diagnose en classificatie van acute leukemieën · 2009-03-13 · dana van kerkhoven en caroline...

Dana Van Kerkhoven en Caroline Brusselmans LAG

Diagnose en classificatie van acute leukemieën


Maligne aandoeningen

• Myelodysplastische Syndromen• Chronische myeloproliferatieve aandoeningen• Chronische lymfoproliferatieve aandoeningen• Acute leukemieën• Plasmacelpathologieën



• Algemeen• Diagnose• Classificatie


Wat is een leukemie?

• Kwaadaardige, ongecontroleerde proliferatie van beenmergcellen ⇨ vorming kloon

• Verdringing van de normale hematopoïetischereeksen ⇨ pancytopenie

• Interferentie met normale functie van het beenmerg

• Leidt tot de dood zonder therapie


Wat is een acute leukemie?

ACUUT CHRONISCHleeftijd alle leeftijden (ALL vnl.

bij kinderen; AML vnl. bij volwassenen)

volwassenen

begin plots insidieus

overleving (onbehandeld)

< 6 maanden 2-6 jaar

leukemische cellen immatuur matuur

anemie mild tot ernstig mild

trombopenie mild tot ernstig mild

WBC variabel verhoogd

organomegalie mild prominent


Oorzaak:

Schade aan genetisch materiaal van de hematopoïetische voorlopercellen

Risicofactoren:

• Congenitale chromosomale abnormaliteiten vb. Down, Turner, Klinefelter,…• Bestraling• Chemicaliën en medicatie: benzeen, chemo,…• Virussen: HTLV, EBV• Immuundeficiënties• Chronische beenmergdysfunctie (MDS, myeloproliferatieve aandoeningen,

aplasie, PNH,…)


Prevalentie:

20-30/100 000 (50% acuut, 50% chronisch)

Kliniek:

• Symptomen cytopeniën (anemie: vermoeidheid, trombopenie: bloedingen, granulocytopenie: infecties)

• Hepatosplenomegalie, lymfadenopathiën (vnl. ALL)• Huidinfiltratie, gingivale hypertrofie en orale letsels (vnl. AML M4/M5)• DIC (vnl. AML M3)• Bot- of gewrichtspijnen (door expansie van de leukemische lijnen in de

beenmergcaviteit)• Neurologische symptomen (bij invasie van het centraal zenuwstelsel) (vnl. ALL)• Testisinvasie (vnl. ALL)


Belang van correcte identificatie van type en subklasse van leukemie

1. Diagnose en behandelingALL: nakijken CZS!AML M3: DIC!

2. Voorspellen prognose

3. Betere communicatie (vergelijking resultaten mogelijk door uniforme en reproduceerbare definities van de diverse vormen van acute leukemie)


Diagnose van acute leukemieën

• Morfologie• Cytochemie• Immuunfenotypering• Cytogenetica• Moleculaire diagnostiek


Morfologie

• Onderscheid leukemie versus andere neoplasmen en niet-neoplastische ziekten

• Onderscheid acute myeloïde leukemie (AML) versus acute lymfoblastische leukemie (ALL)

• Classificatie van de leukemie

Leukemie

Normaal BM


Myeloblast

• 15-20 mm Ø

• kern: groot, overwegend rond-ovaal, fijnmazig chromatinepatroon, meerdere duidelijke nucleoli (2 - 5), N/C 7:1 tot 5:1

• cytoplasma: weinig, lichtblauw (naar de celmembraan toe: donkerder), soms enkele azurofiele (blauwrode) grove korrels, (Auerse staaf)


Lymfoblast

• 10-20 mm Ø

• kern: rond-ovaal (sporadisch gekliefd, geplooid), fijn chromatinepatroon (maar grover dan bij myeloblasten), 1-2 (soms onduidelijke) nucleoli, N/C 7:1 tot 5:1

• cytoplasma: meestal smalle rand, licht tot sterk basofiel, agranulair, soms vacuolisatie, soms aan één kant van de kern gelegen ("hand mirror“appearance)


Monoblast

• 15-25 mm Ø

• kern: rond-ovaal tot ingesnoerd, fijnmazig chromatinepatroon, duidelijke nucleoli (1-2)

• cytoplasma: ruim aanwezig, grijsblauw met soms kleine azurofiele korrels

ALL AML


Cytochemie

Myeloperoxidase(POX)

