25-oh-vitamina d2/d3 in plasma e siero – analisi on-line · studi recentemente pubblicati...

ClinMass® LC-MS/MS Kit Completo

MS7000

Per uso diagnostico in vitro

IVDD, 98/79/EC

Manuale d’istruzioni

25-OH-Vitamina D2/D3in Plasma e Siero – Analisi On-Line

RECIPE Chemicals + Instruments GmbHDessauerstraße 3, 80992 Munich / Germany

Phone: +49 / 89 / 54 70 81 - 0 Fax: +49 / 89 / 54 70 81 - 11 e-mail: [email protected]

MS7000

Per uso diagnostico in vitro

Versione: 1.0Data di Revisione: 17.05.2013Nome del file: MS7000_m_i.docx

Contenuti

1 INTRODUZIONE 1

1.1 Uso previsto 1 1.1.1 Simboli IVD 1

1.2 Background Clinico 2 1.3 Descrizione generale della procedura analitica 5

2 COMPONENTI DEL KIT COMPLETE E ACCESSORI 6

2.1 Informazioni per l’ordine 6 2.1.1 Informazioni per la sicurezza 7 2.1.2 Condizioni di conservazione e durata dei componenti del kit 7 2.1.3 Disposizioni per lo smaltimento 8

3 STRUMENTAZIONE RICHIESTA 9

4 OPERAZIONI SUL SISTEMA ANALITICO 10

4.1 Configurazione del sistema LC 10 4.2 Flussare il sistema LC 10 4.3 Equilibrazione del sistema LC 11 4.4 Inizializzare il sistema analitico 11

4.4.1 Parametri LC 11 4.4.1.1 Switching valve automatica (analisi on-line) 13

4.4.2 Parametri MS/MS 14 4.5 Modalità Standby 15

5 IMPLEMENTAZIONE DELLA PROCEDURA ANALITICA 16

5.1 Raccolta e conservazione dei campioni 16 5.2 Preparazione del campione 16

5.2.1 Ricostituzione dei calibratori / controlli sierici liofili 16 5.2.2 Flusso di lavoro 16

5.2.2.1 Preparazione della miscela IS/P 17 5.2.2.2 Precipitazione 17 5.2.2.3 Analisi LC-MS/MS 17 5.2.2.4 Stabilità dei campioni preparati 17

5.3 Analisi LC-MS/MS 18 5.3.1 Ottimizzazione degli analiti (MS/MS) 18 5.3.2 Equilibrazione del sistema analitico e corsa test 18 5.3.3 Calibrazione 18 5.3.4 Controllo di qualità 19 5.3.5 Esempi di cromatogrammi 20

5.3.5.1 Calibratore sierico ClinCal® 20 5.3.5.2 Campioni con epimero C-3 (3-epi-25-OH-vitamina D3) 21

Contenuti

6 VALUTAZIONE 22

7 TEST DATI 23

7.1 Validazione 23 7.1.1 Linearità, limiti di rilevazione e quantificazione 23 7.1.2 Recupero 23 7.1.3 Precisione 23

7.1.3.1 Intraserie 24 7.1.3.2 Interserie 24

7.2 Intervalli di riferimento 25

8 REFERENZE 26

9 RISOLUZIONE DEI PROBLEMI 27

10 APPENDICE: DICHIARAZIONE DI CONFORMITÀ EC 29

25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero – Analisi On-Line Pagina 1

1 Introduzione

1.1 Uso previsto

Il kit completo ClinMass® permette la determinazione della 25-OH-vitamina D2/D3 in siero e plasma umani in LC-MS/MS.

I componenti del kit devono essere usati in accordo con le istruzioni contenute in questo manuale. Il kit non può essere usato con componenti di altri produttori.

1.1.1 Simboli IVD

Simboli in accordo con la direttiva EU 98/79/EC per prodotti medici per uso diagnostico in vitro (IVDD), usati sulle etichette dei prodotti e in questo manuale:

Per uso diagnostico in vitro Numero d’ordine

Produttore Numero di lotto

Limite Massimo di temperatura: … °C

Limiti di temperatura: … °C - …°C

Data di scadenza: …

Vedere istruzioni per l’uso

Pagina 2 25-OH-Vitamina D2/D3 in Plasma e Siero – Analisi On-Line

1.2 Background Clinico

Il termine “Vitamina D” rappresenta un gruppo di steroidi con attività antirachitica. I membri clinicamente rilevanti di questo gruppo solo la Vitamina D2 (ergocalciferolo) e la Vitamina D3 (colecalciferolo). Ad una sufficiente esposizione alla luce solare (UV-B), la Vitamina D3 può essere prodotta dalla pelle, ciò non concorda con la classica definizione di una vitamina.

La biosintesi cutanea della Vitamina D3 è la più importante fonte di Vitamina D. L’apporto attraverso la dieta diventa importante quando l’esposizione al sole è limitata, in quanto solo pochi cibi contengono naturalmente un adeguato o un elevato quantitativo di Vitamina D, per esempio pesci di mare e olio di fegato di merluzzo [1-3].

La Vitamina D, ottenuta dalla nutrizione (D2 e D3) o prodotta a livello endogeno (D3), viene metabolizzata nel fegato in 25-OH-vitamina D. Per un ulteriore idrossilazione nel fegato si genera la forma biologicamente attiva, la 1,25-(OH)2-vitamina D (figura 1). Per la valutazione dello stato di Vitamina D, viene generalmente utilizzata la concentrazione del metabolita primario (25-OH-vitamina D). La ragione principale consiste nella lunga stabilità di questo metabolita (3 settimane) che fornisce un’indicazione del deposito di Vitamina D in un lungo periodo [1]. Inoltre, le concentrazioni in plasma e siero di 25-OH-vitamina D sono circa 1000 volte maggiori di quelle della 1,25-(OH)2-vitamina D [4].

Vitamina D2: R1 = H, R2 = H 25-OH-Vitamina D2: R1 = H, R2 = OH 1,25-(OH)2-Vitamina D2: R1 = OH, R2 = OH

Vitamina D3: R1 = H, R2 = H 25-OH-Vitamina D3: R1 = H, R2 = OH 1,25-(OH)2-Vitamina D3: R1 = OH, R2 = OH

Figura 1: Vitamina D2, D3 e metaboliti

R2

OH R11

25R2

OH R11

25


La Vitamina D gioca un ruolo importante per l’incorporazione del calcio nella matrice ossea. Carenze di Vitamina D (ipovitaminosi D) interferiscono quindi con la corretta mineralizzazione delle ossa. Di conseguenza, le ossa rimangono più fragili e si piegano sotto stress meccanici. La carenza di Vitamina D porta a rachitismo nei bambini e osteoporosi negli adulti.

