo, 2007). Adaptado (Karamysheva, 2008; de Freitas et al., 2009).


42

O VEGF actua como factor pró-angiogénico sobretudo das formas seguintes: aumenta a

sobrevivência celular; aumenta a migração celular; estimula a proliferação celular e aumenta a

permeabilidade.

2.2.5.4 Selecção de células endoteliais e o estabelecimento da identidade arterial e

venosa

Se os factores pró-angiogénicos estimulam o crescimento vascular, tem de haver um

mecanismo que permita uma selecção das células endoteliais que vão iniciar a expansão

angiogénica. Se assim não fosse, todas as células endoteliais reagiriam ao estímulo angiogénico de

igual modo, e toda a rede vascular sobre o efeito do estímulo se desintegraria no processo, e ficaria

sem capacidade de conter o sangue. Estas células são denominadas tip cells e reagem com o

gradiente de VEGF-A que especifica a direcção da sua migração (Karamysheva, 2008).

Durante o desenvolvimento embrionário de ratinhos, a selecção de tip cells é monitorizada

pela família de receptores da via de sinalização Notch e os seus ligandos transmembranares, delta

like ligand 4 (Dll4). Tanto os receptores Notch como os ligandos Dll4 encontram-se expressos em

células endoteliais. Dll4 tem um papel de regulador negativo. Baixos níveis de Dll4 ou o bloqueio

de Notch resulta num aumento significativo da proliferação endotelial, na migração das células

endoteliais, no aumento de ramificações vasculares e na fusão de estruturas tubulares, com

consequente formação de uma estrutura hiper-ramificada (Suchting et al., 2007; Karamysheva,

2008).

O estabelecimento da identidade arterial ou venosa dos novos vasos formados é mediado

pela sinalização por Ephrins. Os ligandos transmembranares da família Ephrin possuem receptores

Eph, e estes constituem uma grande família de receptores com domínio tirosina – cinase (Flanagan

& Vanderhaeghen, 1998). O ligando transmembranar Ephrin-b2 é expresso especificamente nas

células endoteliais arteriais enquanto o receptor Eph-b4 é expresso especificamente nas células


43

endoteliais venosas. A sinalização Ephrin-b2- Eph-b4 é essencial para a angiogénese (Carmeliet,

2003; Adams & Alitalo, 2007).

Para além dos factores genéticos, os factores físicos também condicionam o fluxo

sanguíneo. Estudos em embriões de galinha demonstraram que cortando o fluxo sanguíneo a uma

artéria ocorre uma redução da expressão de marcadores arteriais e uma indução da expressão de

marcadores venosos, o que se inverte se o mesmo vaso voltar a ter uma circulação regular (le Noble

et al., 2004).

2.2.5.5 Recrutamento de células de suporte e maturação dos vasos.

Os vasos recém formados são instáveis e imaturos de modo que o estabelecimento de uma

rede vascular funcional requer que os vasos nascentes sofram maturação, a qual permitirá a

transição do estado activo da rede vascular em crescimento, para um estado quiescente

completamente formado e funcional. Nesta circunstância ocorre a inibição da proliferação do

endotélio e também da emergência de novos capilares, juntamente com a estabilização das

estruturas tubulares nascentes formadas e incorporação de células murais (Cleaver & Melton, 2003;

Jain, 2003). A associação de perícitos e células do músculo liso aos novos vasos formados, regula a

proliferação, sobrevivência, migração, diferenciação, ramificação, fluxo sanguíneo e

permeabilidade vascular das células endoteliais (Carmeliet, 2003).

No início do desenvolvimento os vasos são constituídos por apenas uma camada de células

endoteliais. Com o aumento da complexidade da rede vascular os vasos vão recrutando células

murais e desenvolvendo uma matriz extracelular.

Os perícitos estão em contacto intercelular directo com as células endoteliais, e formam as

paredes dos capilares e vasos sanguíneos imaturos. As paredes dos vasos sanguíneos maduros e os

vasos de grande diâmetro, como as artérias e veias, são formadas por diversas camadas de músculo

liso separadas do endotélio por uma membrana basal (Karamysheva, 2008).


44

Os perícitos são células de origem mesenquimal. Compreendem uma população de células

heterogénea, e são capazes de se diferenciar em vários tipos de células mesenquimais tais como

células do músculo liso, fibroblastos e osteoblastos (Gerhardt & Betsholtz, 2003). Os perícitos têm

diversas funções, como a modulação do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular, e a

libertação de sinais para o endotélio e matriz extracelular através de moléculas celulares (Conway et

al., 2001).

As células do músculo liso vasculares podem ter origem mesenquimal, endotelial, em

precursores da medula óssea em macrófagos (Carmeliet & Jain, 2000). Estas células inibem a

migração e proliferação endotelial estabilizando os vasos nascentes (Conway et al., 2001)

Apesar dos perícitos e das células do músculo liso partilharem algumas características, não é

claro se a sua origem provém dos mesmos progenitores ou se são uma variação fenotípica da

mesma linha celular (Karamysheva, 2008).

A fase inicial da maturação consiste na fusão dos novos vasos formados com outros já

existentes. Este processo é auxiliado pelas “tip cells”que entram em contacto com outras “tip cells”

ou com capilares já existentes. Para que se formem vasos coesos, as “tip cells”param de se mover e,

nos locais de contacto, estabelecem-se interacções com moléculas de adesão.

O lúmen dos novos vasos forma-se e o fluxo de sangue emergente contribui para a

estabilização do novo vaso formado, enquanto o fornecimento de oxigénio pela circulação

sanguínea diminui a expressão de VEGF-A e outros sinais pró -angiogénicos induzidos previamente

pela hipóxia (Karamysheva, 2008).

Estão envolvidos diversos factores moleculares no recrutamento de perícitos para formar as

novas paredes vasculares. Este processo é organizado por via: dos ligandos Angiopoietina (Ang) e

dos receptores Tie; do ligando factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGFB) e do seu

receptor PDGFRβ; e do ligando factor de transformação do crescimento beta (TGFβ)

(Karamysheva, 2008).


45

PDGFB é considerado o factor chave no recrutamento de perícitos. É um quimioatractor de

células de músculo liso (Hellstrom, 1999) que facilita tanto a proliferação como o recrutamento,

migração e incorporação na parede dos vasos, por interacção com o seu receptor tirosina – cinase

PDGFRβ (Karamysheva, 2008).

Angiopoietina é outra via de sinalização envolvida na manutenção, crescimento e

estabilização entre células endoteliais e peri-endoteliais. O receptor Tie-2 liga-se às angiopoietinas

(Ang-1 e Ang-2) e desencadeia uma cascata de sinalização. Apesar das semelhanças estruturais, as

angiopoietinas Ang-1 e Ang-2 têm uma acção directa diferenciada sobre Tie-2. Enquanto Ang-1

estimula a fosforilação de Tie2, a interacção com Ang-2 não resulta na activação do receptor. Desta

forma, Ang-2 é um inibidor competitivo de Ang-1 (Suri et al., 1998; Marme & Fusenig, 2007).

Quando a concentração de Ang-2 é mais baixa que Ang-1, Ang-1 recruta perícitos para os vasos

imaturos (Yonenaga et al., 2005).

A cascata de activação Tie2/Ang-1 promove a associação de perícitos ao endotélio; diminui

a permeabilidade vascular e exibe actividade anti inflamatória (Carmeliet, 2003; Karamysheva,

2008). A Figura 9 resume os principais processos e factores moleculares envolvidos na maturação

dos vasos sanguíneos.

Figura 9. Recrutamento de células murais e maturação dos vasos sanguíneos

Os vasos nascentes consistem inicialmente numa camada de células endoteliais. A maturação dos vasos necessita de factores angiogénicos para que se recrutem perícitos para que ocorra a maturação. A chave deste processo é a via do ligando PDGFB. A via de sinalização Ang1-Tie2 permite a estabilização e associação de perícitos ao endotélio. A maturação permite a transição do estado activo da rede vascular em crescimento, para um estado quiescente completamente formado e funcional. Adaptado (Carmeliet, 2003).


46

Os vasos consistem em dois tipos principais de células, endoteliais e murais (células do

músculo liso e perícitos). Desta forma é importante que a investigação tenha em consideração a

compreensão dos mecanismos de angiogénese para determinar que processos regulam a actividade

biológica destas células e para estudar a sua interacção.

A avaliação da maturação dos vasos pode ser realizada por técnicas imunocitoquímicas que

marquem os perícitos, tais como o anticorpo actina músculo liso (Yonenaga et al., 2005) - os

perícitos expressam anticorpo actina músculo liso - α (AML) sendo-lhes atribuída uma função

contráctil (Benjamin et al., 1998) -.

2.2.5.6 Factores anti-angiogénicos

Os factores anti-angiogénicos inibem o crescimento dos vasos sanguíneos por alteração do

processo angiogénico podendo ser encontrados tanto em circulação como sequestrados para a

matriz extracelular das células próximas (Nyberg et al., 2005). Estes factores podem ser endógenos,

tais como proteínas do próprio organismo, ou exógenos tais como fármacos ou componentes da

dieta (Ribatti, 2009).

Numerosos factores anti-angiogénicos endógenos têm sido reportados, nomeadamente a

angiostatina, a endostatina e a trombospondina-1 (TSP-1). TSP-1 é um anti – angiogénico na

medida que inibe a proliferação e migração das células endoteliais e induz a sua apoptose

(Rodríguez-Manzaneque et al., 2001). Angiostatina e endostatina são moléculas derivadas da

clivagem de proteínas maiores que, por si só, são inactivas. Enquanto a angiostatina inibe a

proliferação e migração das células endoteliais e aumenta a apoptose das células endoteliais, a

endostatina diminui a migração das células endoteliais e aumenta a apoptose (O'Reilly et al., 1997).

2.2.5.7 A importância terapêutica no estudo da angiogénese

O conhecimento da associação entre a existência de factores produzidos pelos tumores com

a formação de novos vasos tem várias décadas (Ferrara & Kerbel, 2005). Estudos de Folkman

(Folkman, 1971) levantaram a hipótese sobre a inibição da angiogénese ser uma estratégia


47

terapêutica no estudo do cancro, dando início à investigação da angiogénese terapêutica. Nas

décadas seguintes iniciou-se uma procura extensa de factores pró-angiogénicos e anti-angiogénicos

com vista à descoberta de novos alvos terapêuticos. Os trabalhos desenvolvidos nesta área tiveram

um crescimento exponencial com mais de 10000 artigos publicados sobre angiogénese (Kerbel,

2008).

Actualmente é claro que a compreensão dos mecanismos de regulação da angiogénese veio

abrir portas para a elaboração de novas abordagens terapêuticas. Se a activação da angiogénese é

uma condição necessária para o crescimento e progressão tumoral e de outras patologias, o

desenvolvimento da rede vascular e o seu, aumento de permeabilidade contribuem para a

metastização. Consequentemente, os estudos desenvolvidos incidiram nas premissas de que os

fármacos que promovessem a supressão tumoral iram bloquear o crescimento do tumor

(Karamysheva, 2008).

A utilização do fármaco Bevacizumab (nome comercial Avastin; Genentech Inc, South San

Francisco, CA), um anticorpo monoclonal recombinante humanizado, produzido por tecnologia de

DNA que inibe a angiogénese tumoral por neutralização do VEGF-A, foi aprovada pela Food and

Drug Administration (FDA), nos estados Unidos, em Fevereiro de 2004.

Os primeiros resultados da aplicação de Bevacizumab, em combinação com a quimioterapia,

mostraram que contribui para o aumento da esperança de vida em pacientes com tumores da mama,

pulmão e recto, de 15,6 meses para 20,3 meses (Hurwitz et al., 2004). Em 2006, Bevacizumab era

testado em mais de 25 patologias.

No campo da terapêutica, as investigações evoluem em duas vertentes: no ajuste dos

protocolos de tratamento dos tumores (com base nos dados obtidos a partir do estudo da estrutura

microvascular dos tumores) e no desenvolvimento de terapêuticas anti-angiogénicas específicas. As

aplicações terapêuticas incluem o desenvolvimento de novas substâncias anti-angiogénicas;

fármacos que actuam nos neovasos, terapêutica baseada em anticorpos e terapia génica (Graça et

al., 2004).


48

Potencialmente todos os promotores da angiogénese podem ser bloqueados por uma terapia

anti-angiogénica específica. A título de exemplo, o Factor Indutor de Hipóxia-1 (HIF-1), que

conduz ao aumento da expressão de VEGF-A, é um alvo preferencial para terapia. Contudo, o

bloqueio dos promotores da angiogénese envolve mecanismos complexos que, à luz dos

conhecimentos actuais são difíceis de compreender na sua totalidade. O bloqueio da angiogénese

também pode ser considerado para receptores específicos da estimulação da angiogénese. A maioria

dos receptores conhecidos são tirosina – cinases. Isto inclui receptores do PDGF (PDGFRα e

PDGFRβ), do VEGF VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3), entre outros. O Quadro 4 sumariza os

principais inibidores da angiogénese em uso (Longatto Filho et al., 2010).

Outras investigações apontam no sentido de terapias pró-angiogénicas de modo a estimular a

revascularização (por exemplo em doentes com isquémia do miocárdio), no entanto os resultados

preliminares têm-se mostrado aquém das expectativas (Heinl-Green et al., 2005).

Os desafios que se levantam passam pelo conhecimento dos mecanismos de angiogénese em

detalhe de modo a que se produzam terapêuticas eficazes e seguras.

Quadro 4. Inibidores da angiogénese em uso corrente na prática clínica

Adaptada (Longatto Filho et al., 2010)

Inibidor angiogénico Alvo Uso clínico

Bevacizumab VEGF Aprovado pela FDA em 2004 para doentes com tumor colorectal metastático. Hoje em dia é usado para diversos tumores tais como o cancro da mama

Sorafenib VEGFR-2 e 3, PDGFR-β,

FLT3 e KIT

Carcinoma de células renais e carcinoma hepatocelular

Sunitinib PDGFRα, PDGFRβ, VEGFR-1,

VEGFR-2, VEGFR-3, KIT,

FLT3, CSF-1R, e RET

Tumores do estroma gastrointestinal

Thalidomide FGF-2 e FGFR Mieloma

Aflibercept

(VEGFR solúveis)

VEGF-A, VEGF-B, e PlGF Carcinoma do pulmão de não- pequenas células metastático; tumor da prostata

Vascular disrupting agents (VDAs)

VDAs biológicos combinam um alvo endotelial com uma toxina ou pró-coagulante

Tumor anaplásico da tiróide


49

2.2.5.8 O significado da densidade vascular

A densidade vascular, estudada em secções histológicas, corresponde à medição da extensão

da angiogénese - nº vasos/ area (Barbareschi et al., 1995). A visualização dos vasos pode ser

realizada recorrendo a métodos imunocitoquímicos que utilizem uma variedade de anticorpos

endoteliais específicos, tais como o Factor de Von Willebrand (FVIII), a molécula-1 de adesão

celular endotelial a plaquetas PECAM-1 (CD31) ou o CD34 (Barbareschi et al., 1995).

A verdadeira importância da densidade vascular é controversa. É aceite que a caracterização

da densidade vascular é importante para definição da estratégia terapêutica mais adequada para cada

doente (Longatto Filho et al., 2010). Numerosos estudos demonstram correlação entre a extensão da

angiogénese e a probabilidade de metastização (sendo esta um importante factor de prognóstico).

No entanto, esta correlação não é constante, observando-se importantes variações entre os vários

tumores (Graça et al., 2004).

2.2.5.9 Limitações da densidade vascular

Apesar do uso da densidade vascular enquanto factor preditivo da eficácia de terapêuticas,

esta técnica apresenta algumas limitações.

A medição da densidade vascular não permite um estudo tridimensional (o estudo de uma

área, por exemplo por biópsia, pode não corresponder à densidade vascular da totalidade do tumor);

a correlação entre a densidade vascular e o tumor ainda é incerta em muitos tipos de tumores

(Weidner, 2000); para este método ser usado como preditivo da eficácia de terapias anti-

angiogénicas tem de se recorrer a métodos invasivos para colheita de tecidos (Hlatky et al., 2002).

Para um prognóstico mais preciso e a identificação dos pacientes que podem efectivamente

beneficiar de um determinado tratamento em detrimento de outro poderia recorrer-se ao doseamento

dos factores angiogénicos circulantes (Barbareschi et al., 1995). Esta técnica parece fornecer

informações adicionais sobre o prognóstico, predizer a resposta à terapêutica e monitorizar o curso

clínico em alguns tumores (Kuroi & Toi, 2001; Graça et al., 2004). Deste modo, uma abordagem


50

combinada entre a densidade vascular histológica e o estudo bioquímico no soro ou urina dos

pacientes forneceria uma informação mais completa, válida e reprodutível da actividade

angiogénica (Barbareschi et al., 1995).

2.3 Angiogénese associada a helmintoses

Ainda que o estudo da angiogénese tenha mais de um século, a maioria das investigações

recai sobre a angiogénese tumoral. Pouco se sabe sobre a angiogénese associada a helmintoses,

tanto em humanos como em modelos animais. É no entanto provável que a angiogénese tumoral e a

angiogénese associada aos helmintas apresente analogias. O sucesso do parasitismo relativo ao

crescimento, maturação, produção de ovos e reinfecção, recai sobre os helmintas associados à

angiogénese, que partilham pelo menos algumas das características na tumorogénese dependentes

de neovascularização (Dennis et al., 2011).

Durante o desenvolvimento dos helmintas, é aparente uma interacção directa ou indirecta

com o sangue do hospedeiro e/ou com o seu sistema vascular/linfático. Potencialmente estes

parasitas helmintas podem ter a capacidade de iniciar eventos pró-angiogénicos. (Dennis et al.,

2011).

O nemátode de vida livre Caenorhabditis elegans tem sido utilizado, com sucesso, como

modelo em estudos que permitem a identificação de factores altamente conservados durante a

evolução dos organismos (Shen et al., 2005). Investigadores identificaram uma família de quatro

receptores tirosina – cinase em C. elegans estruturalmente relacionados com os VEGFRs. As

semelhanças entre os genes do parasita e dos vertebrados no que se refere aos processos de

neurogénese e morfogénese sugere que os homólogos de VEGFR foram primeiro envolvidos na

migração e adesão da neurogénese e morfogénese de um organismo vivo simples e posteriormente

adaptados pelos vertebrados para incluir angiogénese (Popovici et al., 2002). De facto, foi

demonstrado que C. elegans codifica um factor capaz de se ligar aos receptores de VEGF de

mamíferos e induzir a angiogénese. Este é o gene pvf-1 que codifica factores do tipo PDGF/VEGF


51

com propriedades bioquímicas similares aos factores PDGF/VEGF dos vertebrados.

Adicionalmente pvf-1 liga-se aos receptores VEGFR-1 (flt-1) e VEGFR-2 (KDR) dos mamíferos

sendo capaz de induzir a angiogénese (Tarsitano et al., 2006).

Com base nestes estudos, levanta-se a hipótese de os nemátodes terem a capacidade de

produzir e secretar moléculas do tipo VEGF biologicamente activas (Dennis et al., 2011) A Figura

10 ilustra a via hipotética utilizada pelos helmintas parasitas na indução de angiogénese.

Figura 10. Via hipotética utilizada pelos helmintas parasitas na indução de angiogénese.

