Resultaten TRIDENT-studie

Diane Van Opstal,

Laboratorium Specialist Klinische Genetica

Symposium 23 mei 2016

Stichting Prenatale Screening Zuidwest

Nederland

1 april 2014: start of NIPT in the Netherlands (until 2016) (all UMCs participate)

Trident Trial by Dutch laboratories for Evaluation of Non-invasive prenatal Testing

Patients:

-increased risk of trisomy > 1/200 based on abnormal first trimester screening

-medical indication

choice of NIPT or invasive testing (chorionic villi or amniocentesis)

Aim:

1.To study how NIPT can best be implemented in the Netherlands next to other

prenatal screening programs (FTS, US)

2. To study the performance of the test: which factors influence the performance

3. To study the choices pregnant couples make after aFTS results

TRIDENT

Het begin

“Fetus-derived Y sequences were detected in 24 (80%) of the 30 maternal

plasma samples………. may have implications for non-invasive prenatal

diagnosis…………”

-NIPT with fetal cells: expensive and time-consuming

-presence of tumour DNA in plasma of cancer patient

(cf)-DNA in maternal blood is partially fetal

Fetal fraction: (Wang et al., 2013, Prenat Diagn, 33,

662–666)

mean 10,2 % at 10 wks

in 2% < 4% FF

4% is theoretical cut-off value

(<->Fiorentino et al., 2016, Prenat Diagn: 2%)

Half-life very short

Uniformely distributed over the whole

genome

Gestational age

BMI

Fetal aneuploidy

Factors that influence the fetal fraction

Wang et al., 2013, Prenat Diagn, 33, 662–666) Taglauer et al., 2014, Placenta, 28, S64-S68)

1 april-1 september 2014:

1413/23232 (6%) afwijkende CT

1211 (85.7%) + 179 medical indication kozen voor NIPT:

N=1390

1386 resultaat (99.7%) (6x na herhaalde bloedafname (0.4%))

Gemiddelde TAT= 11 dagen

37/38 (97.4%) trisomies 21 (29/30), 18 (4/4) or 13 (4/4) (0.1%)

5 vals positieven (0.4%) (2x +21, 1x +18 en 2x +13)

reductie invasieve testen geschat op 62%

Submitted to Prenat Diagn

Resultaten TRIDENT: trisomie 13, 18, 21

Chromosome

aberration

sensitiviteit specificiteit PPV NPV

Trisomy 21

96.7% 99.9% 93.5% 99.9%

Trisomy 13

100% 99.9%

66.7% 100%

Trisomy 18

100% 99.9%

80% 100%

Performance NIPT

In 2/8 centra (G/U) alleen 13, 18 en 21

In 6/8: ook overige chromosoomafwijkingen

Overige chromosoomafwijkingen

bepaald door:

techniek en analyse methode

de oorsprong van het onderzochte cel-vrije DNA

Typen/aantal nevenbevindingen

1. Techniek

Counting: in

case of trisomy:

relative excess

of reads on

chromosome of

interest (as

compared to

reference

chromosome,

normal control)

bioinformatics

100% foetale fractie

Ratio 1.5

10-20% foetale fractie

Results expressed as

Z-score = (Chr21 fraction test sample) – (Average Chr21 fraction reference set)

Standard Deviation Chr 21 fraction reference set

Fraction = number of reads on chr n / total mapped reads

Reference set = a set of normal samples

Z-score > 3 trisomy

Calculation of z-score

Analyse methode: WISECONDOR

Onderzoek van alle autosomen! Geen geslachts-chromosomale afwijkingen en geen triploidie

Andere chromosoomafwijkingen

Trisomie 16

del(4)(p15.3) ~ Wolf-Hirschhorn

• NIET alleen trisomie 13, 18 en 21

• Resolutie ong 20Mb

(dus GEEN microdeleties/duplicaties)

A. grotendeels van moederlijke origine (~90% maternaal/10% foetaal)

-Moederlijk mozaïek

-Moederlijke copy number variatie

-Moederlijke maligniteit

2. Oorsprong van het cel-vrije DNA

B. cel-vrije foetale fractie heeft een placentaire oorsprong

Oorsprong van het “foetale” cel-vrije DNA

Confined

placental

mosaicism

“Foetaal” DNA in maternaal plasma afkomstig van

cytotrophoblast van chorionic villi (CV)

syncytiotrophoblast

cytotrophoblast

Mesenchymal core

Prenatale cytogenetica in CV sinds de

jaren “80 (~’84)

(Simoni et al., 1983, Hum Genet, 63(4):349-57))

(STC-villi)

(LTC-villi)

Zygote

Trophoblast (STC-villi)

ICM

Fetus (amniotic fluid )

EEM (LTC-villi)

Discrepanties tussen cytotrophoblast en foetus

Syncytiotrophoblast

Cytotrophoblast STC – villi/NIPT

Mesenchymal Core LTC - villi

Early embryonic development

Crane and Cheung, Prenat Diagn, 1988 Feb;8(2):119-29; Bianchi Am J Med Genet, 1993 Jun 15;46(5):542-50.

