8/7/2019 Cloning Finding 3

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V o l . 1 5 7 , N o . 1OURNAL O F B A C T E R I O L O G Y , J a n . 1 9 8 4 , p . 3 1 4 - 3 1 70 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 4 / 0 1 0 3 1 4 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t X 1 9 8 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

S h u t t l e V e c t o r s f o r C l o n i n g R e c o m b i n a n t DNA i n E s c h e r i c h i a c o l ia n d S t r e p t o m y c e s g r i s e o f u s c u s C 5 8 1J . L . LARSON AND C . L . HERSHBERGER*

E l i L i l l y & C o. , I nd i an ap o l i s , I n d i a n a 4 6 2 8 5R e c e i v e d 2 3 J u n e 1 9 8 3 / A c c e p t e d 7 O c t o b e r 1 9 8 3

T h e r e p l i c o n o f t h e S t r e p t o m y c e s p l a s m i d S C P 2 * was l o c a t e d on a 5 . 9 - k i l o b a s e E c o R I - S a l I r e s t r i c t i o nf r a g m e n t . T h e S C P 2 * r e p l i c o n was c o m b i n e d w i t h E s c h e r i c h i a c o l i p l a s m i d pBR322 a n d genes s p e c i f y i n gneomycin r e s i s t a n c e a n d t h i o s t r e p t o n r e s i s t a n c e i n s t r e p t o m y c e t e s t o c o n s t r u c t s h u t t l e vectors t h a t ar eu s e f u l f o r c l o n i n g i n E . c o l i a n d s t r e p t o m y c e t e s .