Representação esquemática das quatro fases da angiogénese induzida pelos helmintas parasitas. I- Libertação de factores pró - angiogénicos pelo helminta e/ou indução da sobre expressão de factores pró-angiogénicos pelo infiltrado inflamatório hospedeiro; II- “Angiogenic switch” com consequente activação das células endoteliais e quebra focal da membrana dos vasos existentes; III- remodelação e formação da vasculatura induzida pelo helminta; IV- Manutenção da instabilidade da vasculatura ou maturação pelo recrutamento de perícitos. Adaptado (Dennis et al., 2011).


52

Com o objectivo de ilustrar diferentes mecanismos utilizados pelos parasitas que estimulam

a neovascularização, destacam-se em seguida alguns estudos realizados na área da angiogénese

associada a helmintoses.

2.3.1.1 Cestodes

Neurocisticercose é uma infecção do sistema nervoso central causada pela forma larvar da

Taenia solium. Um estudo de oito pacientes com neurocisticercose, submetidos a crarniotomia para

avaliação histológica e imunocitoquímica, mostrou que as larvas de T. solium mortas induzem a

formação de um granuloma com fibrose, angiogénese e infiltrado inflamatório associado (Restrepo

et al., 2001). Adicionalmente, foi observado em modelos animais (porcos) com neurocisticercose

um aumento de angiogénese sugestivo de perda da barreira hematoencefálica (Sikasunge et al.,

2009).

2.3.1.2 Tremátodes

A maioria das investigações sobre a associação de angiogénese a helmintas foram realizadas

nos hospedeiros definitivos dos tremátodes.

A schistosomose é uma doença causada por várias espécies do género Schistosoma. A

resposta granulomatosa à volta dos ovos dos parasitas alojados nos tecidos do hospedeiro é

considerada uma das principais bases patogénicas da shistosomose.

Vários autores demonstraram a presença de angiogénese em modelos de schistosomose. Os

autores Baptista e Andrade utilizaram uma metodologia combinada de injecção vascular colorida,

demonstração da laminina em membranas basais e análise ultraestrutural, com o objectivo de

visualizar e descrever a angiogénese nos granulomas de Schistosoma mansoni com diferentes

tempos de evolução. Concluíram que a angiogénese é um fenómeno que ocorre numa fase inicial da

formação do granuloma. Com o tempo, os granulomas tornam-se quase avasculares, por vezes

apenas delimitados por uma rede vascular na periferia. (Baptista & Andrade, 2005). Os mesmos

autores publicam outro estudo em 2010 cujos resultados mostram que se observa uma marcada


53

proliferação de vasos em peri-granulomas e uma proliferação concêntrica de células positivas para

actina do músculo liso que se comportam como perícitos à volta dos vasos que proliferaram. Estes

achados foram muito mais evidentes na fase inicial da formação do granuloma (Lemos & Andrade,

2010).

Adicionalmente, outro estudo revela que os ovos de S. mansoni secretam factores capazes de

estimular a proliferação de células endoteliais, células endoteliais vasculares, e a sua migração

(Kanse et al., 2005). Outro estudo mostra que o antigénio solúvel dos ovos de S. mansoni promove

a proliferação, diminuí a apoptose e aumenta o ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) do VEGF.

Desta forma os autores (Loeffler et al., 2002) sugerem que os produtos secretados pelos ovos de S.

mansoni promovem a angiogénese no granuloma hepático através de uma sobre expressão de

VEGF, que leva à activação endotelial que contribui para o desenvolvimento do granuloma. Por

outro lado, os ovos deste parasita ligados ao endotélio promovem indirectamente angiogénese

através da resposta inflamatória e hipóxia (Pearce et al., 2004).

Noutro trabalho, mais recente (Shariati et al., 2011) foi analisado o soro de pacientes com

diferentes infecções helminticas diagnosticadas. Os autores do estudo referem que os níveis de

VEGF analisados nos pacientes com schistosomose e filariose eram substancialmente mais elevados

do que os níveis encontrados em pacientes saudáveis ou infectados com cestodes. Adicionalmente

foi estudado efeito de factores anti-angiogénicos (endostatina) em modelos murinos infectados com

S. mansoni, tendo sido observada uma diminuição do número de granulomas encontrados no fígado

dos animais sujeitos a tratamento.

No que se refere à angiogénese em schistosomose humana, destaca-se o estudo de um

investigador egípcio (Tawfeek et al., 2003) que avaliou 90 doentes infectados com S.mansoni e

classificou-os em grupos de acordo com o grau de infecção (levemente ou fortemente infectados,

infecção intestinal, infecção recente hepatoesplénica, infecção peri portal). Quando comparou os

grupos com controlos, verificou que os níveis de VEGF estavam significativamente elevados nos

grupos levemente infectados e nas infecções intestinais. Constatou ainda que os níveis de VEGF


54

estavam correlacionados com a progressão da doença. Os autores admitem que com base nestes

resultados o VEGF possa ser utilizado como um indicador da progressão patológica de S. mansoni,

reflectindo a angiogénese que regula o desenvolvimento do granuloma.

2.3.1.3 Nematodes

A filariose é uma doença causada por várias espécies de nemátodes. Na literatura estão

descritas associações com angiogénese para Wuchereria bancroft e Onchocerca volvulus.

O parasita W. bancroft aloja-se nos vasos linfáticos causando linfedema, dilatação dos vasos

linfáticos e em alguns casos elefantíase. Alguns autores (Pfarr et al., 2009), associam a activação de

factores de crescimento endotelial vascular (VEGF-C) ao antigénio libertado pelo parasita no

hospedeiro, o que promove a hiperplasia vascular (o primeiro passo para o desenvolvimento de

linfedema).

A oncocercose, nos humanos, é uma doença causada pelo nemátode da espécie Onchocerca

volvulus e é caracterizada por dois tipos de manifestações clínicas: nódulos subcutâneos (por

alojamento das formas adultas debaixo da pele, o que leva à sua encapsulação como resposta

imunitária do organismo) e lesões oculares (por migração para o olho). Em 1988 realizou-se um

estudo de perfusão vascular, em nódulos subcutâneos excisados, onde se aplicou tinta-da-china por

canulação dos vasos superficiais. Os resultados deste trabalho mostraram que em nódulos maiores

ocorre uma intensa vascularização periférica, alimentada por vasos superficiais e em contacto

próximo com os parasitas, enquanto a zona central se encontra pouco vascularizada. Os autores

consideram que o padrão de angiogénese é variado e levantam a hipótese de Onchocerca volvulus

libertar factores angiogénicos (VEGF-C) e desta forma controlar a angiogénese. (Smith et al.,

1988).

O papel dos factores angiogénicos na infecção por Stongyloides venezuelensis foi estudado

em 2010. Neste trabalho, os autores administraram a ratos um inibidor angiogénico (endostatina) e

infectaram-nos com o parasita. A avaliação parasitológica revelou uma diminuição significativa de


55

ovos por grama de fezes, e do número de larvas recolhidas dos pulmões dos ratos submetidos ao

tratamento. As larvas (L3) e os parasitas adultos recolhidos respectivamente nos pulmões e no

intestino, eram VEGF e FGF2 dependentes. Os antigénios da L3 regulavam a sobre expressão de

mRNA VEGF e FGF2 (Shariati et al., 2010).

O número de exemplos de nemátodes associados a angiogénese é bastante extenso. Estes

nemátodes são caracterizados por ciclos de vida que envolvem uma fase de desenvolvimento larvar

migratória e/ou uma fase estacionária intravascular no seu local preferencial.

2.4 Angiogénese em T. spiralis

2.4.1 A descoberta da rede vascular na superfície da cápsula de T. spiralis

As primeiras observações, que relatam a associação entre o aumento da vascularidade

muscular e T. spiralis, são atribuídas a Friedrich Alexander Hermann Pagenstecher. Em 1865 este

médico observou, a partir de estudos “post mortem”, o aumento de vascularidade à volta de fibras

musculares infectadas com T. spiralis, antes do momento de encapsulação (Pagenstecher, 1865). O

desenho da rede ilustra-se na Figura 11.

Figura 11. Desenho da rede vascular em músculo infectado com T. spiralis.

Injecção de tinta-da-china em cão infectado (Pagenstecher, 1865).

Anos depois, em 1949, Ogielski injectou tinta-da-china em ratos e observou uma “rede de

capilares”, ao 33º dia após infecção, no local onde se encontrava cada larva, nas fibras musculares

(Figura 12). O autor sugeriu que um dos motivos relacionados com a preferência das larvas por


56

certos órgãos, como por exemplo o diafragma, possa estar relacionado com o facto de estes

músculos terem um elevado número de vasos (Ogielski, 1949).

Figura 12. Injecção de tinta-da-china na rede vascular da nurse cell de T. spiralis.

Músculo de rato infectado (Despommier, Gwadz et al. 2005).

Nos estudos que se seguiram, os investigadores examinaram o desenvolvimento da rede

vascular associando-a à nurse cell. Os seus trabalhos mostraram que o aumento de vasos ocorre

cerca de 12 dias após a entrada das larvas de T.spiralis no músculo. Foi descrito o desenvolvimento

de uma rede vascular superficial, que envolve individualmente as células musculares encapsuladas

(Humes & Akers, 1952; Wright, 1989; Baruch & Despommier, 1991). O esquema da Figura 13

mostra o início da angiogénese em associação com a formação da nurse cell.

Figura 13. Angiogénese e formação da nurse cell.

A rede vascular é visível cerca de 12 dias após a entrada da larva no músculo (Despommier, 1998).


57

2.4.2 A estrutura da rede vascular na nurse cell de T. spiralis

Em 1991, foi realizado um estudo que utilizou os métodos combinados de perfusão cardíaca

e injecção de um reagente que polimeriza in situ. Este método permitiu a criação de moldes

anatómicos plásticos da rede vascular das nurse cell de T. spiralis.

As redes vasculares estavam presentes apenas em células infectadas. Verificou-se a perca da

vasculatura nas porções terminais da nurse cell. Os vasos variavam em calibre e em complexidade.

Foram observadas redes vasculares sobrepostas em camadas nas nurse cells. Identificaram-se três

tipos de rede vascular: simples, complexa e hipercomplexa (Figura 14). A rede vascular simples

continha um ou dois vasos circunferenciais, era espaçada e os vasos minimamente dilatados, com

pouca evidência de ramificação. As redes complexas tinham mais de três vasos circunferenciais que

davam origem a uma rede vascular ramificada, que podia estar dilatada até três vezes, e era mais

densa. As redes hipercomplexas eram formadas por vasos mais compactos.

Os autores do estudo consideraram que as redes vasculares observadas eram resultado “de

novo”, ou seja de angiogénese, por comparação da estrutura dos vasos observados na infecção, com

a dos que se localizavam no músculo não infectado (Baruch & Despommier, 1991).


58

Figura 14. Moldes anatómicos da rede vascular envolvente da nurse cell.

Moldes anatómicos plásticos da rede vascular da nurse cell de T. spiralis. A- vasos de músculo não infectado (Normais), B – rede simples, C- rede complexa, D- rede hipercomplexa. Adaptado (Baruch & Despommier, 1991).

Noutro trabalho, utilizando a microscopia intravital, que permite o estudo dinâmico, in vivo,

da microcirculação, verificou-se um elevado fluxo de elementos nos vasos formados à volta da

nurse cell de T. spiralis. O elevado diâmetro dos vasos levou a que se especulasse sobre a

possibilidade das redes vasculares serem formadas por arteríolas em vez de capilares (Despommier,

1993).

Actualmente (Despommier, 1998), contrariando o estudo de Despommier em 1993, sabe-se

que os vasos são derivados de vénulas adjacentes e que têm o diâmetro de capilares (Figura 15).

A B

DC


59

Figura 15. Representação da rede vascular envolvendo a nurse cell de T. spiralis.

Adaptado http://www.Trichinella.org/.

2.4.3 O significado biológico da angiogénese em T.spiralis

As investigações sobre a angiogénese em T. spiralis prosseguiram no sentido de

compreender as funções da rede vascular.

O significado biológico da rede vascular, formada à volta da nurse cell de T.spiralis, tem

sido associado sobretudo à aquisição de nutrientes e à eliminação de resíduos. Para uma relação de

parasitismo a longo termo, em que o parasita se mantém metabolicamente activo (Despommier,

1993) é essencial a aquisição de nutrientes e a eliminação de resíduos. Pensa-se que a T. spiralis

realiza estas duas tarefas com uma só acção, atraindo uma série de vasos permeáveis (a rede

vascular) para a superfície da sua cápsula de colagénio (Despommier, 1998).

O facto da rede vascular se formar fora da célula infectada pode representar uma adaptação

invulgar de parasitismo, em que a nurse cell tenta lidar com volumes fora do comum de resíduos

metabólicos derivados do parasita e da célula hospedeira infectada (Kennedy & Harnett, 2001).

Conhecida a estrutura e o diâmetro dos vasos, e comparando com o diâmetro de capilares,

pensa-se que do diâmetro dos novos vasos formados facilita a troca de elementos formados entre

eles por um lado, mas também favorece a troca de nutrientes e resíduos por outro (Despommier,

1998).


60

Adicionalmente, a rede vascular pode ter funções de regular necessidades

aeróbias/anaeróbias da célula hospedeira, do parasita, ou de ambos proporcionando as condições

óptimas para a troca eficiente de gases entre a nurse cell e as células sanguíneas que passam por ela

nos vasos que a envolvem (Stewart, 1983; Capó et al., 1998).

O metabolismo energético da larva (L1) assemelha-se ao anaeróbio (Stewart, 1983) e muito

provavelmente o parasita necessita de um ambiente com baixos níveis de oxigénio no ambiente

envolvente para que possa degradar a glucose (Montgomery et al., 1995). Curiosamente a nurse cell

localiza-se em tecidos musculares que geralmente exibem um elevado consumo de oxigénio

(Sciacco & Bonilla, 1996). Estudos com vista à compreensão das características das mitocôndrias

das nurse cell mostraram que a síntese de trifosfato de adenosina mitocondrial (mtATP) é diminuída

em tecidos infectados, comparativamente com tecidos musculares normais. Adicionalmente a

síntese de mtATP podia ser normalizada quando se tratavam os animais infectados com pequenas

doses de mebenzadole (Boczon et al., 1993). Estes dados sugerem que o parasita mantém um estado

anaeróbio interferindo com a síntese de mtATP (Boczon et al., 1993; Capó et al., 1998). Esta

estratégia metabólica explica como o parasita se mantém infectante no tecido muscular deteriorado,

após a morte do seu hospedeiro (dependendo de condições de temperatura), durante dias e semanas

(Despommier, 1998).

Tendo em consideração todos os estudos referidos, é razoável assumir-se que o parasita

secreta proteínas, constantemente, de modo a manter a nurse cell no seu estado diferenciado. (Capó

et al., 1998). Em resumo, a larva de T. spiralis está provavelmente em controlo da formação e

manutenção da nurse cell (Capó et al., 1998).

2.4.4 Factores que estimulam a produção da rede vascular na nurse cell de T. spiralis

O conhecimento actual sobre os eventos bioquímicos e moleculares que estimulam a

produção da rede vascular na nurse cell de T. spiralis é reduzido.

Sabe-se que à medida que o parasita e a nurse cell crescem, há um aumento na necessidade

de nutrientes promovendo a neovascularização (Capó et al., 1998). Em resposta a estímulos


61

angiogénicos, as células endoteliais alteram a sua morfologia, causam dilatação vascular, degradam

a membrana basal, proliferam e migram, formando capilares (Cao et al., 1996). A maioria dos casos

em que ocorre a formação de um vaso novo é desencadeada por uma alteração local no equilíbrio

entre os factores angiogénicos e inibidores (Folkman, 1995) sendo precedida por uma situação de

hipoxia (Fong, 2008). As células localizadas na área onde ocorre a diminuição da tensão de

oxigénio secretam e sobre expressam citocinas angiogénicas (Brindle, 1993), sendo a mais

importante o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF).

A origem dos factores que estimulam a produção da rede vascular na nurse cell de T.

spiralis foi estudada pela primeira vez com a detecção do factor de crescimento endotelial vascular,

que levantou a possibilidade de regulação do VEGF pela nurse cell (Capó et al., 1998). Neste

estudo, injectaram larvas no músculo de rato e detectaram, por hibridação in situ, ácido ribonucléico

mensageiro no citoplasma da nurse cell desde o sétimo dia até oito meses após a injecção de larvas

no músculo. Verificaram ainda por marcação imunocitoquímica a presença do péptido de VEGF a

partir do nono dia até oito meses após a injecção de larvas no músculo. A sobre expressão de

mRNA e pépdido manteve-se na nurse cell durante os oito meses. Detectou-se mRNA e péptido de

VEGF nas células inflamatórias adjacentes à nurse cell 15 dias após a infecção, verificando-se uma

diminuição da intensidade da marcação no dia 24, mantendo-se este padrão até oito meses

(marcação com mais intensidade na nurse cell do que no infiltrado inflamatório). Em nenhum

período foi detectada marcação na larva. Em algumas células a marcação do péptido apresentava-se

sob a forma de grãos finos, enquanto noutras era grosseiramente granular

Com base nestes resultados, os autores propõem que o gene que codifica o VEGF

permanece sobre expresso durante o período de infecção. O facto de o péptido ser detectado no

citoplasma da nurse cell mesmo após a formação da rede vascular, levanta a possibilidade de se

manter um estado constante de hipóxia, e é indicativo de um aumento permanente de

permeabilidade vascular (Capó et al., 1998; Despommier, 1998).


62

Apesar do desenvolvimento dos conhecimentos relativos aos factores que estimulam a

produção da rede vascular na nurse cell de T. spiralis, a estimulação de angiogénese pelas células

inflamatórias do hospedeiro adjacentes às nurse cell, ou até pelo parasita não podia ser excluída

(Raines & Stewart, 1988).

Em 2009 é publicado um trabalho que investiga as diferenças na expressão de VEGF e o

factor de crescimento de fibroblastos básico (FGF2) por T.spiralis e T.pseudospiralis, a partir de

culturas celulares de macrófagos.

Um dos efeitos do FGF2 é a proliferação em células de cultura, incluindo fibroblastos,

células endoteliais e células do músculo liso vasculares (Shariati et al., 2009) (Klagsbrun &

Edelman, 1989).

Os autores do estudo demonstram que as culturas de macrófagos conseguem produzir e

libertar tanto VEGF como FGF2 em resposta a antigénios de T. spiralis, e que as células

inflamatórias na área adjacente à nurse cell de T. spiralis contribuem para a produção de factores

angiogénicos (Shariati et al., 2009).

Resumindo, previamente foi demonstrado que as nurse cells são capazes de produzir VEGF

durante a infecção por T. spiralis (Capó et al., 1998) e posteriormente demonstrado que as células

inflamatórias adjacentes à nurse cell contribuem para a produção de VEGF (Shariati et al., 2009).

Está por esclarecer a expressão de factores pró-angiogénicos pelo parasita.

Com base no exposto nos pontos anteriores, apresenta-se um esquema dos mecanismos

possivelmente utilizados pelo parasita que estimulam a angiogénese (Figura 16).


63

Figura 16. Mecanismos utilizados pelo parasita que estimulam a angiogénese

Factores pró - angiogénicos como o VEGF e o FGF2 induzem angiogénese directamente, por estimulação da proliferação endotelial, migração e diferenciação em estruturas tubulares vasculares (Capó et al., 1998); outros factores angiogénicos como a interleucina-1, promovem angiogénese indirectamente estimulando as células inflamatórias a produzir VEGF (Niborski et al., 2004); poderão existir outras vias que promovam, a angiogénese. Expressão da angiogénese observada no citoplasma das nurse cells (VEGF) e nas células inflamatórias adjacentes à nurse cell (VEGF) (Shariati et al., 2009). A estimulação de angiogénese pelo parasita não pode ser excluída (Raines & Stewart, 1988).