In contrasto, un’intossicazione di Vitamina D (ipervitaminosi D) può risultare da un eccessivo consumo con la dieta di Vitamina D2 e D3 causato da cibi fortificati o integratori. I sintomi possono includere nausea, vomito, diarrea, mal di testa, polidipsia e poliuria tutti associati con ipercalcemia [1].

A causa dell’influenza del sole sulla sintesi di Vitamina D3 endogena, ci sono diversi intervalli di normalità della Vitamina D in estate e in inverno*. Le concentrazioni di 25-OH-Vitamina D (D2 + D3) maggiori di 30 µg/l [5, 6] sono largamente considerate appropriate per assicurare una sufficiente quantità di Vitamina D, mentre concentrazioni sotto i 20 µg/l [1, 6] indicano chiaramente una carenza (vedere la classificazione dello stato di Vitamina D nella sezione 7.2). Una carenza può essere trattata con una supplementazione di Vitamina D (D2 o D3). Un livello di 40 µg/l richiede un supplemento orale di Vitamina D di 20 - 100 µg/giorno in base all’esposizione al sole [7].

Le persone a rischio per ipovitaminosi D, specialmente nei mesi invernali, sono gli anziani, le donne incinte, i neonati e tutte le persone che passano poco tempo all’aperto. Comunque, livelli insufficienti di Vitamina D non riguardano solo questi gruppi a rischio, ma sono diffusi nella popolazione generale [1, 5, 6, 8]. Secondo [8], in Germania più del 60% dei pazienti misurati presenta livelli di 25-OH-vitamina D sotto i 20 µg/l durante la stagione invernale.

Quindi, per prevenire uno stato di carenza di Vitamina D, un regolare monitoraggio è raccomandato specialmente alle persone dei gruppi a rischio. Inoltre, anche le persone sane di età superiore ai 50 anni devono essere controllati ogni 5 anni come misura preventiva contro l’osteoporosi [8].

Deve essere considerato che il siero dei pazienti può contenere l’epimero C-3 della 25-OH-vitamina D. Questi epimeri sono diasteroisomeri della 25-OH-vitamina D (figura 2) e quindi possono essere separati cromatograficamente dagli analiti e quantificati in spettrometria di massa.

Studi recentemente pubblicati riportano significative concentrazioni di of 3-epi-25-OH-vitamina D3, in particolare nei sieri dei neonati (età < 1 anno) [9, 10] e dei bambini [10]. L’epimero C-3 della 25-OH-vitamina D2 non è rilevabile in campioni nativi (vedere es. [10], [11] e [12]). Siccome la rilevanza clinica dell’epimero C-3 non è ancora chiara, deve essere considerata una quantificazione separata dell’epimero C-3 rispetto alla 25-OH-vitamina D3 [10].

* In accordo con [4], i seguenti intervalli di normalità della 25-OH-Vitamina D sono consigliati per l’estate e l’inverno: estate: 20 - 120 µg/l, inverno: 10 - 50 µg/l


3-epi-25-OH-vitamina D2 3-epi-25-OH-vitamina D3

Figura 2: epimero C-3 della 25-OH-vitamina D. Diversamente dalla 25-OH-vitamina D, il gruppo idrossilico è posto sull’atomo C-3 “sopra” il livello dell’anello

Il presente kit completo* ClinMass® LC-MS/MS permette un’affidabile determinazione della 25-OH-vitamina D2 e della 25-OH-vitamina D3 per la determinazione dello stato di Vitamina D e permette la separazione e l’analisi qualitativa del rispettivo epimero C-3 nella stessa corsa analitica.

Per la quantificazione della 25-OH-vitamina D2/D3 viene fornito il calibratore sierico ClinCal® a 4 livelli. Il controllo di qualità viene eseguito mediante l’uso dei controlli sierici ClinChek®.

La costante elevata qualità dei reagenti e del materiale di riferimento è garantita dal nostro sistema di qualità interna QM (certificato ISO 9001 e ISO 13485) e da programmi di controllo di qualità esterna (INSTAND, Germania; DEQAS, UK).

* Per la determinazione in HPLC è disponibile un kit completo ClinRep® con numero d’ordine 35000. Per la determinazione in UPLC® è disponibile un kit completo ClinRep® con numero d’ordine 35100.

OH

OH1

25OH

OH 1

25


1.3 Descrizione generale della procedura analitica

In questo metodo analitico la 25-OH-vitamina D2/D3 viene determinata in plasma o siero. L’analisi viene eseguita mediante SPE-HPLC online e con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

I metodi convenzionali in HPLC richiedono una fase preparativa manuale, eseguita prima dell’iniezione. Coi metodi HPLC online la purificazione del campione viene eseguita con l’LC-MS/MS configurata per scambiare diverse colonne usando una valvola a porte multiple e una colonna SPE (fase preparativa online, vedere sezione 4.4.1.1).

Dopo la separazione cromatografica gli analiti vengono ionizzati mediante APcI (APcI: atmospheric pressure chemical ionisation) e rivelati mediante uno spettrometro di massa tandem (MS/MS).

In APcI, i componenti del campione vengono vaporizzati e poi ionizzati prima di passare nel sistema MS/MS che è composto di due quadrupoli connessi da una cella di collisione.

La misura degli analiti in questo metodo è condotta in modalità MRM (MRM: multiple reaction monitoring). In questa modalità solo gli ioni selezionati (chiamati “ioni precursori”) con un definito rapporto mass/carica (m/z) vengono isolati nel primo quadrupolo e successivamente trasferiti nella cella di collisione. Lì gli ioni vengono frammentati per impatto con un gas inerte (argon o azoto) a voltaggi selezionati. Di tutti i frammenti generati (chiamati “ioni prodotto”), solo quelli con un definito rapporto m/z vengono isolati nel quadrupolo finale per il successivo rilevamento. Quindi, la misura in MRM assicura l’identificazione e la quantificazione con elevata selettività e sensibilità, identificando l’analita in base alle transizioni di massa caratteristiche del composto d’interesse.

