characterization of hevein

8/8/2019 Characterization of Hevein

1/5

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 0 ) 7 5 , 2 3 6

The P r o t e i n s o f Hevea b r a s i l i e n s i s L a t e x4 . ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF CRYSTALLINE HEVEIN*

By B . L . ARCHERT h e B r i t i s h R u b b e r P r o d u c e r s ' R e s e a r c h A 8 8 o c i a t i o n , 5 6 T e w - i n Road, Welwyn Garden C i t y , Herts( R e c e i v e d 9 S e p t e m b e r 1 9 5 9 )

F r e s h r u b b e r l a t e x o b t a i n e d f r o m H e v e a b r a 8 i -l i e n s i s c o n s i s t s o f a s u s p e n s i o n o f s e v e r a l t y p e s o fp a r t i c l e s i n a n a q u e o u s s e r u m , and c a n b e s e p a r a t e di n t o f r a c t i o n s by h i g h - s p e e d c e n t r i f u g i n g ( C o o k &S e k h a r , 1 9 5 3 ) . The t o p l a y e r i n t h e c e n t r i f u g e t u b ec o n s i s t s m a i n l y o f r u b b e r p a r t i c l e s , b e l o w w h i c h i sa l a y e r o f a l m o s t c l e a r s e r u m . At t h e b o t t o m o f t h et u b e i s a l a y e r r e f e r r e d t o i n t h i s p a p e r a s t h e' b o t t o m f r a c t i o n ' , w h i c h c o n t a i n s s e d i m e n t a b l eb o d i e s i n c l u d i n g t h e l u t o i d p a r t i c l e s d e s c r i b e d byH o m a n s & van G i l s ( 1 9 4 8 ) .I n p r e l i m i n a r y work an a q u e o u s e x t r a c t o f t h ebottom f r a c t i o n was f o u n d t o c o n t a i n s e v e r a le l e c t r o p h o r e t i c a l l y d i s t i n c t p r o t e i n c o m p o n e n t s .T h i s o b s e r v a t i o n h a s b e e n c o n f i r m e d and e l a b o r -a t e d by M o i r & T a t a ( 1 9 6 0 ) . T h i s p a p e r d e s c r i b e st h e i s o l a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f a m a j o rc o m p o n e n t w h i c h i s a n i o n i c a t pH 8 - 6 and f o rw h i c h t h e name h e v e i n i s p r o p o s e d .

EXPERIMENTALM a t e r i a l s . F r e e z e - d r i e d s a m p l e s o f t h e b o t t o m f r a c t i o no f f r e s h l y t a p p e d l a t e x w e r e u s e d t h r o u g h o u t . C o l l e c t i o no f t h e l a t e x a n d c e n t r i f u g a l s e p a r a t i o n a n d f r e e z e - d r y i n g o ft h e b o t t o m f r a c t i o n w e r e c a r r i e d o u t b y t h e s t a f f o f t h eR u b b e r R e s e a r c h I n s t i t u t e o f M a l a y a , a s d e s c r i b e d b yM c M u l l e n ( 1 9 5 9 ) . A l l f r e e z e - d r i e d f r a c t i o n s were s e a l e du n d e r h i g h vacuum i n M a l a y a , a n d o n a r r i v a l a t ourL a b o r a t o r y w e r e s t o r e d a t - 1 5 0 u n t i l r e q u i r e d .E l e m e n t a r y a n a l y s e s . T o t a l N w a s d e t e r m i n e d b y t h em i c r o - K j e l d a h l m e t h o d a n d C , H a n d a s h b y P r e g l m i c r o -c o m b u s t i o n . T h e S c o n t e n t o f t h e a s h a n d g a s e o u s com-b u s t i o n p r o d u c t s w a s m e a s u r e d t u r b i d i m e t r i c a l l y a sB a S O 4 a f t e r c o m p l e t e d i s s o l u t i o n o f t h e a s h i n d i l u t e H C 1 .W h e r e t h e amount o f m a t e r i a l a v a i l a b l e f o r a n a l y s i s w a sl i m i t e d , a n d t h e a s h c o n t e n t wa s k n o w n t o b e l o w ( a s i np u r i f i e d h e v e i n ) , C , H a n d S were d e t e r m i n e d o n t h e sa m es a m p l e w i t h a m i c r o c o m b u s t i o n t u b e c o n t a i n i n g a r o l l o fs i l v e r a n d P b O 2 o n l y . P w a s d e t e r m i n e d c o l o r i m e t r i c a l l yw i t h ammonium m o l y b d a t e a f t e r w e t o x i d a t i o n .S o l u b l e p r o t e i n s were e x t r a c t e d f r o m t h e f r e e z e - d r i e ds o l i d s w i t h 0 * 0 5 M - p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 - 8 , o r w i t h 0 - 0 5 m-N a 2 B 4 0 7 , p H 9 - 3 . T h e p r o t e i n - N c o n t e n t o f t h e e x t r a c tw a s t h e n d e t e r m i n e d b y t a n n i c a c i d p r e c i p i t a t i o n a n dK j e l d a h l a n a l y s i s ( A r c h e r & S e k h a r , 1 9 5 5 ) . P u r i f i e d p r o -t e i n s a m p l e s were d r i e d t o c o n s t a n t w e i g h t i n v a c u o a t 8 0 0b e f o r e a n a l y s i s .

* P a r t 3 : M o i r & T a t a ( 1 9 6 0 ) .