2.4.5 Angiogénese em T. spiralis: novos avanços, mais questões

As investigações apontam agora no sentido de conhecer o modo como o parasita influencia a

expressão genómica do hospedeiro. Em 2004, foi revelado um perfil genético de 1176 genes nos

tecidos musculares, antes e depois da infecção com T. spiralis. Os autores do estudo realizaram uma

análise por microarray a 311 desses genes, e detectaram um aumento de expressão em 184 deles.

No mesmo trabalho, sugerem que a angiogénese observada nas nurse cell poderia ser uma forte

candidata para justificar o aumento da expressão genética de alguns destes genes (Wu et al., 2005).

Ainda neste estudo, a proteína “bone morphogenetic protein 4” (Bmp4) mostrou uma expressão 10

vezes superior na célula infectada com T. spiralis comparativamente às células normais, e o VEGF

um aumento de três vezes. Três anos mais tarde, o mesmo autor publica um artigo que faz uma


64

analogia entre a formação da nurse cell e a reparação muscular. Neste estudo volta a referir a sobre

expressão da proteína “bone morphogenetic protein 4” (Bmp4), após infecção com T.spiralis,

associando-a à angiogénese (Wu et al., 2008).

A proteína BMP, é membro da superfamília dos factores de transformação do crescimento

beta (TGF-β). Estes factores estão envolvidos no crescimento e diferenciação e são reguladores da

embriogénese (Wu et al., 2005).

Estudos recentes têm dado ênfase ao papel dos BMPs na angiogénese. Estão descritas

doenças vasculares hereditárias associadas a mutação nos genes que codificam as BMPs (David et

al., 2009). Por outro lado a terapia genética tem ganho visibilidade enquanto uma ferramenta capaz

de fornecer proteínas terapêuticas, de modo fisiológico e eficaz, em determinadas patologias. A

título de exemplo, o trabalho realizado por investigadores que utilizaram células estaminais

originárias de músculo geneticamente modificadas para expressar VEGF e BMP4. Os resultados

dos seus trabalhos mostram que o VEGF para além de aumentar a angiogénese actua em sinergia

com o BMP4 promovendo a mobilização de células estaminais mesenquimatosas (importantes na

regeneração do tecido) (Peng et al., 2002).

Muito está por esclarecer no que respeita à angiogénese e à sua manutenção na nurse cell de

T. spiralis. É essencial aumentar o conhecimento sobre a natureza das alterações celulares e

moleculares que ocorrem na célula hospedeira que se transforma em nurse cell; compreender a

interacção da angiogénese com a resposta inflamatória do hospedeiro; caracterizar os factores pró-

angiogénicos expressos e analisar se a vasculatura formada pelo processo de angiogénese é uma

consequência do aumento da sobre expressão de factores pró-angiogénicos do hospedeiro e/ou do

parasita. Reunindo estes dados será possível por um lado, aumentar o conhecimento biológico sobre

este parasita com características tão peculiares, e por outro avançar com uma abordagem terapêutica

no sentido de inibir a formação da rede vascular e desta forma prevenir e/ou impedir a formação de

nurse cells. O sucesso da abordagem terapêutica anti-angiogénica poderá contribuir para o


65

insucesso da infecção, já que a angiogénese permite ao parasita permanecer no hospedeiro durante

longos períodos de tempo.

3 Material e métodos

Capítulo 3 – Material e métodos

69

3 Material e métodos

3.1 Caracterização do estudo

Trata-se de um estudo experimental, descritivo – correlacional, no qual foram analisadas as

variáveis: presença, ausência, localização e relação da expressão imunocitoquímica da molécula -1

de adesão celular endotelial a plaquetas (PECAM-1); de actina músculo liso (AML) e do Factor de

Crescimento Endotelial Vascular (VEGF).

3.2 Amostra

Com o objectivo da amostragem ser representativa do ciclo de vida do parasitaforam

obtidas 105 amostras de músculo provenientes de modelo animal (11 Rattus rattus) infectados com

T. spiralis por um período de 120 dias. Destas amostras foram seleccionadas42 para o estudo: 22

fragmentos fixados em formol e impregnados em parafina e 20 biópsias musculares congeladas.

3.3 Critérios de inclusão e exclusão

Foram considerados critérios de inclusão: as amostras estarem parasitadas com T. spiralis;

os tecidos musculares evidenciarem boa preservação morfológica e os órgãos em estudo terem o

maior número de quistos.

Foram avaliadas a totalidade das amostras, fixadas em formol e impregnadas em parafina

(55 amostras), para os parâmetros da preservação morfológica, presença de T. spiralis e contagem

do número de quistos, de acordo com o número de dias de infecção.

Após observação microscópica foi realizada uma amostragem, tendo sido seleccionados para

estudo histoquímico e imunocitoquímico os tecidos de língua e masseter (22 amostras), por

apresentarem o maior número de quistos. Foram excluídos os fragmentos de músculo dos membros

superiores e inferiores, por revelarem um menor número de quistos, e os fragmentos de diafragma

por má preservação morfológica. Com base nestes resultados, seleccionaram-se os tecidos de língua

e masseter para estudos de imunofluorescência na biópsia muscular congelada (20 amostras) e

excluíram-se as amostras de diafragma, membro superior e membro inferior.


70

3.4 Modelo Animal

Infecções experimentais, em diferentes modelos animais, mostraram que a susceptibilidade a

T. spiralis varia com os hospedeiros (Kapel et al., 1998). Os ratos, no entanto, são considerados

excelentes modelos experimentais para T. spiralis (Malakauskas et al., 2001) já que têm permitido

estudos imunológicos e parasitológicos de grande relevância (Stewart et al., 1978; Bell, 1998).

Baseado no tamanho dos quistos, os ratos são considerados melhores hospedeiros que os ratinhos

ou os porquinhos-da-índia (Harley, 1972). Para além do seu valor enquanto modelos experimentais,

na natureza os ratos desempenham um papel importante na manutenção de T. spiralis (Leiby et al.,

1990).

O presente estudo foi desenvolvido em 21 ratos fêmeas (Rattus rattus) com nove semanas de

idade, com um peso médio de aproximadamente 160 gramas, criados no biotério do Instituto de

Higiene e Medicina Tropical (IHMT) (Figura 17).

A amostra de 21 ratos foi estabelecida atendendo ao ciclo de vida do parasita e tendo em

consideração o número de dias de infecção que se pretendiam estudar (45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,

90 e 120 dias). Para estabelecer os dias de abate, foi utilizado como referência, um trabalho prévio

em T. spiralis desenvolvido no mesmo modelo animal (Marques, 2008).

Os ratos foram separados por grupos e colocados em caixas identificadas (Tabela 2): um

isolado (G0, controlo negativo, sem infecção) e os restantes em dez grupos de dois (G1 a G10, de

acordo com o número de dias de infecção previstos até ao abate). Destes, 10 ratos foram usados

para a actividade experimental e outros 10 foram infectados para salvaguardar qualquer imprevisto

durante a experiência, nomeadamente a morte prematura de algum dos animais.

Os animais foram mantidos no biotério do IHMT (Figura 18) em condições de temperatura,

humidade e luminosidade adequadas, de acordo com as leis em vigor (portaria nº 1005/92).


71

Figura 17. Modelo animal.

(original de C. Freitas).

Figura 18. Ratos mantidos no biotério do IHMT.


Tabela 2. Grupos de ratos em estudo separados por dias de infecção

Grupos em estudo

Dias de infecção

Animais experimentais por caixa (nº)

G0 0

G1 45

G2 50

G3 55

G4 60

G5 65

G6 70

G7 75

G8 80

G9 90

G10 120


72

3.5 Infecção experimental.

3.5.1 Exame parasitológico pré infecção: método de Willis

Um dia antes da infecção alterou-se a dieta dos ratos, retirando-lhes a comida e deixando-

lhes apenas a água. Com o objectivo de diagnosticar a presença de ovos de helmintas intestinais,

com base no princípio da flutuação em solução de Cloreto de Sódio (Figura 19), efectuou-se o

exame parasitológico das fezes de todos os ratos utilizando o método de Willis (Rey, 2001)

Figura 19. Método de Willis


3.5.2 Obtenção de tecidos de roedor infectado com T. spiralis.

Para a infecção experimental dos ratos, foi necessário obter larvas enquistadas de T. spiralis

da estirpe em estudo (Espanha) a partir de um roedor (Rattus rattus) previamente infectado na

UHMM. O sacrifício do rato (com oito meses de infecção) foi efectuado de acordo com o protocolo

seguido na UHMM. Deste modo, procedeu-se ao abate colocando o rato dentro de um recipiente de

vidro contendo algodão embebido em clorofórmio e tapando o recipiente. Após a sua morte, o rato

foi imobilizado e colocado sobre uma placa de dissecção, tendo sido fixadas as extremidades dos

membros com alfinetes de dissecção (Figura 20). Com auxílio de uma pinça e tesoura foi aberta a

cavidade abdominal, estendendo as incisões em direcção a cada extremidade, tendo o cuidado de


73

expor bem as massas musculares dos membros anteriores e posteriores, do pescoço e mandíbula.

Com a ajuda da pinça e de um bisturi retiraram-se todas as massas musculares dos membros

superiores e inferiores, masseteres, língua e diafragma.

Figura 20. Fixação do rato infectado à placa de dissecação.


Cortou-se o tecido muscular removido em pequenos fragmentos de aproximadamente 2 a 3

mm os quais se colocaram no triquinoscópio para pesquisa das larvas enquistadas no microscópio

óptico composto (Figura 21).

Figura 21. Larvas de T. spiralis do masseter do rato infectado.

Barra da escala: 50 µm (original de C. Freitas).


74

3.5.3 Preparação da dose infectante e infecção dos ratos

Primeiramente avaliou-se a carga parasitária do rato dador através da observação, no

microscópio óptico composto, dos fragmentos de tecido infectado (língua, masseter, membro

superior, diafragma e membro inferior) colhidos e colocados no triquinoscópio (Figura 22).

Figura 22. Avaliação da carga parasitária de músculo infectado com T.spiralis no triquinoscópio.


Em seguida realizou-se uma contagem de quistos de T.spiralis para cada fragmento (Figura

23).

Figura 23. Larvas de T.spiralis do masseter do rato infectado.

Barra da escala: 100 µm (original de C. Freitas).

Com o objectivo de provocar uma infecção com 1500 larvas (Marques, 2008) pesaram-se os

fragmentos observados no microscópio invertido e as massas musculares obtidas a partir do roedor


75

infectado sacrificado. Com base no número de larvas existentes em um grama de tecido, calculou-se

o número de gramas necessário para provocar a infecção pretendida.

Os 20 ratos foram seguidamente infectados pela administração oral de fragmentos de tecido

parasitado com T.spiralis envoltos em miolo de pão (Figura 24).

Figura 24. Fragmentos de músculo parasitado com T.spiralis envoltos em pão para infecção oral.

(original de C. Freitas)

3.6 Controlo de peso dos animais experimentais

O peso dos ratos foi registado antes da infecção e imediatamente antes do abate.

Para as pesagens utilizou-se uma balança de precisão -Sertφrius PT600- (Figura 25).

Figura 25. Controlo do peso dos ratos.

(original de C.Freitas).


76

3.7 Colheita de amostras

Os pontos seguintes descrevem o procedimento realizado para a colheita de amostras na

população em estudo.

3.7.1 Colheita de sangue

Logo após o abate dos ratos (controlo negativo e ratos infectados) foi colhido sangue por

punção cardíaca.

O sangue foi colocado na estufa (Memmert) a 37ºC durante 30 minutos e centrifugado a

1500 rotações por minuto durante 10 minutos. Os soros foram armazenados a -20ºC (arca

congeladora Angelantoni industrie- Kryolab 300H) com o objectivo de realizar estudos

imunológicos posteriores.

3.7.2 Colheita dos tecidos musculares

O abate dos ratos foi efectuado de acordo com o protocolo seguido na UHMM (como

previamente descrito no ponto 3.5.2).

Todas as massas musculares da língua, masseteres, diafragma e membros superiores e

inferiores foram retiradas e colocadas numa caixa de petri identificada com o nome dos órgãos

(Figura 26).

Figura 26. Tecidos musculares colhidos após o abate os ratos.

Fragmentos de língua, masseter, diafragma, membros superiores e membros inferiores (original de C. Freitas).


77

3.7.3 Controlo da infecção parasitária

Após a colheita dos tecidos musculares, obteve-se uma amostra de cada órgão (com

aproximadamente 3 mm) que se colocou no triquinoscópio para pesquisa de T. spiralis ao

microscópio. Esta observação permitiu comprovar a infecção do rato e realizar uma observação da

evolução desse processo ao longo do tempo em que decorreu este estudo. Uma vez comprovada a

infecção em todos os órgãos, prosseguiu-se com as técnicas histopatológicas e com a congelação da

biópsia muscular.

3.8 Procedimentos histológicos com os tecidos musculares

3.8.1 Fixação

Após a colheita do tecido muscular, procedeu-se à selecção dos fragmentos para estudos

histológicos em parafina e às biópsias musculares para congelação.

Relativamente aos estudos histológicos, colocaram-se os fragmentos em cassetes

histológicas previamente identificadas (Figura 27), e iniciou-se o processo de fixação.

Figura 27. Cassetes histológicas com tecidos musculares para fixação.

Fragmentos de língua, masseter, diafragma, membros superiores e membros inferiores, colhidos após sacrifício os ratos (original de C. Freitas).


78

A fixação é um processo fundamental na manutenção da morfologia dos tecidos. Os

fixadores têm a propriedade de formar ligações cruzadas entre as proteínas do tecido, originando

uma “rede” que mantém as características in vivo do mesmo (Bancroft & Gamble, 2002). Para

padronizar o processo de fixação todos os fragmentos foram imersos em 100 mL de formol

tamponado a 10% (Panreac), durante 48 horas à temperatura ambiente.

3.8.2 Processamento histológico

Os fragmentos foram processados num processador histológico automático (Shandon

Citadel 2000) utilizando concentrações crescentes de álcool (70%, um banho de 30 minutos e outro

de 60 minutos; 96%, um banho de 30 minutos e outro de 60 minutos; 99,9%, 3 banhos de 60

minutos cada - AGA), seguido de xilol (3 banhos de 60, 90 e 120 minutos cada - AGA ) e parafina

(2 banhos de 60 minutos e 2 banhos de 120 minutos cada- Histosec®-Merck). O processamento

decorreu num total de 16 horas e meia. O objectivo do processamento histológico foi remover a

água e os reagentes aquosos, substitui-los por outro miscível com a parafina (Xilol) e impregná-los

em parafina (Bancroft & Gamble, 2002).

3.8.3 Inclusão em parafina

Após o processamento histológico, os fragmentos foram incluídos em parafina (Histosec®-

Merck), obtendo-se um total de 55 blocos histológicos. Os blocos histológicos conferem o suporte e

a maleabilidade adequados para que se realizem secções histológicas finas por microtomia, para

observação microscópica dos tecidos (Bancroft & Gamble, 2002).

3.8.4 Microtomia

Procedeu-se ao corte histológico dos 55 fragmentos (Figura 28) em micrótomo de corrediça

(Leica - SM 2000R).

Para todas as amostras em estudo realizaram-se dois cortes histológicos com espessura de 3

micra: um para a coloração de Hematoxilina – Eosina (para a avaliação da qualidade da morfologia


79

dos tecidos e observação da presença de T. spiralis) e outro para a coloração de Giemsa modificado

(para quantificação dos quistos nos diversos músculos).

Figura 28. Corte histológico dos fragmentos de músculo.

Micrótomo de corrediça (original de C. Freitas).

Após avaliação histológica de todas as amostras ao microscópio óptico composto, realizou-

se uma amostragem de 22 fragmentos de músculo (11 fragmentos de língua e 11 fragmentos de

masseter) para as restantes técnicas a realizar. Assim, voltou-se a cortar os blocos realizando-se

cinco cortes histológicos para cada amostra de língua e masseter: um para a coloração histoquímica

de Verhoeff (para determinação da presença de fibras elásticas nas amostras); três cortes para

técnicas imunocitoquímicas (PECAM-1, AML e VEGF) e um de reserva (para uma eventual

repetição).

Foram ainda realizados cortes histológicos para lâminas de teste, com fragmentos de língua

(G0,G1,G10) e placenta humanas, para aferir os anticorpos em estudo em técnicas

imunocitoquímicas.


80

As lâminas foram colocadas na estufa (Memmert) a uma temperatura de 64ºC durante a

noite, visando obter a completa aderência do tecido à lâmina.

3.9 Procedimentos histológicos com a biópsia muscular

3.9.1 Colheita de amostras para biópsia muscular

A biópsia muscular é utilizada para diagnóstico parasitológico na identificação de larvas de

T. spiralis (Dupouy-Camet et al., 2002).

Os procedimentos associados à colheita e processamento laboratorial da biópsia muscular

são de grande importância e podem ter muita influência nos resultados finaisn (Anderson, 1997).

Imediatamente após o sacrifício dos ratos em estudo, foram realizadas 5 biópsias musculares

(da língua, masseter, diafragma, membros superiores e membros inferiores), com aproximadamente

4 mm de largura e 10mm de comprimento. Os fragmentos foram manipulados com muito cuidado

de forma a evitar o seu traumatismo. Seguidamente procedeu-se à orientação dos fragmentos para

congelação.

3.9.2 Orientação da biópsia muscular para congelação

Para a orientação dos fragmentos, identificaram-se 5 discos de cortiça (com o nome dos

órgãos das biópsias musculares). Preparou-se uma solução de goma adragante a 10% (Sigma) com

5 gotas de formol (para evitar contaminações por microrganismos), e colocou-se cerca de 2 gramas

em cada disco de cortiça. Em seguida posicionaram-se as biópsias perpendicularmente à superfície

da cortiça (Figura 29).


81

Figura 29. Orientação das biópsias musculares em disco de cortiça para congelação.


3.9.3 Congelação das biópsias

O método de congelação escolhido teve em conta o facto da biópsia muscular ser

extremamente propensa à formação de artefactos provocados pela congelação. Os artefactos podem

mascarar ou impedir a interpretação morfológica do músculo, pelo que a congelação correcta é

crucial para estudos histológicos (Dubowitz & Sewry, 2007).

A imersão das biópsias musculares directamente em azoto líquido induz a formação de

artefactos (Anderson, 1997; Dubowitz & Sewry, 2007) . O principal motivo pelo qual os artefactos

de congelação ocorrem deve-se ao efeito Leidenfrost (Faupel & Seitz, 1972). Este fenómeno ocorre

quando um líquido entra em contacto com uma massa, com uma temperatura significativamente

superior ao seu ponto de ebulição, produzindo um gás que isola a massa do líquido (Curzon, 1978).

Deste modo, a imersão directa da biópsia muscular em azoto líquido impede a sua congelação

imediata já que origina algum gás de nitrogénio à volta da biópsia, abrandando o processo de

arrefecimento (Dubowitz & Sewry, 2007).


82

Uma técnica viável que minimiza o efeito Leidenfrost, consiste em congelar a biópsia

muscular, quase instantaneamente, em isopentano previamente arrefecido em Azoto líquido (Manz,

1980; Anderson, 1997; Bancroft & Gamble, 2002; Dubowitz & Sewry, 2007).

