Colored De Bruijn Graphs

Marcos Castro

De novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn Graphs1

“Variantes genéticas e HTS

“Abordagem tradicional:

mapear os reads para um genoma de referência.

“Limitação 1: a amostra pode conter

sequência faltante.

“Limitação 2: sequências referências

incompletas.

“Limitação 3: reads de regiões faltantes frequentemente mapeiam para regiões parálogas levando a falsos variant calls.

“Limitação 4: amostras em estudo

podem não ter uma referência disponível ou adequada.

“Limitação 5: os métodos não

determinam a exata localização/tamanho de variantes.

“Limitação 6: focam em um único tipo de variante, isso pode levar a erros.

“Algumas limitações podem ser

resolvidas com de novo assembly.

Exemplo: tipo de variante

De novo assembly também possui limitações.

“Métodos de montagem tem ignorado informação pré-existente de variantes conhecidas ou sequência referência.

“Objetivo desse artigo: detectar e

caracterizar variações genéticas em um ou mais indivíduos.

“Os algoritmos propostos fazem uso de

Grafos De Bruijn (DBG).

Acrescentam ao DBG clássico coloração dos nós e arestas por amostras que

estão sendo observadas.

“Leva em conta informações das

amostras: uma ou mais sequências referências e variantes conhecidas.

“O método também é capaz de detectar

variação em espéces sem uma referência, combinando informações

através de vários indivíduos para melhorar a acurácia.

“Nome da aplicação desenvolvida:

Cortex.

Site:http://cortexassembler.sourceforge.net

“DBG’s representam informação

sobreposta.

Muito utilizados em montagem de genoma. Exemplos: Velvet, Abyss etc.

“O grafo consiste de um conjunto de nós representando palavras de tamanho K.

Essas palavras são k-mers.

K-mers são substrings!

“Arestas direcionadas juntam os k-mers.

“Variações entre genomas geram novos

nós e arestas.

“Exemplo: ACT, k = 2

K-mers: AC, CT

AC CTACT

nóaresta

nó

“O grafo pode apresentar estruturas

conhecidas.

Exemplo: bolhas.

“Bolha:

“Um DBG colorido generaliza a formulação original para várias

amostras.

A identidade de cada amostra é mantida pela coloração dos nós.

“Alguns algoritmos para descoberta de

variantes e genotipagem:

1) Bubble-calling2) Path divergence

“Bubble-calling: método mais simples para identificar bolhas em um único

indivíduo diplóide.

“A abordagem bubble-calling pode ter uma alta taxa de falsos positivos que

pode ser melhorado com a inclusão de um genoma de referência.

“Esses falsos positivos são causadas

pela dificuldade de separar bolhas de repetição e de variação.

“

Descoberta de variante em um único indivíduo diploide.A referência está em vermelho.

“Resumindo: polimorfismos verdadeiros

geram bolhas que divergem da referência, enquanto que estruturas de

repetição levam a bolhas também observadas na referência.

“O que temos é um genoma de

referência auxiliando na detecção de variantes.

“Todos os tipos de variantes podem

induzir bolhas.

“Para variantes complexas (grandes

deleções, novas inserções, inversões) pode ser difícil gerar um contig limpo.

“PD algorithm pode aumentar

substancialmente a capacidade de detectar varitantes.

“Caso simples: amostras são combinadas numa única cor.

“Mantendo cores separadas para cada

amostra , tem-se a informação adicional sobre se uma bolha é

induzida por repetições ou erros.

“Quando é induzida por repetições,

muitas ou todas as amostras apresentam cobertura de ambos os

caminhos na bolha.

“

Várias amostras (cada uma com um cor diferente).

Cobertura normal,nenhuma variânciaentre amostras.

“

Bolhas de repetição: ambos os lados da bolha estãopresentes em todas as amostras.

“Portanto, pode ser descoberta variante

mesmo em espécies onde não há nenhuma referência adequada.

“Tem-se desenvolvidos métodos

estatísticos que permitem a classificação probabilística de

estruturas de bolhas decorrentes de erros, repetições ou variantes.

“Se tiver um genoma de referência, essa

abordagem pode ajudar a distinguir variantes verdadeiras de erros e

estruturas de repetição.

“DBG coloridos podem ser usados para genotipar amostras em loci conhecida

mesmo quando a cobertura é insuficiente.

“

Em azul temos a cobertura (insuficiente).Os alelos estão em vermelho e verde.

“Foi construído um DBG colorido da

sequência referência, variantes alélicas conhecidas e dados a partir da

amostra.

“Cortex é um assembler eficiente do

ponto de vista de memória.

Ele constrói e representa um DBG colorido. Realiza variant calling e

genotipagem de dados HTS.

“Foi utilizada uma eficiente hash table que codifica implicitamente o grafo.

O uso de memória é previamente especificado de acordo com uma

fórmula.

“Várias operações tem complexidade

linear ou melhor.

“K-mers e seus complementos reversos

são armazenados em um único nó.

“Valor da hash table é um array de

inteiros representando a cobertura de cada cor.

“Para cada k-mer, uma flag binária é usada para cada nucleotídeo para

verificar se uma determinada aresta está presente.

“É o único assembler capaz de lidar com

vários eucariotos simultaneamente.

Exemplo: 10 seres humanos utiliza menos de 256GB de RAM.

“Exemplo de K: 75

(teste com dados de humanos)

“O aumento do K (tamanho do k-mer)

aumenta a probabilidade de um k-mer conter um erro.

“O tamanho do k-mer maximiza a sensibilidade do BC algorithm.