P a p e r e l e c t r o p h o r e s 8 s . F o r d e t e r m i n i n g t h e n u m b e r o fe l e c t r o p h o r e t i c a l l y d i s t i n c t p r o t e i n s i n a s o l u t i o n , t h em e t h o d o f K u n k e l & T i s e l i u s ( 1 9 5 1 ) a s m o d i f i e d b y A r c h e r& S e k h a r ( 1 9 5 5 ) w a s u s e d . T h e i s o e l e c t r i c p o i n t o f h e v e i nw a s a l s o d e t e r m i n e d w i t h a p a p e r - s t r i p - e l e c t r o p h o r e s i st e c h n i q u e . T h i s m e t h o d w a s c h o s e n b e c a u s e s u f f i c i e n tp u r i f i e d m a t e r i a l w a s n o t a v a i l a b l e f o r t h e c l a s s i c a l T i s e l i u sm e t h o d i n f r e e s o l u t i o n . T h e b u f f e r s u s e d f o r d e t e r m i n i n gt h e i s o e l e c t r i c p o i n t c o n t a i n e d 0 - 0 2 M - s o d i u m a c e t a t e ,t o g e t h e r w i t h s u f f i c i e n t a c e t i c a c i d t o g i v e t h e r e q ui r e dv a l u e s o v e r t h e r a n g e p H 4 - 3 8 - 5 - 3 9 . A l l p H v a l u e s w e r ed e t e r m i n e d a t 2 0 0 w i t h a C a m b r i d g e p H m e t e r a n d g l a s se l e c t r o d e . C u r r e n t w a s a p p l i e d t o t h e s t a n d a r d p a p e r -e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s b y m e a n s o f p l a t i n u m e l e c t r o d e si m m e r s e d i n b e a k e r s o f e l e c t r o l y t e c o n n e c t e d v i a a g a rb r i d g e s t o t h e b u f f e r c o m p a r t m e n t s o f t h e a p p a r a t u s . T h i sm o d i f i c a t i o n w a s n e c e s s a r y t o p r e v e n t p H c h a n g e s i n t h eb u f f e r s o l u t i o n r e a c h i n g t h e p a p e r s t r i p s d u r i n g t h e l o n gp e r i o d s o f e l e c t r o p h o r e s i s ( a b o u t 4 8 h r . ) , n e e d e d b e c a u s e o ft h e l o w m o b i l i t y o f t h e p r o t e i n n e a r t h e i s o e l e c t r i c p o i n t .T h e v o l t a g e a c r o s s t h e s t r i p w a s m e a s u r e d w i t h p l a t i n i z e de l e c t r o d e s i m m e r s e d i n t h e b u f f e r c l o s e t o t h e s t r i p , a n dc o n n e c t e d t o a r e c o r d i n g v o l t m e t e r , t h e r e b y e n a b l i n g t h ea v e r a g e v o l t a g e d u r i n g a n e x p e r i m e n t t o b e d e t e r m i n e d .A p p r o x i m a t e l y 7 0 0 v w a s a p p l i e d a c r o s s t h e c u r r e n te l e c t r o d e s , r e s u l t i n g i n a p o t e n t i a l g r a d i e n t i n t h e p a p e ri t s e l f o f 8 - 5 v / c m . T h e e l e c t r o p h o r e t i c movement o f t h ep r o t e i n i n a g i v e n t i m e w a s t a k e n a s t h e d i f f e r e n c e b e t w e e nt h e d i s t a n c e s moved b y t h e p r o t e i n a n d a d e x t r a n s p o tw h i c h w a s a p p l i e d t o a s e c o n d s t r i p p l a c e d a l o n g s i d e t h a tc o n t a i n i n g t h e p r o t e i n . A l l d e t e r m i n a t i o n s w e r e c a r r i e d o u ti n d u p l i c a t e . T h e p H o f z e r o m o b i l i t y w a s o b t a i n e d b yg r a p h i c a l i n t e r p o l a t i o n o f t h e r e s u l t s o b t a i n e d a t f i v ev a l u e s i n t h e r a n g e p H 4 - 3 8 - 5 - 3 8 .I s o l a t i o n o f h e v e i n . A p p r o x . 4 0 g . o f f r e e z e - d r i e d b o t t o mf r a c t i o n w a s m i x e d w i t h 3 6 0 m l . o f 0 2 - f r e e w a t e r , 0 - 2 g . o fs o d i u m d i t h i o n i t e ( t o d e a c t i v a t e t h e p o l y p h e n o l - o x i d a s ee n z y m e s , w h i c h r a p i d l y t u r n t h e s o l u t i o n s b l a c k ) , 0 - 0 5 m l .o f o c t a n - l - o l ( t o r e d u c e f r o t h i n g ) a n d a f e w s m a l l p i e c e s o fs o l i d C O 2 i n a h i g h - s p e e d b l e n d e r (MSE A t o - M i x ) a t 0 0 f o r1 m i n . T h e m i x t u r e w a s t h e n c e n t r i f u g e d b e l o w 5 0 a n d t h er e s i d u e r e - e x t r a c t e d t w i c e m o r e w i t h 8 0 m l . o f c o l d w a t e r a sd e s c r i b e d a b o v e . A . R . ( N H 4 ) 2 S 0 4 w a s t h e n a d d e d t o t h ec o m b i n e d e x t r a c t s i n t h e p r o p o r t i o n s o f 4 3 g . / 1 0 0 m l . o fl i q u i d , w i t h c o n s t a n t s t i r r i n g . T h e p H w a s a d j u s t e d t o 6 - 0a n d t h e m i x t u r e s t o r e d a t 0 0 f o r 1 6 h r . T h e p r e c i p i t a t e w a sr e j e c t e d a f t e r c e n t r i f u g i n g a n d w a s h i n g i t w i t h 6 5 %s a t u r a t e d ( N H 4 ) 2 S 0 4 s o l u t i o n , a n d t h e h e v e i n w a s p r e c i p i -t a t e d f r o m t h e c o m b i n e d s u p e r n a t a n t s b y s a t u r a t i n g w i t h( N H 4 ) 2 S 0 4 . T h i s p r e c i p i t a t e was w a s h e d w i t h s a t u r a t e d( N H 4 ) 2 S O 4 s o l u t i o n a n d m i x e d w i t h w a t e r u n t i l d i s s o l u t i o nw a s a l m o s t c o m p l e t e . An e q u a l v o l u m e o f 6 5 % s a t u r a t e d