Questo metodo permette una robusta e affidabile quantificazione in matrici biologiche complesse mediante l’utilizzo di uno standard interno marcato isotopicamente (vedere sezione 4.4.2, tabella 5). Per ogni analita (es. 25-OH-vitamina D2 e 25-OH-vitamina D3) vengono usate due transizioni (quantificatrice, qualificatrice). Il tempo di analisi è di 3 minuti. La forma epimerica C-3 della 25-OH-vitamina D3 (3-epi-25-OH-vitamina D3) che l’epimero più rilevante in campioni nativi*, viene separato dal picco dell’analita con un grado sufficiente per evitare valori analitici falsamente elevati (vedere cromatogrammi esemplicativi in sezione 5.3.5.2).

Una colonna alternativa con ordine num. MS7035 può essere usata per aumentare la risoluzione a basse concentrazioni di epimero C-3. Il tempo di analisi diventa di 4 minuti.

Per l’ottimizzazione dei parametri MS/MS (vedere sezione 5.3.1) e per la corsa test del sistema analitico (vedere sezione 5.3.2) è disponibile una mix di ottimizzazione ClinMass® (ordine num. MS7014). Per la corsa test per la separazione della 3-epi-25-OH-vitamina D3 è disponibile un’ulteriore mix di ottimizzazione ClinMass® con ordine num. MS7015 (vedere sezione 5.3.2).

La calibrazione del sistema analitico viene eseguita con i calibratori sierici ClinCal®. Per questo scopo viene fornito un set di calibratori sierici a 4 livelli (vedere sezione 5.3.3).

Il controllo di qualità viene eseguito con i controlli sierici ClinChek®. Questi controlli sono disponibili in 2 diverse concentrazioni (vedere sezioni 5.3.4).

* 3-epi-OH-vitamina D2 è generalmente non rilevabile in campioni nativi (vedere sezione 1.2). La separazione dei due epimeri rimane teoricamente possibile con questo kit.


2 Componenti del kit completo e accessori

2.1 Informazioni per l’ordine Order No.Description Quantity

MS7000 ClinMass® Complete Kit for 25-OH-Vitamin D2/D3 1 pce.in Plasma and Serumfor 300 assays

Contents:Autosampler Washing Solution 1 x MS7005SPE - Buffer 2 x MS7009Mobile Phase 1 x MS7010IS Internal Standard 1 x MS7012Serum Calibrator Set, lyophil. (Level 0 - 3) 1 x MS7013Sample Pretreatment Vials 3 x MS7020P Precipitant 1 x MS7021Manual

Separately available components:MS7005 Autosampler Washing Solution 1000 mlMS7009 SPE - Buffer 1000 mlMS7010 Mobile Phase 700 mlMS7012 IS Internal Standard 30 mlMS7013 Serum Calibrator Set, lyophil. (Level 0 - 3) 4 x 1 x 1 mlMS7014 Optimisation Mix 2 mlMS7015 Optimisation Mix 3-epi 1 mlMS7020 Sample Pretreatment Vials 100 pcs.MS7021 P Precipitant 15 ml

Start Accessories:MS7030 Analytical Column with test chromatogram 1 pce.MS7035 Analytical Column 3-epi with test chromatogram 1 pce.

(for the additional analysis of 3-epi-25-OH-Vitamin D3)MS7031 SPE - Column 1 pce.FK7400 Inline-Filter (stainless steel sieve, free of dead volume) 1 pce.

Accessories:FK1102 Switching valve Sykam (6-port / 3-channel incl. electr. drive, PEEK) 1 pce.FK7330 Endfittings 2 pcs.FK7340 Sealings and sieves 4 pcs. eachFK7350 Endstoppers 2 pcs.

ClinChek® Controls:MS7080 Serum Control, lyophil., Level I 10 x 1 mlMS7081 Serum Control, lyophil., Level II 10 x 1 mlMS7082 Serum Control, lyophil., Level I, II 2 x 5 x 1 ml


2.1.1 Informazioni per la sicurezza

Diversi componenti del kit come la fase mobile e i reagenti sono preparazioni chimiche che possono contenere sostanze pericolose. Per informazioni sulla sicurezza consultare le rispettive schede di sicurezza (SDS) di ogni componente.

I calibratori sono preparati con siero di origine animale (siero di cavallo). Sebbene il siero sia controllato a livello veterinario in termini di regolamentazione EC 1774/2002 deve essere considerato come potenzialmente infetto. Si raccomanda di maneggiare questo prodotto con le stesse precauzioni usate per i campioni dei pazienti. Dettagliate informazioni per la sicurezza sono fornite nell’appropriata scheda di sicurezza.

Il materiale di controllo è preparato in siero umano. Sebbene il prodotto sia testato per l’assenza dei comuni marcatori d’infezione, deve essere considerato come potenzialmente infetto. Si raccomanda di maneggiare questo prodotto con le stesse precauzioni usate per i campioni dei pazienti. Dettagliate informazioni per la sicurezza sono fornite nell’appropriata scheda di sicurezza.

2.1.2 Condizioni di conservazione e durata dei componenti del kit

Sballare i componenti del kit dalla confezione di trasporto immediatamente dopo averlo ricevuto e seguire le indicazioni di conservazione indicate sulle etichette dei prodotti e in tabella 1.

I componenti inutilizzati, conservati nelle condizioni appropriate, possono essere usati fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta del prodotto.

Dopo l’uso dei reagenti ClinMass®, della fase mobile ClinMass® e dell’SPE buffer ClinMass®, le bottiglie devono essere chiuse e conservate immediatamente nelle condizioni indicate. Se vengono seguite le corrette procedure di conservazione la stabilità dei reagenti è la stessa dei prodotti ancora chiusi.