Para a congelação das biópsias musculares deste estudo, realizou-se a metodologia em vigor

no Laboratório de Neuropatologia do Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE- Hospital de Santa

Maria mediante o esquema descrito na Figura 30.

Transferiu-se azoto líquido para um termo com capacidade de 500 mL. Em seguida

colocou-se 100 mL de isopentano -2-Methyl Butane - (BDH GPRTM) num copo de precipitação de

polietileno de três bicos, com capacidade 500mL, que se imergiu no azoto líquido (Figura 31).

Figura 30. Congelação de biópsia muscular em isopentano arrefecido com azoto líquido.


Realizou-se um controlo visual da temperatura. Considerou-se que o isopentano estava

arrefecido quando se observou a formação de uma névoa branca no topo do copo de precipitação, e

a presença de cristais brancos no fundo do mesmo (Anderson, 1997). Voltou-se a encher o termo

com azoto líquido e a controlar visualmente a formação da névoa no copo de precipitação.

Copo deprecipitação

Azoto líquidono interior do termo

Pinça

Disco de cortiça

Isopentano

Goma adragante

Biopsia muscular

Termo


83

Fixou-se o disco de cortiça a uma pinça, com a biópsia muscular orientada. Procedeu-se à

imersão das biópsias (uma a uma) na solução de isopentano, realizando movimentos circulares à

volta do copo de precipitação, continuamente, durante 60 segundos (Figura 32).

Figura 31. Material de congelação das biópsias.

(original de C.Freitas).

Figura 32. Congelação das biópsias musculares.


Imediatamente após a congelação, as biópsias musculares foram transferidas para tubos de

plástico identificados e previamente colocados a -80ºC.

O procedimento de congelação foi efectuado na UHMM de forma a garantir que as biópsias

musculares eram congeladas o mais rapidamente possível (imediatamente a seguir ao abate). As

amostras foram conservadas a -80ºC (Cryocell) e depois transportadas em gelo seco, para o

Laboratório de Neuropatologia do Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE- Hospital de Santa Maria.

A escolha do Laboratório de Neuropatologia para a realização do processamento em congelação e

técnicas imunohistoquímicas, prendeu-se com a vasta experiência do mesmo no trabalho

desenvolvido com biópsias musculares. Os protocolos descritos estão de acordo com os utilizados

neste laboratório.


84

3.9.4 Corte histológico em crióstato

No Laboratório de Neuropatologia, as amostras foram conservadas a -80ºC (arca Thermo

Electron Corporation - 994).

Apesar de inicialmente se terem colhido e congelado 50 fragmentos de músculo (de 10

ratos), o corte histológico em crióstato foi realizado em 20 amostras (língua e masseter). Esta

amostragem teve em conta os critérios de inclusão e exclusão utilizados para o material fixado em

formol e impregnado em parafina, e a verificação da qualidade morfológica das amostras

congeladas mediante coloração de Hematoxilina - Eosina extemporânea, realizada nos primeiros

cortes de congelação efectuados.

Para a realização de cortes de congelação, retiraram-se as amostras da arca a -80ºC e

transferiram-se para o interior do crióstato (Microm HM550), com uma temperatura de -24ºC.

Fixou-se o disco de cortiça com a biópsia muscular a um molde metálico, apropriado para o

crióstato, utilizando-se para o efeito Tissue – Tek® O.C.T. compound (Sakura) (resina solúvel em

água que forma um polímero sólido quando congelado).

O molde metálico foi colocado no porta bloco do crióstato e realizaram-se cortes de

congelação (Figura 33) para os músculos de língua e masseter: um corte a 10 micra (para coloração

de Hematoxilina - Eosina extemporânea), e quatro cortes a 6 micra (dois para técnicas

imunofluorescentes e dois para eventuais repetições).

Para os cortes de congelação, utilizaram-se lâminas carregadas electroestaticamente

Menzel®-Glaser®,Superfrost®Plus.

Após o corte, as lâminas secaram ao ar, à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em

seguida envolveram-se em papel de alumínio e congelaram-se a -80ºC (arca Thermo Electron

Corporation).


85

Figura 33. Corte das biópsias musculares em crióstato.


3.10 Métodos e técnicas histoquímicas

Os tecidos biológicos são, na sua maioria, desprovidos de cor. Para se proceder ao estudo

microscópico dos mesmos é necessário utilizar colorações histoquímicas. Os métodos e técnicas

histoquímicas permitem a demonstração selectiva de estruturas tecidulares importantes para o

diagnóstico de uma determinada patologia, e possibilitam a evidenciação de constituintes naturais

dos tecidos (Carson, 1997).

Algumas das alterações morfológicas musculares, podem ser observadas pela coloração

Hematoxilina - Eosina. São exemplos a alteração de tamanho das fibras musculares ou a presença

de células inflamatórias. Quando se pretende demonstrar estruturas específicas, devem usar-se

outras técnicas histoquímicas específicas (Carson, 1997).

Todos os métodos e técnicas histoquímicas descritos, foram realizados no Centro Hospitalar

de Lisboa Central, EPE- Hospital de São José - Laboratório de Anatomia Patológica (tecidos

processados em parafina) e no Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE- Hospital de Santa Maria -

Laboratório de Neuropatologia (biópsia muscular).


86

As soluções utilizadas nos protocolos das colorações encontram-se descritas no anexo A.

3.10.1 Coloração Hematoxilina - Eosina

A coloração de Hematoxilina – Eosina é utilizada por rotina no estudo anatomopatológico, e

permite uma visualização genérica da histologia de diversos tecidos (Carson, 1997).

Em T. spiralis, esta coloração mostra que a nurse cell cora de azul, o que sugere que é de

estrutura básica, e os constituintes celulares não infectados circundantes coram de vermelho, o que

sugere uma natureza ácida (Matsuo et al., 2000; Boonmars et al., 2004).

Esta coloração foi realizada para a avaliação da preservação morfológica dos tecidos

musculares fixados em formol e impregnados em parafina e das biópsias musculares congeladas.

Relativamente à coloração realizada para tecidos fixados em formol, as lâminas histológicas

contendo os fragmentos previamente cortados, foram desparafinadas com Xilol (AGA) durante 10

minutos e hidratadas com álcool 99,9%, álcool 96%, álcool 70% (AGA) e água corrente – 1 minuto

em cada. Seguiu-se a coloração com Hematoxilina de Harris (Merck - 1.09253.2500) durante 5

minutos; azulou-se com água corrente (3 minutos), diferenciou-se 1 segundo com álcool-clorídrico

a 1% (Merck- 1.09973.Tirtrisol®); lavou-se com água corrente – 2 minutos e meio; corou-se com

Eosina durante 20 segundos, e desidratou-se com soluções com concentrações crescentes de álcool

(96%, 100º%- duas vezes – 1 minuto em cada - AGA). Colocou-se 1 minuto em xilol (AGA) e

montou-se com Entellan® (Merck – 1.07961.0500). A coloração foi realizada em colorador

automático Leica Autostainer XL.

Observaram-se as lâminas ao microscópio óptico composto (Leitz Laborlux K,Germany) e

avaliou-se a preservação morfológica das amostras (critério de inclusão) qualitativamente para

todas as amostras, em todos os dias de infecção estudados. Classificou-se uma amostra com o

símbolo “+” sempre que se considerou que a morfologia se encontrava preservada e com o símbolo

“-“ sempre que se considerou que a morfologia não se encontrava preservada (tecidos levantados,

presença de artefactos nas amostras, pregas, dobras, indícios de má fixação em zonas mal coradas e

sem distinção clara das diferentes estruturas ácidas e básicas no tecido, incluindo o parasita).


87

Para a biópsia muscular, efectuou-se uma coloração de Hematoxilina – Eosina

extemporânea, logo após o corte em crióstato das biópsias. Esta coloração teve como objectivo a

observação da morfologia muscular (preservação da morfologia, presença de artefactos de

congelação, qualidade dos cortes em crióstato) e a identificação de T.spiralis nas várias biópsias.

A coloração extemporânea consistiu em colocar as lâminas histológicas 60 segundos em

Hematoxilina de Harris (Merck - 1.09253.2500); lavagem em água corrente; coloração com Eosina

3 minutos; desidratação em álcool 96%, 100% - duas vezes, 1 minuto em cada (AGA); xilol (AGA)

durante 1 minuto e montagem com entellan® (Merck– 1.07961.0500).

3.10.2 Coloração Giemsa modificado

A coloração de Giemsa pode ser utilizada para detecção rápida de larvas de T. spiralis em

preparações histológicas (Ramirez-Melgar et al., 2007) e foi realizada para a contagem de quistos

nos músculos processados em parafina.

As lâminas histológicas (55) foram desparafinadas com Xilol (AGA) durante 10 minutos e

hidratadas com álcool 99,9%, álcool 96%, álcool 70% (AGA), e água corrente – 1 minuto em cada.

Seguiu-se a coloração com solução de Giemsa a 6% (Merck - 1.09204.2500) durante 5 minutos;

lavou-se em água corrente durante 3 minutos e diferenciou-se com álcool a 96% (AGA). A

diferenciação foi controlada ao microscópio. Desidratou-se utilizando soluções com concentrações

crescentes de álcool (96%, 100%- 2 vezes – 1 minuto em cada - AGA). Colocou-se 1 minuto em

xilol (AGA) e montou-se com Entellan® (Merck - 07961.0500). A coloração foi realizada em

colorador automático Leica Autostainer XL.


procedeu-se à quantificação de quistos de T. spiralis nos músculos da língua, masseter, diafragma,

membro superior e membro inferior dos animais experimentais, de acordo com o número de dias de

infecção. A coloração rosa da cápsula do parasita facilitou a contagem.

Para a contagem de quistos foram observados cinco campos a uma ampliação de 40x com

um diâmetro total do campo de 4mm e uma área de 12,56 mm2. O número de campos foi definido


88

tendo em conta o número máximo de campos observáveis no fragmento menor (língua) nesta

ampliação. Desta forma, para cada fragmento foram quantificados quistos numa área de 62,8mm2.

Após a avaliação fez-se soma dos resultados obtidos e o resultado final foi expresso em

número de nurse cells total, contabilizados em 62,8mm2.

3.10.3 Coloração Verhoeff

A coloração de Verhoeff pode ser utilizada para demonstração específica de fibras elásticas,

patológicas ou normais (Carson, 1997; Bancroft & Gamble, 2002)

Esta técnica foi realizada em todas as amostras de língua e masseter fixadas em formol e

impregnadas em parafina, para identificação de vasos e demonstração histoquímica de fibras

elásticas nas áreas adjacentes às nurse cells de T. spiralis.

As lâminas histológicas foram desparafinadas com Xilol (AGA) durante 10 minutos;

hidratadas com álcool 99,9%, álcool 96%, álcool 70% (AGA), e água corrente – 1 minuto em cada.

O tecido foi em seguida sobre corado com a solução de Verhoeff (Figura 34) durante 30 minutos.

Lavou-se em água corrente e diferenciou-se com cloreto de ferro a 2% (Merck - 1.03943.0250) e

solução de Van Gieson. O cloreto de ferro teve como função quebrar o complexo formado entre o

tecido e o corante (excesso de mordente). Apesar deste processo, as fibras elásticas tendo afinidade

para o corante, retiveram o corante mais tempo do que as restantes estruturas tecidulares. Este facto

permitiu que as fibras elásticas permanecessem coradas de negro, enquanto os outros elementos

tecidulares eram descorados. A solução de Van Gieson actuou como diferenciadora (devido ao

ácido pícrico que está na sua composição) mas também teve função de contraste (Carson, 1997). O

processo de diferenciação foi controlado ao microscópio e foi realizado lâmina a lâmina. Para

terminar a coloração, desidratou-se com álcool a 100% (AGA) e colocou-se 1 minuto em xilol

(AGA). Montaram-se as lâminas com Entellan® (Merck – 1.07961.0500).


89

Figura 34. Coloração de fibras elásticas com a solução de Verhoeff.

(original de C.Freitas)


procedeu-se à avaliação qualitativa da presença ou ausência de fibras elásticas nas áreas adjacentes

às nurse cell de T. spiralis. Classificou-se uma amostra com o símbolo “+” sempre que se observou

a presença de fibras elásticas nas áreas adjacentes às nurse cells de T. spiralis e com o símbolo “-“

sempre que não se observou a presença das fibras nessa área. Para cada tecido observado foi tido o

cuidado de comprovar a existência de controlo interno (coloração a negro de fibras elásticas de um

vaso próprio do músculo do rato).

3.11 Métodos e Técnicas Imunocitoquímicas

A imunocitoquímica é um método utilizado para a identificação de estruturas tecidulares, as

quais se comportam como antigénios específicos in situ, que se baseia na especificidade anticorpo –

antigénio no tecido biológico (Dabbs, 2002). É amplamente utilizada quer no diagnóstico

anatomopatológico, quer na investigação científica em estudos que visam a compreensão da

distribuição de antigénios expressos de diferentes modos num dado tecido.

Desta forma, nas técnicas imunocitoquímicas utilizam-se anticorpos como reagentes

específicos para a localização de constituintes in situ (Polak et al., 1997). Estes anticorpos também

permitem uma avaliação de modificações proteicas e da sua expressão in vivo (Duerr, 2006).


90

Todos os métodos e técnicas imunocitoquímicas descritos, foram realizados no Centro

Hospitalar de Lisboa Central, EPE- Hospital de São José - Laboratório de Anatomia Patológica.

As soluções utilizadas nos protocolos das técnicas imunocitoquímicas encontram-se

descritas no anexo B.

3.11.1 Anticorpos utilizados para localização de constituintes in situ.

A escolha dos anticorpos primários utilizados neste trabalho foi realizada com o propósito

de se obter uma marcação imunocitoquímica específica para células endoteliais, células de músculo

liso e células endoteliais em desenvolvimento, no decurso da triquinelose em modelo roedor.

Foram tidas em consideração as especificidades e características dos anticorpos para a

execução das diversas técnicas. A especificidade da imunomarcação dos anticorpos utilizados está

descrita no Quadro 5 (de acordo com a informação dos fabricantes).

Quadro 5. Especificidade da imunomarcação dos anticorpos primários utilizados.

Anticorpo primário Especificidade

Factor de crescimento endotelial vascular (VEGF)

Células endoteliais em desenvolvimento; trofoblastos (placenta); glomérulos renais (rim); megacariócitos (medula óssea); ductos (mama); citoplasma de células epitelias neoplásicas; miócitos e septos inter fasciculares (músculo).

Molécula-1 de adesão celular endotelial a plaquetas

(PECAM-1)

Células endoteliais (incluindo as de artérias, arteríolas, vénulas, veias e capilares).

Adicionalmente é expresso difusamente na superfície de megacariócitos, plaquetas, pequenas células mieloides, células natural killers, algumas células T e precursores de células B.

actina músculo liso

(AML)

Células de músculo liso, miofibroblastos, células mioepiteliais e perícitos.

3.11.2 Aferição da técnica imunocitoquímica

Antes da realização dos ensaios nas amostras, testou-se a imunoreactividade apropriada para

cada anticorpo em estudo. Os ensaios iniciais estiveram de acordo com as indicações dos

fabricantes e os métodos em vigor na instituição onde se realizaram as técnicas. A partir destes

resultados aferiram-se os protocolos de modo a obter-se uma marcação imunocitoquímica

específica, sensível e fiável.


91

Para aferir a especificidade da marcação, seleccionaram-se tecidos biológicos que continham

à partida o antigénio em estudo. Para o anticorpo anti - VEGF utilizou-se um fragmento de placenta

humana, já que este órgão tem muitos vasos em formação (células endoteliais em desenvolvimento)

e consequentemente era expectável uma marcação citoplasmática dos trofoblastos. Para os

anticorpos AML, e PECAM-1 utilizaram-se fragmentos de língua do rato do controlo negativo (G0)

e dos ratos com 45 e 120 dias de infecção ( G1 e G10) para visualização da marcação de vasos

próprios do rato (Figura 35).

Para aferir a recuperação antigénica e a sensibilidade da marcação, seleccionou-se uma

pequena amostragem de tecidos de língua em ratos de diferentes grupos (G0,G1,G10).

Figura 35. Esquema das lâminas de controlo positivo utilizadas nas técnicas imunocitoquímicas.


Tendo em consideração que o anticorpo AML não era anti - rato, mas anti - humano, foram

realizados diversos testes, sobretudo na recuperação antigénica, factores de diluição, tempo e

temperaturas de incubação do anticorpo primário, até optimizar os protocolos finais.

As diluições e os tempos de incubação dos anticorpos primários utilizados nas técnicas

imunocitoquímicas encontram-se expressos no Quadro 6.

Placenta

Língua G0

Língua G1

Língua G10

Língua G0

Língua G1

Língua G10


92

Quadro 6. Anticorpos primários utilizados nas técnicas imunocitoquímicas.

Anticorpo primário Espécie Clone Fabricante Diluição Tempo de incubação

Factor de crescimento endotelial vascular

(VEGF)

Policlonal de coelho anti rato, ratinho e humano

ab46154 Abcam

(ab46154)

1:400 30 minutos

(temperatura ambiente)


(PECAM-1)


M-185 Santa Cruz Biotechnology, inc.

(sc-28188)

1:20 30 minutos (temperatura ambiente)

Actina músculo liso

(AML)

Monoclonal de rato anti humano

1A4 Dako

(M0851)

1:50 Durante a noite 4ºC + 120 minutos (temperatura ambiente)

3.11.3 Controlo da qualidade da imunomarcação: controlos positivos e negativos

Para controlar a qualidade da imunomarcação, aquando da realização da técnica

imunocitoquímica, adicionou-se para cada anticorpo primário, uma lâmina histológica para controlo

negativo, em todos os ensaios realizados. Este controlo consistiu na realização da técnica

imunocitoquímica na ausência de anticorpos primários, mantendo os restantes procedimentos

técnicos. O objectivo deste controlo foi avaliar a presença de marcação inespecífica, confirmando-

se assim a especificidade do método

Como controlo positivo, para o anticorpo VEGF utilizou-se um fragmento de placenta

humana (controlo externo) e realizou-se controlo interno (visualização da marcação de nervo e

células endoteliais do músculo do rato). Para os anticorpos PECAM-1 e AML realizou-se controlo

interno (visualização da marcação de vasos próprios do rato).

3.11.4 Procedimentos da técnica imunocitoquímica

A técnica imunocitoquímica realizou-se em 22 amostras de músculo (11 de língua e 11 de

masseter dos grupos G0 a G10) e respectivos controlos positivos e negativos, para os anticorpos em

estudo.

