conservacion del germoplasma

5/11/2018 Conservacion Del Germoplasma - slidepdf.com

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Conservación de germoplasma

El hombre ha dependido básicamente de los

vegetales como fuente de energía.

Las técnicas modernas de producción de variedades

mejoradas, altamente homogéneas, han provocado

la reducción de la variabilidad genética de las

especies cultivadas, ocasionando una verdadera

«erosión genética».

Cuando se habla de preservación de germoplasma

hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la

mayor integridad posible, la variabilidad genética de

las poblaciones seleccionadas.



Métodos empleados para la

conservación de germoplasma Depende de la naturaleza del material vegetal,

y está definida por la duración de su ciclo de

vida, el modo de reproducción y el tamaño de

sus individuos

Se han intentado diversas alternativas de

conservación, que van desde el tradicional

banco de semillas hasta el mantenimiento de

áreas de reserva.



Sin embargo, en muchos casos elmantenimiento no es posible y en otrosresulta sumamente costoso, siendo muy

elevados los riesgos de pérdidas pormanipulación o desastres naturales.

Los métodos de conservación degermoplasma pueden dividirse en métodos insitu y métodos ex situ.



Métodos in situ

Se basan en la conservación de las plantas ensus hábitat natural e incluyen la conservaciónen parques nacionales y en reservas

ecológicas, lo cual requiere de un considerableespacio físico e implica altos costos, asociadosa la necesidad de mano de obra especializada,control permanente de enfermedades y

malezas, a la par que las plantas estánexpuestas a las inclemencias del clima y de losincendios



Métodos ex situ

se basan en el mantenimiento del materialbiológico en bancos de semillas, bancos decultivo in vitro, colecciones de plantas (en

campo, viveros o jardines botánicos). Los bancos de semillas constituyen uno de los

métodos más convenientes para la

conservación de germoplasma ex situ Permiten almacenar una gran variabilidad

genética en forma económica y práctica.



Para la conservación de semillas el

International Plant Genetic Resouces

Institute (IPGRI) recomienda su desecación

hasta un 3-7% de humedad y su

almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en

general, el más recomendado para la mayoría

de las especies que se propagan por semillas y

cuyas semillas resisten la desecación sin que

ello implique pérdida de viabilidad.



A las semillas que presentan estas

características se las denominan «semillas

ortodoxas», como por ejemplo las semillas de

arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga.



No es aplicable porque la especie se propaga,

en la práctica, vegetativamente, (como papa,caña de azúcar, plátanos y bananos), o bienporque sus semillas pierden rápidamente laviabilidad cuando son sometidas a procesos

de desecación. A estas semillas se lasdenominan «semillas recalcitrantes». Lassemillas de numerosas especies que viven enzonas tropicales o subtropicales se incluyen en

esta categoría, como por ejemplo las de coco,cacao, frutales tropicales y diversas palmeras.



Otro método de conservación de germoplasma

ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos.

Mantenimiento in vitro del germoplasma de

diversas especies. implican el cultivo, bajo

condiciones de asepsia, de órganos o

fragmentos de órganos (meristemas, semillas,

embriones somáticos, embriones cigóticos,

hojas, tallos, raíces, yemas, polen, anteras,

callos o protoplastos), en un medio de cultivoartificial definido, bajo condiciones

ambientales controladas.



Cultivo in vitro

Utilizada para mantener colecciones encrecimiento mínimo.

Reducir la temperatura, reducir las condicionesde luminosidad, modificar el medio de cultivo,adicionar al mismo inhibidores osmóticos oretardantes del crecimiento, deshidratadores detejido o modificar la fase gaseosa del recipientede cultivo.

Se basan en reducir el metabolismo celular y conello reducir el crecimiento y el número desubcultivos durante meses hasta un año, sin queello afecte la viabilidad de los cultivos.



La crioconservación consta de seis

pasos:

Selección del material a crioconservar

Deshidratación

Aclimatación

Almacenamiento

Descongelamiento y rehidratación

Tests de viabilidad



Selección del material a crioconservar

Cuando se realiza la selección del material acrioconservar se debe tener la absoluta seguridad deque a partir del mismo se obtendrán plantascompletas.