“Exemplo: com cobertura 50x, K = 65 e 100bp reads, foi identificado 86% dos

SNPs de 92% possíveis.

“O Cortex se utiliza de DBG colorido

para representar informações de várias fontes e abordagens estatísticas para detectar variantes de diferentes tipos.

“Um implementação eficiente do DBG colorido permite a utilização de dados

de várias amostras bem como sequências de referências e variantes

conhecidas.

Todos são incluídos numa única estrutura de grafo. A identidade da amostra é preservada com o uso de

cores.

“Essa abordagem permite a análise

simultânea de vários genomas.

Isso pode ser poderoso para detectar variantes precisas sem qualquer necessidade de um genoma de

referência.

“É possível a análise HTS de variações

genéticas em qualquer espécie.

“A abordagem também possui

limitações.

“Limitação 1: não foi usada informação read-pair para melhorar a montagem

local.

“Limitação 2: explosão do grafo quando

mais indivíduos são incluídos.

“Limitação 3: aumenta necessidade de

correção de erro quando o k-mer aumenta.

Succint Colored de Bruijn Graphs2

“DBG colorido foi introduzido em 2012.

Objetivo: detectar e genotipar variantes genéticas simples e complexas em um

indivíduo ou população.

“Relembrando o DBG clássico:

1) Conjunto de strings (sequence reads)

2) Vértice para cada (k-1)-mer.3) Aresta para cada k-mer com (k-1)-

mer prefixo e (k-1)-mer sufixo.

“Um contig é um caminho sem

ramificação.

“A aresta em um DBG colorido é o

mesmo do DBG clássico.

“A diferença: cada vértice ((k-1)-mer) e aresta (k-mer) estão associados a uma

lista de cores correspondendo as amostras.

“Dado um conjunto de n amostras,

existe um conjunto C de n cores: c[1], c[2], c[3], …, c[n] onde c[i] corresponde a amostra i e todos os k-mers e (k-1)-mers que estão contidos na amostra i

são coloridos com c[i].

“Uma bolha no grafo corresponde a um ciclo direcionado e é considerada um

indicativo de variação biológica.

“Essas cores permitem que não perder o

controle dos indivíduos dos quais os kmers foram originados.

“Relembrando: o Cortex utiliza DBG

colorido para montar vários genomas simultaneamente, por isso é importante

o uso das cores para manter um controle.

“Nesse artigo foi desenvolvida uma estrutura de dados eficiente para o

armazenamento e uso do DBG colorido.

“Comparado ao Cortex, essa estrutura

reduz dramaticamente a quantidade de memória para armazenar e utilizar o DBG colorido com alguma penalidade

de execução.

“Método VARI - 2016

“

Datasets, números de cores, k-mers etc.foram removidos para eu poder colocar no slide...

“Resumindo: Cortex ganha em tempo de execução e o VARI ganha em eficiência

de memória.

Voltando ao Cortex...3

“A detecção de variantes genéticas

entre amostras quando não há uma sequência referência introduz desafios.

“A acurácia do variant calling pode ser

melhorada adicionando uma sequência referência.

“Existem várias abordagens para o variant calling: bubble calling, path

divergence, multiple-sample analysis, genotyping.

“Algoritmo Bubble Calling

“Lembrando:

1) Bolhas podem ser induzidas por variantes, repetições ou erros de

sequenciamento.2) Variantes podem ser separadas de

repetições por inclusão da referência.

“Alguns conceitos importantes para a

compreensão do algoritmo...

“1) Nó: representa um k-mer (string de tamanho K restrita ao alfabeto A, C, T,

G).

“2) Supernode: caminho de

comprimento máximo com restrição que somente o primeiro/último nós do

caminho podem ter grau de entrada/saída != 1.

“3) Bubble: é um par de supernodes que

tem os mesmos nós de início e fim.

“4) Branch: cada um dos supernodes

constituindo uma bolha.

“5) Tip: um pequeno caminho que

termina em um nó com grau de saída 0.

“5) Confounded: uma variante que se

sobrepõem com outras partes do genoma (ou com ela própria)

impedindo que se forma uma bolha limpa.

“O algoritmo Bubble Caller foi implementado como um percurso de

uma hash table.

O tempo de acesso numa hash é constante, portanto, o caminho tem um

custo proporcional ao tamanho da tabela.

“

“n é um nó do grafo de bruijn

“G é o grafo de bruijn

“todo o grafo é coberto

“se estamos diante de uma

nova bifurcação...

“marca o nó como visitado

“obtém as arestas de saída

“obtém os supernodes

“marca os supernodes

como visitados

“se os dois supernodes seencontram no mesmo nóe na mesma orientação,então temos uma bolha

“Path Divergence Caller Algorithm

“

Vermelho: alelo de referência.Azul: o indivíduo

“

Mesmo quando não se forma uma bolha limpa, pode-se descobrir variantes através da divergência

do caminho de referência.

“

Ao encontrar um breakpoint (verde), pega-se o contigmais longo da amostra

(exemplo: caminho até o próximo cruzamento).

“

O azul pontilhado é uma sequência de repetição dentrodo alelo de referência presente em outro local

dentro do genoma da amostra.

o algoritmonão é afetado

“Algoritmo de Genotipagem

Tem-se um grafo com uma cor para cada alelo conhecido, uma cor para o genoma de referência e uma cor para

amostra.

“Algoritmo de Genotipagem

Tem-se um grafo com uma cor para cada alelo conhecido, uma cor para o genoma de referência e uma cor para

amostra.

Referências

■ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3272472/■ http://biorxiv.org/content/biorxiv/early/2016/02/18/040071.f

ull.pdf