Niet-specifiek esterase(ANBE)

AML + +(monocytair)

(diffuus)ALL - +/-

(focaal)


Cytochemie


Immuunfenotypering⇨ bepalen antigeenstructuren van de leukemische cel

mbv. monoclonale antistoffen

• Typeert specifieke cellijn (myeloïd versus lymfoïd) en differentiatiestadium (onrijp versus rijp) ⇨ diagnose en subclassificatie van ALL vb. lymfoïde merker: CD19⇨ subclassificatie van AMLvb. myeloïde merker: CD13⇨ bepaling bifenotypische leukemie⇨ immature merkers: CD34, TdT

• Prognostische waarde• Opsporen van minimale residuele ziekte (indien aberrant

fenotype)


Immuunfenotypering

AML• Panmyeloïd:

CD13, CD33, CD65, CD117, anti-myeloperoxidase

• Merkers van maturatie: CD15, CD11b

• Merkers van monocytairedifferentiatie: CD14, CD11b, CD64

• Erythroïde merker: anti-glycophorine

• Megakaryocytaire merker: CD41, CD42a, CD42b, CD61

• Expressie van immaturemerkers:CD34, TdT

ALL• Expressie van lymfoïde

antigenen:

B-cel merkers: CD19, cyCD22T-cel merkers: CD2, CD5, CD7, cyCD3

• Expressie van immaturemerkers:TdT, CD34


Immunofenotypische classificatie van ALL

% of ALL

FAB category

T-cell-associated antigens

B-cell-associated antigens

Surface Ig1

B-cell precursor

80 L1,L2 -2 + -

B-cell 5 L3 - + +

T-cell precursor

15 L1,L2 + - -

1 Ig, immunoglobulin ; 2 -, negatieve; +, positive


Immuunfenotypering en subclassificatie van B-cel ALL

CD19* s/cCD22* cCD79a* CD10 cμ s/c Igκ or s/c Igλ

pro-B + + + - - -

Common ALL + + + + - -

pre-B + + + +/- + -

mature-B + + + +/- +/- +

* ten minste 2 van deze markers moeten getest worden en positief zijn


Immuunfenotypering en subclassificatie van T-cel ALL

cCD3 CD7 CD2* CD5* CD8* sCD3 CD1a

pro-T + + - - - - -

pre-T + + +/- +/- +/- - -

cortical T + +/- +/- +/- +/- +/- +

mature T + +/- +/- +/- +/- + -

*ten minste 1 van deze 3 markers moet positief zijn, behalve voor pro-T


Prognose van ALL gerelateerd tot immunofenotype

Gunstig B cel precursor (CD10+) (Cytogenetische bevindingen beinvloeden de prognose)

Minder gunstig Vroege B cel precursor (CD10-) T cel mature B cel – Slg + (Burkitt’s)


Immuunfenotypering en subclassificatie van AML

• AML M0: positief voor myeloide merkers CD13, CD33

• AML M7: positief voor de thrombocytenmerkersCD41, CD42, CD61

• AML M6: positief voor erythroide merker glycoforineA

• monocytaire leukemie: positief voor monocytairemerkers CD64, CD14


Cytogenetica (karyotypering)• Diagnose van acute leukemieën• Prognostische waarde • Classificatie van acute leukemieën• Startpunt voor identificatie van genen• Opsporen minimale residuele ziekte-recidief

Vb. inv(16) p13;q22


Cytogenetica

• Structurele afwijkingen:• translocaties• inversies• deleties• duplicaties

• Numerieke afwijkingen• hypodiploïdie-

monosomie• hyperdiploïdie - trisomie


Moleculaire diagnostiek

⇨ snelle en specifieke detectie van verscheidene specifieke genetische afwijkingen op moleculair niveau

• Identificatie van fusiegenen– herschikking van genetisch materiaal tgv. structurele defecten

resulteert in de vorming van fusiegenen (PML-RAR, TEL-AML1, etc.)