2 3 6


2/5

CRYSTALLINE H EVEINN H 4 ) 2 S O 4 w a s t h e n a d d e d a n d , a f t e r s t a n d i n g f o r 2 h r . , a n ym a t e r i a l w a s c e n t r i f u g e d o f f a n d r e j e c t e d . T h ew a s a g a i n s a t u r a t e d w i t h ( N H 4 ) 2 S 0 4 , t h eh e v e i n r e d i s s o l v e d i n 6 5% s a t u r a t e d ( N H 4 ) 2 S O 4n d r e p r e c i p i t a t e d a s b e f o r e . T h e f i n a l p r e c i p i t a t e w a s t h e ni n w a t e r a n d d e s a l t e d . T h i s c o u l a n o t b e a c h i e v e da t i s f a c t o r i l y b y o u r u s u a l d i a l y s i s t e c h n i q u e b e c a u s e o fo f p r o t e i n t h r o u g h t h e c e l l u l o s e m e m b r a n e s , s o

w a s e m p l o y e d w i t h m e m b r a n e s w h o s e p e r -t o h e v e i n w a s n e g l i g i b l e .E l e c t r o d i a l y s i s . An a p p a r a t u s s i m i l a r t o t h a t o f W o o d1 9 5 6 ) w a s c o n s t r u c t e d f r o m P e r s p e x . T h e 5 c m . d i a m e t e rw e r e o f c a r b o n a n d t h e a n o d e a n d c a t h o d ee m b r a n e s w e r e P e r m a p l e x i o n - e x c h a n g e m e m b r a n e sP e r m u t i t C o . L t d . , L o n d o n ) A . 1 0 a n d C . 1 0 r e s p e c -S o f t w a t e r p re v i o us l y c o o l e d t o 0 0 w a s c i r c u l a t e dt h e e l e c t r o d e s a t a c o m b i n e d r a t e o f a b o u t 1 8 1 . / h r .h e i n i t i a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s r e s t r i c t e d t o t h a tt o E 2 8 0 m 0 - 3 t o r e d u c e membrane b l o c k a g e ,

o c c u r r e d a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s . T h e d . c . v o l t a g et o t h e c e l l f r o m a f u l l - w a v e r e c t i f i e r u n i t ( u n -w a s i n i t i a l l y 6 0 v a n d r o s e t o 1 5 0 v a s t h e s a l t w a sT h e i n i t i a l c u r r e n t w a s 3 0 0 mA, w h i c h d e c r e a s e do 7 mA a t t h e e n d o f t h e e l e c t r o d i a l y s i s .C r y s t a l l i z a t i o n . A f t e r e l e c t r o d i a l y s i s , t h e p r o t e i n s o l u t i o na s f r e e z e - d r i e d , a n d t h e r e s u l t i n g s o l i d d i s s o l v e d i n t h e m i n i -v o l u m e o f w a t e r a t 4 0 0 . T h e s o l u t i o n w a s t h e n c e n t r i -a n d a l l o w e d t o c r y s t a l l i z e a t 0 0 o v e r n i g h t . T h e h e v e i na s c e n t r i f u g e d o f f a n d r e c r y s t a l l i z e d t w i c e m o r e . T h ew e r e f i n a l l y d r i e d i n v a c uo o v e r P 2 0 r .P a p e r c h r o m a t o g r a p h y . T h e a m i n o a c i d s p r e s e n t i nh y d r o l y s a t e s w e r e i d e n t i f i e d b y t w o - d i m e n s i o n a lc h r o m a t o g r a p h y o n W hatman n o . 1 p a p e r w i t hf o l l o w e d b y l u t i d i n e - p r o p a n - 2 - o l - d i -a s s o l v e n t s ( s e e b e l o w ) .F o r q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a m i n o a c i d s , ao n e - d i m e n s i o n a l d e s c e n d i n g t e c h n i qu e w i t h ao f s o l v e n t s w a s u s e d , s i m i l a r t o t h a t o f R o l a n d &( 1 9 5 4 ) a s m o d i f i e d b y D r a k e , G i f f e e , J o h n s o n &( 1 9 5 7 ) . A p p r o x . 1 0 m g . o f c r y s t a l l i n e h e v e i n ( d r i e do c o n s t a n t w e i g h t a t 7 0 0 i n v a c u o ) w a s a c c u r a t e l y w e i g h e dn d h y d r o l y s e d i n a s e a l e d t u b e i n v a c u o w i t h 1 m l . o f 9 0 %a c i d a n d 1 m l . o f 1 7 % H C I f o r 2 4 h r . a t 1 0 0 0 . T h ew a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a s m a l l d i s t i l l a t i o na n d e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r r e d u c e di n a s t r e a m o f N 2 . T h e r e s i d u e w a s d i s s o l v e d i n ae w d r o p s o f w a t e r a n d t r a n s f e r r e d t o a s m a l l r o u n d -f l a s k o f c a l i b r a t e d v o l u m e ( 0 . 5 9 1 m l . ) , s e a l e d t o

h e e n d o f a B . 1 4 s t a n d a r d g r o u n d - g l a s s s o c k e t . T h i sa v o l u m e o f u p t o 2 m l . o f w a t e r t o b e u s e d f o rt h e d i s t i l l a t i o n f l a s k , e x c e s s o f w a t e r i n t h e c a l i -f l a s k b e i n g r e m o v e d i n a s t r e a m o f N 2 . F i n a l l y- 1 m l . o f p r o p a n - 2 - o l w a s a d d e d a n d t h e s o l u t i o n d i l u t e dw a t e r t o t h e s t a n d a r d v o l u m e . T h i s m i c r o t e c h n i q u ea s n e c e s s i t a t e d b y t h e s m a l l a m o u n t s o f h e v e i n a v a i l a b l e .m i c r o p i p e t t e d e l i v e r i n g 0 - 0 0 5 m l . w a s u s e d t o p u t t h e