Per le condizioni di conservazione e la stabilità dello Standard Interno ClinMass®, delle mix di ottimizzazione ClinMass® , dei calibratori ClinCal® e dei controlli ClinChek® (liofili / dopo ricostituzione) riferirsi ai rispettivi fogli illustrativi dei prodotti. Tabella 1: Condizioni di conservazione dei componenti del kit

Ordine num. Descrizione del prodotto Condizioni di conservazione

MS7005 Sol. di lavaggio dell’autocampionatore

Conservare a 15 - 30 °C

MS7009 SPE - Buffer


MS7010 Fase Mobile


MS7012 IS Standard Interno

Conservare sotto - 18 °C

MS7013 Calibratori sierici, liofili

Conservare sotto - 18 °C*


MS7014 Mix di ottimizzazione

Conservare sotto - 18 °C

MS7015 Mix di ottimizzazione 3-epi Conservare sotto - 18 °C

MS7020 Vials per la fase preparativa Conservare a temperature ambiente

MS7021 P Precipitante


MS7030 Colonna Analitica


MS7035 Colonna Analitica 3-epi


MS7031 Colonna SPE


FK7400 Inline-Filter Conservare a temperature ambiente

FK1102 Switching valve Sykam (6-porte / 3-canali)

Conservare a temperature ambiente

FK7330 Endfittings Conservare a temperature ambiente

FK7340 Sealings and sieves Conservare a temperature ambiente

FK7350 Endstoppers Conservare a temperature ambiente

MS7080- MS7082

Controlli sierici, Livelli I, II, I+II

Conservare sotto - 18 °C*

* Si riferisce al prodotto liofilo. Per le condizioni di conservazione dopo la ricostituzione riferirsi al foglio illustrativo.

2.1.3 Disposizioni per lo smaltimento

Per lo smaltimento i rifiuti devono essere raccolti separatamente in base alle diverse proprietà chimiche dei prodotti. Indicazioni per lo smaltimento dei prodotti e il rispettivo confezionamento sono riportate nella sezione 13 delle rispettive schede di sicurezza.


3 Strumentazione richiesta

Per l’utilizzo di questo kit è richiesto un sistema HPLC equipaggiato con uno spettrometro di massa tandem (LC-MS/MS) e software di gestione.

Requisiti per lo spettrometro di massa tandem:

Spettrometro di massa tandem con sufficiente sensibilità.

Moduli LC richiesti:

● Autocampionatore (con funzione di raffreddamento, 4 °C)

● Pompa isocratica HPLC 1 (SPE - buffer)

● Pompa isocratica HPLC 2 (fase mobile)

● 6-porte-3-canali-switching valve (e.s. RECIPE, ordine num. FK1102)

● Riscaldatore di colonna (40 °C)

● Degasatore (opzionale)

Per la fase preparativa dei campioni sono richiesti i seguenti strumenti da laboratorio:

● Pipette e puntali

● Centrifuga da banco

● Vortex


4 Operazioni sul sistema analitico

4.1 Configurazione del sistema LC

Connettere i moduli LC (P1, P2, AS) e la switching valve (ASV) automatica come mostrato nella figura sottostante, con eccezione delle (SPE, AC). Inserire il capillare terminale in un contenitore adeguato per lo scarico.

4.2 Flussare il sistema LC

Impostare entrambe le pompe HPLC (P1, P2) ad un flusso di 1 ml/min e flussare il sistema LC con 10 ml di SPE buffer e fase mobile rispettivamente.

Successivamente collegare la colonna SPE (SPE) e l’a colonna analitica (AC) come mostrato in figura 3. La colonna analitica deve essere installata nel riscaldatore di colonna (CH).

Quando si collegano la colonna SPE e la colonna analitica prestare attenzione che la direzione del flusso segua la direzione indicata con le frecce sulle colonne stesse!

Figura 3: Configurazione del sistema LC

Abbreviazioni: P1: pompa isocratica HPLC (SPE-buffer); P2: pompa isocratica HPLC (fase mobile); AS: autocampionatore; PF: inline-filter (ordine no. FK7400); ASV: automatica switching valve (switching valve, 6-porte/3-canali ad alta pressione; ordine no. FK1102); SPE: Colonna SPE; AC: Colonna analitica; CH: riscaldatore di colonna

AS

P1

PF

P2

SPE scarico

AC

scarico

ASV 4

5 6

1

2 3

CH


4.3 Equilibrazione del sistema LC

Dopo aver flussato il sistema (vedere sezione 4.3) l’equilibrazione deve essere eseguita come segue:

● Impostare entrambe le pompe HPLC (P1, P2) ad un flusso di 0.5 ml/min, impostare il forno portacolonne a 40 °C e flussare approssimativamente 10 ml di SPE-buffer e di fase mobile rispettivamente attraverso la colonna.

● Successivamente, fermare le pompe HPLC e collegare il capillare in uscita dalla colonna analitica allo spettrometro di massa.

4.4 Inizializzare il sistema analitico

La sezione seguente fornisce i parametri per il sistema LC (vedere sezione 4.4.1) e per lo spettrometro di massa (vedere sezione 4.4.2). Per l’ottimizzazione, l’equilibrazione e per l’analisi, come per la calibrazione del sistema LC-MS/MS riferirsi alla sezione 5.3.

Consultare il manuale dello spettrometro di massa per assicurarsi un corretto uso dello strumento. È consigliato anche un corso agli operatori da parte dell’azienda fornitrice della strumentazione.

4.4.1 Parametri LC

Tabella 2: parametri LC

Pompa HPLC 1, Isocratica (SPE-buffer):

Flussi usati: 0.1 ml/min, 2.0 ml/min, 5.0 ml/min;

vedere tabella 3

Pompa HPLC 2, Isocratica (fase mobile):

Flusso usato: 0.5 ml/min

vedere tabella 3

SPE-Buffer / fase mobile:

Assicurarsi che le bottiglie siano ben chiuse per evitare l’alterazione dei tempi di ritenzione per l’evaporazione di alcuni componenti dell’SPE-buffer e della fase mobile.

Colonna: La colonna analitica va installata nel forno portacolonna (40° C).

Ad un flusso di 0.5 ml/min, la contropressione della colonna analitica (ordine num. MS7030) non deve superare i 250 bar*. Ad un flusso di 5.0 ml/min, la contropressione della colonna SPE non deve superare i 20 bar.

I filtri di ricambio del filtro in linea (PF) devono essere sostituiti ogni 300 iniezioni. Queste parti devono essere sostituite se la contropressione del filtro in linea super i 20 bar (ad un flusso di 5.0 ml/min).

* In caso venga usata la colonna con numero d’ordine MS7035, la contropressione della colonna non deve superare i 350 bar.

Riscaldatore di colonna: 40 °C


Autocampionatore: Impostare la funzione di raffreddamento dell’autocampionatore a 4°C. Per il lavaggio del sistema d’iniezione è disponibile una soluzione di lavaggio dell’autocampionatore (ordine num. MS7005). Riferirsi al manuale d’istruzioni dell’autocampionatore.