T h e s t r e p t o my c e t e p l a s m i d S C P 2 a n d i t s m u t a n t S C P 2 * ( 3 ,4 , 1 5 ) a r e 3 1 - k i l o b a s e ( k b ) ( 1 0 ) s e x f a c t o r s ( 3 ) w i t h o n e t o f i v ec o p i e s p e r c e l l ( 1 6 ) . T h e SCP2 s e q u e n ce c an b e s t a b l y c l o n e di n E s c h e r i c h i a c o l i ( 1 2 ) . S C P 2 * i s s u i t a b l e a s a c l o ni n g v e c t o ri n s t r e p t o m y c e t e s ( 2 ) . F u r t h e r d e v e l o p m e n t s o f S C P 2 * i n t ou s e f u l c l o n i n g v e c t o r s a r e d e s c r i b e d i n t h i s r e p o r t .( P o r t i o n s o f t h i s w o r k w e r e p r e s e n t e d a t t h e a n n u a lm e e t i n g o f t h e I n d i a n a b r a n c h o f t h e A m e r i c a n S o c i e t y o fM i c r o b i o l o g i s t s , 2 3 A p r i l 1 9 8 3 , C r a w f o r d s v i l l e , I n d . , a n d t h eE n g i n e e r i n g F o u n d a t i o n C o n f e r e n c e , 1 9 t o 2 4 S e p t e m b e r1 9 8 2 , S a n t a B a r b a r a , C a l i f . [ A n n . N . Y . A c a d . S c i . , i np r e s s ] . )E . c o l i K - 1 2 C 6 0 0 h s d R hsdM ( 1 1 ) ( d e s i g n a t e d E . c o l i ) w a su s e d t h r o u g h o u t . S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r M i 1 1 0 ( 5 ) w a s u s e dt o i s o l a t e p l a s m i d S C P 2 * ( 3 , 4 ) . M e t h o d s f o r g r o w t h , i s o l a -t i o n o f D NA, a n a l y s i s o f DNA, c o n s t r u c t i o n o f r e c o m b i n a n tp l a s m i d s , a n d t r a n s f o r m a t i o n h a v e b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s -l y ( 8 ; P . R . R o s t e c k , J r . , a n d C . L . H e r s h b e r g e r , G e n e[ A m s t e r d a m ] , i n p r e s s ) . P l a s m i d s w e r e i n i t i a l l y d e s g i n a t e dp J L ; h o w e v e r , pHJL w a s a p p r o v e d a s t h e o f f i c i a l d e s i g n a -t i o n b y t h e P l as m i d R ef e r e nc e C e n t e r .S t r e p t o m y c e s g r i s e o f u s c u s C 5 8 1 i s t h e p r e f e r r e d h o s t f o rt r a n s f o r m a t i o n a n d p r o p a g a t i o n o f t h e s t r e p t o m y c e t e p l a s -m i d s . I t w a s s e l e c t e d b e c a u s e i t g r o w s r a p i d l y , s p o r u l a t e sw e l l , a n d i s e a s i l y p r o t o p l a s t e d a n d r e g e n e r a t e d ( 1 ) . A d d i -t i o n a l l y , i t a p p e a r s t o b e n o n r e s t r i c t i n g ( K . C o x a n d R .B a l t z , m a n u s c r i p t i n p r e p a r a t i o n ) .A c o l l e c t i o n o f c h i m e r i c p l a s m i d s w a s c on s t r u ct e d w i t hd e l e t i o n s i n t h e S C P 2 * s e q u e n c e s o t h a t t h e s e g m e n t r e s p o n -s i b l e f o r s e l f - p r o p a g a t i o n i n s t r a i n C 5 8 1 c o u l d b e i d e n t i f i e d .Two c h i m e r i c p l a s m i d s , p H J L 1 2 0 a n d p H J L 1 2 1 , c o n t a i n e dt h e e n t i r e s e q u e n c e o f S C P 2 * . T h e y w e r e e i t h e r c o m p l e t e l yo r p a i t i a l l y d i g e s t e d w i t h r e s t r i c t i o n e n z y m e B g l I I , P s t I ,S a l l , S s t I , o r X o r l I , l i g a t e d u n d e r c o n d i t i o n s t h a t f a v o r e dc i r c u l a r i z a t i o n r a t h e r t h a n f o r m a t i o n o f r e c o m b i n a n t s ( 7 ) ,a n d t r a n s f o r m e d i n t o E . c o l i . E i g h t e e n i s o l a t e s w e r e r e t a i n e df o r f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s . A d d i t i o n a l d e l e t e d d e r i v a t i v e s o fS C P 2 * w e r e g e n e r a t e d b y s h o t g u n c l o n i n g o f P s t I f r a g m e n t sa n d BamHI f r a g m e n t s i n t o t h e P s t I s i t e o r t h e BamHI s i t e o fp B R 3 2 2 o r p B R 3 2 5 . R e s t r i c t i o n m a p s f o r t h e p l a s m i d d e r i v a -t i v e s a r e s u m m a r i z e d i n F i g . 1 .

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .3 1 4

F I G . 1 . R e s t r i c t i o n m a p s o f c h i m e r i c p l a s m i d s w i t h d e l e t i o n s i nS C P 2 * . T h e o u t e r c i r c l e i s t h e r e s t r i c t i o n map o f S C P 2 * . A i d e n t i f i e st h e p o s i t i o n w h e r e p B R 3 2 2 i s i n s e r t e d , a n d A i d e n t i f i e s t h e p o s i t i o nw h e r e p B R 3 2 5 i s i n s e r t e d . T h e p l a s m i d s c o n t a i n i n g p B R 3 2 2 wereg e n e r a t e d b y s h o t g u n c l o n i n g . T h e p l a s m i d s c o n t a i n i n g p B R 3 2 5w e r e g e n e r a t e d b y t h e d e l e t i o n o f p H J L 1 2 0 o r p H J L 1 2 1 o r b ys h o t g u n c l o n i n g . T h e a r c s , e x t r a p o l a t e d t o t h e o u t e r c i r c l e , d e f i n et h e p o r t i o n s o f S C P 2 * t h a t a r e p r e s e n t i n t h e d e l e t e d d e r i v a t i v e s .T h e d a s h e d a r c s i d e n t i f y a f a m i l y o f p l a s m i d s d e l e t e d t o d i f f e r e n tS a l l s i t e s . T h e l o c a t i o n s o f most o f t h e S a l l s i t e s h a v e n o t b e e na c c u r a t e l y d e t e r m i n e d on t h e r e s t r i c t i o n m a p . T h e K p n I s i t e a t c a .1 1 o ' c l o c k o n t h e map a c t u a l l y r e p r e s e n t s two K p n I s i t e s . T h e s c a l eo f t h e r e s t r i c t i o n map d o e s n o t a l l o w a c c u r a t e r e s o l u t i o n o f t h e twos i t e s . T h e o f f s e t l i n e b e t w e e n 1 2 a n d 1 o ' c i o c k on t h e r e s t r i c t i o n maps h o w s t h e o rd er o f f o u r r e s t r i c t i o n s i t e s i n S C P 2 * w h i c h a r e t o oc l o s e l y s p a c e d f o r a c c u r a t e r e s o l u t i o n on t h e s c a l e o f t h e r e s t r i c t i o nm a p . T h e i r a p p r o x i m a t e p o s i t i o n i s d e n o t e d b y a s i n g l e l i n e c r o s s i n gt h e c i r c l e .