o f h y d r o l y s a t e o n t h e p a p e r a n d t h e s a m e p i p e t t e w a sf o r t h e s p o t s o f s t a n d a r d a m i n o a c i d s p r e p a r e d i n 1 0 %s o l u t i o n b y d i r e c t w e i g h i n g . T h e s t a n d a r d a m i n os o l u t i o n s w e r e 2 0 mm e x c e p t f o r t y r o s i n e a n d g l u t a m i cw h i c h w e r e 1 0 m m . D i l u t i o n s w e r e p r e p a r e d a t6 m m r , 1 0 m m , 6 m m a n d 4 m m . F o u r s h e e t s o f Whatmano . 1 p a p e r , 3 6 c m . x 5 4 c m . , c a r r i e d a t o t a l o f n i n e s po t s o f

a n d n i n e s p o t s o f e a c h o f t h e s t a n d a r d s . A f t e r

s o l v e n t d e v e l o p m e n t t h e s h e e t s w e r e a i r - d r i e d f o r 2 4 h r .a n d t h e n i m m e r s e d i n 0 - 2 5% o f n i n h y d r i n i n a c e t o n e c o n -t a i n i n g1% o f a c e t i c a c i d . F o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o l i n e0-2% o f i s a t i n i n a c e t o n e w a s u s e d i n s t e a d o f n i n h y d r i n .T h e s h e e t s w e r e l e f t i n a d a r k b o x a t 5 0 % r e l a t i v e h u m i d i t ya t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t , a n d t h e maximum d e n -s i t i e s o f t h e s p o ts w e r e d e t e r m i n e d w i t h a n E E L s c a n n e rc o n v e r t e d f o r u s e w i t h a 3 mm. d i a m e t e r a p e r tu r e i n s t e a do f t h e s t a n d a r d s l i t . Amino a c i d c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r -m i n e d ( p r o b a b l e a c c u r a c y 5 - 1 0 % ) f r o m c u r v e s o fmaximum s c a n n e r - g a l v a n o m e t e r r e a d i n g s a g a i n s t s t a n d a r da m i n o a c i d c o n c e n t r a t i o n s . T h e s o l v e n t s u s e d f o r d e v e l o p -m e n t w e r e :A . P h e n o l - N a H C 0 3 ( D r a k e e t a l . 1 9 5 7 ) i n a n a t m o s p h e r eo f c o a l g a s , w i t h s o l u t i o n s o f NH 3 ( 3 % ) a n d KCN ( 1 0 % )i n b e a k e r s i n t h e t a n k s . A s p a r t i c a c i d , g l u t a m i c a c i d ,s e r i n e , g l y c i n e , t h r e o n i n e , a l a n i n e , t y r o s i n e , h i s t i d i n e a n da r g i n i n e w e r e d e t e r m i n e d b y t h i s m e t h o d .

B . B u t a n - l - o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 2 5 : 6 : 2 5 , b y v o l . ) . T h eu p p e r p h a s e w a s u s e d f o r d e v e l o p m e n t a n d t h e l o w e r p h a s ef o r e q u i l i b r a t i o n i n t h e t a n k . P r o l i n e a n d l y s i n e w e r e e s t i -m a t e d w i t h t h i s s y s t e m .C . i 8 o A m y l a l c o h o l - p y r i d i n e - w a t e r - d i e t h y l a m i n e( 1 0 0 : 1 0 0 : 7 0 : 4 , b y v o l . ) w i t h b e a k e r s c o n ta i n i n g 1%KCN s o l n . a n d a n a q u e o us s o l u t i o n o f p h e n o l i n t h e t a n k .T h i s m e t h o d w a s u s e d f o r l e u c i n e a n d t o p r o v e t h e a b s e n c eo f i s o l e u c i n e .D . B u t a n - 2 - o l - 3 % N H 3 ( a q . ) s o l n . ( 3 : 1 , v / v ) w a s u s e d f o rd e t e r m i n a t i o n o f v a l i n e .

D e t e r m i n a t i o n o f t h i o l g r o u p s . The a m p e r o m e t r i c -t i t r a t i o n m e t h o d o r i g i n a l l y d e v e l o p e d b y K o l t h o f f & H a r r i s( 1 9 4 6 ) , a s m o d i f i e d b y B e n e s c h & B e n e s c h ( 1 9 4 8 ) a n dW e i s e m a n , S c h o e n b a c h & A r m i s t e a d ( 1 9 5 0 ) , w a s u s e d .S p e c t r o g r a p h i c a n a l y s i s . The s p e c t r u m o f h e v e i n w a ss t u d i e d i n n e u t r a l , a c i d a n d a l k a l i n e m e d i a i n t h e r a n g e

