Metodi di identificazione e quantificazione:Metodi di identificazione e quantificazione:Metodi Metodi immunoenzimaticiimmunoenzimaticiDaniela MatteiMara Stefanelli

I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI: I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI: IMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIOIMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIO

Istituto Superiore di Sanità – Roma Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione PrimariaRoma 15 novembre 2007

Principioidentificazione di un particolare anticorpo mediante legame con antigene specificoevidenza del complesso antigene-anticorpo indice della presenza dell'anticorpo cercatoreazione semi-quantitativa

StepsAntigene (analita) adsorbito su superficie del sistema (‘sorbent’).Antigene riconosciuto dall’anticorpo specifico (‘immuno’)Anticorpo riconosciuto da un secondo anticorpo marcato con enzima (‘enzyme-linked’).Reazione enzima-substrato con produzione di un complesso, generalmente coloratointensità del segnale (risposta) semi proporzionale alla quantità diantigene (analita) inizialmente presente

ELISA ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Direttoantigene viene direttamente adesoalla base solida (pozzetto) seguito da un anticorpo direttamente marcato con un enzima

Indirettoantigene direttamente adeso alla base solida anticorpo primario non marcatoaggiunto anticorpo secondario marcato, specifico contro quello primario

ELISAEnzyme Linked Immunosorbent Assay

strips, in forma di piastre da 96 pozzetti, con anticorpo adeso sul fondoControllo negativo

DiluenteConiugatoSoluzione di lavaggioSubstrato Soluzione Stop

Un tipico KIT ELISA commerciale

Calibratori a concentrazioni (in ppb) diverse

MicrocistineNodularineAnatossina-aCilindrospermopsineSaxitossine

Alcuni saggi ELISA per la Alcuni saggi ELISA per la determinazione di tossine da determinazione di tossine da cianobattericianobatteri

1. preparazione del campionealiquota (es. 100 ml) sottoposta a congelamento/scongelamento & ultrasuoni: lisi cellulare e rilascio tossine

Metodo ELISA competitivo per la determinazione di microcistine in campioni di acqua

2. allestimento dei pozzetti:n. 2 pozzetti per ciascun campionen. 2 pozzetti per ciascun materiale di riferimento diluente in ciascun pozzetto analita standard (antigene) immobilizzato sul supporto

3. reazione di competizione:campione inserito nel pozzetto insieme ad anticorpo specifico per l’analitaantigene (campione) compete con l’antigene immobilizzato nel legare l’anticorpoincubazione (t ambiente, 30 min)

lavaggio: rimozione dei complessi antigene-anticorpo in soluzione

4. legame del complesso marcato anticorpo-enzima:inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima che va a legarsi all’anticorpo primario

lavaggio: rimozione dei complessi in soluzione

5. reazione cromogenica:addizionato un reagente incolore che genera una reazione colorimetrica prodotta dall’enzima legato al complesso antigene-anticorpo immobilizzato sul substratoincubazione (t ambiente, 30 min)reazione inibita mediante addizione di reagente acido

6. dosaggio:lettura spettrofotometricaintensità di colore inversamente proporzionale alla concentrazione di analitaconcentrazione incognita ottenuta per interpolazione su una funzione assorbanza/concentrazione di analita ottenuta con materiali di riferimento Conc. MC (log)

Metodo ELISA competitivo per la determinazione di microcistine in campioni di acqua

Vantaggi Svantaggi

Metodo ELISA per la determinazione di microcistine

sensibilità (LOD ca. 0.1 μg/L)

disponibilità di anticorpi specifici per aptenipresenti sulla molecola di cianotossine

disponibilità kit commerciali

rapidità (ca. 3 ore / > 40 campioni)

aspecificità cross-reactivity (falsi +)costi

accuratezza e precisione idonei allo scopo

Ridotte quantità di campione (non trattato)

Conclusioni

• saggi ELISA e PPi metodi di screening efficaci e praticabili

• esperienza ISS• materiali di riferimento:

– limitazioni di impiego– costi– limitati a poche tossine

• metodi di conferma: indispensabili per effettiva valutazione del rischio

• aspettative da metodi molecolari