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N O T E S 3 1 5A B

Bam H i P s t IC..D\ I Bam H IS a l I

Bam H IP s t IBam HIP s t I -S a l IX b a IK p n I S a I

Bam H

H I

/\ K p n I H i n d I I I P s t IBam H I P s t IF I G . 2 . R e s t r i c t i o n m a p s o f p H J L 1 9 0 , p H J L 1 9 1 , a n d p H J L 1 9 2 . T h e r e s t r i c t i o n m a p s o f p H J L 1 9 0 a n d p H J L 1 9 2 a r e i d e n t i c a l . T h e b r o a ds o l i d l i n e d e n o t e s t h e 5 . 9 - k b E c o R I - S a l I f r a g m e n t o f S C P 2 * . T h e b r o a d o p e n l i n e d e n o t e s t h e f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e a p h g e n e t h a t s p e c i f i e sn e o m y c i n r e s i s t a n c e i n s t r e p t o m y c e t e s . T h e b r o a d s t i p l e d l i n e d e n o t e s t h e s e g m e n t o f S C P 2 * w h i c h i s n o t e s s e n t i a l f o r r e p l i c a t i o n i ns t r e p t o m y c e t e s . T h e t h i n l i n e d e n o t e s t h e s e q u e n c e f r o m p B R 3 2 2 .