f r o m 2 1 5 t o 3 5 0 m , u w i t h a H i l g e r U v i s p e k s p e c t r o p h o t o -m e t e r . T h e t y r o s i n e a n d t r y p t o p h a n c o n t e n t s o f t h e u n -h y d r o l y s e d p r o t e i n w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e s p e c t r a lc u r v e s i n a c i d a n d a l k a l i n e m e d i a a s d e s c r i b e d b y B e a v e n &H o l i d a y ( 1 9 5 2 ) , G o o d w i n & M o r t o n ( 1 9 4 6 ) a n d B e n c z e &S c h m i d ( 1 9 5 7 ) .U l t r a c e n t r i f u g e a n a l y s i s . S e d i m e n t a t i o n m e a s u r e m e n t sw e r e c a r r i e d o u t a t 2 1 0 o n a 0 - 7 % s o l u t i o n o f h e v e i n i n0 - 2 m - N a C l a t p H 6 - 0 i n a S p i n c o m o d e l E u l t r a c e n t r i f u g e ,w i t h a n a r t i f i c i a l b o u n d a r y c e l l , a t 5 9 7 8 0 r e v . / m i n .O s m o m e t r y . T h e a p p a r a t u s u s e d w a s s i m i l a r t o t h a t o fA d a i r ( A l e x a n d e r & J o h n s o n , 1 9 4 9 ) . T o p r e v e n t d i f f u s i o n o fh e v e i n t h r o u g h t h e n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s t h e l a t t e rw e r e t r e a t e d w i t h a n 1 8 % g l y c e r o l s o l u t i o n i n w a t e r( A d a i r , 1 9 5 5 ) t o r e d u c e t h e i r s p e c i f i c p e r m e a b i l i t y . T h em o s t s u i t a b l e v a l u e f o r t h e l a t t e r w a s f o u n d t o b e 1 - 4 x 1 0 8c . g . s . u n i t s . E q u i l i b r i u m o s m o t i c p r e s s u r e s w e r e d e t e r m i n e da t 0 0 i n 0 - 2 M - N a C l a t p H 5 - 0 o v e r a r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n sw i t h r e c r y s t a l l i z e d h e v e i n . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s o l u -t i o n i n s i d e t h e membrane w a s d e t e r m i n e d b y u . v . a b -s o r p t i o n a f t e r t h e o s m o t i c p r e s s u r e h a d b e e n m e a s u r e d .

RESULTSThe p a p e r - e l e c t r o p h o r e s i s p a t t e m ( F i g . 1 ) a nd

t h e s e d i m e n t a t i o n diagram ( F i g . 2 ) o f c r y s t a l l i n eh e v e i n g i v e no i n d i c a t i o n t h a t more than onep r o t e i n compon en t i s p r e s e n t . The e l e m e n t a r y

o l . 7 5 2 3 7


3/5

B . L . ARCHERa n a l y s i s o f h e v e i n ( F o u n d : C , 4 6 - 0 ; H, 6 - 0 ; N , 1 5 - 7 ;S , 5 - 0 ; P < 0 - 0 0 6 ; a s h , 0 - 2 % ) i s n o t a b l e f o r t h eh i g h s u l p h u r c o n t e n t .R e a c t i o n s o f t h e p r o t e i n t o t h e M o l i s c h , B e n e d i c tand F e h l i n g t e s t s w e r e a l l n e g a t i v e , i n d i c a t i n g t h ea b s e n c e o f c a r b o h y d r a t e .Amino a c i d a n a l y s i s . The 1 5 a m i n o a c i d s d e -t e c t e d i n h e v e i n h y d r o l y s a t e by p a p e r c h r o m a t o -g r a p h y a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . No e v i d e n c e wasf o u n d f o r t h e p r e s e n c e o f i s o l e u c i n e , n o r l e u c i n e ,n o r v a l i n e , a s p a r a g i n e , o r n i t h i n e , p h e n y l a l a n i n e ,c y s t e i n e , m e t h i o n i n e , d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e o rh y d r o x y p r o l i n e , a n d t h e y a r e a s s u m e d t o b ea b s e n t .The t h i o l - t i t r a t i o n method was shown t o g i v ec o n s i s t e n t r e s u l t s w i t h ' t e r t . - d o d e c y l m e r c a p t a n 'o n s a m p l e s c o n t a i n i n g a s l i t t l e a s 5 0 u g . o f S . Withb o v i n e - s e r u m a l b u m i n t h e method g a v e 0 - 6 5 moleo f S H / m o l e o f a l b u m i n ( u n c o r r e c t e d f o r w a t e rc o n t e n t o f t h e p r o t e i n ) a s c o m p a r e d w i t h a v a l u e o fa p p r o x . 0 - 6 7 o b t a i n e d by H u g h e s ( 1 9 4 7 ) . W h e n6 m g . o f h e v e i n , c o n t a i n i n g 3 3 0 j i g . o f t o t a l S , wast i t r a t e d a z e r o e n d - p o i n t was o b t a i n e d . A s i m i l a rt i t r a t i o n w i t h s t a n d a r d m e r c u r i c c h l o r i d e s o l u t i o n

F i g . 1 . P a p e r e l e c t r o p h o r e s i s o f h e v e i n . E l e c t r o p h o r e s i sw a s c a r r i e d o u t f o r 1 6 h r . a t p H 8 - 6 i n 0 0 5 m - v e r o n a lb u f f e r .

i n s t e a d o f s i l v e r n i t r a t e g a v e t h e s a me r e s u l t . T h i sc o n f i r m s t h e a b s e n c e o f c y s t e i n e , a n d s i n c e m e t h i o -n i n e i s a l s o a b s e n t t h e w h o l e o f t h e S i n h e v e i nh a s b e e n a t t r i b u t e d t o c y s t i n e .A l l t h e f i g u r e s i n T a b l e 1 were o b t a i n e d f r o m t h ep a p e r - c h r o m a t o g r a p h i c m a x i m u m - d e n s i t y r e s u l t sw i t h t h e e x c e p t i o n o f c y s t i n e , t r y p t o p h a n andt y r o s i n e . The l a s t two were c a l c u l a t e d f r o m t h es p e c t r a l c u r v e s ( s e e b e l o w ) .U l t r a v i o l e t - a b s o r p t i o n s p e c t r a . F i g . 3 s h o w s t h es p e c t r a o f h e v e i n i n 0 - 0 5 N - s o d i u m h y d r o x i d e and i n0 - 0 5 w - h y d r o c h l o r i c a c i d . The c u r v e i n p u r e w a t e r i si n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h a t i n t h e a c i d medium.The a b s e n c e o f an i n f l e x i o n a t 2 5 7 - 5 m , . i n a q u e o u so r a c i d s o l u t i o n s c o r r o b o r a t e s t h e c h r o m a t o g r a p h i ce v i d e n c e t h a t p h e n y l a n i n e i s a b s e n t ( E l " . 2 5 - 6 i na q u e o u s s o l u t i o n f o r t h e main p e a k a t 2 8 0 m e ) .The p e r c e n t a g e s o f t r y p t o p h a n i n t h e h e v e i nm o l e c u l e , c a l c u l a t e d f r o m t h e s p e c t r a by t h e t h r e em e t h o d s r e f e r r e d t o i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ,w e r e 9 - 6 , 9 * 0 and 8 - 6 r e s p e c t i v e l y ; t h e c o r r e s p o n d -i n g v a l u e s f o r t y r o s i n e were 4 0 , 4 - 3 and 4 - 0 .