Types of chromosomal mosaicism

generalized CFM (“false” negative NIPT)

CPM (“false” positive NIPT)

“Exotic” aberrations with NIPT as with CVS

1. Foetale afwijkingen ≠ trisomie 13, 18 en 21

2. Confined placental mosaicism

3. Moederlijk mozaïek

4. Moederlijke copy number variatie

5. Moederlijke maligniteit

Typen nevenbevindingen

N=3306 getest

N=3278 (99.2%) met uitslag

107 met trisomie 13, 18 of 21 (3.3%)

51 nevenbevindingen (1.6%)

1/3 afwijkingen ≠ trisomy 13, 18, 21

Resultaten in 1e jaar TRIDENT

9 foetale afwijkingen

25 (waarschijnlijk) confined placental mosaicism

9 moederlijke CNVs

2 wrschl technisch

6 onbekend :

1 geen FU

5x foetus en placenta normaal (4 gezond; 1 neonatale dood)

51 nevenbevindingen

Chromosoomafwijking zwangerschapsuitkomst

mos +9 Levend met MCA/MR (19 ma)

mos +15 (echo g.b.) Levendgeboren 40 3/7 wkn. Geen FU.

mos +22 (geen echo) TOP (dysmorfieën)

mos +del(8)(p21.3p23.1) (echo g.b.) TOP 17 1/7 wkn (dysmorfieën,

hand/voet/anusafw)

der(9)t(2;9)(p21;p24) IUVD 30 wks (familiaire translocatie)

del dup (9p) (echo g.b.) TOP 21 3/7 wkn

del(12)(q21.2q21.33) (echo g.b.) TOP 21 3/7 wkn

der(13;18)(q10;q10) (geen echo) TOP (dysmorfieën)

del(6)(q14.1q16.1) (echo g.b.) Levendgeboren 33 5/7 wkn

(fenotype: 6q14 deletie syndroom)

1. Foetale chromosoomafwijkingen (N=9)

Case report

Patiënte 38 jaar

NIPT bij 12 2/7 wkn

Indicatie: afw ETS: risico Down syndroom: 1:149

del(6)(q14.1q16.1)

Resultaat NIPT: 17 Mb deletie 6q

Wilden geen vruchtwaterpunctie

Array ouders: normaal

FISH (uitsluiting gebalanceerde chromosoomafwijking in 1 van

ouders): normaal

Echo-onderzoek: geen bijzonderheden

Vervolgonderzoek tijdens de zwangerschap

33 5/7 weken een sectio caesarea verricht.

Kind: een goede start. De Apgarscores waren 5, 8 en 8 na

respectievelijk 1, 5 en 10 minuten.

Naar SKZ vanwege ademhalingsproblemen; beademd

Gewicht 1575 gram (-1.92 SD), schedelomtrek 29.5 cm (-1.41 SD)

Open ductus Botalli, niet geopereerd

Vertraagde ontwikkeling

Wordt vervolgd bij de chromosomenpoli in Groningen

Na geboorte

SNP array op navelstrengbloed

14.8 Mb deletie 6q14.1q16.1

overlappend met

6q14 deletie syndroom

Klinische kenmerken:

mentale en ontwikkelingsachterstand

obesitas

gedragsafwijkingen

macrocephaly

dysmorfieën

Incidentie foetale chromosoomafwijking

≠ +13, +18, +21

3/530 (0.6%*)

NIPT

9/2527 (0.4%)

Array*

* Van Opstal et al., 2015, Hum Mut, 36(3):319-26

Chromosoomafwijking aantal

+2 1

+3 1

+7 7

+8 2

+9 2

+16 9

+22 1

+7,+20 1

+2,+20 1

totaal 25

2. Confined placental mosaicism N=25

Incidentie CPM

5/530

~1%

NIPT

25/2527

~1%

Array*

* Van Opstal et al., 2015, Hum Mut, 36(3):319-26

Geassocieerd met:

IUGR

IUVD

Foetale afwijkingen (gegeneraliseerd mozaïek?)

vervolg echografisch onderzoek geïndiceerd

Kalousek, D. K., P. N. Howard-Peebles, S. B. Olson, I. J. Barrett, A. Dorfmann, S. H. Black, J. D. Schulman and R. D. Wilson. "Confirmation of

CVS mosaicism in term placentae and high frequency of intrauterine growth retardation association with confined placental mosaicism." Prenat

Diagn 1991 11(10): 743-750.