A l l o f t h e p l a s m i d s t h a t c o n t a i n e d t h e 5 . 9 - k b E c o R I - S a I lf r a g m e n t f r o m S C P 2 * c a u s e d t h e f o r m a t i o n o f p o c k s i n s t r a i nC 5 8 1 a n d c o u l d b e r e c o v e r e d a f t e r b a c k t r a n s f o r m a t i o n t o E .c o l i . p H J L 1 2 5 w a s g e n e r a t e d b y c o m p l e t e S a l l d i g e s t i o n o fp H J L 1 2 1 a n d w a s t h e s m a l l e s t p l a s m i d t h a t p r o p a g a t e d i nC 5 8 1 ( F i g . 1 ) . I t c o n t a i n s o n l y t h e 5 . 9 - k b E c o R I - S a l I f r a g -m e n t f r o m S C P 2 * . T h i s 5 . 9 - k b f r a g m e n t i s c o n t a i n e d w i t h i nt h e l a r g e r r e p l i c o n f r a g m e n t s i d e n t i f i e d p r e v i o u s l y ( 2 ) .P l a s m i d p F J 1 6 5 ( 1 3 ) w a s u s e d t o i n s e r t n e o m y c i n r e s i s t -a n c e i n t o d e r i v a t i v e s o f S C P 2 * . E c o R I - H i n d I I I f r a g m e n t s o fp F J 1 6 5 a n d p H J L 1 2 0 w e r e j o i n e d t o c o n s t r u c t p H J L 1 9 0 a n dp H J L 1 9 1 . B o t h p H J L 1 9 0 a n d p H J L 1 9 1 c o n t a i n e d t h e 7 . 7 - k bE c o R I - H i n d I I I f r a g m e n t f r o m p F J 1 6 5 . p H J L 1 9 0 c o n t a i n e dt h e 1 9 - k b E c o R I - H i n d I I I f r a g m e n t f r o m p H J L 1 2 0 , w h e r e a sp H J L 1 9 1 c o n t a i n e d t h e 1 2 - k b E c o R I - H i n d I I I f r a g m e n t f r o mp H J L 1 2 0 ( F i g . 2 ) . T r a n s f o r m a t i o n o f s t r a i n C 5 8 1 b yp H J L 1 9 0 r e s u l t e d i n t h e a p p e a r a n c e o f p o c k s w h i c h c o r r e l a t -e d t o n e o m y c i n - r e s i s t a n t g r o w t h ; h o w e v e r , p H J L 1 9 1 d i d n o ty i e l d t r a n s f o r m a n t s o f C 5 8 1 t h a t w e r e d e t e c t a b l e b y p o c k s o rn e o m y c i n r e s i s t a n c e .S t r a i n C 5 8 1 ( p H J L 1 9 0 ) g r e w o n m o d i f i e d R 2 m e d i u m s u p -p l e m e n t e d w i t h 1 . 0 j i g o f n e o m y c i n p e r m l a n d d i d n o t g r o wi n T r y p t i c a s e s o y b r o t h (BBL M i c r o b i ol o g y S y s t e ms ) w i t h1 . 0 , u g o f n e o m y c i n p e r m l . A s p o n t a n e o u s m u t a n t w i t hr e s i s t a n c e t o a n e l e v a t e d c on ce nt r a t i o n o f n e o m y c i n w a ss e l e c t e d b y s p r e a d i n g C 5 8 1 ( p H J L 1 9 0 ) o n m o d i f i e d R 2 m e d i -um c o n t a i n i n g 1 0 . 0 , u g o f n e o m y c i n p e r m l . A l s o , t h e m u t a n tg r e w i n T r y p t i c a s e s o y b r o t h c o n t a i n i n g 1 . 0 j i g o f n e o m y c i np e r m l . A l l p h e n o t y p i c t r a i t s o f t h i s m u t a n t e x c e p t t h e l e v e lo f r e s i s t a n c e t o n e o m y c i n w e r e i d e n t i c a l t o t h e p h e n o t y p e si m p a r t e d b y p H J L 1 9 0 . T h e p l a s m i d i s o l a t e d f r o m t h i s m u t a n tw a s t r a n s f o r m e d i n t o v i r g i n C 5 8 1 a n d y i e l d e d t r a n s f o r m a n t st h a t w e r e r e s i s t a n t t o n e o m y c i n a t t h e e l e v a t e d l e v e l o f 1 0j i g / m l . T h i s new p l a s m i d , p H J L 1 9 2 , h a s t h e same r e s t r i c t i o nmap a s p H J L 1 9 0 ( F i g . 2 ) .Two p l a s m i d s w e r e c o n s t r u c t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h em u t a t i o n o c c u r r e d i n t h e f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e a p h g e n ew h i c h s p e c i f i e s n e o m y c i n r e s i s t a n c e i n s t r e p t o m y c e t e s ( 1 7 ,1 8 ) . T h e 5 . 9 - k b E c o R I - S a l I f r a g m e n t f r o m p H J L 1 2 5 w a sj o i n e d t o c o r r e s p o n d i n g 6 . 7 - k b E c o R I - p a r t i a l S a l l f r a g m e n t sc o n t a i n i n g t h e a p h g e n e a n d m o s t o f t h e s e q u e n c e o f p B R 3 2 2f r o m p H J L 1 9 2 a n d p F J 1 6 5 . R e s t r i c t i o n m a p s o f p H J L 1 9 5c o n t a i n i n g t h e s a m e a p h a l l e l e a s p H J L 1 9 0 a n d r e s t r i c t i o n