T a b l e 1 . Amino a c i d a n a l y s i s o f h e v e i n

A l a n i n eA r g i n i n eA s p a r t i c a c i dC y s t i n eG l u t a m i c a c i dG l y c i n eH i s t i d i n eL e u c i n eL y s i n eP r o l i n eS e r i n eT h r e o n i n eT r y p t o p h a nT y r o s i n eV a l i n e

P e r c e n t a g e( w / w ) o fr e s i d u e s1 . 1 -5 - 71 1 - 61 9 - 29 . 94 - 43 - 84 . 75 . 44 - 18 - 71 - 89 - 14 - 11 * 39 4 . 9

R e l a t i v ep r o p o r t i o n s o fa m i n o a c i dr e s i d u e s1 - 63 . 71 0 - 18 - 07 - 87 - 82 - 84 - 24 - 24 - 21 0 . 01 * 84 - 63 - 81 - 3

I n i t i a l A f t e r A f t e r A f t e rb o u n d a r y 6 5 m i n . 9 6 m i n . 1 2 8 m i n .F i g . 2 . U l t r a c e n t r i f u g a l a n a l y s i s o f h e v e i n a t 5 9 7 8 0 r e v . / m i n . w i t h a 0 7 % s o l u t i o n o f t h e p r o t e i ni n 0 . 2 N - N a C l a t p H 6 - 0 . S 1 * 1 9 x 1 0 - 1 3 .

2 3 8 1 9 6 0


4/5

7 5 CRYSTALLINE H EVEIN 2 3 9O 8 m o t i c p r e 8 8 u r e . E q u i l i b r i u m w a s r e a c h e d i nh e o s m o m e t e r i n a b o u t 1 2 d a y s , and by e x t r a -a p l o t o f 7 I c a g a i n s t c t o z e r o c o n c e n t r a t i o n ,v a l u e o f t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t i n 0 - 2 M -

c h l o r i d e a t pH 5 . 0 o f 1 0 5 0 0 was o b t a i n e d .I 8 o e l e c t r 2 c p o i n t . The pH a t w h i c h h e v e i n had t h em o b i l i t y a s d e x t r a n i n 0 - 0 2 M - s o d i u m a c e t a t ei n p a p e r - e l e c t r o p h o r e s i s e x p e r i m e n t s , was- 7 .S o l u b i l i t y . The s o l u b i l i t y o f p u r e h e v e i n i n w a t e rt 0 0 i s l e s s t h a n 1 % , b u t t h e s o l u b i l i t y i n c r e a s e si n t h e p r e s e n c e o f n e u t r a l s a l t s . The p r o t e i n

3 0

2 0

1 0

2 4 0 2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0W a v e l e n g t h ( m # )F i g . 3 . U l t r a v i o l e t - a b s o r p t i o n s p e c t r a o f h e v e i n:0 , i n 0 - 0 5 N - H C I ; x , i n O 0 - 5 N - N a O H .

F i g . 4 . P h o t o m i c r o g r a p h o f h v i e r x y s t a s .

c r y s t a l l i z e s r e a d i l y f r o m s a l t - f r e e c o l d w a t e r i n t h ef o r m o f h e x a g o n a l n e e d l e s ( F i g . 4 ) , w h i c h showb i r e f r i n g e n c e . I t i s a p p r e c i a b l y s o l u b l e i n am-mo nium s u l p h a t e s o l u t i o n s w h i c h a r e b e l o w s a t u r a -t i o n and i t s s o l u t i o n s a r e n o t c o a g u l a t e d by h e a t ,a l t h o u g h i t s s o l u b i l i t y i n s t r o n g a m m o n i u m s u l -p h a t e s o l u t i o n s i s l 6 w e r e d by t h i s t r e a t m e n t .

DISCUSSIONA s s u m i n g t h a t t h e n e a r e s t i n t e g e r s t o t h en u m b e r s i n t h e t h i r d c o l u m n o f T a b l e 1 r e p r e s e n tt h e n u m b e r s o f a m i n o a c i d r e s i d u e s i n t h e h e v e i nm o l e c u l e , a minimum m o l e c u l a r w e i g h t o f 9 5 1 2 i so b t a i n e d , w h i c h m a y b e c o m p a r e d w i t h t h e v a l u e so f 1 0 5 0 0 c a l c u l a t e d f r o m t h e o s m o t i c d a t a .I n r e s p e c t o f i t s h i g h s u l p h u r c o n t e n t and l o wm o l e c u l a r w e i g h t , h e v e i n r e s e m b l e s t h e t r y p s i n -

i n h i b i t i n g p r o t e i n f r o m l i m a b e a n s r e p o r t e d byF r a e n k e l - C o n r a t , B e a n , Ducay & O l c o t t ( 1 9 5 2 ) .The e l e c t r o p h o r e t i c and s o l u b i l i t y p r o p e r t i e s o fh e v e i n s u g g e s t t h a t t h i s p r o t e i n m a y b e i d e n t i c a lw i t h a p r o t e i n component ( n o . 4 ) i d e n t i f i e d byA r c h e r & S e k h a r ( 1 9 5 5 ) i n t h e a q u e o u s serum o fH e v e a b r a 8 i l i e n 8 i 8 l a t e x , and work i s i n p r o g r e s s t oe l u c i d a t e t h i s p o i n t . I t a l s o a p p e a r s t h a t h e v e i n i sl a r g e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e band d e s i g n a t e d com-p o n e n t ( v i i i ) by M o i r & T a t a ( 1 9 6 0 ) .