As lâminas com os cortes histológicos de língua e masseter foram retiradas da estufa

(Memmert), onde permaneceram a uma temperatura de 64ºC. durante a noite, e foram colocadas à


93

temperatura ambiente 30 minutos, para promover o seu arrefecimento. Em seguida, foram

desparafinadas com Xilol (AGA) durante 10 minutos e hidratadas com álcool 99,9%, álcool 96%,

álcool 70% (AGA), e água corrente - 1 minuto em cada. Realizou-se uma passagem por água

destilada e inibiu-se a peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio a 3% (Merck-

1.07210.1000) durante 10 minutos. Este procedimento foi efectuado para reduzir a presença de

fundo na fase da revelação, porque o sistema de amplificação utilizado tem acoplado peroxidase de

rábano (Horse Radish Peroxidase - HRP) que proporciona a visualização da imunomarcação ao

microscópio óptico. Lavou-se em água corrente e passou-se por água destilada. De forma a

contornar os problemas associados à fixação com formol (formação de uma rede proteica que

mascara epítopos) e restituir a antigenicidade tecidular diminuindo a incidência de falsos negativos,

realizou-se a recuperação antigénica por alta temperatura com tampão Tampão Tris/EDTA pH 9.0

100x (PT Module Buffer 4 –Thermo Scientific- TA-250-PM4x) em microondas (Panasonic), a 900

Watts, executando um ciclo de 20 minutos com 500 mL de tampão, seguindo-se outro com

reposição de tampão durante 10 minutos. Promoveu-se o arrefecimento das lâminas no tampão de

recuperação à temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavou-se em água corrente 5 minutos.

Traçou-se um círculo à volta das secções histológicas, com uma caneta hidrófoba (Dako Pen- S

200230-2), que delimitou a área de incubação, criando uma barreira aos líquidos aplicados sobre as

secções histológicas. Lavou-se com tampão de lavagem (Dako Wash Buffer 10x – S3006) 5

minutos. As lâminas foram em seguida incubadas em câmara húmida (Bio-Optica) durante a noite a

4ºC (frigorífico Superser), ou à temperatura ambiente, com os anticorpos primários (150 microlitros

para cada lâmina), diluídos em tampão de diluição (Antibody Diluent-Zymed Invitrogen- 00-3218),

de acordo com os factores de diluição específicos previamente aferidos para cada um. No caso das

lâminas que incubaram durante a noite, no dia seguinte, a câmara foi retirada do frio e colocada à

temperatura ambiente duas horas. Após este tempo, realizaram-se 5 lavagens de 5 minutos cada em

tampão de lavagem para eliminar os anticorpos primários que não se ligaram especificamente. Nas

lâminas que incubaram à temperatura ambiente foram realizadas as mesmas lavagens, logo após a


94

incubação. Em seguida, incubou-se com o sistema de amplificação Dako REALTM EnVisioNTM –

HRP Rabbit/Mouse do KIT Dako REALTM EnVisionTM Detection System, Peroxidase/DAB+,

Rabbit/Mouse (Dako - K5007) – 2 gotas durante 30 minutos. Lavou-se duas vezes em tampão de

lavagem durante 5 minutos. Revelou-se com Dako REALTM EnVisionTM – Substrate Buffer e Dako

REALTM EnVisionTM – DAB + Chromogen (x50) (Dako - K5007) – 150 microlitros para cada

lâmina durante 4 minutos, duas vezes. Lavou-se com água destilada, contrastou-se com

hematoxilina de Harris (Merck – 1.09253.2500) durante 3 segundos e azulou-se em água amoniacal

a 1% durante 5 segundos. Lavou-se em água corrente 5 minutos. Em seguida desidratou-se com

soluções com concentrações crescentes de álcool (75º%, 96º%, 100º%-2x - AGA) durante 1 minuto

em cada. Colocou-se 1 minuto em xilol (AGA) e montou-se com Entellan® (Merck –

1.07961.0500).

3.12 Métodos e técnicas de imunofluorescência

Os princípios das técnicas imunofluorescentes são em tudo similares aos descritos para a

imunocitoquímica. As técnicas imunofluorescentes permitem a visualização de antigénios nos

tecidos utilizando marcadores fluorescentes (fluorocromos), que absorvem luz ultravioleta e a

emitem no determinado comprimento de onda visível (Bancroft & Gamble, 2002).

Estas técnicas têm o potencial de demonstrar as interacções anticorpo - antigénio ao nível

subcelular (tal como a detecção de antigénios em mitocôndrias e fibras musculares) ou seja,

identificar o sítio da interacção do anticorpo com o antigénio (Bancroft & Gamble, 2002). Para o

sucesso da técnica é fundamental uma boa preservação dos antigénios em estudo -conseguido

sobretudo quando se utilizam materiais não fixados que têm mais probabilidade de distorcer a

arquitectura dos tecidos, procedendo-se para isso à congelação dos mesmos- (Bancroft & Gamble,

2002; Dubowitz & Sewry, 2007).

A escolha das técnicas imunofluorescentes neste estudo teve como principal objectivo uma

abordagem mais esclarecedora dos sítios da interacção dos antigénios - anticorpos (VEGF,

PECAM-1) na nurse cell e no parasita T. spiralis, em relação com o hospedeiro.


95

Todos os métodos e técnicas imunofluorescentes descritos, foram realizados no Centro

Hospitalar Lisboa Norte, EPE- Hospital de Santa Maria - Laboratório de Neuropatologia.

As soluções utilizadas nos protocolos das técnicas imunofluorescentes encontram-se

descritas no anexo B.

3.12.1 Aferição da técnica de imunofluorescência e controlos

A aferição da técnica e a utilização de controlos teve em conta os mesmos critérios descritos

para as técnicas imunocitoquímicas. Os Quadros 7, 8 e 9 resumem as características dos anticorpos

primários, secundário e do corante fluorescente nuclear utilizados nas técnicas de

Imunofluorescência, em biópsias musculares congeladas.

Quadro 7. Anticorpos primários utilizados nas técnicas de imunofluorescência.

Anticorpo primário Espécie Clone Fabricante Diluição Tempo de incubação

Factor de crescimento endotelial vascular (VEGF)


ab46154 Abcam

(ab46154)

1:500 60 minutos



(PECAM-1)


M-185 Santa Cruz Biotechnology, inc.

(sc-28188)

1:250 60 minutos


Quadro 8. Anticorpo secundário utilizado nas técnicas de imunofluorescência.

Anticorpo secundário Fabricante Espécie Cor emitida Diluição Tempo de incubação

Alexa Fluor® 488 Invitrogen Cabra anti rato verde 1:250 60 minutos


Quadro 9. Características corante nuclear utilizado nas técnicas de imunofluorescência.

Coloração nuclear Fabricante Cor emitida Tempo de incubação

4',6-diamidino-2-phenylindole

(DAPI)

Invitrogen azul 30 minutos



96

3.12.2 Procedimentos da técnica de imunofluorescência

A técnica de imunofluorescência realizou-se em 20 amostras de músculo (10 de língua e 10

de masseter dos grupos G1 a G10) e respectivos controlos positivos e negativos, para os anticorpos

VEGF e PECAM-1.

As lâminas com os cortes de congelação das biópsias musculares foram retiradas da arca de

congelação a -80ºC (Thermo Electron Corporation -994) e colocadas à temperatura ambiente

durante 30 minutos, protegidas do pó. Traçou-se um círculo à volta das secções histológicas, com

uma caneta hidrófoba (Super Pap Pen- Invitrogen 00-8899), que delimitou a área de incubação,

criando uma barreira aos líquidos aplicados sobre as secções histológicas. Em seguida procedeu-se

ao bloqueio de ligações inespecíficas com albumina/bovina a 3% (Albumin,Bovine- Sigma- A-

6793) durante 60 minutos à temperatura ambiente. Escorreu-se a albumina/bovina e incubou-se com

o anticorpo primário (VEGF ou PECAM-1) diluído em albumina/bovina a 1% (Albumin,Bovine-

Sigma- A-6793), sendo que cada anticorpo teve um factor de diluição específico previamente

testado. A incubação ocorreu à temperatura ambiente, em câmara húmida e escura, durante 60

minutos. Após este tempo as lâminas foram lavadas em tina de vidro de ranhuras vertical, com

agitação, cinco vezes com tampão de lavagem (Dako Wash Buffer 10x – S3006) durante 10

minutos cada. Incubou-se em seguida com o anticorpo secundário (Alexa Fluor® 488), diluído em

albumina/bovina a 1% (Albumin,Bovine- Sigma- A-6793), à temperatura ambiente, em câmara

húmida e escura, durante 60 minutos. Em seguida as lâminas foram lavadas em tina de vidro de

ranhuras vertical com agitação, cinco vezes com tampão de lavagem (Dako Wash Buffer 10x –

S3006) durante 10 minutos cada. Procedeu-se à coloração nuclear do ácido desoxirribonucleico

(DNA) com DAPI (Merck- 1.24653.0100) à temperatura ambiente, em câmara húmida e escura,

durante 30 minutos. Finalmente, lavou-se com água destilada e desidratou-se com soluções de

álcool com concentrações crescentes (75%, 96%, 100%-2x) – (AGA) durante 1 minuto cada.

Colocou-se 1 minuto em xilol (AGA) e montou-se com Entellan® (Merck – 1.07961.0500). As


97

lâminas ficaram a secar 60 minutos, protegidas da luz, e foram conservadas no frio a 3ºC em caixa

escura, até observação ao microscópio.

3.13 Avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF

A avaliação da expressão imunocitoquímica de VEGF nas nurse cell de T. spiralis, foi

efectuada para todos os fragmentos de língua e masseter fixados em formol e processados em

parafina e biópsias musculares congeladas (42 amostras no total).

Relativamente à avaliação por técnicas imunocitoquímicas, para cada amostra foram

seleccionados ao microscópio óptico composto (Leitz Laborlux K,Germany) cinco campos a uma

ampliação de 100x, com uma área de 1,76 mm2 (8,8 mm2 de área total avaliada). Os campos foram

seleccionados de acordo com o maior número de nurse cell observados em cada fragmento a uma

ampliação de 40x.

Para cada campo observado foram avaliados os seguintes parâmetros:

• Expressão de VEGF no citoplasma da nurse cell;

• Expressão de VEGF na larva;

• Expressão de VEGF no infiltrado inflamatório adjacente à nurse cell.

Foram contabilizadas apenas as nurse cell em que se observava a presença de parasita, tanto

em secção transversal (nurse cell em forma redonda), como em secção longitudinal (nurse cell de

forma alongada). A expressão de VEGF no infiltrado inflamatório só foi contabilizada quando este

estava presente.

Depois de observadas as lâminas, procedeu-se à atribuição de um Score, resultante da

classificação das amostras, de acordo com uma escala semi-quantitativa (Guset et al.) (adaptada)

que teve em conta dois parâmetros:

• % de estruturas marcadas

0- Negativo

1- Expressão de VEGF em menos de 25% das estruturas avaliadas

2- Expressão de VEGF entre 26% e 50% das estruturas avaliadas


98

3- Expressão de VEGF em mais de 50% das estruturas avaliadas

• Intensidade da coloração de VEGF

0-Negativo

1-Intensidade fraca

2-Intensidade moderada

3-Intensidade forte

A intensidade da coloração teve como referência a marcação do controlo interno observado

nas lâminas.

O score final foi obtido somando os dois parâmetros, com a seguinte interpretação da

reacção imunocitoquímica (Quadro 10):

Quadro 10. Scores da avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF

Score Interpretação da marcação imunocitoquímica

0 Sem expressão de VEGF

2 Expressão fraca de VEGF

3-4 Expressão moderada de VEGF

5-6 Expressão fortemente positiva de VEGF

Relativamente às técnicas de imunofluorescência, as amostras foram observadas no

microscópio confocal (LSM 510 META – Carl Zeiss Microlmaging- SN 2435000218, ano 2006),

do Instituto de Medicina Molecular de Lisboa. Foram fotografados cinco campos por amostra com

uma objectiva de 20x, tendo sido avaliada uma uma área de 450 µm2 por campo (2250 µm2 de área

total). Os campos foram seleccionados de acordo com o maior número de nurse cell observados em

cada fragmento na objectiva de 10x .

Para cada campo fotografado foram avaliados os seguintes parâmetros:

• Expressão de VEGF no citoplasma da nurse cell;

• Expressão de VEGF na larva.

• Expressão de VEGF no infiltrado inflamatório adjacente à nurse cell.


99

Foi utilizada a escala descrita para a avaliação de VEGF em técnicas imunocitoquímicas.

A avaliação foi feita recorrendo ao programa de imagem Image J 1.43u (Figura 36).

Figura 36. Avaliação da expressão de VEGF por técnicas de imunofluorescência.

Fotografia de fragmento de língua com 60 dias de infecção por microscopia confocal. Seta vermelha, expressão citoplasmática; seta branca, expressão na larva (original de C. Freitas).

O resultado final da expressão de VEGF foi traduzido em médias de scores semi-

quantitativos, para cada parâmetro observado em cada técnica, em cada período de infecção

estudado. Os dados foram correlacionados com a densidade vascular e a densidade da expressão de

actina músculo liso.

3.14 Medição da densidade vascular e da densidade da expressão de actina músculo

liso.

A medição da densidade vascular nas nurse cell de T. spiralis e tecido adjacente foi

efectuada em todos os fragmentos de língua e masseter fixados em formol e processados em

parafina e biópsias musculares congeladas (42 amostras no total), e fazendo recurso à análise

computorizada de imagem. A medição da densidade da expressão de AML foi efectuada em tecidos


100

fixados em formol e processados em parafina, tendo-se utilizado o mesmo procedimento que para a

densidade vascular. O método descrito corresponde a uma adaptação de Weidner (Weidner, 1995).

Os programas de análise de imagem têm surgido como ferramentas capazes de melhorar a

exactidão e aumentar a reprodutibilidade da medição da densidade vascular (Barbareschi et al.,

1995).

As lâminas com marcação imunocitoquímica foram observadas ao microscópio óptico

composto (Motic Images Advanced 3.1) acoplado com câmara (Motic B3 Professional Series). Foi

seleccionada uma amostragem de cinco campos por amostra (onde se identificaram o maior

número de nurse cell na ampliação de 40x), tendo sido fotografados a uma ampliação de 100x (para

avaliação da área das nurse cells) com uma área de campo de 1,76 mm2 (8,8 mm2 de área total

avaliada) e a 400x (para contagem de vasos e de células que expressavam AML). Sempre que o

tamanho de uma nurse cell se mostrou superior ao tamanho da Capture Window (a imagem

visualizada no computador é inferior à observada no microscópio) foram realizadas duas

fotografias, e realizado um somatório de dados obtidos com as contagens de vasos ou células que

expressam AML.

Para a avaliação foram tidos em conta os seguintes critérios:

• O parasita tinha de estar visível (para garantir tratar-se de uma nurse cell, já que a

técnica imunocitoquímica apenas confere um contraste azul ao tecido evidenciando os

vasos ou células que expressam AML a castanho);

• As nurse cells tinham de estar isoladas (não podiam estar contínuas para não confundir

os limites aquando da medição da área e também para isolar os vasos e as células de

músculo liso);

• Os vasos ou células que expressam AML tinham de estar marcados especificamente

(corados a castanho), claramente separados uns dos outros;

• Os vasos ou células que expressam AML tinham de estar na área imediatamente

adjacente à cápsula.


101

Fazendo recurso ao programa de imagem ImageJ 1.43u, usou-se a ferramenta de “multi-

point selections”para individualizar as estruturas vasculares. Efectuou-se a contagem de vasos, de

acordo com os critérios estabelecidos, e mediu-se a área do conjunto nurse cell e vasos adjacentes

(a área foi medida em micrómetros2). A Figura 37 ilustra a metodologia seguida. Por fim, calculou-

se a densidade vascular (nº vasos/ µm2) e a densidade da expressão de AML (nº células positivas

para AML/ µm2).

Relativamente às técnicas imunofluorescentes, as amostras de língua e masseter congeladas,

marcadas com PECAM-1, foram observadas no microscópio confocal (LSM 510 META – Carl

Zeiss Microlmaging- SN 2435000218, ano 2006), do Instituto de Medicina Molecular de Lisboa.

Foram fotografados cinco campos por amostra com uma objectiva de 20x, tendo sido avaliada uma

uma área de 450 µm2 por campo (2250 µ m2 de área total). Os campos foram seleccionados de

acordo com o maior número de nurse cell observados em cada fragmento na objectiva de 10x .

Para cada campo fotografado foram utilizados os mesmos critérios (com excepção da

marcação específica, que neste caso estaria expressa a verde) e procedimentos descritos para as

técnicas imunocitoquímicas.


102

Figura 37. Metodologia utilizada na medição da densidade vascular e da densidade de AML.

A) Fotografia do campo a uma ampliação de 100x. B) Numeração das nurse cells e medição das áreas. C) Contagem de vasos/células positivas para AML para cada nurse cell a uma ampliação de 400x (original de C. Freitas).

A

B

C


103

O resultado final da expressão de PECAM-1 e AML foi traduzido em médias de densidade

vascular e de densidade da expressão de actina músculo liso de acordo com os dias de infecção

estudados. Os dados foram correlacionados com a expressão de VEGF.

3.15 Análise estatística.

Realizou-se uma estatística descritiva exploratória geral dos dados. Esta análise, bem como

os gráficos apresentados, foram executados no programa informático Microsoft Office Excel 2010.

Para tratamento estatístico dos resultados recorreu-se ao programa informático Statistical

Package for the Social Sciences (SPSS) versão 19 para Microsoft Windows XP. Foi utilizado o

teste de Spearman (rs) para avaliar a correlação entre as variáveis: expressão de VEGF, densidade

vascular e densidade de expressão de células AML; e aplicou-se o teste de Qui-quadrado (χ2) na

comparação das frequências das variáveis em estudo. Para os testes realizados considerou-se como

indicativo de significância estatística os valores de P <0,05.

4 Resultados

Capítulo 4 - Resultados

107

4 Resultados

4.1 Peso total dos animais experimentais

Com excepção do grupo controlo (0 dias de infecção), verificou-se um aumento gradual do

peso dos ratos experimentais ao longo do estudo (Figura 38). Não houve mortalidade dos animais

durante o período de infecção.

Figura 38. Evolução do peso dos ratos experimentais, entre o dia de infecção e o dia de abate.

0

50

100

150

200

250

300

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Peso

(g)

Dias de Infecção com Trichinella spriralis

Peso total dos ratos experimentais nos dias de infecção e de abate

Peso no dia de infecção (Pi)

Peso no dia de abate (Pa)

Diferença de pesos (Pa-Pi)


108

4.2 Monitorização da infecção parasitária

A monitorização da infecção com T. spiralis ao microscópio, utilizando o triquinoscópio,

revelou que todos os tecidos musculares (língua, masseter, diafragma, membro superior e membro

inferior) dos animais infectados, de todos os grupos em estudo, estavam parasitados (Figura 39).

Figura 39. Observação de músculo infectado com larvas de T.spiralis pelo triquinoscópio.

Todos os grupos em estudo se encontram parasitados. Legenda: masseter - M, língua - L, diafragma -D, membro superior - MS, membro inferior – MI. Os números correspondem aos dias de infecção (barra da escala: 200µm A, G, H, I; 100 µm - B a F; 50 µm - J). (Original de C.Freitas).

M45

L55 D60

MS50

M65

D75 DI80

L90 MS120

MI70

A B

DC

E F

G H

I J


109

4.3 Análise morfológica qualitativa

4.3.1 Avaliação histológica da preservação morfológica dos tecidos musculares

A observação microscópica das lâminas coradas com a coloração de Hematoxilina - Eosina

para as amostras fixadas em formol, permitiu constatar que quase todas apresentavam boa

preservação morfológica, com evidência das fibras musculares e dos parasitas. A excepção

verificou-se nas amostras de diafragma que, em muitos casos, apresentavam pregas e dobras.

Tendo em conta os critérios de exclusão definidos inicialmente, excluíram-se as amostras de

diafragma do estudo, já que as pregas no tecido inviabilizariam a medição da área das nurse cells. A

Tabela 3 resume as observações morfológicas qualitativas realizadas e a Figura 40 ilustra as

amostras.