Volume d’iniezione: 10 - 50 µl

Intervallo d’iniezione: 3 min (4 min*)

* al posto della colonna analitica con numero d’ordine MS7030, può essere usata la colonna con numero d’ordine MS7035 (vedere sezione 1.3). L’intervallo d’iniezione viene prolungato a 4 minuti (vedere la tabella 3).

Switching valve automatica: vedere sezione 4.4.1.1


4.4.1.1 Switching valve automatica (analisi on-line)

L’analisi viene eseguita on-line mediante l’uso della switching valve automatica a 6 porte e 3 canali. Una descrizione del principio di funzionamento viene data in figura 4.

* in caso di uso della colonna analitica con num. d’ordine MS7035

Figura 4: Switching valve automatica e configurazione del sistema LC

Abbreviazioni: P1: pompa HPLC isocratica (SPE-buffer); P2: pompa HPLC isocratica (fase mobile); AS: autocampionatore; PF: inline-filter (ordine no. FK7400); ASV: switching valve automatica (valvola ad alta pressione, 6-porte/3-canali, ordine no. FK1102); SPE: colonna SPE; AC: colonna analitica; CH: forno portacolonne; MS: spettrometro di massa tandem

ASV posizione “load”: 0.00 – 0.75 min: Il campione viene iniettato nel sistema LC e trasferito nella colonna SPE, che selettivamente estrae gli analiti dalla matrice del campione. I componenti della matrice vengono lavati dalla colonna SPE e portati allo scarico. Nel frattempo, la colonna analitica viene riequilibrata dal precedente ciclo d’iniezione.

ASV posizione “inject”: 0.75 – 2.20 min: La switching valve automatica passa nella posizione di “inject”. Gli analiti estratti vengono eluiti dalla colonna SPE con fase mobile in controflusso. Vengono trasferiti alla colonna analitica dove vengono separati cromatograficamente.

ASV posizione “load”: 2.20 – 3.00 min (4.00 min*): La switching valve automatica torna nella posizione di “load”. Entrambe le colonne (colonna SPE e analitica) vengono riequilibrate per la successiva iniezione.

AS

P1

PF

P2

SPEwaste

AC

exhaust

CH

MS

ASV

5 6

1

2 3

4

ASV position: „inject“ AS

P1

PF

P2

SPE waste

AC

exhaust

CH

ASV 4

5 6

1

2 3

MS

ASV position: „load“


I tempi di rotazione e le posizioni della switching valve automatica (ASV), i flussi delle pompe HPLC P1 e P2 devono essere programmati secondo la tabella seguente. Tabella 3: tempi di rotazione e posizioni della switching valve automatica, flussi delle pompe HPLC (P1, P2)

Tempo [min]

Posizione ASV

Pompa P1 (SPE buffer) Pompa P2 (fase mobile)

Flusso [ml/min]

Evento colonna SPE

Flusso [ml/min]

Evento colonna analitica

0.00 load 0.1 Caricamento 0.5 Equilibrazione

0.01 5.0

0.75 inject 5.0 Eluizione 0.5 Caricamento

0.85 0.1 Separazione

2.15 0.1

2.20 load 2.0 Equilibrazione 0.5 Equilibrazione

2.85 2.0

2.90 0.1

3.00* 0.1

* Al posto della colonna analitica con num. d’ordine MS7030 può essere opzionalmente usata la colonna analitica con num. d’ordine MS7035 (vedere sezione 1.3). L’intervallo d’iniezione si allunga a 4.00 min.

4.4.2 Parametri MS/MS

I parametri MS/MS indicati nelle tabelle seguenti rappresentano solo valori indicativi. Questi parametri si applicano alle transizioni di massa dei singoli parametri. Questi valori rappresentano un punto di partenza per l’ottimizzazione. I parametri ottimali differiscono tra i diversi sistemi MS/MS, devono essere quindi ottimizzati sul sistema in uso (vedere sezione 5.3.1). Per la quantificazione è disponibile uno Standard Interno ClinMass® (contiene d6-25-OH-vitamina D3) con num. d’ordine MS7012.


I seguenti parametri si riferiscono al sistema MS/MS API 4000™. Tabella 4: parametri MS/MS, API 4000™

Ion Source Heated Nebuliser (APcI), positive

Resolution Q1 and Q3 unit (0.7 amu)

GS 1 40

GS 2 -

Curtain Gas (CUR) 40

Collision Gas (CAD) 6

Source Temperature 400 °C

Interface Heater ON

Nebuliser Current (NC) 3

Mass transitions Vedere tabella 5

Tabella 5: Transizioni di massa e parametri specifici per API 4000™

Analita Precursore

[amu] Prodotto

[amu]

Dwell time [sec]

DP [V]

CE [V]

CXP[V]

EP [V]

25-OH-Vitamina D2 (quantificatore) 395.2 209.2 50 56 39 14 10

25-OH-Vitamina D2 (qualificatore) 395.2 269.1 50 56 30 21 10

25-OH-Vitamina D3 (quantificatore) 383.2 257.2 50 36 28 17 10

25-OH-Vitamina D3 (qualificatore) 383.2 211.2 50 36 36 20 10

d6-25-OH-Vitamina D3 (quantificatore) 389.2 263.2 50 36 28 17 10

d6-25-OH-Vitamina D3 alternativo 389.2 211.2 50 36 36 20 10

4.5 Modalità Standby

Quando il sistema analitico non è in uso, le pompe devono essere spente. L’SPE buffer e la fase mobile possono essere lasciate nel sistema LC.

Le pompe da vuoto dello spettrometro di massa tandem (sistema MS/MS) devono essere permanentemente in funzione. Al fine di preservare la sorgente ionica e il moltiplicatore, il sistema MS/MS può essere messo in modalità di standby. Per periodi di inattività più lunghi la colonna SPE e la colonna analitica devono essere disconnesse e conservate chiuse. Il sistema LC deve essere flussato con una miscela di acqua/metanolo (1:1).


5 Implementazione della procedura analitica

5.1 Raccolta e conservazione dei campioni

La determinazione della 25-OH-vitamina D può essere eseguita in plasma e siero.

I campioni possono essere conservati fino a 2 giorni a temperatura ambiente (15 - 30 °C), fino a 4 giorni a temperatura compresa tra 2 - 8 °C e fino a 4 settimane a temperatura di -18 °C (ripetuti cicli di congelamento/scongelamento devono comunque essere evitati).