SUMMARY1 . A c r y s t a l l i n e p r o t e i n h a s b e e n i s o l a t e d f r o m

f r e s h r u b b e r l a t e x ( H e v e a b r a s i l i e n s 8 w ) , f o r w h i c ht h e name h e v e i n i s p r o p o s e d .2 . T h i s p r o t e i n c o n t a i n s 5 % o f s u l p h u r , h a s am o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 0 0 , a s e d i -m e n t a t i o n c o n s t a n t o f 1 - 1 9 s a t a c o n c e n t r a t i o n o f0 7 %, and E l % a t 2 8 0 m , u 2 5 - 6 .3 . H e v e i n c o n t a i n s 1 5 a m i n o a c i d s i n c l u d i n gc y s t i n e b u t n o c y s t e i n e o r m e t h i o n i n e .T h i s w o r k f o r m s p a r t o f a p r o g r a m m e o f r e s e a r c h u n d e r -t a k e n b y t h e B o a r d o f T h e B r i t i s h R u b b e r P r o d u c e r s 'R e s e a r c h A s s o c i a t i o n . T h e a u t h o r w i s h e s t o t h a n k t h eR u b b e r R e s e a r c h I n s t i t u t e o f M a l a y a f o r t h e l a t e x

m a t e r i a l s u s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n ; M r B . B o o n o fC a m b r i d g e U n i v e r s i t y f o r t h e u l t r a c e n t r i f u g a l m e a s u r e -m e n t s ; Dr A . I . M c M u l l e n f o r t h e o s m o t i c - p r e s s u r e d a t a a n dDr W. T . C h a m b e r s a n d Mr G . H i g g i n s f o r t h e a n a l y t i c a la n d s p e c t r a d a t a . M y t h a n k s a r e a l s o d u e t o Dr E . G .C o c k b a i n f o r many u s e f u l d i s c u s s i o n s a n d f o r h i s h e l p i n t h ep r e p a r a t i o n o f t h i s p a p e r , a n d f i n a l l y t o M r K . R . W h i t e f o rt e c h n i c a l a s s i s t a n c e .R E F E R E N C E S

A d a i r , G . S . ( 1 9 5 5 ) . B i o c h e m . J . 6 2 , 2 6 .A l e x a n d e r , A . E . & J o h n s o n , P . ( 1 9 4 9 ) . C o U o i d S c i e n c e ,v o l . 1 , p . 1 6 4 . O x f o r d : C l a r e n d o n P r e s s .A r c h e r , B . L . & S e k h a r , B . C . ( 1 9 5 5 ) . B i o c h e m . J . 6 1 , 5 0 3 .


5/5

2 4 0 B . L . A R C H E R 1 9 6 0B e a v e n , G . H . & H o l i d a y , E . R . ( 1 9 5 2 ) . A d v a n e . P r o t e i nC h e m . 7 , 3 6 9 .B e n c z e , W. L . & S c h m i d , K . ( 1 9 5 7 ) . A n a l y t . C h e m . 2 9 ,1 1 9 3 .B e n e s c h , R . & B e n e s c h , R . E . ( 1 9 4 8 ) . A r c h . B i o c h e m . 1 9 ,3 5 .C o o k , A . S . & S e k h a r , B . C . ( 1 9 5 3 ) . J . R u b b . R e 8 . I n s t .M a l a y a , 1 4 , 1 6 3 .D r a k e , M . P . , G i f f e e , J . W . , J o h n s o n , D . A . & K o e n i g , V . L .( 1 9 5 7 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 7 9 , 1 3 9 5 .F r a e n k e l - C o n r a t , H . , B e a n , R . C . , D u c a y , E . D . & O l c o t t ,H . S . ( 1 9 5 2 ) . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y 8 . 3 7 , 3 9 3 .G O o o d w i n , T . W. & M o r t o n , R . A . ( 1 9 4 6 ) . B i o c h e m . J . 4 0 ,6 2 8 .

H o m a n s , L . N . S . & v a n G i l s , G . E . ( 1 9 4 8 ) . P r o c . 2 n d R u b b .T e c h . C o n f . p . 2 9 2 .H u g h e s , W. L . j u n . ( 1 9 4 7 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 6 9 , 1 8 3 6 .K o l t h o f f , I . M . & H a r r i s , W . E . ( 1 9 4 6 ) . I n d u s t r . EnngChem.( A n a l . ) , 1 8 , 1 6 1 .K u n k e l , H . G . & T i s e l i u s , A . ( 1 9 5 1 ) . J . g e n . P h y 8 i o l . 3 5 , 8 9 .M c M u l l e n , A . I . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h e m . J . 7 2 , 5 4 5 .M o i r , G . F . J . & T a t a , S . J . ( 1 9 6 0 ) . J . R u b b . B e s . I n t .M a l a y a ( i n t h e P r e s s ) .R o l a n d , J . F . & G r o s s , A . M . ( 1 9 5 4 ) . A n a l y t . C h e m . 2 6 ,5 0 2 .W e i s e m a n , N . , S c h o e n b a c h , E . B . & A r m i s t e a d , E . B .( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 7 , 1 5 3 .W o o d , T . ( 1 9 5 6 ) . B i o c h e m . J . 6 2 , 6 1 1 .