Johnson, A., R. J. Wapner, G. H. Davis and L. G. Jackson. "Mosaicism in chorionic villus sampling: an association with poor perinatal

outcome." Obstet Gynecol 1990 75(4): 573-577.

Goldberg, J. D., A. E. Porter and M. S. Golbus. "Current assessment of fetal losses as a direct consequence of chorionic villus sampling." Am J

Med Genet 1990 35(2): 174-177.

Toutain et al. Prenat Diagn 2010; 30: 1155–1164.

Klinische relevantie van CPM

afwijking aantal zwangerschapsuitpomst

+2 1 TOP o.b.v. echo-afwijkingen

+3 1 IUGR

+7 7 2x IUGR (<p10); 1 prematuur

1x foetale afwijkingen (anusatresie en afw balzak)

4x normaal

+8 2 2x Normaal

+9 2 2x IUGR

+16 9 9x IUGR

8/9 prematuur

3x foetale afwijkingen:

-Hemihypertrofie, sondevoeding 11 ma, neurologisch oz 11 ma g.b.

-Dysmorfieën: bdz dwarse handlijn, simpele oorschelpen, goede

inhaalgroei

-urogenitale afwijkingen, vertraagde ontwikkeling, tethered cord,

beenlengte verschil.

+22 1 IUGR

+7,+20 1 IUGR

+2,+20 1 normaal

7/25 normale zwangerschapsuitkomst

20% kind/foetus met afwijkingen

~60% IUGR

* Toutain et al., 2010, 30, 1155-1164

Klinische follow-up van 25 x CPM

afwijking Follow-up tijdens de zwangerschap echo

10 Mb dup (1) (known maternal CNV from previous array) g.b.

12 Mb dup (3) (known maternal CNV 3 Mb from previous array) Array

navelstrengbloed normaal.

g.b.

15 Mb del (11p)

6 Mb del 11p in blood and wangslijmvlies mother ?

10 Mb dup(17p) Buffy coat: 1.3 Mb dup 17p12 ~ Charcot Marie Tooth

(klinisch daarmee bekend)

g.b.

dup(20) Array on maternal gDNA ?

del(13q) (spike) Buffy coat: del(13) g.b.

10 Mb dup (13)

Mat ~500 Kb dup on 13q ?

11 Mb dup (21)

Buffy coat: ~2 Mb dup= UV (geen onderzoek van foetus) IUGR

11 Mb dup (21)

AF: QF normal

Mother: array: dup 21 ?

3. Maternal CNVs (N=9)

Moederlijke duplicatie

Array buffy coat: 1.3 Mb duplicatie op 17p~ CMT

CMT: groep erfelijke

polyneuropathieën. De meest

voorkomende erfelijke

aandoeningen van zenuwen

naar benen en armen. Zwakte

van de spieren in de

onderbenen, de voeten en de

handen

Charcot Marie Tooth

Maternal CNV on chr21

[

Case:

a FTS: risk trisomy 21 1:85 at 12 5/7 wks

BMI 32.2

z-scores for #21:

BS: 4.43

Lmfit: 4.63

WISECONDOR: <5

Partial duplication 21q21.1

Array op buffy coat: 2 Mb mat duplicatie

chr21:20,604,811-22,572,304: klinische relevantie onbekend

geen onderzoek foetus. Wel gerapporteerd ivm toekomstig NIPT onderzoek

Overige moederlijke afwijking

• Buffy coat: normaal

• Overleg met aanvrager: patiënte bekend met uterus myomatosus

• Voor zekerheid: vruchtwater: normaal

Vervolgonderzoek:

Altijd vervolgonderzoek nodig

• Soms onderzoek moeder voldoende

• Indien niet-maternaal: invasief vervolgonderzoek

NIPT geen diagnostische test

Vruchtwaterpunctie of vlokkentest?

Altijd bevestging van NIPT middels diagnostische test

In praktijk meestal vruchtwaterpunctie

Vlokkentest mogelijk?

NIPT bij ~10 wkn resultaat bij ~12 wkn

vruchtwaterpunctie ~15-16 wkn??