maps o f p H J L 1 9 6 c o n t a i n i n g t h e a p h a l l e l e f r o m p H J L 1 9 2were i d e n t i c a l ( F i g . 3 ) . B o t h p H J L 1 9 5 a n d p H J L 1 9 6 c a u s e dt h e f o r m a t i o n o f p o c k s i n s t r a i n C 5 8 1 w h i c h c o r r e s p o n d e d t on e o m y c i n - r e s i s t a n t g r o w t h o n 1 . 0 j i g o f n e o m y c i n p e r m l .C 5 8 1 ( p H J L 1 9 6 ) g r e w o n m o d i f i e d R 2 medium c o n t a i n i n g 1 0, u g o f n e o m y c i n p e r m l a n d i n T r y p t i c as e s o y b r o t h c o n t a i n -i n g 1 . 0 p . g o f n e o m y c i n p e r m l ; h o w e v e r , C 5 8 1 ( p H J L 1 9 5 ) d i dn o t g r o w i n T r y p t i c a s e s o y b r o t h c o n t a i n i n g n e o m y c i n a n dd i d n o t g r o w o n m o d i f i e d R 2 medium w i t h 1 0 , u g o f n e o m y c i np e r m l .T h e 1 . 0 - k b B c I l f r a g m e n t o f p F J 1 0 5 ( 1 3 ) c o n t a i n i n g t h e t s rg e n e w h i c h s p e c i f i e s r e s i s t a n c e t o t h i o s t r e p t o n i n s t r e p t o m y -c e t e s ( 1 7 , 1 8 ) w a s c l o n e d i n t o p H J L 1 9 6 w h i c h h a d b e e np a r t i a l l y d i g e s t e d w i t h BamHI a n d s e p a r a t e d b y a g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s t o i s o l a t e f u l l - l e n g t h l i n e a r m o l e c u l e s . Two

P s t I E c o R II

S a l IBam H I -P s t I I #sKpn3 s t ' I / I S a l IS a l I Kpn IX b a IF I G . 3 . R e s t r i c t i o n m a p s o f p H J L 1 9 5 a n d p H J L 1 9 6 . T h e r e s t r i c -t i o n m a p s o f p H J L 1 9 5 a n d p H J L 1 9 6 a r e i d e n t i c a l . T h e b r o a d s o l i dl i n e d e n o t e s t h e 5 . 9 - k b E c o R I - S a I l f r a g m e n t f r o m S C P 2 * . T h e b r o a do p e n l i n e r e p r e s e n t s t h e f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e a p h g e n e w h i c hs p e c i f i e s n e o m y c i n r e s i s t a n c e i n s t r e p t o m y c e t e s . T h e t h i n l i n er e p r e s e n t s t h e s e q u e n c e f r o m p B R 3 2 2 .VOL. 1 5 7 , 1 9 8 4

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3 1 6 N OTESA B

I

BcII\~ SalIP s t I PIl\ IBam H I S a I XbaI

S a l IBam H I / B c l I- K p n I S a l I/B a r n I / B c l I

F I G . 4 . R e s t r i c t i o n maps o f p H J L 1 9 7 a n d p H J L 1 9 8 . T h e B c l l f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e t s r gene h a s o p p o s i t e o r i e n t a t i o n s i n pHJL197 a n dp H J L 1 9 8 ; o t h e r w i s e , t h e r e s t r i c t i o n maps ar e i d e n t i c a l . T h e b r o a d s o l i d l i n e d e n o t e s t h e 5 . 9 - k b E c o R I - S a l I f r a g m e n t f r o m S C P 2 * . Th e b r o a dopen l i n e d e n o t e s t h e f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e a p h gene w h i c h s p e c i f i e s n e o m y c i n r e s i s t a n c e i n s t r e p t o m y c e t e s . Th e b r o a d s t r i p e d l i n e d e n o t e st h e f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e t s r gene w h i c h s p e c i f i e s r e s i s t a n c e t o t h i o s t r e p t o n i n s t r e p t o m y c e t e s . Th e t h i n l i n e d e n o t e s t h e sequence f r o mpBR322.