Tabela 3. Avaliação histológica qualitativa da preservação morfológica dos tecidos musculares

Avaliação histológica, pela coloração de Hematoxilina - Eosina, da preservação morfológica dos tecidos musculares fixados em formol e impregnados em parafina de acordo com os dias de infecção. Chave: + morfologia preservada, - morfologia não preservada.

Dias de infecção

Tecido muscular

Língua Masseter Diafragma Membro Superior

Membro Inferior

0 + + - + +

45 + + - + +

50 + + - + +

55 + + - + +

60 + + - + +

65 + + - + +

70 + + - + +

75 + + - + +

80 + + - + +

90 + + - + +

120 + + - + +


110

Figura 40. Avaliação histológica qualitativa da preservação morfológica dos tecidos musculares.

Avaliação histológica da preservação morfológica dos tecidos musculares fixados em formol e impregnados em parafina. Coloração de Hematoxilina – Eosina. Todas As amostras apresentam boa preservação morfológica com excepção do diafragma, cujos tecidos apresentam, frequentemente, dobras e pregas. Legenda: masseter - M, língua - L, diafragma -D, membro superior - MS, membro inferior – MI. Os números correspondem aos dias de infecção (barra da escala: B -50 µm; C-200 µm; A, D, E, F- 100 µm). (Original de C.Freitas).

A avaliação microscópica qualitativa das biópsias musculares congeladas, de língua e

masseter, mostrou boa preservação morfológica das fibras de músculo e dos parasitas (Figura 41).

Figura 41. Avaliação histológica qualitativa da preservação morfológica dos tecidos musculares.

Avaliação histológica da preservação morfológica das biópsias musculares congeladas em isopentano arrefecido em azoto líquido. Coloração de Hematoxilina – Eosina. Todas As amostras apresentam boa preservação morfológica com boa distinção das fibras musculares e parasitas. Legenda: A- masseter, 50 dias de infecção; B- masseter, 60 dias de infecção (barra da escala: A -50 µm; B - 100 µm). (Original de C.Freitas).

L 55 MS 120M 60

M 55D 45

A B

DC E F

MI 75

M50 M60

A B


111

4.3.2 Identificação histológica e quantificação de nurse cells de T. spiralis nos tecidos

musculares

Foram identificadas nurse cell em todos os fragmentos fixados em formol e processados em

parafina, com excepção dos fragmentos do G0 -rato controlo, não infectado- (Tabela 4).

Tabela 4. Identificação histológica de nurse cells de T. spiralis.

Identificação histológica de nurse cells de T. spiralis, pela coloração de Giemsa modificado. Chave: presença (+) ou ausência (-) de nurse cells de T. spiralis nos músculos da língua, masseter, diafragma, membro superior e membro inferior dos tecidos fixados em formol e processados em parafina, de acordo com os dias de infecção.

Dias de infecção

Tecido muscular


Membro Inferior

0 - - - - -

45 + + + + +

50 + + + + +

55 + + + + +

60 + + + + +

65 + + + + +

70 + + + + +

75 + + + + +

80 + + + + +

90 + + + + +

120 + + + + +


112

A Figura 42 ilustra os parasitas nas nurse cells, com as cápsulas de colagénio coradas a lilás.

Figura 42. Identificação histológica de nurse cells de T. spiralis nos tecidos musculares.

Coloração de Giemsa modificado. Foram identificadas nurse cells de T. spiralis em todos os tecidos parasitados. Legenda: masseter - M, língua - L, diafragma -D, membro superior - MS, membro inferior – MI. Os números correspondem aos dias de infecção (barra da escala: A -50 µm; B a F- 200 µm). (Original de C.Freitas).

MS 60 D 60 MI 60

M 60 L 60MS 60

A B

D

C

E F


113

Relativamente à quantificação de nurse cells, verificou-se que as amostras de masseter,

língua e diafragma apresentavam o maior número de parasitas (Tabela 5).

Tabela 5. Quantificação de nurse cells de T. spiralis

Avaliação numa área de 62,8mm2 por fragmento de tecido muscular, de acordo com os dias de infecção. As amostras de língua, masseter e diafragma são as mais parasitadas.

Dias de infecção

Tecido muscular


Membro Inferior

0 0 0 0 0 0

45 66 68 96 11 12

50 30 49 40 17 8

55 28 118 56 17 14

60 58 67 60 11 13

65 43 59 30 22 8

70 49 75 68 26 16

75 66 101 42 18 25

80 68 128 31 9 21

90 110 160 101 15 16

120 104 52 32 6 7

Total 622 877 556 152 140

4.3.3 Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas nas nurse cells de T.

spiralis e áreas adjacentes

A avaliação microscópica das amostras coradas com Verhoeff, nas amostras de língua e

masseter, evidenciou uma marcação circular de fibras elásticas na cápsula do parasita e em áreas

adjacentes à cápsula. Tanto na língua como no masseter, existe um aumento aparente da marcação

num ou nos dois pólos das nurse cells aos 45, 50 e 55 dias de infecção. Com esta coloração, não foi

possível observar o reforço da marcação de fibras elásticas nos períodos de infecção posteriores.

Esta técnica resulta numa marcação pouco específica, não se conseguindo evidenciar vasos de


114

pequeno calibre nem compreender os limites das estruturas coradas em muitos casos. A Tabela 6

resume a avaliação histoquímica efectuada. Na Figura 43 podem ser comparadas as marcações aos

45 e 120 dias de infecção.

Tabela 6. Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas nas nurse cells de T. spiralis.

Avaliação pela coloração de Verhoeff, da presença (+) ou ausência (-) de fibras elásticas nas nurse cells de T. spiralis e áreas adjacentes, de acordo com os dias de infecção.

Dias de infecção

Tecido muscular

Língua Masseter

0 - -

45 + +

50 + +

55 + +

60 - -

65 - -

70 - -

75 - -

80 - -

90 - -

120 - -


115

Figura 43. Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas nas nurse cells de T. spiralis.

Coloração de Verhoeff. Fibras elásticas dos vasos próprios do rato marcam a negro (controlo positivo interno, E e F). Note-se o reforço da marcação de fibras elásticas junto à cápsula e num dos pólos das nurse cells aos 45 dias de infecção (A e C), não observado aos 120 dias (B, D) (barra da escala: A a D 100 µm, E- 200 µm, F- 50 µm). (Original de C.Freitas).

Lín

gua

Mas

sete

rC

ontr

olo

Inte

rmo

L45

M45

M0 L0

M120

L120

A B

DC

E F


116

4.4 Estudo da expressão de VEGF

A avaliação da expressão do péptido de VEGF foi realizada em 312 nurse cells: 182 por

técnicas imunocitoquímicas (95 de língua e 87 de masseter) e 130 por técnicas de

imunofluorescência (64 de língua e 66 de masseter).

4.4.1 Localização morfológica do VEGF na nurse cell

A expressão do péptido por técnicas imunocitoquímicas foi observada no citoplasma das

nurse cells, nas larvas e no infiltrado inflamatório adjacente às nurse cells. Esta localização foi

confirmada por técnicas imunofluorescentes, com excepção do infiltrado inflamatório em que,

utilizando estas técnicas, não se observou marcação. Estes resultados confirmam as previsões

iniciais deste estudo (expressão de VEGF no citoplasma da nurse cell e no tecido inflamatório

adjacente). Adicionalmente mostram a expressão de VEGF por parte do parasita, o que se revelou

como um resultado inesperado.

4.4.2 Tipo de marcação

Utilizando técnicas de imunocitoquímica (Figura 44), foi possível constatar que o padrão de

marcação do péptido de VEGF caracteriza-se por ser sobretudo homogéneo no citoplasma, difuso

no infiltrado inflamatório e ligeiramente granular na larva.

Utilizando técnicas de imunofluorescência (Figura 45) observou-se uma marcação que varia

entre o finamente granular e o grosseiramente granular no citoplasma das nurse cells, e uma

marcação fina e lisa na cutícula da larva.

4.4.3 Período de expressão do VEGF na nurse cell de T. spiralis

A expressão do péptido de VEGF verificou-se em todo o período de infecção em que

decorreu este estudo (desde os 45 dias até aos 120 dias pós-infecção), confirmando as hipóteses

iniciais. Não se observou expressão no rato controlo (0 dias, não infectado).


117

A Figura 44 e a Figura 45 ilustram a expressão imunocitoquímica e imunofluorescente do

péptido de VEGF.

Figura 44. Expressão imunocitoquímica de VEGF nas nurse cells de T.spiralis.

Marcação a castanho do péptido de VEGF em fundo com contraste azul. Chave: L- língua, M- masseter. Os números correspondem aos dias pós-infecção. Expressão normal do músculo e língua (A, M0 e B, L0) e controlo negativo (C-). A expressão do péptido de VEGF foi observada em todo o período de infecção (45 a 120 dias após infecção), tanto na língua como no masseter. Marcação observada no citoplasma das nurse cells (por exemplo G e H), nas larvas (I, M) e no infiltrado inflamatório adjacente às nurse cell (F). A marcação é sobretudo homogénea no citoplasma, difusa no infiltrado inflamatório e finamente granular na larva. (barra da escala: C, F, I, M - 50 µm; restantes imagens 100 µm). (Original de C.Freitas).

LínguaMasseter

Con

trol

os45

dia

s

70 d

ias

120

dia

s

L0 L45 C-M0

A B

D

C

E F

G H I

J L M


118

Figura 45. Expressão imunofluorescente de VEGF nas nurse cells de T.spiralis.

Imagens de microscopia confocal. Marcação a verde brilhante do péptido de VEGF e núcleos a azul (DAPI). Chave: L- língua, M- masseter. Os números correspondem aos dias pós-infecção. A expressão do péptido de VEGF foi observada em todo o período de infecção (45 a 120 dias pós-infecção), tanto na língua como no masseter. Marcação observada no citoplasma das nurse cell identificada com setas amarelas e nas larvas com setas vermelhas. Não foi observada marcação no infiltrado inflamatório adjacente à nurse cell. A marcação é sobretudo finamente granular no citoplasma, podendo ser grosseira, e fina e lisa junto à cutícula da larva (barra da escala: 100 µm). (Original de C.Freitas).

4.4.4 Avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF

4.4.4.1 Estudo da relação entre a intensidade e os locais de expressão do VEGF na

nurse cell de T. spiralis

A análise da marcação imunocitoquímica com o anticorpo anti-VEGF, revelou que os ratos

infectados mostram uma expressão fortemente positiva do péptido nas nurse cells (citoplasma,

larvas e infiltrado inflamatório adjacente), enquanto o controlo não apresenta expressão de VEGF

L45

M120M45 M70

L120L70

A B

D

C

E F


119

em nenhum dos parâmetros avaliados. O Quadro 11 resume os resultados principais obtidos pela

avaliação semi-quantitativa.

Quadro 11. Avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF por técnicas imunocitoquímicas.

Comparação da expressão imunocitoquímica de VEGF no grupo controlo e no grupo infectado com T.spiralis. O controlo não apresenta expressão de VEGF nas nurse cells, enquanto os ratos infectados mostram uma expressão fortemente positiva no citoplasma das nurse cells, larvas e infiltrado inflamatório adjacente.

Grupos infectados com T.spiralis (45 a 120 dias após infecção)

Grupo de controlo

Expressão de VEGF na nurse cell

Estruturas marcadas

(%)

Intensidade da coloração (de VEGF)

Avaliação semi-quantitativa

(Scores)

Marcação imunocitoquímica

(expressão VEGF)

Marcação imunocitoquímica

(expressão VEGF)

Citoplasma 100 moderada 5 Fortemente

positiva Sem

expressão

Larva 100 forte 6 Fortemente

positiva Sem

expressão

Infiltrado inflamatório adjacente

100 forte 6 Fortemente

positiva Sem

expressão

Como se ilustra no Quadro 11, a expressão do péptido de VEGF foi observada em 100% das

nurse cells, 100% das larvas e 100% do infiltrado inflamatório (sempre que este se encontrava

visível). A intensidade da marcação foi particularmente forte na larva e no infiltrado inflamatório,

apresentando-se de forma moderada no citoplasma das nurse cells. Estes resultados são

concordantes com as hipóteses teóricas iniciais, acrescentando indicações sobre a intensidade de

expressão de VEGF na larva.


120

4.4.4.2 Estudo da relação entre a intensidade de expressão de VEGF e o número de dias

de infecção

A Figura 46 traduz os resultados (% de células marcadas mais intensidade da marcação) da

avaliação semi-quantitativa da expressão de VEGF ao longo do período de infecção.

Figura 46. Expressão imunocitoquímica de VEGF nas nurse cells de T. spiralis.

Com 0 dias de infecção não há expressão do péptido de VEGF. Em todo o período de infecção, o citoplasma das nurse cells, as larvas e as células inflamatórias mostram uma expressão fortemente positiva de VEGF. Os resultados representam a média dos scores obtidos (somatórios dos resultados da língua e masseter). Interpretação dos scores da expressão de VEGF: (0) sem expressão (2) fraca (3-4) moderada (5-6) forte. N=182.

Os resultados obtidos mostram que, em todos os períodos de infecção estudados, ocorre uma

expressão de VEGF fortemente positiva. Verificou-se que 92,9% das larvas foram classificadas com

score 6 enquanto apenas 7,1% apresentou score 5, no infiltrado inflamatório 95,6% foi classificado

com score 6 enquanto apenas 4,3% apresentou score 5. No citoplasma das nurse cells 56,5% foram

classificados com score 5 enquanto 43,5% apresentaram score 6.

0

1

2

3

4

5

6

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Expressão imunocitoquímica de VEGF nas nurse cells de T.spiralis

nurse cells Larvas Células inflamatórias

Dias após infecção

Scor

es


121

Comparando a expressão de VEGF com o tempo de infecção, os resultados sugerem uma

correlação negativa, significativa, entre o VEGF no citoplasma das nurse cells e o tempo de

infecção (rs= -0,213; P≅0.003; N=182). Com efeito, verificaram-se diferenças significativas (χ2, P

≅0.000) dos scores do VEGF. Quanto à expressão de VEGF nas larvas e nas células inflamatórias,

não parece haver uma associação significativa com o tempo de infecção P> 0.005). Os resultados

estão de acordo com as previsões iniciais, no que respeita à expressão de VEGF no citoplasma das

nurse cells.

Os resultados mostraram-se concordantes com os obtidos pelas técnicas de

imunofluorescência, embora não se tenha verificado uma correlação estatisticamente significativa

(Figura 47 e Figura 48).

Figura 47. Expressão imunofluorescente de VEGF nas nurse cells de T. spiralis.

Com 0 dias de infecção não há expressão do péptido de VEGF. Em todo o período de infecção, o citoplasma das nurse cells e as larvas mostram uma expressão fortemente positiva de VEGF. Os resultados representam a média dos scores obtidos (somatórios dos resultados da língua e masseter). Interpretação dos scores da expressão de VEGF: (0) sem expressão (2) fraca (3-4) moderada (5-6) forte. N=130.

0

1

2

3

4

5

6

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Expressão imunofluorescente de VEGF nas nurse cells de T.spiralis

nurse cells Larvas

Scor

es



122

Figura 48. Expressão imunocitoquímica e imunofluorescente de VEGF nas nurse cells.

Quando correlacionados os resultados das técnicas imunocitoquímicas e imunofluorescentes, verifica-se que em ambas os scores da expressão do péptido de VEGF seguem o mesmo padrão nos dias de infecção estudados, tanto em marcações no citoplasma da nurse cell, como nas larvas. Os resultados representam a média dos scores obtidos (somatórios dos resultados da língua e masseter). Interpretação dos scores da expressão de VEGF: (0) sem expressão (2) fraca (3-4) moderada (5-6) forte.

4.5 Avaliação Histomorfométrica

4.5.1 Estudo da formação de novos vasos

A análise da marcação imunocitoquímica com o anticorpo anti-PECAM-1, revelou que os

ratos infectados mostraram um aumento da expressão de células endoteliais (positivas para

PECAM-1), particularmente junto à cápsula, em alguns casos nos pólos das nurse cells, e por vezes

no infiltrado inflamatório. No grupo controlo apenas se visualizaram alguns vasos próprios nos

tecidos em estudo. O padrão da marcação de vasos com o anticorpo PECAM-1 pode ser observado

na Figura 49.

0

1

2

3

4

5

6

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Expressão imunocitoquímica (IC) e imunofluorescente (IF) de VEGF nas nurse cells de T.spiralis

Larvas (IC) nurse cells Larvas (IF) nurse cells

Scor

es


(IC) (IF)


123

Figura 49. Expressão imunocitoquímica de PECAM-1 nas nurse cells de T.spiralis.

Marcação a castanho de PECAM-1 em fundo com contraste azul. Chave: L- língua, M- masseter. Os números correspondem aos dias pós-infecção. Expressão de PECAM-1 no tecido controlo (A) onde são visíveis alguns vasos próprios do rato. Note-se os vasos junto à cápsula (B, D) e nos pólos das nurse cells, por vezes junto ao infiltrado inflamatório (C) (barra da escala: A e C-100 µm; B e D -50 µm). (Original de C.Freitas).

O estudo da formação de novos vasos foi efectuado recorrendo à avaliação da densidade

vascular, que expressa a área de endotélio por nurse cell, e que permite uma quantificação dos

novos vasos formados pelo processo de angiogénese. O cálculo da densidade vascular foi realizado

em 294 nurse cells (152 de língua e 142 de masseter) através de técnicas imunocitoquímicas e

recorrendo à análise computorizada de imagem. A técnica foi ainda realizada por

imunofluorescência no entanto, os resultados desta técnica não foram contabilizados neste contexto,

uma vez que a marcação era sobretudo difusa, sendo difícil a quantificação. A Figura 49 representa

os valores médios de densidade vascular avaliados entre os 0 dias (controlo) e os 120 dias de

infecção.

L0 L45

M70M60

A B

DC


124

Figura 50. Expressão imunocitoquímica de PECAM-1 nas nurse cells de T.spiralis.

As médias da densidade vascular representam a área de microscopia ocupada por endotélio na língua e no masseter. Há um aumento de células PECAM-1 positivas, ao longo do período de infecção. rs =0,287; P≅0,000; N (língua) =152; N (masseter) =142.

Os resultados, ilustrados na Figura 50, sugerem uma correlação estatisticamente

significativa, fortemente positiva, entre o aumento de novos vasos e o tempo de infecção (rs =0,287;

P≅0,000; N= 294) demonstrada por um forte aumento de novos vasos formados (com excepção do

período dos 90 dias pós-infecção em que a formação de vasos é proporcionalmente inferior aos

outros períodos).

Estes resultados não confirmam as hipóteses iniciais, que estimavam um aumento inicial, seguido

de uma estabilização do número de vasos no decorrer da triquinelose.

Relativamente às técnicas imunofluorescentes, a observação por microscopia confocal da

marcação fluorescente de PECAM-1, mostrou-se difusa sendo difícil a sua quantificação. Porém,

pela observação das lâminas foi possível constatar uma marcação junto à cápsula das nurse cells,

que se ilustra neste trabalho mas que não foi valorizada (Figura 51).

0

0,00005

0,0001

0,00015

0,0002

0,00025

0,0003

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Densidade vascular

Lingua Masseter


Den

sida

de V

ascu

lar

(µm

2 )


125

Figura 51. Expressão imunofluorescente de PECAM-1 nas nurse cells de T.spiralis.