FTS

< 12 wkn

NIPT

> 12 wkn

Resultaat

~14-15 wkn

Afhankelijk van de chromosoomafwijking is

CVS soms mogelijk

Trisomy

13, 18, 21

Trisomy

3, 72, 81, 9, 202 Trisomy

152, 16, 22, rare trisomies and sex-

chromosomal aneuploidy

Normal

fetus

Chorionic villus sampling (mesenchymal core) 3

MOS

(risk ~3%) A

Abnormal

fetus

Cordocentesis4

N A or MOS N2

Normal

fetus

Amniocentesis2, 4

(MOS)+3,

+72,+9,+202 (MOS)+81

Amniocentesis4

A or MOS N2

Normal

fetus

Abnormal

fetus2

Amniocentesis4

Placenta

biopsies

(4 quadrants)5

NIPT result

type of

invasive test

cytogenetic

results

prenatal

diagnosis

cytogenetic

follow up

investigations

Chorionic villus sampling (mesenchymal core) 3

Placenta

biopsies

(4 quadrants)5

Van Opstal and Srebniak (2016), Expert Rev Mol Diagn. 2016 Feb 29:1-8.

Chromosome

aberration

Van Opstal and

Srebniak, 2016

(N= 704)

Grati et al 2015

(N= 1512)

Trisomie 13

8.3% 22%

Trisomie 18

3.2% 4%

Trisomie 21 1.6% 2%

Totaal 3.3% 3.9%

Risico op een 2de invasieve test

• Van Opstal and Srebniak, 2016, Exp Rev Mol Diagn

• Grati et al., 2015, Prenat Diagn, 35(10): p. 994-8

= risico op chromosomaal mosaicisme

Vruchtwater normaal hoogstwaarschijnlijk confined placental mosaicism

Bevestiging van NIPT:

Onderzoek van placenta na de geboorte:

min 4 biopten uit min 4 kwadranten

Bevestiging afwijkende NIPT na de geboorte

Placental site variation

PhD thesis

Chromosomal mosaicism in the placenta. Presence and consequences

G.H. Blom

Faculty AMC-UvA

Year 2001

NIPT: duplicatie 4q

Vruchtwater: deletie 2

Placenta na TOP: deletie 2

Placenta na TOP: duplicatie 4

De introductie van NIPT in Nederland heeft geleid tot een hoge uptake onder zwangeren

met een afwijkende CT (~86%) met als gevolg een reductie van invasieve ingrepen met

~62% (Oepkes et al., submitted, Prenat Diagn).

Hoge sensitiviteit en specificiteit voor detectie van tris 13, 18 en 21 (Oepkes et al.,

submitted, Prenat Diagn).

O.b.v. gebruikte techniek zijn nevenbevindingen te verwachten (1/3 van alle afwijkingen!):

Algoritme: foetale afwijkingen ≠ trisomie 13, 18 en 21

Oorsprong van het cel-vrije DNA:

-Moederlijk mozaiëk, CNV of maligniteit/benign tumor

-Confined placental mosaicism en/of vanishing twin

Vanwege de oorsprong van het gebruikte DNA is NIPT GEEN diagnostische test. Altijd

vervolgonderzoek noodzakelijk!

Vervolgonderzoek middels invasieve test: vlokkentest of vruchtwaterpunctie o.a. afhankelijk

van chromosoomafwijking

Indien vruchtwater normaal: bevestigingsonderzoek in placenta (min 4 biopten!)

•

• Indien NIPT normaal en later echo-afwijkingen -> indicatie voor invasief onderzoek

Conclusies

Acknowledgements

Janneke Weiss, VUMC

Merel van Maarle, AMC

Klaske Lichtenbelt, UMCU

Brigitte Faas, RUNMC

Voor cytogenetische FU:

Shama Bhola, VUMC

Karin Huijsdens, AMC

Mariëtte Hoffer, LUMC

Merryn Macville, MUMC

Angelique Kooper, RUNMC

Heleen Schuring-Blom, UMCU

Voor klinische FU:

Lutgarde C.P. Govaerts, Erasmus MC

Gita Tan, VUMC

Nicolette den Hollander, LUMC

Lieve Page-Christiaens, UMCU

Ilse Feenstra, RUNMC

Eramus MC, Rotterdam:

-Laboratorium van de afd Klinische Genetica

-labspecialisten klinische genetica:

Gosia Srebniak

Femke de Vries

Jeroen Knijnenburg

-Klinisch genetici:

Marieke Joosten.

Lutgarde Govaerts

Karin Diderich

Robert-Jan Galjaard

-gynaecologen: ErasmusMC, Albert Schweitzer

ZH, Reinier de Graaf ZH, Amphia ZH

Erik Sistermans, VUMC

Dick Oepkes, LUMC

Heleen Schuring – Blom, UMCU

Lieve Christiaens, UMCU

Robert-Jan Galjaard

Lidewij Henneman, VUMC

Alle consortium leden van alle disciplines

De TRIDENT studie werd mede mogelijk gemaakt door:

Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en

Zorginnovatie (ZonMw) & Ministerie van Volksgezondheid,

Welzijn en Sport

Vragen?