p l a s m i d s , p H J L 1 9 7 a n d p H J L 1 9 8 , were i s o l a t e d . R e s t r i c t i o nmaps o f p H J L 1 9 7 a n d pHJL198 were i d e n t i c a l except t h a tt h e y c o n t a i n e d r e c i p r o c a l o r i e n t a t i o n s o f t h e f r a g m e n t w i t ht h e t s r gene ( F i g . 4 ) .C o m p a r a b l e t r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c i e s ( 1 . 2 x 1 0 6 per , u g )a n d c l o n i n g e f f i c i e n c i e s ( 3 x 1 0 3 t o 1 0 x 1 0 3 r e c o m b i n a n t sper pg o f v e c t o r ) were o b t a i n e d i n b o t h E . c o l i a n d s t r a i nC 5 8 1 w h e n p H J L 1 9 7 was i s o l a t e d f r o m e i t h e r s p e c i e s . T h e s es h u t t l e v e c t o r s a l l o w t r a n s f e r o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d s i n t oE . c o l i f r o m w h i c h l a r g e q u a n t i t i e s o f t h e DNA ca n b ei s o l a t e d e a s i l y a n d c l o n i n g o f S t r e p t o m y c e s genes i n C 5 8 1w h o s e e x p r e s s i o n can b e a n a l y z e d . T h e s e v e c t o r s can b es h u t t l e d b e t w e e n t h e h o s t s w i t h o u t any d e t e c t a b l e d e l e t i o n sor r e a r r a n g e m e n t s .

T h e p a r e n t a l p l a s m i d c o n t a i n s a l o w - c o p y - n u m b e r r e p l i -con ( 1 6 ) . T h e copy n u m b e r s o f p H J L 1 9 7 a n d p H J L 1 9 8 weren o t m e a s u r e d d i r e c t l y ; h o w e v e r , t h e y i e l d s o f p l a s m i d s seenb y e l e c t r o p h o r e s i s o f w h o le -c el l l y s a t e s a n d b y i s o l a t i o n o fc o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r DNA i n d i c a t e d t h a t t h e l o w copyn u m b e r was p r e s e r v e d . T h e l o w copy n u m b e r may b e ani m p o r t a n t f e a t u r e i f t h e v e c t o r s ar e u s e d t o c l o n e genes t h a ts p e c i f y s y n t h e s i s o f p r o d u c t s , s u c h as a n t i b i o t i c s , w h i c h mayb e t o x i c i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s t o t h e p r o d u c i n g o r g a n i s m s .p H J L 1 9 7 a n d p H J L 1 9 8 c o n t a i n f o u r s i n g l e r e s t r i c t i o n s i t e s( E c o R I , X b a I , BamHI, a n d C l a I ) t h a t s h o u l d b e u s e f u l f ori n s e r t i n g DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . C l o n i n g i n t o t h e C l a Is i t e s h o u l d i n s e r t i o n a l l y i n a c t i v a t e t h i o s t r e p t o n r e s i s t a n c e ( 6 ,9 ) , a n d c l o n i n g i n t o t h e BamHI s i t e i n s e r t i o n a l l y i n a c t i v a t e dn e o m y c i n r e s i s t a n c e as was e x p e c t e d ( 6 , 9 ) . Th e BamHI s i t es h o u l d b e p a r t i c u l a r l y u s e f u l f o r c o n s t r u c t i n g r e c o m b i n a n tp l a s m i d s b e c a u s e i t can a c c e p t f r a g m e n t s t h a t ar e p r o d u c e dw i t h BamHI, B c l I , B g l I I , M b o I , S a u 3 A , a n d X h o I I ( 1 4 ) .