El explante seleccionado dependerá del objetivo deconservación y está estrechamente relacionado con eltipo de propagación de la especie. Por ejemplo, en elcaso de la mandioca, especie que se propagaPrincipalmente por vía asexual (mediante estacas), se

conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivode microestacas y también de meristemas, con lo cualparalelamente a la conservación se consigue elsaneamiento de los cultivares.



Deshidratación

La deshidratación del explante es un paso crucialpara el éxito de la crio-conservación, ya que esnecesario eliminar toda el agua libre presente enel tejido vegetal, minimizando así posibles dañosdebidos a congelación. La deshidratación deltejido puede realizarse en una cámara a 0ºC o encámaras herméticamente cerradas utilizandosustancias higroscópicas como silica gel o glicerol

(5 - 20%), o sometiendo al explante a unacorriente de aire en un flujo laminar de aireestéril.



Aclimatación

La aclimatación rápida consiste en colocar el explantedirectamente en nitrógeno líquido, con o sin la adiciónexógena de crioprotectores.

La aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente

la temperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe sermanejado cuidadosamente, pues una deshidrataciónexcesiva de las células puede exponerlas a una altaconcentración interna de solutos. Por esta razón, elmaterial generalmente se congela lentamente, a una

velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperaturapróxima a los -40 ºC. Luego se lleva directamente a latemperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC).

Rapida

Lenta



A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentarlas bajas temperaturas a las que será sometido, se

utilizan sustancias crioprotectoras como azúcares(sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol,manitol y sorbitol), dimetilsulfóxido (DMSO) ypolivinilpirrolidona (PVP).

También pueden utilizarse soluciones de vitrificación,que son una combinación de varios crioprotectorestales como el PVS2, que está compuesto por 30% deglicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M desacarosa.

Tanto los crioprotectores como las soluciones devitrificación actúan fundamentalmente como agentesanticongelantes, aumentando la viscosidad del tejidovegetal y reduciendo la permeabilidad de las células.



Almacenamiento

De acuerdo al material vegetal que se utilice, sepresentan dos grandes sistemas:

Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos

vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a lasbajas temperaturas y a la deshidratación.

Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidosvegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a ladeshidratación, por lo cual se requiere de unaprotección exógena. Esta protección puede lograrse através del uso de crioprotectores o bien porlautilización de soluciones de vitrificación.



Sistemas

Los sistemas secos, por tratarse de tejidos másresistentes, necesitan de una menor preparaciónpara el almacenamiento y comprenden aquellas

especies que habitan zonas frías y/o templadas. Los sistemas hidratados son más susceptibles a

las bajas temperaturas y están representados portodas aquellas especies que habitan zonas

tropicales y subtropicales, las cuales no estánadaptadas para soportar temperaturas inferioresa 0ºC.



Descongelamiento y rehidratación

Cuando se desea recuperar el explante

mantenido en nitrógeno líquido se puede

realizar un descongelamiento rápido en baño

de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 ºC) o

en forma lenta, sometiendo al explante a la

temperatura del laboratorio o a una corriente

de aire en el flujo laminar de aire estéril.



Tests de viabilidad

Los tests de viabilidad nos permiten comprobarlas zonas del tejido que han muerto y cuáles hansobrevivido al frío. La evaluación de la viabilidad

puede llevarse a cabo en forma visual, realizandoel re-cultivo y determinando la capacidad deregeneración, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5Trifenil- Tetrazolio) que colorea el tejido que ha

sobrevivido a la crioconservación o midiendo laconductividad eléctrica, que permite estimar eldaño producido en las membranas celulares.



Técnicas de almacenamiento del

material a preservar

En la última década han surgido numerosas técnicas quecombinan el uso de crioprotectores y de soluciones devitrificación con técnicas de deshidratación yencapsulación, las cuales básicamente pueden resumirse

en técnicas de:- Encapsulación-deshidratación

- Vitrificación

- Encapsulación-vitrificación

- Desecación

- Precultivo- Precultivo-desecación

- Gotita congelada.