5.2 Preparazione del campione 5.2.1 Ricostituzione dei calibratori / controlli sierici liofili

I calibratori sierici ClinCal® ed i controlli sierici ClinChek® (ordine num. MS7013 e MS7080-82), (vedere sezione 2.1.1) sono liofili e devono quindi essere ricostituiti prima dell’uso. Le indicazioni riguardo alla ricostituzione e alla concentrazione degli analiti e le informazioni riguardo la conservazione e la stabilità, sono riportate nei rispettivi foglietti illustrativi.

5.2.2 Flusso di lavoro

Preparazione del campione:

Precipitazione: 150 µl miscela IS/P* 50 µl campione (calibratore, controllo, paziente)

Agitare per 30 sec (vortex mixer) incubare (10 min, 4 °C)

Agitare per 10 sec (vortex-mixer) centrifugare (5 min, 10000 x g)

Analisi LC-MS/MS: iniettare 10 - 50 µl

* Note: Per la precipitazione viene utilizzata una miscela (miscela IS/P) contenente lo Standard Interno IS e il Precipitante P (vedere sezione 5.2.2.1).


5.2.2.1 Preparazione della miscela IS/P

Lo Standard Interno IS e il Precipitante P possono essere premiscelati (miscela IS/P) in base al numero di campioni da analizzare (vedere tabella 6). La miscela IS/P deve essere usata per la precipitazione della matrice come descritto nella sezione 5.2.2.2. Tabella 6:Preparazione della miscela IS/P in base al numero di campioni

Numero di campioni

Standard Interno IS [ml]

Precipitante P [ml]

Volume totale della miscela IS/P [ml]

50 5.0 2.5 7.5

100 10.0 5.0 15.0

300 30.0 15.0 45.0

La miscela IS/P può essere conservata fino a 4 settimane ad una temperatura di 2 - 8 °C.

Note: A causa della temperatura di conservazione si può formare un precipitato nella miscela IS/P che generalmente si dissolve a temperatura ambiente. Il precipitato non ha un effetto negativo sulla funzionalità della miscela IS/P.

5.2.2.2 Precipitazione

Pipettare 150 µl della miscela IS/P (per la preparazione vedere 5.2.2.1) in una provetta di preparazione del campione (ordine num. MS7020) ed aggiungere 50 µl di campione (calibratore, controllo, paziente). Agitare per 30 sec su un vortex mixer ed incubare 10 min a 4 °C. Agitare ancora per 10 sec su un vortex mixer e centrifugare per 5 min a 10000 x g.

5.2.2.3 Analisi LC-MS/MS

Trasferire un’aliquota del surnatante in una provetta adatta per l’autocampionatore in uso. Il volume d’iniezione può variare tra 10 - 50 µl in base alla sensibilità dello spettrometro di massa utilizzato.

5.2.2.4 Stabilità dei campioni preparati

I campioni di plasma e siero preparati possono essere conservati fino a 3 giorni a temperatura ambiente (15 - 30 °C), fino a 1 settimana a temperatura compresa tra 2 - 8 °C e fino a 3 mesi a temperatura di -18 °C (evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento).


5.3 Analisi LC-MS/MS

Indipendentemente dal metodo analitico, l’accuratezza di massa dello spettrometro di massa tandem (MS/MS) deve essere controllata ad intervalli regolari. Potrebbe essere richiesta una calibrazione delle masse.

Per informazioni riguardo il controllo del sistema MS/MS, riferirsi alla documentazione fornita dal produttore dello strumento.

5.3.1 Ottimizzazione degli analiti (MS/MS)

L’ottimizzazione del sistema MS/MS comprende l’ottimizzazione dei parametri della sorgente ionica e dei parametri legati alle specifiche transizioni di massa degli analiti. Per questo scopo è disponibile un’optimisation mix (ordine num. MS7014) contenente gli analiti 25-OH-vitamina D2, 25-OH-vitamina D3 e lo standard interno (d6-25-OH-vitamina D3). In base alla sensibilità del sistema MS/MS in uso, può essere necessaria una diluizione dell’optimisation mix in metanolo.

Note: Per la determinazione dell’epimero C-3, possono essere usati i parametri MS/MS della 25-OH-vitamina D2 / D3 (vedere sezione 4.4.2).

5.3.2 Equilibrazione del sistema analitico e corsa test

Equilibrare il sistema analitico per almeno 30 minuti prima di iniettare l’intero campione.

All’inizio di ogni serie analitica devono essere eseguite diverse iniezioni di SPE buffer. Questa procedura permette di ottenere risultati analitici riproducibili già dal primo campione iniettato.

Per eseguire una corsa test, iniettare ripetutamente l’optimisation mix finchè due cromatogrammi consecutivi sono comparabili come tempi di ritenzione e area dei picchi.

Per il sistema MS/MS API 4000™ si raccomanda una diluizione 1:20 dell’optimisation mix con 50 % di metanolo. In base alla sensibilità del sistema MS/MS in uso può essere necessaria un’ulteriore diluizione.

Note: Per una corsa test per la separazione dell’epimero C-3, è disponibile un’ulteriore optimisation mix con ordine num. MS7015. Per l’ottimizzazione dello spettrometro di massa tandem (vedere sezione 5.3.1) può essere usata l’optimisation mix con ordine num. MS7014.

Per il sistema MS/MS API4000™ si raccomanda una diluizione 1:4 dell’optimisation mix (ordine num. MS7015) con una soluzione al 50 % di metanolo.

5.3.3 Calibrazione

Per la calibrazione è disponibile un set di calibratori sierici a 4 livelli ClinCal® (Levelli 0 - 3, ordine num. MS7013).

Dopo la ricostituzione (vedere sezione 5.2.1) i calibratori devono essere preparati nello stesso modo dei campioni dei pazienti (vedere sezione 5.2).

Per ogni serie analitica è necessario l’utilizzo di calibratori preparati al momento.


5.3.4 Controllo di qualità

Per il controllo di qualità del dosaggio analitico sono disponibili controlli sierici ClinChek® in due differenti concentrazioni (livello I, ordine num. MS7080; livello II, ordine num. MS7081; livello I+II, ordine num. MS7082).

Dopo la ricostituzione (vedere sezione 5.2.1) i controlli devono essere preparati nello stesso modo dei campioni dei pazienti (vedere sezione 5.2).