Imagens de microscopia confocal. Marcação a verde brilhante de PECAM-1 e núcleos a azul (DAPI). Chave: L- língua, M- masseter. Os números correspondem aos dias pós-infecção. Note-se uma marcação difusa junto à cápsula, difícil de valorizar (setas a vermelho). (barra da escala: 100 µm). (Original de C.Freitas).

4.5.2 Estudo do recrutamento de células de músculo liso

Este estudo foi efectuado recorrendo à avaliação da densidade de expressão de células do

músculo liso (positivas para o anticorpo anti - AML), que expressa a área de células de músculo liso

por nurse cell. O cálculo da densidade de expressão de células do músculo liso foi realizado em 239

nurse cells por técnicas imunocitoquímicas (108 de língua e 131 de masseter) e recorrendo à análise

computorizada de imagem.

Comparando as amostras do rato controlo (não infectado) com as dos grupos infectados,

observa-se um aumento da expressão de células positivas para AML em todos os períodos de

infecção estudados. A expressão de AML foi observada particularmente junto à cápsula, em muitos

casos nos pólos das nurse cells e por vezes no infiltrado inflamatório. O padrão da marcação de

vasos com o anticorpo anti-AML pode ser observado na Figura 52.

L45

M45 M70

L60

A B

DC


126

Figura 52. Expressão imunocitoquímica de AML nas nurse cells de T.spiralis.

Marcação a castanho do AML em fundo com contraste azul. Chave: L- língua, M- masseter. Os números correspondem aos dias pós-infecção. Expressão de AML no tecido controlo (A) onde são visíveis alguns vasos próprios do rato. Note-se os vasos junto à cápsula nos pólos das nurse cells (C), por vezes junto ao infiltrado inflamatório (D) (barra da escala: B e C-100 µm; A e D -50 µm). (Original de C.Freitas).

Os resultados da densidade de expressão de células do músculo liso avaliados entre os 0 dias

(controlo) e os 120 dias de infecção são ilustrados na Figura 53.

M55M0

M70 M70

A B

DC


127

Figura 53. Densidade de expressão imunocitoquímica de AML nas nurse cells de T.spiralis.

As médias da densidade de expressão de AML representam a área de microscopia ocupada por células AML positivas no rato controlo e nos ratos infectados. Há um aumento da área ocupada por células AML positivas nas nurse cells dos ratos infectados, que diminui com o tempo de infecção (até aos 75 e 80 dias). rs =-0,475; P≅0,000; N (língua) =108; N (masseter) =131.

Os resultados sugerem uma correlação estatisticamente significativa, fortemente negativa,

entre a maturação de vasos sanguíneos e o tempo de infecção (rs=-0,475; P≅0,000; N= 239)

demonstrada por um forte aumento de células de músculo liso para cobrir os novos vasos num

período inicial da infecção (45 dias), seguido de uma diminuição até aos 75 e 80 dias, ocorrendo um

novo aumento a partir dos 90 dias. Estes resultados são discordantes com as previsões iniciais, em

que se estimava um aumento de células do músculo liso, indicativo da maturação e estabilização

dos vasos no decorrer da triquinelose.

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0,0006

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Densidade de expressão de AML

Lingua Masseter

Den

sida

de d

e cé

lula

s de

mús

culo

liso

(µm

2 )



128

4.5.3 Correlação da expressão de VEGF, PECAM-1 e AML

Para compreender as relações entre a produção de factores angiogénicos (VEGF), a

formação de novos vasos sanguíneos (PECAM-1) e a maturação dos vasos formados (AML),

estabeleceram-se correlações entre as três variáveis. A Figura 54 corresponde a uma representação

gráfica dos valores de densidade vascular (PECAM-1) e de densidade de expressão de AML

Figura 54. Densidade vascular e da densidade de expressão de AML nas nurse cells.

As médias da densidade vascular e da densidade de expressão imunocitoquímica de AML, representam a área de microscopia ocupada por novos vasos e células AML positivas, respectivamente, no rato controlo e nos ratos infectados (somatório dos resultados da língua e do masseter). rs =-0,475; P≅0,000; N (PECAM-1) =294; N (AML) =239.

Comparando o rato controlo (0 dias, não infectado), com os restantes animais infectados, podemos

constatar um aumento inicial tanto de PECAM-1 como de AML. Contudo, enquanto PECAM-1

demonstra um aumento do número de vasos ao longo de todo o tempo de infecção (com excepção

do período dos 90 dias); AML demonstra um forte aumento no período inicial da infecção (45 dias),

seguido de uma diminuição até aos 75 e 80 dias, ocorrendo um novo aumento aos 90 dias (Figura

55).

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Densidade vascular vs densidade de expressão AML

PECAM-1 AML

Den

sida

de (µ

m2 )



129

Figura 55. Aumento médio de área ocupado por PECAM-1 e AML nas nurse cells.

As médias da densidade de expressão de AML e PECAM-1 representam a área de microscopia ocupada por células AML e PECAM-1 positivas no rato controlo e nos ratos infectados. Há um aumento médio de 50% da área ocupada por células AML e de 79% de células PECAM-1 nas nurse cells dos ratos infectados, comparativamente ao rato controlo.

Os resultados indicam um aumento médio de 79% de área ocupada por endotélio e de 50%

de células AML positivas, nas nurse cells dos ratos infectados com T. spiralis, face ao rato controlo.

A expressão de VEGF, mostrou-se presente em todo o período de infecção (com diminuição

no citoplasma da nurse cell), parecendo existir uma correlação positiva (não significativa) com

PECAM-1, na nurse cell, na larva e nas células inflamatórias. No que se refere à AML, parece

existir uma correlação estatística significativa, positiva, com o VEGF do citoplasma da nurse cell (rs

=0,46 e P=0,002), na larva (rs =0,313 e P≅0,000) e nas células inflamatórias (rs =0,245 e P=0,005).

52

76 76 77 79 7984

100

68

96100

82

44 45

3429 28 28

36

78

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 45 50 55 60 65 70 75 80 90 120

Aumento médio de área ocupada por PECAM-1 e AML

PECAM-1 AML

Méd

ia d

a ár

ea (%

)


Média 50%Média 79%

5 Discussão e conclusões

Capítulo 5- Discussão e conclusões

133

5 Discussão e conclusões

A ocorrência da triquinelose tem vindo a crescer em humanos, não só em países

considerados endémicos, mas também em outros países onde, até recentemente, não existiam dados

epidemiológicos descritos. Esta situação ocorre devido a alterações culturais, nomeadamente à

introdução de novas práticas alimentares, incluindo o consumo de carne crua ou insuficientemente

cozinhada de diferentes origens animais (Pozio, 2007). A dimensão do problema levou a que, em

muitos países europeus, a triquinelose passasse a ser monitorizada de forma mais rigorosa, tendo

mesmo sido declarado o seu reporte obrigatório (Gottstein et al., 2009). Adicionalmente tem sido

realizado um esforço combinado de diversos organismos no sentido de promover a investigação,

controlo e prevenção desta doença causadora de morbilidade e mortalidade (Dupouy-Camet &

Murrell, 2007).

O sucesso do parasitismo de T. spiralis está intimamente ligado com o processo de

angiogénese. A angiogénese garante as condições de que o parasita necessita para instalar-se,

desenvolver-se e manter-se durante vários anos no músculo do hospedeiro. Deste modo, o

conhecimento da actividade angiogénica de T. spiralis é essencial para o desenvolvimento de novas

abordagens terapêuticas que inibam as vias utilizadas pelo parasita para formar novos vasos,

permitindo desta forma controlar a doença. O conhecimento das moléculas implicadas na

angiogénese, poderá também ser útil para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico

específicos e sensíveis para a detecção da triquinelose em animais e humanos.

5.1 Monitorização da infecção parasitária

Na investigação científica existe frequentemente a necessidade de recorrer a modelos

animais para melhor compreender os mecanismos subjacentes às diversas patologias e assim

suportar o avanço científico. Para que tais modelos possam ser úteis deverão atender a alguns

pressupostos, nomeadamente: que um processo patológico espontâneo ou induzido possa ser

investigado; o processo em estudo seja semelhante ao que ocorre em seres humanos; e o modelo


134

permita o estudo dos processos biológicos ou de comportamento do animal (Fagundes & Taha,

2004). O modelo animal utilizado teve em vista a reprodução do ciclo de vida de T. spiralis o mais

semelhante possível ao que ocorre na natureza. A monitorização da infecção parasitária permitiu

confirmar a infecção e acompanhar a fase de enquistamento das larvas nos músculos.

5.2 Análise morfológica qualitativa

5.2.1 Preservação morfológica

Os tecidos de diafragma foram excluídos do estudo pois o seu processamento histológico e

inclusão resultavam frequentemente na criação de pregas, que inviabilizavam as medições das áreas

relativas às nurse cells, impossibilitando assim a determinação da densidade vascular e densidade

de células AML. O estudo poderia, no entanto, ter sido alargado para os membros superiores e

inferiores, possibilitando a comparação da evolução da angiogénese nos diferentes órgãos. Porém,

tendo em conta a metodologia definida (relativa às medições das áreas), as limitações técnicas e o

tempo disponível para a realização deste trabalho, restringiu-se o estudo à língua e ao masseter.

5.2.2 Identificação histológica do parasita e quantificação de nurse cells

A coloração de Giemsa cora a cápsula da nurse cell de rosa, o que facilita a identificação e a

quantificação. O maior número de nurse cells foi determinado na língua, masseter e diafragma.

Uma coloração alternativa é a de Azul de Toluidina a 2% que para além da visualização do parasita

e da cápsula (Figura 1D, página 17), evidencia as fibras musculares e mastócitos com grande

qualidade (dados não utilizados neste trabalho, mas que poderão ser utilizados em estudos futuros).

5.2.3 Avaliação histoquímica da presença de fibras elásticas

A avaliação da presença de fibras elásticas pela coloração de Verhoeff mostrou um aumento

da coloração num dos pólos das nurse cells de T.spiralis. Esta coloração não permite a visualização

de vasos de pequeno calibre porém, é indicativa de um aumento de fibras elásticas entre os 45 e os

55 dias após a infecção. Estes resultados podem de alguma forma estar relacionados com a


135

expressão de AML que mostrou um aumento do recrutamento de células para cobrir os novos no

início da infecção.

5.3 Estudo da expressão de VEGF na nurse cell de T.spiralis

5.3.1 Locais morfológicos onde é expresso o VEGF

Estudos prévios demonstraram que as nurse cells estão aptas a produzir VEGF durante a

infecção por T. spiralis, tendo sido detectada a presença do péptido de VEGF no citoplasma das

nurse cells bem como na área adjacente (Capó et al., 1998). Posteriormente foi demonstrado que as

células inflamatórias adjacentes à nurse cell também contribuem para a produção de VEGF

(Shariati et al., 2009). Os resultados do presente estudo estão em concordância com os dos autores

referidos, já que a expressão do péptido de VEGF foi identificada no citoplasma das nurse cells

bem como nas células inflamatórias adjacentes às nurse cells. Adicionalmente, observou-se que as

larvas também expressaram VEGF durante todo o período de infecção estudado (45 a 120 dias), o

que constitui um novo registo face ao descrito na literatura, que poderá dever-se à sensibilidade e

especificidade das técnicas realizadas para detecção do péptido de VEGF (Figura 44, página 117 e

Figura 45, página 118).

A avaliação da expressão de VEGF foi realizada através de técnicas imunocitoquímicas e

técnicas imunofluorescentes, tendo-se verificado uma concordância de resultados entre ambas. Não

foi possível avaliar a expressão de VEGF no infiltrado inflamatório por técnicas

imunofluorescentes, já que este não se encontrava perceptível na observação por microscopia

confocal. Este facto pode dever-se a uma limitação resultante da técnica realizada

(autofluorescência e fundo).

O padrão de marcação na larva mostrou-se bastante distinto pelas duas técnicas. Enquanto

por imunocitoquímica a expressão de VEGF se observou em todo o parasita (Figura 44, página 117)

por técnicas imunofluorescentes observou-se marcação na cutícula da larva (Figura 45, página 118),

o que se deve ao facto dos reagentes fluorescentes não terem penetrado.


136

5.3.2 Período de tempo em que é expresso o VEGF.

A expressão do péptido de VEGF foi identificada em todo o período de infecção do estudo:

desde os 45 até aos 120 dias. A expressão de VEGF no rato controlo (sem infecção) foi observada

nas estruturas histológicas que naturalmente expressam a proteína, tais como os septos inter-

fasciculares do músculo e os megacariócitos (controlo interno positivo).

Outros autores mostraram que a expressão de VEGF no citoplasma das nurse cells podia ser

observada desde o dia sete até oito meses após infecção, utilizando uma metodologia de injecção

directa de larvas no músculo (Capó et al., 1998). Os resultados obtidos com o presente estudo estão

em concordância com os destes autores, comprovando que a expressão de VEGF poderá ser

necessária não só para formação da nurse cell como também para a sua manutenção, sendo um

factor essencial para o sucesso da infecção. Os resultados não podem, no entanto, ser generalizados

tendo em conta o desenho inicial do estudo, que começou a avaliação de VEGF aos 45 dias de

infecção, momento em que a quase totalidade das larvas se encontravam enquistadas. Para

compreender a expressão de VEGF na fase inicial de enquistamento, o período de abate deveria ter

ocorrido mais cedo -aos 20 dias, ou aos 33 dias- (Humes & Akers, 1952), de forma a compreender

com maior rigor o ciclo de vida do parasita na natureza.

5.3.3 Relação entre a expressão de VEGF e o número de dias pós-infecção

A relação entre a intensidade da expressão de VEGF no citoplasma das nurse cells e o

número de dias pós-infecção, apresenta uma correlação negativa, significativa, o que sugere que a

quantidade de péptido de VEGF no citoplasma das nurse cells tende a diminuir com o tempo. Pelo

contrário, não parece haver uma associação significativa entre o tempo de infecção e a expressão de

VEGF nas larvas e nas células inflamatórias, ou seja, verifica-se a manutenção de VEGF durante o

período de infecção. Face aos resultados contraditórios entre a intensidade de expressão de VEGF

do citoplasma da nurse cell, e a intensidade da larva e células inflamatórias, não é possível validar a

hipótese teórica inicialmente estabelecida, que preconizava uma diminuição da expressão de VEGF


137

com o número de dias pós-infecção. Relativamente aos resultados da expressão de VEGF no

citoplasma da nurse cell, poderíamos inferir que a diminuição da intensidade da marcação de VEGF

com o tempo, é indicativa de uma menor dependência do factor angiogénico para a formação de

vasos. Porém, os resultados das outras estruturas mostram que a expressão de VEGF não diminui

com o tempo, o que está de acordo com o estudo de outros autores (Capó et al., 1998), sugerindo

que a presença contínua de VEGF pode indicar a manutenção de um estado constante de hipóxia, o

que é essencial para que ocorra uma alteração local no equilíbrio entre os factores angiogénicos e

inibidores (Folkman, 1995) e seja desencadeada a formação de novos vasos. Provavelmente estes

resultados são indicativos de que o parasita tem de secretar constantemente proteínas que

mantenham a nurse cell no seu estado diferenciado (Capó et al., 1998; Dennis et al., 2011).

5.3.4 Relação entre a intensidade e os locais de expressão de VEGF.

Perante a expressão de VEGF em três locais morfológicos distintos (citoplasma das nurse

cells, células inflamatórias adjacentes e larvas), tentou compreender-se se existiria uma relação

entre a intensidade da expressão de VEGF e os seus locais de expressão na nurse cell de T.spiralis.

A análise da marcação imunocitoquímica com o anticorpo anti-VEGF, por metodologia

semi-quantitativa, revelou que os ratos infectados mostram uma expressão fortemente positiva do

péptido nas nurse cells (citoplasma, larvas e infiltrado inflamatório adjacente); enquanto o controlo

não apresenta expressão de VEGF em nenhum dos parâmetros avaliados. Nos grupos de animais

infectados estudados, 100% das estruturas avaliadas parecem expressar o péptido. Relativamente ao

infiltrado inflamatório adjacente à nurse cell, a orientação de algumas nurse cells não permitia a sua

visualização e consequente classificação. A expressão de VEGF verificou-se sempre que se

conseguiu observar o infiltrado inflamatório, por técnicas imunocitoquímicas (Quadro 11, página

119).

Estudos prévios (Capó et al., 1998) avaliaram em simultâneo a presença do pépdido e do

mRNA de VEGF e observaram que as reacções positivas para mRNA de VEGF se verificavam nas


138

áreas imediatamente adjacentes aos núcleos localizados nas nurse cells, demonstrando assim que os

núcleos se encontravam activos na transcrição de proteína. Tendo em conta as diferenças de

intensidade observadas nas 182 nurse cells avaliadas no presente estudo, (de intensidade geralmente

forte para as larvas e células do infiltrado inflamatório, e moderada para o citoplasma das nurse

cells), podemos questionar-nos sobre a contribuição das células inflamatórias, da larva e do

citoplasma da nurse cell na indução da angiogénese. Se o aumento da intensidade for indicativo da

quantidade estimada do pépdido expresso, podemos sugerir que os locais onde a intensidade é

maior podem ser os implicados na produção de VEGF. Nesta circunstância, coloca-se a hipótese de

o citoplasma das nurse cells poder constituir um depósito do VEGF expresso pelas larvas, ao invés

de um local de produção do péptido. Esta hipótese pode ser apoiada pelo facto da expressão de

VEGF no citoplasma das nurse cells e nas larvas sugerir uma correlação estatisticamente

significativa, positiva, (o aumento de VEGF na larva leva ao aumento de VEGF no citoplasma). São

necessários estudos adicionais que clarifiquem o papel do citoplasma da nurse cell e do parasita na

produção de VEGF.

Os resultados do presente estudo podem contribuir para o esclarecimento das vias

hipotéticas utilizadas pelo parasita na indução da angiogénese, já que a expressão de VEGF pela

larva sugere de que os factores pró-angiogénicos (VEGF) podem ser libertados pelo parasita,

induzindo a angiogénese directamente por estimulação da proliferação endotelial. Por outro lado, a

expressão de VEGF pelas células inflamatórias adjacentes pode dever-se a uma resposta por parte

do sistema imunitário do hospedeiro (factores angiogénicos como a interleucina-1, que promovam a

angiogénese indirectamente estimulando as células inflamatórias do hospedeiro a produzir VEGF).

Não obstante, face a estes resultados, não pode ser excluída a hipótese do parasita estimular o

sistema imunitário do hospedeiro, que por sua vez estimula a produção de factores pró-angiogénicos

(Zcharia et al., 2004; Dennis et al., 2011). São necessários estudos adicionais que elucidem sobre o

papel do parasita na indução directa e/ou indirecta da angiogénese.


139

5.4 Estudo da formação de novos vasos

5.4.1 Relação entre o aumento de vasos junto à nurse cell e o número de dias pós-

infecção

A transformação dos miócitos infectados pelas larvas em nurse cells implica diversas

modificações, como a formação de redes vasculares. Estudos prévios identificaram redes vasculares

“de novo”, ou seja resultantes de angiogénese, por comparação da estrutura dos vasos observados

na infecção, com a dos que se localizavam no músculo não infectado (Baruch & Despommier,

1991). Os mesmos autores verificaram a perda da vasculatura nas porções terminais das nurse cells.