Encapsulación-Deshidratación

Se basa en la metodología aplicada a las semillassintéticas, en la cual un explante es recubierto por unamatriz de alginato de sodio y polimerizado en unasolución de cloruro de calcio, formando un gel de

alginato de calcio alrededor del explante. Una vezencapsulados, los explantes son pretratados,generalmente con sacarosa (que actúa comocrioprotector.

En especies tolerantes al frío la exposición de las

plantas madres a bajas temperaturas durante variassemanas, previo a la criopreservación, incrementa lasupervivencia.



La deshidratación puede llevarse a cabo

sometiendo las cápsulas de alginato

(conteniendo a los explantes) a una corriente

de aire en el flujo laminar o exponiéndolas en

cámaras herméticamente cerradas con silica

gel. Las cápsulas, así deshidratadas, pueden

sumergirse directamente en nitrógeno líquidoo bien pueden ser llevadas a un descenso

lento de temperatura.



Vitrificación

Esta técnica involucra el pretratamiento de lasmuestras con soluciones de vitrificación, como el PVS2o bien otra, compuesta por 40% de etilenglicol, 15% desorbitol y 6% de albúmina sérica bovina.

Luego de la exposición a las soluciones de vitrificación(generalmente a una temperatura de 0ºC, a fin dedisminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestraspueden ser sumergidas directamente en nitrógenolíquido o a través de un descenso lento de la

temperatura. El tiempo de exposición a la solucióndebe estar relacionado con el tamaño del explante y lamisma debe ser removida rápidamente luego deldescongelado.



- Encapsulación-Vitrificación

Las muestras son encapsuladas en alginato de

calcio y sometidas a vitrificación durante el

enfriamiento. La supervivencia del material

vegetal cuando se utiliza esta técnica es un

30% mejor que cuando se usa la de

encapsulación-deshidratación. Esto puede

explicarse debido a que las cápsulas dealginato de calcio reducen la toxicidad de las

soluciones de vitrificación.



Desecación

Proceso muy simple que sólo requiere la

deshidratación del material vegetal, la cual es crucial

para el éxito de la crioconservación.

Esta técnica consiste en someter al explante a unacorriente de aire en un flujo laminar o en cámaras

herméticamente cerradas, que contienen silica gel,

luego de lo cual se realiza un enfriado rápido

sumergiendo el material directamente en nitrógenolíquido.



Precultivo

La técnica del precultivo involucra la incorporación de

crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del

explante) antes del congelamiento. Como ejemplos pueden

citarse la adición de altas dosis de sacarosa para la

crioconservación de meristemas de Musa spp.; la utilización

de polietilenglicol (PEG) y dimetilsulfóxido (DMSO) en el caso

de embriones cigóticos de Triticum aestivum y Phaseolus

vulgaris; la utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en

semillas, embriones cigóticos, polen y anteras de Oryza spp., y la utilización de ácido abscísico para la conservación de líneas

celulares y de callos de Oryza sativa.



Precultivo-Desecación

Es una combinación de dos de las técnicas descriptas

anteriormente. Las muestras son tratadas con

crioprotectores, parcialmente desecadas y luego

sometidas a enfriamiento rápido o lento.Generalmente en el precultivo se emplean azúcares

como sacarosa o glucosa. La duración del

tratamiento es variable, desde horas, como en el

caso de la conservación de embriones maduros deC ocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20 hs., hasta

días, como en el caso de embriones somáticos de

Elaeis guineensis, que dura 7 días.



Gotita congelada

Esta técnica ha sido aplicada con éxito en ápices de

Solanum tuberosum. C onsiste em pretratar el

material con DMSO por 2-3 hs. en medio líquido y

formar una microgota (2.5ml), la cual se suspendesobre papel de aluminio y luego se sumerge

directamente en nitrógeno líquido. Este

procedimiento es una adaptación de la técnica

clásica desarrollada para meristemas de mandioca.Esta técnica ha sido satisfactoriamente aplicada en

150 variedades de Solanum tuberosum, con un

porcentaje de supervivencia del 40%.

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