Per ogni serie analitica è necessario l’utilizzo di controlli preparati al momento. Nel caso di lunghe serie analitiche si raccomanda di iniettare i controlli anche alla fine della serie stessa.


5.3.5 Esempi di cromatogrammi

5.3.5.1 Calibratore sierico ClinCal®

Cromatogrammi del calibratore sierico ClinCal® (ordine num. MS7013), livello 2, ottenuti col sistema MS/MS API 4000™.

Figura 5: Cromatogrammi del calibratore sierico ClinCal® (MS7013), livello 2, volume d’iniezione: 50 µl

25-OH-vitamina D2

25-OH-vitamina D3

d6-25-OH-vitamina D3


5.3.5.2 Campioni con epimero C-3 (3-epi-25-OH-vitamina D3)

La figura 6 mostra dei cromatogrammi di campioni contenenti 3-epi-25-OH-vitamina D3 ottenuti da pazienti reali e per aggiunta. I cromatogrammi sono stati ottenuti con le colonne analitiche con num. d’ordine MS7030 (3 min) e MS7035 (4 min).

Figura 6: Cromatogrammi ottenuti con le colonne analitiche MS7030 (a, c, e) e MS7035 (b, d, f). a, b: Siero umano, 31 µg/l 25-OH-vitamina D3, con l’aggiunta di 5 µg/l 3-epi-25-OH-vitamina D3; c, d: Siero umano, 31 µg/l 25-OH-vitamina D3, con l’aggiunta di 17 µg/l 3-epi-25-OH-vitamina D3; e, f: Siero di paziente (età < 1 anno), nativo, 29 µg/l 25-OH-vitamina D3, 5 µg/l 3-epi-25-OH-vitamina D3

a b

c d

e f

25-OH-vit D3 25-OH-vit D3



3-epi-25-OH-vit D3

3-epi-25-OH-vit D3 3-epi-25-OH-vit D3

3-epi-25-OH-vit D3

3-epi-25-OH-vit D3 3-epi-25-OH-vit D3


6 Valutazione

La rilevazione degli analiti è stata eseguita usando transizioni di massa specifiche per ogni composto (vedere sezione 4.4.2).

La valutazione della concentrazione degli analiti è stata eseguita con il metodo dello standard interno usando l’area dei picchi.

Le curve di calibrazione sono state ottenute dai calibratori incrociando nel grafico il rapporto tra area del picco dell’analita/area del picco dello standard interno contro il rapporto tra la concentrazione dell’analita/concentrazione dello standard interno.

Le concentrazioni degli analiti nei campioni e nei controlli sono calcolate dalla curva di calibrazione.

Riferirsi al manuale d’uso del software del produttore del sistema MS/MS per assicurarsi una corretta valutazione dei risultati.

Per la conversione delle concentrazioni di massa [µg/l] in concentrazioni molari [nmol/l] e viceversa, i risultati analitici devono essere moltiplicati con i fattori riportati in tabella 7. Tabella 7: Fattori di conversione

Analita Peso molecolare

[g/mol] Fattore di conversione:

nmol/l --> µg/l Fattore di conversione:

µg/l --> nmol/l

25-OH-Vitamina D2 412.7 0.413 2.42

25-OH-Vitamina D3 400.6 0.401 2.50


7 Test dati

7.1 Validazione

La validazione del metodo è stata eseguita con un sistema LC Agilent 1200 e con un sistema MS/MS API 4000™.

7.1.1 Linearità, limiti di rilevazione e quantificazione

Tabella 8: Linearità, limiti di rilevazione e quantificazione

25-OH-Vitamina D2 25-OH-Vitamina D3

LLOD [µg/l]* 0.43 0.67

LLOQ [µg/l]** 1.44 2.25

Linearity [µg/l] 1.44 - 250 2.25 - 250

*LLOD: Lower limit of detection, S/N=3, **LLOQ: Lower limit of quantitation, S/N=10

7.1.2 Recupero

Per la 25-OH-vitamina D2 e la 25-OH-vitamina D3, il recupero medio dalle prove effettuate è compreso tra 92 - 103 %.

7.1.3 Precisione

Per la valutazione della precisione intraserie e interserie, sono stati usati campioni con tre concentrazioni differenti (vedere tabella 9).

Tabella 9: Concentrazioni di 25-OH-vitamina D2 e 25-OH-vitamina D3

25-OH-Vitamina D2 [µg/l]

25-OH-Vitamina D3 [µg/l]

Campione 1 10.9 9.57




7.1.3.1 Intraserie

Per la determinazione della precisione intraserie i campioni sono stati misurati in 3 serie analitiche differenti con 8 ripetizioni per ciascuna serie (n = 24; n: numero di valori per campione). I coefficienti di variazione ottenuti (CV) sono mostrati nella tabella 10 (valori medi). Tabella 10: Precisione intraserie

25-OH-Vitamina D2

CV [%] 25-OH-Vitamina D3

CV [%]

Campione 1 7.4 5.1

Campione 2 6.9 5.1

Campione 3 6.0 3.9

7.1.3.2 Interserie

Per la determinazione della precisione intraserie i campioni sono stati misurati in 8 serie analitiche differenti con 3 ripetizioni per ciascuna serie (n = 24; n: numero di valori per campione). I coefficienti di variazione ottenuti (CV) sono mostrati nella tabella 11 (valori medi). Tabella 11: Precisione interserie

25-OH-Vitamina D2

CV [%] 25-OH-Vitamina D3

CV [%]

Campione 1 8.7 8.8

Campione 2 7.3 6.4

Campione 3 6.9 4.7


7.2 Intervalli di riferimento

In accordo con [5, 6] un sufficiente apporto di vitamina D è assicurato quando la concentrazione di 25-OH-vitamina D è > 30 µg/l.

La classificazione dello stato di vitamina D in accordo con [1] è mostrata in tabella 12. Tabella 12: Classificazione dello stato di vitamina D in accordo con [1]

25-OH-Vitamina D [µg/l]

Classificazione

< 5.0 Severa carenza di vitamina D (porta a rachitismo e osteoporosi)

5.0 – 10 Moderata carenza di vitamina D

10 – 20 Leggera carenza di vitamina D = insufficienza di vitamina D

20 – 70 Sufficiente livello di vitamina D (intervallo di normalità)

30 – 70 Desiderabile per il trattamento di osteoporosi, pazienti con funzionalità renale ridotta o in dialisi (linee guida K/DOQI), prevenzione contro il cancro e malattie autoimmuni

70 – 100 Osservati dopo una forte esposizione a luce UV, vacanze in località soleggiate

> 100 Inizio d’intossicazione

Gli intervalli di riferimento indicati sono stati estrapolati da recenti pubblicazioni scientifiche selezionate. Le pubblicazioni corrispondono alla data di stampa di questo documento. Da notare che questi intervalli non rappresentano un’indicazione da parte del produttore di questo prodotto, ma possono essere usati come linee guida per la messa a punto dei propri intervalli di riferimento da parte del laboratorio clinico.