We t h a n k R . H . B a l t z f o r e x t e nd i ng p e rm i ss i on t o c i t e h i su n p u b l i s h e d c h a r a c t e r i z a t i o n o f S . g r i s e o f u s c u s , D a v i d Hopwoodf o r p r o v i d i n g S . c o e l i c o l o r M110 a n d h e l p f u l d i s c u s s i o n s d u r i n g t h i sp r o j e c t , D . J . L y d i a t e f o r t h e i n f o r m a t i o n t h a t t h e 1 1 - o ' c l o c k r e g i o no f t h e S C P 2 * r e s t r i c t i o n map ( F i g . 1 ) c o n t a i n s two c l o s e l y s p a c e dK p n I s i t e s , J e f f F a y e r m a n f o r p l a s m i d s p F J 1 0 5 a n d p F J 1 6 5 , a n dL o r i e H e n e g h a n f o r t y p i n g t h e m a n u s c r i p t .

LITERATURE CITED1 . B a l t z , R . H . , a n d P . M a t s u s h i m a . 1 9 8 1 . P r o t o p l a s t f u s i o n i nS t r e p t o m y c e s : c o n d i t i o n s f o r e f f i c i e n t g e n e t i c r e c o m b i n a t i o na n d c e l l r e g e n e r a t i o n . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 2 7 : 1 3 7 - 1 4 6 .2 . B i b b , M . , J . L . S c h o t t e l , a n d S . N . C o h e n . 1 9 8 0 . A DNA c l o n i n g

s y s t e m f o r i n t e r s p e c i e s gene t r a n s f e r i n a n t i b i o t i c - p r o d u c i n gS t r e p t o m y c e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 4 : 5 2 6 - 5 3 1 .3 . B i b b , M. J. , R . F . F r e em a n , a n d D . A . H o p w o o d . 1 9 7 7 . P h y s i c a la n d g e n e t i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f a s e c o n d sex f a c t o r , S C P 2 , f o rS t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3 ( 2 ) . M o l . G e n . G e n e t . 1 5 4 : 1 5 5 - 1 6 6 .4 . B i b b , M. J . , a n d D . A . H o p w o o d . 1 9 8 1 . G e n e t i c s t u d i e s o f t h ef e r t i l i t y p l a s m i d SCP2 a n d i t s S C P 2 * v a r i a n t s i n S t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r A 3 ( 2 ) . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 2 6 : 4 2 7 - 4 4 2 .5 . B i b b , M. J . , J . M. W a r d , T . K i e s e r , S . N . C o h e n , a n d D . A .H o p w o o d . 1 9 8 1 . E x c i s i o n o f c h r o m o s o m a l DNA sequences f r o mS t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r f o r m s a n o v e l f a m i l y o f p l a s m i d s d e -t e c t a b l e i n S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s . M o l . G e n . G e n e t . 1 8 4 : 2 3 0 -2 4 0 .6 . C h a t e r , K . F . , D . A . H o p w o o d , T . K i e s e r , a n d C . J . T h o m p s o n .1 9 8 2 . G e n e c l o n i n g i n S t r e p t o m y c e s . C u r r . T o p . M i c r o b i o l .I m m u n . 9 6 : 6 9 - 9 5 .7 . D u g a i c z y k , A . , H . W. B o y e r , a n d H . M . G o o d m a n . 1 9 7 5 .L i g a t i o n o f E c o R I e n d o n u c l e a s e - g e n e r a t e d DNA f r a g m e n t s i n t ol i n e a r a n d c i r c u l a r s t r u c t u r e s . J . M o l . B i o l . 9 6 : 1 7 1 - 1 8 4 .8 . F i s h m a n , S . E . , a n d C . L . H e r s h b e r g e r . 1 9 8 3 . A m p l i f i e d DNA i nS t r e p t o m y c e s f r a d i a e . J . B a c t e r i o l . 1 5 5 : 4 5 9 - 4 6 6 .9 . H o p w o o d , D . A . , a n d K . F . C h a t e r . 1 9 8 2 . C l o n i n g i n S t r e p t o m y -ces: s y s t e m s a n d s t r a t e g i e s , p . 1 1 9 - 1 4 5 . I n J . K . S e t l o w a n d A .H o l l a e n d e r ( e d . ) , G e n e t i c e n g i n e e r i n g : p r i n c i p l e s a n d m e t h o d s ,v o l . 4 . P l e n u m P u bl i s hi n g C or p . , N ew Y o r k .1 0 . K i r b y , R . , a n d S . W o t t o n . 1 9 7 9 . R e s t r i c t i o n s t u d i e s on t h e S C P 2p l a s m i d o f S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3 ( 2 ) . FEMS M i c r o b i o l .L e t t . 6 : 3 2 1 - 3 2 3 .1 1 . M e s e l s o n , M . , a n d R . Y u a n . 1 9 6 8 . DNA r e s t r i c t i o n enzyme f r o mE . c o l i . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 1 7 : 1 1 1 0 - 1 1 1 4 .1 2 . P i r u z y a n , E . S . , A . V . V e t o s h k i n , N . S . K o b e t s , a n d I . A .S l a d k o v a . 1 9 8 2 . C l o n i n g o f f r a g m e n t s o f S t r e p t o m y c e s c o e l i c o -l o r - A 3 ( 2 ) S C 2 - p l a s m i d i n E s c h e r i c h i a c o l i c e l l s . G e n e t i k a1 8 : 1 8 1 1 - 1 8 1 6 .1 3 . R i c h a r d s o n , M. A . , J . A . M a b e , N . E . B e e r m a n , W. M. N a k a t s u -k a s a , a n d J . T . F a y e r m a n . 1 9 8 2 . D e v e l o p m e n t o f c l o n i n g v e h i -c l e s f r o m t h e S t r e p t o m y c es p l a s m i d p F J 1 0 3 . Gene ( A m s t e r d a m )2 0 : 4 5 1 - 4 5 7 .1 4 . R o b e r t s , R . J . 1 9 8 2 . R e s t r i c t i o n a n d m o d i f i c a t i o n enzymes andt h e i r r e c o g n i t i o n sequences. N u c l e i c A c i d s R e s . 1 0 : r 1 1 7 - r 1 4 4 .1 5 . S c h r e m p f , H . , H . B u j a r d , D . A . H o p w o o d , a n d W. G o e b e l . 1 9 7 5 .