Vb. inv(16) ⇨ MYH 11/CBFβ• Bepaling van clonaliteit

– T-cel receptor genherschikkingen– Immuunglobuline genherschikkingen

• Opsporen van minimale residuele ziekte– Clonaliteit– Fusiegenen


Cytogenetica en moleculaire diagnostiek

Chromosomale afwijkingen in ALL

Chromosomale afwijkingen in AML

Cytogenetische afwijkingen Betrokken genent(12;21)(q12;q22) TEL/AML-1t(1;19) (q23;p13) PBX/E2At(9;22) (q34;q11) ABL/BCR (p190) t(4;11) (q21;q23)1 V/MLL1

Cytogenetische afwijkingen Betrokken genent(8;21) (q22;q22) ETO/AML1inv(16) (p13;q22) MYH11/CBFbetat(15;17) (q22;q21) PML/RARalfat(6;9) (p23;q34) DEK/CAN t(9;11) (p22;q23) AF9/MLL


Prognose en cytogenetica in ALL

Gunstig Hyperdiploïdie > 50 Cryptic t(12;21) (p12;q22)

Intermediair Hyperdiploïdie 47-50 "Normaal"(diploïdie) del (6q)

Ongunstig Hypodiploïdie : near haploid Near tetraploidie del 17p t(9;22) (q34;q11) t(11q23), gewoonlijk t(4;11) t(1;19) Burkitt


Prognose en cytogenetica in AML

Prognose groep Chromosomale afwijking

Gunstig inv 16 of t(16;16) t (8;21) t(15;17)

Intermediair Trisomie 8 t(9;11)-kinderen "normaal"

Ongunstig Abnormaliteiten chr. 5 en 7 t(11;q23), inv(3q) Complexe afwijkingen


Prognose AML

respons op inductie

relaps

- Ongunstig karyotype of immuunfenotype- > 60 jaar- Secundaire AML- Slechte algemene toestand- WBC > 20000

- Ongunstig karyotype- > 60 jaar- Vertraagde respons op inductie chemotherapie- WBC > 20000- Vrouw- Gestegen LDH


Classificatie: nut?

• Kennis van natuurlijk verloop van de ziekte– genezingskansen/sterftekansen– complicaties– frequentie van recidief– biologie van de ziekte

• Keuze van aangepaste therapie• Vergelijking van resultaten van therapeutische

trials


Classificatie

• 1976, French American British classification(FAB classificatie) – morfologie en cytochemie, soms aangevuld door immuunfenotypering

• 1999, World Health Organisation classificationproposals (WHO classificatie)– kliniek, morfologie, immuunfenotypering, cytogenetica en moleculaire

diagnostiek


FAB:

• Acute leukemie: – Minimaal 30% blasten (≥ 3% MPO +) (tellen op ANC!)

– Indien > 50% erytroblasten op ANC: minimaal 30% blasten op NEC!

– Verdere onderverdeling naargelang• Differentiatierichting naar één of meerdere cellijnen• Graad van uitrijping

– AML: 8 subtypes– ALL : 3 subtypes


AML

FAB-classificatie


• AML M0: Myeloïde leukemie met minimale differentiatie (pox +, myeloïde merkers +)

• AML M1: Myeloblastische leukemie met minimale uitrijping• AML M2: Myeloblastische leukemie met uitrijping• AML M3: Promyelocyten leukemie• AML M4: Myelomonocytaire leukemie (AML M4 eo: met eosinofilie)• AML M5: Monocytaire leukemie

– weinig gedifferentieerd: AML M5a– gedifferentieerd: AML M5b

• AML M6: Erythroïde leukemie• AML M7: Megakaryoblastische leukemie


AML M1 (FAB)

Acute myeloblastischeleukemie zonder maturatie

• ≥ 90% blasten (op NEC)• ≥ 3% MPO +• Mature componenten (monocyten-

granulocyten) ≤ 10% (op NEC)

- anemie-trombopenie-leucocytose (met neutropenie)

- vaak Auerse staven- hypercellulair merg met overwegend

blasten!- soms dysplasie in rode en

megakaryocytaire reeks


AML M2 (FAB)

Acute myeloblastischeleukemie met maturatie

• 30-89% blasten (op NEC)• Granulocytaire component > 10% (op

NEC)• Monocytaire component ≤ 20% (op

NEC) (geen andere criteria van M4!)