8 Referenze

[1] G.R. Hart, J.L. Furniss, D. Laurie, S.K. Durham: Measurement of Vitamin D Status: Background, Clinical Use, and Methodologies, Clin. Lab. 2006, 52, 335-343.

[2] E.D. Collins, A.W. Norman: Vitamin D, in: L. J. Machlin (ed.): Handbook of Vitamins, 2nd ed., Marcel Dekker, New York 1991, S. 59-98.

[3] W. Bayer, K. Schmidt: Vitamine in Prävention und Therapie, Hippokrates-Verlag, Stuttgart 1991, S. 31 ff.

[4] A.M. Gressner, T. Arndt (Eds.): Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik, Band 1 Klinische Chemie, 1. Auflage Springer Medizin Verlag Heidelberg 2007, Seiten 1351 ff.

[5] E. Cavalier, P. Delanaye, J. Chapelle, J. Souberbielle: Vitamin D: Current Status and Perspectives, Clin. Chem. Lab. Med. 2009, 47(2), 120-127.

[6] E. Hyppönen, C. Power: Hypovitaminosis D in British Adults at Age 45 y: Nationwide Cohort Study of Dietary and Lifestyle Predictors: Am. J. Clin. Nutr. 2007, 85, 860-868.

[7] K. H. Bässler, I. Golly, D. Loew, K. Pietrzik: Vitamin-Lexikon, 3. Auflage, Urban & Fischer Verlag, München Jena 2002, S. 380-384.

[8] H. Schmidt-Gayk, H.J. Roth: Vitamin D – das Sonnenvitamin in: Labor & More 03/2007 S. 48, Succidia Verlag.

[9] R. J. Singh, R. L. Taylor, G. S. Reddy, S. K. G. Grebe: C-3 epimers can account for a significant proportion of total circulating 25-hydroxyvitamin D in infants, complicating accurate measurement and interpretation of vitamin D status, J Clin Endocrinol Metab 2006, 91, 3055–61.

[10] F. G. Strathmann, K. Sadilkova, T. J. Laha, S. E. LeSourd, J. A. Bornhorst, A. N. Hoofnagle, R. Jack: 3-epi-25 hydroxyvitamin D concentrations are not correlated with age in a cohort of infants and adults, Clin Chim Acta 2012, 413, 203–6.

[11] I. Shah, A. Petroczi, D. P. Naughton: Method for simultaneous analysis of eight analogues of vitamin D using liquid chromatography tandem mass spectrometry, Chemistry Central Journal 2012, 6, 112.

[12] E. A. Yetley, C. M. Pfeiffer, R. L. Schleicher, et al.: NHANES monitoring of serum 25-hydroxyvitamin D: a roundtable summary, J Nutr 2010, 140, 2030S–45S.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3505479/�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3505479/�


9 Risoluzione dei problemi Problema Possibile causa Misura correttiva

Profilo del gradiente non generato

Pompa HPLC difettosa Controllare le pompe

Bolla d’aria nel sistema Degasare la fase mobile e flussare l’HPLC

Fluttuazioni del flusso Controllare le pompe

Segnali interferenti Sistema d’iniezione contaminato

● Sciacquare con metanolo o iniettare 10 volte fase mobile

● Controllare il livello della soluzione di lavaggio

● Pulire/sostituire l’ago d’iniezione e la porta d’iniezione

Vial del campione contaminata

Usare una nuova vial

Contaminazione del setto della vial

Usare un nuovo setto

Fase mobile contaminata Cambiare la fase mobile e flussare il sistema

Colonna analitica contaminata Cambiare la colonna analitica

Risoluzione di massa troppo bassa

Ottimizzare la risoluzione di massa

Sistema non installato correttamente

Controllare tutte le connessioni

Nessun segnale Iniettore difettoso Controllare l’iniettore

Pompa HPLC difettosa Controllare le pompe

Sistema MS/MS non operativo Controllare il sistema MS/MS

Diminuzione della sensibilità Sorgente ionica contaminata Pulire la sorgente ionica

Spettrometro di massa contaminato

Pulire lo spettrometro di massa

Perdita sulla valvola d’iniezione

Controllare l’iniettore

Spostamento della calibrazione di massa

Ricalibrare il sistema MS/MS

Risoluzione di massa troppo bassa/alta

Ottimizzare la risoluzione di massa


Problema Possibile causa Misura correttiva

Alte fluttuazioni del segnale Instabilità dello spray Controllare il capillare nell’ago dello spray e, se necessario, pulirlo o sostituirlo

Fluttuazioni del flusso Controllare la pompa HPLC

Flusso di gas instabile Controllare le linee dei gas

Assenza del vuoto Pompe da vuoto difettose Controllare le pompe da vuoto

Perdite nel sistema del vuoto Controllare i tubi e le connessioni del vuoto

Assenza di gas Generatore d’azoto difettoso Controllare il generatore d’azoto

Compressore difettoso Controllare il compressore

Bombola di gas vuota Sostituire la bombola di gas

Pressioni dei gas in entrata non nell’intervallo specificato

Regolare le pressioni dei gas in entrata


10 Appendice: Dichiarazione di Conformità EC

Declaration of Conformity

for in-vitro diagnostic medical devices, acc. to article 9 (1) of the directive 98/79/EC

The company

RECIPE Chemicals + Instruments GmbH Dessauerstraße 3 80992 Munich / Germany

declares that the CE labeled product

ClinMass® Complete Kit for 25-OH-Vitamin D2/D3 (order no. MS7000)

meets all applicable provisions of the directive on in-vitro diagnostic medical devices 98/79/EC. The conformity assessment was performed according to annex III. The technical documentation is held according to annex III no. 3.

Munich, 08.05.2013

Alfred Bauer General Manager

25-oh-vitamina d2/d3 in plasma e siero – analisi on-line · studi recentemente pubblicati...

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