K p n I

J . B A C T E R I O L .

8/7/2019 Cloning Finding 3

4/4

V O L . 1 5 7 , 1 9 8 4 N O T E S 3 1 7I s o l a t i o n o f c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r d e o x y r i b o n u c l e i c a c i df r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3 ( 2 ) . J . B a c t e r i o l . 1 2 1 : 4 1 6 - 4 2 1 .1 6 . S c h r e m p f , H . , a n d W. G o e b e l . 1 9 7 7 . C h a r a c t e r i z a t i o n s o f ap l a s m i d f r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3 ( 2 ) . J . B a c t e r i o l .1 3 1 : 2 5 1 - 2 5 8 .1 7 . T h o m p s o n , C . J . , T . K i e s e r , J . M. W a r d , a n d D . A . H o p w o o d .

1 9 8 2 . P h y s i c a l a n a l y s i s o f a n t i b i o t i c - r e s i s t a n c e g e n e s f r o mS t r e p t o m y c e s a n d t h e i r u s e i n v e c t o r c o n s t r u c t i o n . ( A m s t e r d a m )G e n e 2 0 : 5 1 - 6 2 .1 8 . T h o m p s o n , C . J . , J . M. W a r d , a n d D . A . H o p w o o d . 1 9 8 0 . DNAc l o n i n g i n S t r e p t o m y c e s : r e s i s t a n c e g e n e s f r o m a n t i b i o t i c - p r o -d u c i n g s p e c i e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 6 : 5 2 5 - 5 2 7 .