- anemie-trombopenie-leucocytose (met soms normaal tot verhoogd neutrofielenaantal)

- frequent Auerse staven- abnormale myeloïde precursoren

(hypogranulatie, hyposegmentatie, bizarre kernvormen)

- soms dysplasie in rode en megakaryocytaire reeks


AML M3 (FAB)

Acute promyelocytaire leukemie= Hypergranulaire vorm

• < 30% blasten (op NEC) mogelijk• Zeer karakteristieke morfologie

promyelocyten• Vaak oudere kinderen-jong

volwassenen• Snelle diagnose vereist owv. DIC!

- anemie-diepe trombopenie (DIC!)-leucocytose (weinig circulerende leukemische cellen)

- abnormale promyelocyten: rood- tot roodpaarse granules over ganse cel (ook over kern), geen Golgi-zone, rond tot ovale kern, takkenbossen (bundels Auerse staven)


AML M3 variant (FAB)

= Hypogranulaire vorm

• verhoogd aantal WBC met meer abnormale vormen in perifeer bloed

• promyelocyten: agranulair of fijne, stofachtige rode granules, (bundels Auerse staven), sterk gelobde kern (meestal 2 lobben verbonden door een brug), cytoplasma zwak tot matig basofiel van kleur met soms blebvorming

• beenmerg: hypo- en hypergranulaire vormen


AML M4 (FAB) Acute myelomonocytaire leukemie

• ≥ 30% blasten (op NEC)• Granulocytaire component ≥ 20% (op NEC)

én minimum één van de volgende criteria:- mature monocyten (PBl) ≥ 5x109/l - ≥3x verhoogde urine-/serumlysozymes- ≥ 20% positief esterase in of monocytaire cellen

- anemie-trombopenie-leucocytose- leukemische cellen: granulocytaire en monocytaire cellijn - soms eosinofilie-basofilie- soms dysplasie in rode en megakaryocytaire reeks - moeilijke DD met AML M2!


AML M4 EoAML M4 met eosinofilie

• mengsel monocytaire en eosinofielecellijn (≥5% abnormale eosinofielen)

• morfologie: - eosinofiele myelocyten: prominente

pro-eosinofiele granules (basofielekleur) samen met typisch eosinofielegranules

- mature eosinofielen: hypo- of hyperlobulatie, soms pro-eosinofielegranules

• mogelijks aantasting CZS!

AML M4 met basofilie

• verhoogd aantal monocyten, basofilie, (eosinofilie), (neutrofilie)

• myelodysplasie aanwezig


AML M5a (FAB)

Acute monoblastischeleukemie

• ≥ 30% blasten (op NEC)• Monocytaire component ≥ 80%

(op NEC)• ≥ 80% van de monocyten in het

beenmerg zijn monoblasten)

- anemie-trombopenie-leucocytose

Cytochemie kan belangrijk zijn (sterk ANBE +)!


AML M5b (FAB) Acute monocytaire

leukemie

• ≥ 30% blasten (op NEC)• Monocytaire component ≥ 80%

(op NEC)• < 80% van de monocyten in het

beenmerg zijn monoblasten)

- anemie-trombopenie-leucocytose- leukemische cellen: monoblasten

(geen Auerse staven!), promonocyten en monocyten


AML M6 (FAB) Acute erytroleukemie

• ≥ 30% blasten (op NEC)• ≥ 50% erythroïd (op ANC)

- anemie-trombopenie-neutropenie- erytroïde hyperplasie met meerdere

kernlobben, karyorrhexis, meerkernigheid, megaloblastischvoorkomen, verhoogd aantal sideroblasten,…

- blasten: meestal myeloblasten (maar ook mengsel met mono- en megakaryoblasten mogelijk)

- soms dysplasie in megakaryocytaireen granulocytaire reeks

Met cytochemie kan de afkomst van de blasten worden aangetoond!


AML M7 (FAB) Acute megakaryoblastische

leukemie

• ≥ 30% blasten (op NEC)• Hoofdzakelijk megakaryoblasten (maar

ook andere blasten mogelijk!)• CD41/61 positief

- pancytopenie- weinig leukemische cellen ⇨ moeilijke

diagnose- megakaryoblasten: grootte van

myeloblasten, hoge N/C-ratio, agranulair basofiel cytoplasma, perifere cytoplasmatische blebs, soms micromegakaryocyten of dysplasie

- beenmerg: acute myelofibrose- dysplasie andere reeksen


AML M0 (FAB)