O presente estudo obteve resultados discordantes, já que se observaram vasos junto à cápsula das

nurse cells, frequentemente em ambos os pólos (tipicamente em secções longitudinais) e de forma

mais rara, no infiltrado inflamatório (Figura 49, página 123). Esta diferença na descrição dos vasos

pode dever-se à metodologia seguida no presente estudo (estudo histológico), que permite a

visualização simultânea das marcações endoteliais no contexto da anatomia das nurse cells e do

tecido muscular onde estas se inserem.

O estudo da densidade vascular permite calcular a área de endotélio por nurse cell, e a

consequente quantificação dos novos vasos formados pelo processo de angiogénese. A avaliação foi

realizada em 294 nurse cells por técnicas imunocitoquímicas e mostrou uma correlação

estatisticamente significativa, fortemente positiva, entre o aumento de novos vasos e o tempo de

infecção (Figura 50, página 124). Este facto pode estar relacionado com a expressão contínua de

VEGF que incita à produção de vasos. Todavia, a análise estatística dos resultados mostra que

existe uma relação directa entre o VEGF expresso pela larva e infiltrado inflamatório e o aumento

do número de vasos (ainda que esta correlação não seja estatisticamente significativa). O aumento

do número de vasos com os dias de infecção (tendo um aumento médio de 79% em comparação

com o controlo) não confirma a hipótese inicial em que era previsto um aumento nos primeiros dias

de infecção, seguido da estabilização do número de vasos. O alargamento do período de infecção


140

estudado (120 dias) poderia ser útil na compreensão da evolução do número de vasos nas nurse

cells.

O estudo dos mecanismos envolvidos nos factores pró-angiogénicos, nomeadamente os

estudos genéticos e bioquímicos, poderá contribuir para se compreender a formação de novos vasos.

Refere-se, no entanto, como limitação da avaliação realizada, o facto das medições da densidade

vascular se efectuarem apenas num plano, e não a um nível tridimensional.

5.5 Estudo do recrutamento de células de músculo liso

5.5.1 Relação entre as células que expressam AML e o número de dias pós-infecção

A expressão de factores angiogénicos como o VEGF por parte do parasita, estimula o

recrutamento de vasos sanguíneos dos tecidos adjacentes por angiogénese. Os novos vasos

formados são, imaturos, irregulares e permeáveis. A maturação ocorre quando são recrutadas

células murais (perícitos e células do músculo liso) para estes vasos, causando a estabilização do

vaso (Carmeliet 2003).

Com o objectivo de compreendermos se existe uma relação entre o tempo de infecção e o

recrutamento de células de músculo liso, e assim obter uma indicação da maturação dos vasos

formados, realizou-se uma avaliação da densidade das células que expressam AML, recorrendo a

estudos imunocitoquímicos e à análise de imagem. Os resultados mostraram a expressão de células

de AML junto à cápsula, sendo frequente em alguns nos pólos das nurse cells, e esporádica no

infiltrado inflamatório (Figura 52, página 126). Comparando os resultados, verifica-se uma

correlação estatisticamente significativa, fortemente negativa, entre a maturação de vasos

sanguíneos e o tempo de infecção (Figura 53, página 127), o que sugere que o aumento do

recrutamento de células murais para cobrir os novos vasos, é maior no início da infecção (tendo um

aumento médio de 50% em comparação com o controlo). Estes resultados são contrários às

hipóteses teóricas iniciais, que estimavam um aumento de células do músculo liso, que indicassem

maturação e estabilização dos vasos no decorrer da triquinelose. Quando comparados estes


141

resultados com a expressão de VEGF verifica-se uma correlação estatística significativa, positiva.

Estes dados podem indicar que o aumento de AML está directamente relacionado com o aumento

de VEGF. Os novos vasos formados, aos 45 e 50 dias de infecção, mostraram uma densidade de

expressão de AML muito elevada, indicando o recrutamento de perícitos e a maturação dos vasos.

Os perícitos por seu lado actuam sobre as células endoteliais através da libertação de VEGF

(Benjamin et al., 1999). As células endoteliais recém formadas exibem mais dependência de VEGF

do que as que sofreram maturação, com cobertura por perícitos. Supõe-se que um dos eventos chave

que resulta na redução da dependência face ao VEGF, é a formação da parede vascular com

recrutamento dos perícitos (Karamysheva, 2008). Deste modo poderá julgar-se que a diminuição da

densidade de expressão de AML pode dever-se à diminuição da dependência de VEGF, após a

formação inicial e maturação dos novos vasos. Pode assim ser estabelecido um paralelismo entre o

aumento de VEGF e de AML com o crescimento da nurse cell: a expressão de VEGF é mantida em

todo o período de infecção, embora em níveis inferiores aos do início da infecção (no caso do

citoplasma da nurse cell), sendo acompanhada de uma diminuição de recrutamento de células

murais à medida que a nurse cell se forma. A formação de novos vasos aumenta com o tempo de

infecção, mostrando uma correlação estatística, negativa, não significativa com a maturação dos

vasos.

A aquisição pelo parasita da capacidade para estimular a angiogénese, causando um

“angiogenic switch”, traz vantagens claras para o sucesso do parasitismo. Vários autores defendem

que a angiogénese associada a parasitas pode expressar algumas características comuns com a

tumorogénese (Dennis et al., 2011).

Os vasos que não sofrem maturação, como os tumorais, são mais vulneráveis a terapias anti-

angiogénicas, em contraste com os vasos normais e quiescentes estáveis (Jain & Booth, 2003). Os

resultados deste estudo mostram que, à semelhança do que ocorre com os tumores (Poon et al.,

2003), a avaliação serológica de VEGF poderá ser utilizada como um marcador de prognóstico. A


142

aparente maturação dos novos vasos, aquando da formação das nurse cells, indica que a rede

vascular será possivelmente estável e funcional, podendo até mostrar-se quiescente quando

misturada com o tecido do hospedeiro. Este facto pode explicar o sucesso do parasitismo e da nurse

cell, e indica que o parasita T. spiralis poderá não ser tão vulnerável à utilização de terapias anti-

angiogénicas em doentes infectados como previsto no início deste estudo, ainda que se a activação

da angiogénese representa uma condição necessária para o crescimento e progressão da

triquinelose, a supressão da rede vascular poderia bloquear o desenvolvimento do parasitismo.

Evidentemente que os resultados deste estudo são indicativos de alguns aspectos da actividade

angiogénica da nurse cell de T. spiralis não podendo ser generalizados, e carecem de estudos

aprofundados.

O estudo da maturação dos novos vasos apresenta diversas limitações. Não havendo um

marcador imunocitoquímico que marque todos os perícitos, utiliza-se frequentemente a AML para

os identificar (Benjamin et al., 1998).

Estudos em linhas celulares tumorais mostram que os perícitos expressam desmina mas não

AML nas fases iniciais de proliferação (Kurz et al., 2002). Por outro lado, outros autores afirmam

que os perícitos de tumores de grandes dimensões expressam uniformemente AML e desmina, até

nos capilares, em modelos tumorais utilizando ratinhos (Morikawa et al., 2002).

Em suma, pouco se sabe sobre os marcadores apropriados para perícitos, mas a utilização da

AML enquanto marcador generalista de perícitos deve ser utilizada com precaução. Uma forma de

diminuir a incerteza face à presença dos perícitos nos vasos, seria realizar uma técnica

imunocitoquímica dupla com células endoteliais (por exemplo PECAM-1 ou CD34) com AML e

observar a co-expressão.


143

5.6 Estudo da relação entre o VEGF, o número de vasos formados e a sua

maturação

As hipóteses iniciais deste estudo previam que, se o parasita necessita de novos vasos que

lhe permitam receber oxigénio e excretar produtos metabólicos, deveria ocorrer a produção de

factores angiogénicos (VEGF) pela nurse cell, bem como pelo hospedeiro (tecido inflamatório), e

que essa expressão deveria ocorrer com mais intensidade no início da infecção, quando as células

endoteliais dos novos vasos estariam em produção. Os resultados deste estudo confirmaram a

actividade angiogénica em todo o período de infecção estudado e mostraram que também as larvas

expressam VEGF. Essa expressão apenas diminui no citoplasma das nurse cells e é relativamente

constante nas larvas e células inflamatórias adjacentes. A expressão de VEGF parece ter uma

relação directa com a produção de vasos sanguíneos, se analisarmos os dados da expressão de

VEGF da larva e do infiltrado inflamatório. A análise dos dados relativos ao número de novos vasos

formados no decorrer da triquinelose mostrou que, contrariamente à hipótese inicial, não se verifica

uma estabilização na sua formação (em termos de área ocupada por endotélio), nem a perda da

dependência face ao VEGF, o que foi mostrado pelos estudos de correlação PECAM-1 e VEGF. Do

mesmo modo, o estudo da maturação de vasos sanguíneos mostrou-se discordante com as hipóteses

teóricas iniciais, que previam um aumento da expressão de AML com o tempo de infecção,

presumindo-se que os novos vasos formados teriam uma maior associação de perícitos, que

tornassem a nova rede vascular formada estável com o decorrer da infecção. Na verdade, os

resultados obtidos sugerem um aumento da maturação dos vasos em simultâneo com a formação de

novos vasos, seguindo-se uma diminuição do recrutamento de células do músculo liso no decorrer

da triquinelose (Figura 55, página 129). Em suma: com o decorrer da infecção parece que se

mantém a expressão de VEGF, aumenta o número de vasos formados e diminui a maturação dos

vasos.


144

5.7 Estudos futuros

A presente investigação levanta novas questões, fornecendo em simultâneo algumas pistas

para outros trabalhos de investigação.

Partindo do trabalho realizado, o estudo da actividade angiogénica na nurse cell de T.

spiralis poderia ser melhorado com o alargamento do período de infecção estudado, permitindo a

avaliação da expressão de VEGF na fase inicial da formação da nurse cell.

Para compreender a angiogénese de forma mais precisa, poderia realizar-se um estudo com

vista à criação de um modelo da rede vascular e dos perícitos. O estudo tridimensional poderia ser

efectuado em cortes histológicos seriados de congelação, por microscopia confocal (estes cortes

foram efectuados quando se realizou este trabalho e conservados a -80ºC).

De modo a quantificar de forma exacta a expressão de células endoteliais em circulação,

factores angiogénicos, células do músculo liso e células inflamatórias envolvidas na angiogénese,

poderia utilizar-se o sangue colhido por punção cardíaca aos animais deste estudo e realizar-se

citometria de fluxo. Esta metodologia eliminaria algumas limitações da densidade vascular e seria

complementar aos resultados obtidos.

Para visualização simultânea dos vasos formados de novo e dos perícitos, ou do VEGF com

os novos vasos formados, poderia realizar-se uma técnica de imunofluorescência e/ou

imunocitoquímica dupla em secções histológicas e estabelecer a relação entre as variáveis

envolvidas com recurso à visualização morfológica e histológica simultânea.

A realização de estudos aprofundados sobre as vias utilizadas pelos helmintas parasitas na

indução de angiogénese, bem como os mecanismos envolvidos na indução de factores angiogénicos

seria fundamental para o estudo da angiogénese em T.spiralis.

De modo a monitorizar a expressão de factores angiogénicos e células endoteliais e murais,

poderia estudar-se a aplicação de terapias anti-angiogénicas, testando modelos rigorosos, que

pudessem ser aplicadas a humanos e a animais. Poderiam ainda estudar-se outras vias da


145

angiogénese, nomeadamente os mecanismos de resistência natural dos hospedeiros, terapias contra

a hipóxia (inibição da H1F1), e contra a migração endotelial (inibição da ANG-2).

Finalmente, este trabalho deixa em aberto a caracterização de VEGF em relação com a

inflamação (células inflamatórias inatas enquanto moduladoras da angiogénese) não só pela

observação da expressão de VEGF no tecido inflamatório adjacente à nurse cell mas também pela

observação de um aumento considerável der mastócitos marcados com PECAM-1 e observáveis

pela coloração de azul-de-metileno (que demonstra as propriedades metacromáticas de mastócitos)

nos fragmentos de língua, masseter, diafragma, membro superior e inferior em estudo (dados não

divulgados no presente trabalho). Seria interessante compreender a activação de mastócitos e o seu

papel na regulação da inflamação e da angiogénese e caracterizar as células que expressam VEGF

no tecido inflamatório adjacente à nurse cell.

Diversos autores têm estudado o mecanismo de activação de mastócitos na infecção por T.

spiralis. Um dos estudos demonstrou que os antigénios TSL-1 da larva 1 induzem a libertação de

IL-4 e TNF por parte de mastócitos normais, envolvendo um mecanismo independente de Igs.

Adicionalmente, os mesmos autores observaram a expressão intracelular de IL-4 em medula óssea

de roedor. Este facto é sugestivo de que os mastócitos devem desempenhar um papel importante na

resposta imune inicial a T. spiralis e devem ser uma das fontes de citocinas que regulam o

mecanismo final que determina o curso da infecção (Niborski et al., 2004).

A ideia de que a angiogénese é dependente de uma resposta inflamatória coloca a

inflamação como um alvo terapêutico e adicionalmente, na prevenção de angiogénese tumoral

através de fármacos anti-inflamatórios. Diversos fármacos anti-oxidantes e anti-inflamatórios têm

potencial anti-angiogénico, provavelmente porque actuam directamente na angiogénese mediada

por inflamação (Albini et al., 2005). Adicionalmente, há indicações de anti-angiogénicos (como o

vasostatin) com propriedades anti-inflamatórias (Huegel et al., 2006).


146

Idealmente, a prevenção via resposta inflamatória será capaz de prevenir a angiogénese

antes do “angiogenic switch”, resultando em vantagens óbvias no tratamento/prevenção do

parasitismo por T. spiralis. O estudo da combinação terapia anti-angiogénica com terapia anti-

inflamatória seria importante no estabelecimento da relação entre a resposta inflamatória e a

angiogénese.

5.8 Considerações finais

Os objectivos propostos para esta investigação foram alcançados. Foi estudada a actividade

angiogénica na nurse cell de T. spiralis utilizando uma combinação de abordagens histológicas,

caracterizou-se a expressão do Factor de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF) na nurse cell de

T. spiralis, quantificaram-se os novos vasos formados pelo processo de angiogénese e as células

responsáveis pela sua maturação, e correlacionaram-se todos os dados com o tempo de infecção.

Tendo em conta as condições de realização do estudo, o modelo animal estudado, a estirpe

de T. spiralis e os dias de infecção definidos para o abate, foi possível concluir que:

a) A expressão de VEGF ocorre em todo o período de infecção estudado (45 a 120 dias);

b) Os locais morfológicos onde é expresso o VEGF são o citoplasma da nurse cell, o

infiltrado inflamatório adjacente e a larva;

c) Existe uma relação entre a expressão de VEGF e o número de dias pós-infecção: a

quantidade de péptido de VEGF no citoplasma das nurse cells tende a diminuir com o

tempo, mas mantém-se nas larvas e nas células inflamatórias;

d) Existe uma relação entre a intensidade de VEGF e os locais morfológicos de expressão: a

intensidade é geralmente forte na larva e infiltrado inflamatório e moderada no

citoplasma das nurse cells, o que em termos semi-quantitativos se traduziu numa

expressão fortemente positiva do péptido em todos os parâmetros avaliados;

e) Existe uma relação entre o aumento do número de vasos e os dias pós-infecção: o número

de novos vasos aumenta com o tempo, indicando angiogénese em todo o período;


147

f) Existe uma relação entre as células que expressam AML e os dias pós-infecção: o número

de células de músculo liso diminui com o tempo indicando que a maturação dos vasos é

mais activa no início do período estudado;

g) Existem relações entre os factores VEGF, número de vasos formados e maturação dos

vasos: com o decorrer da infecção mantém-se a expressão de VEGF, aumenta o número

de vasos formados e diminuí a maturação dos vasos.

Os resultados do presente estudo são de interesse científico na medida em que contribuem

para o aumento do conhecimento da biologia de T. spiralis. Por outro lado, os dados obtidos

mostram que a triquinelose é um processo em que a angiogénese não corresponde apenas a um

evento. Se complementados com estudos bioquímicos e moleculares, estes resultados poderão

elucidar sobre a produção da rede vascular na nurse cell de T. spiralis e sobre as vias utilizadas pelo

parasita na indução da angiogénese. O bloqueio dessas vias poderá levar à inibição da angiogénese

e à consequente regressão da doença. Desta forma, o conhecimento da actividade angiogénica do

parasita poderá levar ao desenvolvimento de biomarcadores do sangue ou urina expressos mesmo

antes dos sintomas da doença se manifestarem, bem como a abordagens preventivas e terapêuticas

para a triquinelose.

6 Referências bibliográficas

Capítulo 6 – Referências bibliográficas

151

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Instituto de Medicina Molecular

http://www.imm.fm.ul.pt/wiki/doku.php?id=bioimaging:zeiss_lsm510_meta

Trichinela.org- http://www.Trichinella.org/

International commission on trichinellosis- http://intcomtrichinellosis.monsite-orange.fr/

Leis, Decretos-Leis, Portarias e Outros Diplomas Legais

Regulamento (CE) nº 854/2004 do parlamento europeu e do conselho, de 29 de Abril de 2004

Regulamento (CE) nº 1665/2006 da comissão de 6 de Novembro de 2006 que altera o Regulamento

(CE) n.o 2075/2005

Portaria nº 1005/92 de 23/10/1992 , Animais para fins experimentais e científicos

Aplicações lógicas para computador

Image J 1.43u

Microsoft Word 2010

Microsoft Excel 2010

Microsoft Power Point 2010

Autocad 2009

Endnote X2

Anexos

Anexos

171

Anexos

Anexo A. Soluções utilizadas nas técnicas Histoquímicas

Coloração de Hematoxilina-Eosina

Hematoxilina – Eosina

Eosina Alcoólica a 1%

Solução stock:

Eosina Y (Merck- 1.15935.0025)- 1g.

Água destilada- 20mL

Dissolver em Álcool a 95ºV- 80mL

Solução de Trabalho:

Solução stock: 1 parte

Álcool 80ºV: 3 partes

Antes de utilizar, juntar 1mLde Ácido acético Glacial (José M.Vaz Pereira S.A.- 3456) por

cada 100mL de solução.

Verhoeff

Solução de Verhoeff

Hematoxilina 5% em álcool absoluto (Merck- 1.09253.2500)

Cloreto de Ferro 10% (Merck- 1.03943.0250)

Solução Iodada de Weighert

A 100mL de água destilada adicionar 4g. de Iodeto de potássio (Merck – 1.05043.0250) e

2g. de Iodo sublimado (Merck – 1.04761.0500)

Van Gieson

Juntar 10mL de Fucsina ácida aquosa 1% (Merck- 1.05231.0025) a 100mL de Ácido Pícrico

Saturado (Merck- 623.0500)

Anexos

172

Anexo B. Soluções utilizadas nas técnicas imunocitoquímicas e imunofluorescentes

Soluções utilizadas nos protocolos de Imunocitoqímica

Solução de DAB

Por cada mL de substrato (Dako REALTM EnVisionTM – Substrate Buffer - K5007)

adicionar 20 μL de cromogéneo (Dako REALTM EnVisionTM – DAB + Chromogen - x50 -K5007).

Água amoniacal a 1%

Por cada 100mL de água destilada juntar 1mL de Amónia (Riedel-de Haën- 30501)

Soluções utilizadas nos protocolos de imunofluorescência

Solução de DAPI

Pesar 1mg de soluto (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Merck –

1.24653.0100) (balança Mettler AE 200) e dissolver em 1L de tampão fosfato a 1% (BSA –

Albumine, Bovine – Sigma-A-6793).

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