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 0 ) 7 5 , 2 4 0Methods f o r M e a s u r i n g R a t e s o f S y n t h e s i s o f Albumin byt h e I s o l a t e d P e r f u s e d R a t L i v e r

BY A . H. GORDON AND J . H. HUMPHREYN a t i o n a l I n 8 t i t u t e f o r M e d i c a l R e 8 e a r c h , M i l l H i l l , L o n d o n , N.W. 7( R e c e i v e d 2 S e p t e m b e r 1 9 5 9 )

A l t h o u g h t h e a b i l i t y o f t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a tl i v e r t o s y n t h e s i z e p l a s m a p r o t e i n s was c l e a r l yd e m o n s t r a t e d i n 1 9 5 1 by M i l l e r , B l y , Watson &B a l e , f e w s u c h e x p e r i m e n t s h a v e s u b s e q u e n t l y b e e nr e p o r t e d . The p o t e n t i a l u s e o f t h i s s y s t e m f o rs t u d i e s on p r o t e i n s y n t h e s i s w a s , h o w e v e r , r e c o g -n i z e d b y J e n s e n & T a r v e r ( 1 9 5 6 ) . T h e s e a u t h o r sa d d e d 1 4 C - l a b e l l e d h i s t i d i n e a n d l y s i n e t o t h eb l o o d u s e d f o r p e r f u s i n g a l i v e r , and t h e n m e a s u r e dt h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e f r e e a m i n o a c i d s i n t h ep l a s m a a t r e g u l a r i n t e r v a l s . With t h e s e d a t a , and bym e a s u r i n g t h e c o r r e s p o n d i n g amounts o f t h e[ 1 4 C ] a m i n o a c i d w h i c h had become p r o t e i n - b o u n d ,t h e y w e r e a b l e t o c a l c u l a t e a r a t e o f p r o t e i ns y n t h e s i s .H o w e v e r , t h e i r m e a s u r e m e n t s o f t h e s p e c i f i ca c t i v i t i e s o f t h e f r e e a m i n o a c i d s i n t h e p l a s m a ,w h i c h w e r e o b t a i n e d by means o f t h e b a c t e r i a ld e c a r b o x y l a s e m e t h o d , ma y h a v e b e e n s u b j e c t t oc o n s i d e r a b l e e x p e r i m e n t a l e r r o r . F o r t h i s r e a s o n i ts e e m e d w o r t h w h i l e t o r e p e a t some o f t h e i r m e a s u r e -m e n t s w i t h t h e a i d o f a more a c c u r a t e e s t i m a t i o n f o rt h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e f r e e a m i n o a c i d s i n t h ep l a s m a .The r e s u l t s t h u s o b t a i n e d c o u l d b e c o m p a r e dw i t h t h e r a t e o f a l b u m i n s y n t h e s i s i n v i v o f o u n d byC a m p b e l l , C ut h b e r t s o n , M a t t h e w s & M c F a r l a n e( 1 9 5 6 ) . S i n c e i t s e e m e d p o s s i b l e t h a t t h e p e r f u s e dl i v e r ma y o n a v e r a g e s y n t h e s i z e a l b u m i n e i t h e rf a s t e r o r s l o w e r t h a n i t d o e s i n v i v o , i t s e e m e dd e s i r a b l e a l s o t o m e a s u r e a l b u m i n s y n t h e s i s

d i r e c t l y i n t h e p e r f u s i o n s y s t e m . To a c h i e v e t h i s ,i s o l a t i o n o f t h e n e w l y f o r m e d a l b u m i n was n e c e s -s a r y . Newly f o r m e d r a t a l b u m i n c a n n o t b e s e p a r -a t e d f r o m t h e r a t a l b u m i n i n i t i a l l y p r e s e n t i n t h es y s t e m when t h e p e r f u s i o n i s c o n d u c t e d w i t h r a tb l o o d . Thus t h e e x p e d i e n t o f p e r f u s i o n w i t h ah e t e r o l o g o u s b l o o d became n e c e s s a r y . H u m a nb l o o d f r o m w h i c h m o s t o f t h e w h i t e c e l l s andp l a t e l e t s had b e e n r e m o v e d p r o v e d s a t i s f a c t o r y f o rl i v e r p e r f u s i o n s and p e r m i t t e d t h e i s o l a t i o n o fn e w l y f o r m e d r a t a l b u m i n by means o f an a p p r o -p r i a t e a n t i s e r u m . A l t h o u g h s u c h a s y s t e m s u f f e r sf r o m c e r t a i n d i s a d v a n t a g e s m e n t i o n e d b e l o w , i t su s e h a s p e r m i t t e d d i r e c t c o m p a r i s o n b e t w e e n r a t e so f s y n t h e s i s o f a l b u m i n c a l c u l a t e d f r o m c h a n g e s i np l a s m a - a m i n o a c i d s p e c i f i c a c t i v i t y and f r o m t h eamount o f a l b u m i n o b t a i n e d by i s o l a t i o n i n t h esame e x p e r i m e n t .

METHODSP e r f u s i o n t e c h n i q u e . P e r f u s i o n s w e r e c a r r i e d o u t a sd e s c r i b e d b y C o h e n & G o r d o n ( 1 9 5 8 ) , e x c e p t f o r t h e u s e o fhuman b l o o d i n c e r t a i n c a s e s . C a r r i e r l y s i n e w a s u s e d i n a l le x p e r i m e n t s e x c e p t r a t - l i v e r p e r f u s i o n ( R L P ) 8 7 ( f o ra m o u n t s s e e T a b l e 1 ) . When human b l o o d w a s u s e d t h ew h i t e c e l l a n d p l a t e l e t l a y e r , w h i c h s e p a r a t e d f r o m t h eh e p a r i n i z e d b l o o d d u r i n g p r e l i m i n a r y c e n t r i f u g i n g a t1 8 0 0 g f o r 2 0 m i n . a t 2 0 0 , w a s r e m o v e d a s c o m p l e t e l y a sp o s s i b l e b y s u c t i o n a n d t h e p l a s m a w a s r e - m i x e d w i t h t h e

r e d c e l l s . W a r m R i n g e r ' s s o l u t i o n w a s a l l o w e d t o f l o wt h r o u g h t h e l i v e r f o r 1 - 2 m i n . b e f o r e i t s r e m o v a l f r o m t h e

characterization of hevein

Documents