Acute myeloïde leukemie met minimaal bewijs van myeloïde differentiatie

• ≥ 30% blasten (op NEC)• < 3% blasten MPO-positief• Negatieve lymfoïde merkers (CD3, CD5,

CD10, CD19, CD22)• Immunologisch verdacht voor myeloÏd

(minimaal één positive myeloïde merker: CD13, CD14, CD33, CD117, MPO)

- anemie-trombopenie-neutropenie- blasten: agranulair, cytologisch gelijkenis

met AML M1 of ALL type 1 of 2 (verschillen: geen granules en geen Auerse staven)

- soms dysplastische kenmerken in de andere lijnen (pleit tegen ALL)


ALL

FAB-classificatie


ALL L1 (FAB) Acute lymfoblastische

leukemie Perifeer bloed:- anemie-trombopenie-leucocytose

(lymfoblasten)

Beenmerg:- hypercellulair - verdringing andere reeksen (normale

morfologie)- blasten: eerder klein, uniform van

voorkomen, ronde nucleus (regelmatig afgelijnd; hoge N/C-ratio), homogeen chromatine, nucleolen vaak minder duidelijk


ALL L2 (FAB)

Blasten ALL L2:

- groter dan bij L1- meer pleomorf- nucleus: onregelmatige vorm

en meestal duidelijke nucleolen

- meer cytoplasma dan bij L1


ALL L3 (FAB) = leukemische presentatie

Burkitt’s lymfoom

• Endemisch (tropisch Afrika en Nieuw-Guinea) ⇨ tumor wang

• Sporadisch (alle leeftijden!) ⇨ abdominaal, maligne pleura- of peritoneale uitstortingen

• Immuundeficiëntie-gerelateerd: AIDS, orgaantransplantatie

• Rol EBV! (niet bij sporadische gevallen)

Perifeer bloed:- meestal geen abnormaliteiten (wel bij

ziekteprogressie en AIDS)

Beenmerg:- 5-20% beenmerginfiltratie- blasten: medium grootte, relatief uniform,

ronde nuclei, zichtbare nucleoli, zeer sterkbasofiel cytoplasma, vacuolisatie


FAB classificatie niet meer “klinisch relevant” genoeg– AML is een heterogene groep van aandoeningen en

ziekten. Binnen éénzelfde FAB-groep zijn de prognoses nog zeer verschillend.

– Moeilijk te classificeren met FAB: mastcelleukemie, langerhanscelleukemie, hypoplastische AML, therapie-gerelateerde AML, MDS-gerelateerde AML, acute blastische transformatie van chronische aandoeningen.


AML-ALL

WHO-classificatie


WHO-classificatie

• Berust op morfologische, immunologische, cytogenetische en moleculair genetische analyses ⇨subgroepen die verschillen vertonen in etiologie, mechanisme van leukemogenese en clinicopathologische bevindingen

• Maakt onderscheid tussen de novo en secundaire leukemieën

• Leidt tot een betere kennis inzake prognose en therapeutisch beleid van de verschillende ziekten

WHO classificatie, AML1. AML with recurrent cytogenetic

translocations - AML with t(8;21) (q22;q22), AML1/ETO - Acute PML with t(15;17) (q22;q21), PML/RAR-alfa - Variant acute PML with t(v;17), v/RARalfa - AML with abnormal bone marrow eosinophils inv(16) (p13;q22) or t(16;16) (q13;q22), CBFbeta/MYH11 - AML with 11q23, MLL gen abnormalities

2. AML with multilineage dysplasia - With prior myelodysplastic syndrome - Without prior myelodysplastic syndrome

3. AML and myelodysplastic syndrome, therapy related

- Alkylating agent related - Topoisomerase II inhibitor related - Other types

4. AML not otherwise categorized AML minimally differentiated AML without maturation AML with maturation Acute myelomonocytic leukemia Acute monocytic leukemia Acute erythroid leukemia Acute megakaryocytic leukemia Acute basophilic leukemia Acute panmyelosis with myelofibrosis

FAB


AML met t(8;21)(q22;q22)

• AML: 5-12 %, AML M2: 30 %

• typische morfologische kenmerken– heterogene blasten– maturatie in granulocyten

(met dysplasie)• CD19-CD56 expressie• AML1-ETO fusiegen• goede prognose







FAB


Promyelocyten leukemie met t(15;17) (q21;q12)

