Degradacion de cocaína por un cultivo mixto de

Pseudomonas fluorescens y Comamonas acidvorans

Quim. Alberto García

DIANE L. LISTER, RIZWANA F. SPROULE, ADRIAN J. BRITT,CHRISTOPHER R. LOWE, AND NEIL C. BRUCE*

Institute of Biotechnology, University of Cambridge,Cambridge CB2 1QT, United Kingdom

•De las hojas del erythroxylon coca y

e. Novogranatense, alcaloide tropanico.

• Estimulante del SNC , sentimiento placentero

• Su funcion natural no es conocida, recientes estudios indicarian que es insecticida.

• Bloquea receptores presinapticos de la dopamina

Cocaína

Algunos M.O. que degradan cocaína

Estearasas

• Rhodococcus s.p MB1

• Pseudomonas maltophilias MB11L

Otras Pseudomonas degradan atropinoides pero no cocaína.

Estearasas humanas (plasma) que degradan la cocaina :

Butirlicolinesterasas

Crecimiento del cultivo mixto y sus productos de degradacion.

Pseudomonas fluorescens y Comamonas acidvorans

Aislados de una fabrica de procesamiento de cocaina

Medio: 10mM cocaína como fuente de C y energia

Mayor proporcion de P. fluorescens (conteo de celulas viables) en la fase de crecimiento

HPLC, GC-MS , acumulaciuon de metabolitos: benzoato, ecgonina , ester metilico de ecgonina,

Pseudomonas fluorescens y Comamonas acidvorans

Crecimiento mixto y por separado en 10 mM de cocaina

Mejoro crecimiento con 5 mM de cocaina

.

Crecimiento de Pseudomonas fluorescens y Comamonas acidvorans en cultivos que contienen los productos de degradación

C. Acidvorans : Benzoato 10 mM : no creció

C. Acidvorans : Benzoato 5 mM : creció relativamente bien

C. Acidvorans : Ecgonina y ecgonina metil ester : no creció

P. Fluorescens : Benzoato, ecgonina y su metil ester : crecio

Fueron ademas incapaces de crecer en atropina y tropina como unicas fuentes de carbono

Dependencia de uno de los m.o. con respecto al otro

Lado izquierdo

P.Fluorescens

Lado derecho:

C. acidovoransCocaína Ecgonina Benzoato

En cocaína 10mM: Sólo P. fluorescens adyacente a C. acidovorans (donde hay poca conc de cocaína) y C. acidovorans solo crecio adyacente a P. fluorescens (donde hay poca conc de benzoato)

C. Acidovorans no crecio en placas con ecgonina (aun en presencia de P. fluorescens)

P. fluorescens si creció en benzoato y ecgonina como fuente de C.

Y presento una tipica curva diauxica. Benzoato fue usado antes que ecgonina

C. acidovorans

P. fluorescens

Identificacion de cocaina-estearasa inducible

Extractos crudos de C. acidovorans : transforman cocaína a ac benzoico de ecgonina metil ester (HPLC y GC-MS)

No se notó esto en extracto hervido

Se demostró existencia de cocaína estearasa.

Esta es inducible ya que la actividad de la enzima en extractos crudos a partir de celulas crecidas en succinato fue solo de 0.014 frente a los 0.048Ú/mg con cocaina

Extractos de P. Fluorescens no presento tener cocaina estearasa

Identificacion de enzimas para el metabolismo de ecgonina metil ester

P. Fluorescens , extracto celular crecido en 10mM de ecgonina metil ester o de ecgonina, degrado la ecgonina metil ester a ecgonina (según TLC y GC-MS)

No se notó esto en extracto hervido

Se demostró existencia de ecgoninametilester - estearasa.

Esta enzima es inducible ya que la enzima extraida a partir de celulas crecidas en succinato no presento actividad esterolitica Extractos de P. Fluorescens no presento tener cocaina estearasa

• Otros metabolitos

Por TLC y GC-MS se observo un metabolito adicional en los extractos de las incubaciones con acgoninametil ester y ecgonina, identico a la ecgonina por GC-MS , por TLC resulto ser la pseudoecgonina, se interconvertian, estaban en equilibrio.Se demuestra entonces presencia de epimerasa. ( Epimero del C-2 en el anillo tropanico)

Epimerasa es inducida por el anillo tropanico de la cocaina.Se demostro que no se necesitaron cofactores adicionales para la actividad de la epimerasa.

• El requerimiento de ATP, CoA y MgCl2 para la actividad sugirio la presencia de una acil CoA sintetasa activa para el grupo C=O de la ecgonina y la pseudoecgonina..

• La formacion de un derivado del acido hidroxamico derivado del posterior tioester confirmoo la reaccion de la acil CoA sintetasa.