• 5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95%

• leukemische cellen zijn abnormale promyelocyten

• stollingsstoornissen• PML-RAR fusiegen• beantwoordt aan

retinoinezuur therapie• goede prognose







FAB


AML met inv(16)(p13;q22) or t(16;16) (q13;q22)

• 10-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eosinofilie

• morfologische kenmerken van M4, toename aan dysplastischeeosinofielen

• soms CD2+• MYH11-CBFbeta

fusiegen• goede prognose







FAB


AML met 11q23 abnormaliteiten

• 5-6 % van AML• morfologische kenmerken

van M4-5, geassocieerd met monocytairecomponent

• MLL gen• slechte prognose







FAB


AML met multilineage dysplasie

•• als de novo leukemie of secundair uit Myelodysplastische of Myeloproliferatieve ziekte

• dysplasie in 2 of meer cellijnen

• meestal M2, M4 of M6, soms borderline op 2 FAB categorieën

• geen specifieke cytogenetischeafwijkingen, meestal complexe cytogenetische afwijkingen: -7, 7 q-, -5, +8, +9,+11, 11q-

• frequent bij de oudere mensen-zeldzaam bij kinderen

• ongunstige prognose


WHO classificatie,ALL

•Acute lymfoblastische leukemie/lymfoom (vroegere FAB L1 en L2)

-Precursor B-cel ALL (cytogenetische subgroepen)t(9;22) (q34;q11), BCR/ABLt(v;11) (v;q23), MLL gen abnormalitiest(1;19) (q23;p13), E2A/PBX1t(12;21) (p12;q22), ETV/CBF-alpha

-Precursor T-cel ALL•Burkitt’leukemie/lymfoom (vroegere FAB L3)


Vgl FAB en WHO class.sys.bij AML

FAB WHO

Voorgeschiedenis ⎯ +Morfologie

% blasten ≥ 30% ≥ 20%dysplasie (MDS) +

Cytogenetica ⎯ + subgroepMoleculaire Diagnostiek⎯ + subgroep


Casus 1 • jongen, 2 jaar• aanhoudende koorts, vermoeidheid en bleekheid• KOZ: hepatosplenomegalie, klieren: occipitaal, cervicaal,

submandibulair, inguinaal

Hb: 6.9 g/dl 11.5 - 13.5HCT: 0.228 0.34 - 0.4RBC: 2.45 1012/L 3.9 - 5.3Bloedplaatjes: 21 109/l 150 - 450WBC: 63.3 109/l 5.5 - 15.5


Casus 1: morfologisch PB: 84% blasten

2% eosinofielen14% lymfocyten

BM: Hypercellulair merg met 99% blasten. Verdringing van de andere mergreeksen. Beeld passend bij een acute lymfatische leukemie.

Cytochemie: pox negatiefCSV: 11.8/µl (99% blasten) ⇨ invasie

CZS


Casus 1: immuunfenotypering

Positief: CD10 (sterk), CD19, CD22, cyCD22, CD24, CD34, cyCD79a, HLA-Dr, TdT

Zwak tot negatief: CD45Negatief: sIgKappa, sIgLambda,

IgMCommon-B-ALL


Casus 1:andere

• Spiraal CT schedel: contrastcapterende weke delen massa verdacht voor lymfoomlokalisatie of leukemisch infiltraat (om. sinus maxillaris) + leptomeningeale contrastcaptatie linksfrontaal

• Echografie abdomen: hepatosplenomegalie en enkele vergrote klieren thv. leverhilus, normaal aspect van scrotum en testis

• DNA-onderzoek: hyperploïde piek met DNA-index 1.13


Casus 1:therapie

Common B-ALL met centrale invasie (hyperdiploïd)

Chemo volgens EORTC protocol 58951 AR2 (9-2003 tot 12-2005)

Maar vroeg recidief! (2-2006)


Casus 2:


Casus 2:

• Pbl: AML M3 ⇨ 19% blasten en 12% promyelocyten

• Snelle diagnose vereist omwille van stollingsstoornissen!

• Bevestigd door cytogenetisch en moleculair onderzoek: t(15;17)(q22;q21) en PML-RARalfa fusiegen

diagnose en classificatie van acute leukemieën · 2009-03-13 · dana van kerkhoven en caroline...

Documents