National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases

Diagnóstico de laboratorio de la infección por especies del género Candida:

convencional y nuevas tecnologías

Taller Teórico-Práctico “Fortalecimiento de la Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos en Mesoamérica y el Caribe de habla latina”

San José, Costa Rica Julio 15 – 18, 2019

Diego H. Caceres BSc, MScCDC, Mycotic Diseases Branch

Análisis microbiológico:

Bacterias y hongos son microbios,

pero, no son lo mismo

Micosis oportunistas con distribución mundial, ya que sus agentes causales son hongos ambientales o hacen parte de la microbiota humana.

Géneros:CandidaAspergillus

CryptococcusPneumocistisMucolaresFusariumPenicillum

Otros mohos hialinos y demateaceosemergentes

En todas partes…

Detalles que marcan la diferencia.Factores que afectan el desempeño analítico

Calidad de la muestra

Procesamiento de la muestra

– Pre-tratamiento

– Cultivo

– Incubación

Interpretación de los resultados

– Contaminación, infección o enfermedad activa

Pre-tratamiento

Concentración:

– Centrifugación 3.500 rpm por 15 min

Muestras respiratorios con abundante moco pueden ser tratadas, algunas alternativas:

– N-acetil-L-cisteína y citrato de sodio

– Perlas de vidrio

Siembra

Muestras estériles:

– 2 Sabouraud

– 1 Mycosel

– 1 Agar semilla de girasol

– 1 CHROMagar Candida

Muestras no estériles:

– 2 Mycosel

– 1 Sabouraud

– 1 Agar semilla de girasol

– 1 CHROMagar Candida

Muestras estériles

Muestras no estériles

Análisis microscópico

Examen directo:• Fresco•Tinta china

Coloraciones especiales:• Wright• Giemsa• Gram• Plata metenamina

Incubación

24°C x 6 semanas

– Mínimo lecturas semanales

37°C x 6 semanas

– Mínimo lecturas semanales

Interpretación

Colonias puros en el sitio de siembra

Presencia de la misma colonia en múltiples medios de cultivo

Interpretación

Ser cuidadoso al revisar cultivos procedentes de muestras no estériles

Presencia de la misma colonia en múltiples medios de cultivo

Correlacionar con microscopia

Infección

ContaminaciónColonización

1. Evaluar la capacidad de diagnóstico por el laboratorio

2. Acceso a información

3. Personal correctamente entrenado

Diagnóstico

Histopatología Historias clínicas

Microbiología Biomarcadores Registros de farmacia

Control de calidad

Herramientas estadísticas

Laboratorio Sistemas de información

Personal entrenado

Candida spp

Enfermedad por especies del genero Candida

Parte de la microbiota humana

Oportunista y puede llegar a causar

infecciones:

• Superficiales

• Mucosas

• Invasoras

Candidemia: la enfermedad del enfermo

Candidemia

Factores de riesgo:

Diabetes e inmunosupresión

Hospitalización prolongada (UCI)

Presencia CVC

Uso de antibiótico de amplio espectro

Alimentación parenteral

Cirugía reciente

Falla renal y hemodialisis

https://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/invasive/risk-prevention.html

Métodos microbiológicos

Ampliamente disponibles, pero…

No es un diagnóstico rápido• Aislamiento • Identificación

Sensibilidad variable (hemocultivos 50%)• Fase pre-analítica• Fase analítica• Fase post-analítica

Métodos microbiológicos convencionales

=ó

Microscopía Cultivos¿?

Métodos microbiológicos convencionales: Medios cromogénicos

Verde: C. albicans/C. dubliniensis

Azul: C. Tropicalis

Crema a purpura: C. parasilosis, C. glabrata, C. krusei, C. haemulonii, C. auris, C. rugose, etc…

Métodos microbiológicos fenotípicos: Asimilación de azucares

• Identificación basada en metabolismo de azulares

•Métodos ampliamente disponible

•Rápidos, económicos y con buenaconcordancia

Sistemas automatizados

Diagnóstico molecular

Comercial (RUO) C. albicans/C. glabrata PNA FISH ® y Yeast Traffic Light™ PNA FISH®

hibridización in situ, para la identificación de Candidadirectamente de hemocultivos.

C. albicans y/o C. parapsilosis

C. tropicalis

C. glabrata y/o C. krusei

http://www.advandx.com/products/pna-fish/candida/

MALDI-TOF: desorción/ionización láser asistida por matriz

Microflex® (Bruker)

VITEK MS bioMérieux

Comercial (FDA) BioFire FilmArray®

Método totalmente automatizado de PCR en tiempo real. Puede diagnosticar

hasta 83 patógenos.

Panel de hemocultivos: C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis y C.

parapsilosis

Comercial (FDA) T2MR Candida Panel

PCR que se combina con resonancia magnética. Detecta 5 especies de Candidaen muestras de sangre total.

• 91% sensibilidad, 99% especificidad.

• 4.3 horas para resultados.

Comercial (CE-IVD)LightCycler® SeptiFast Test MGRADE

PCR tiempo real a partir sangre total, para la identificación de 6 especies de hongos:

Candida albicans

Candida tropicalis

Candida parapsilosis

Candida krusei

Candida glabrata

Aspergillus fumigatus

Amplificación de un región multicopia

Ensayo colorimétrico basado en zimógenos de proteasas

Ensayo colorimétrico basado en zimógenos de proteasas

Prueba colorimétrica basada en zimógenos de proteasas para la detección cualitativa de (1→3)-β-D-glucano en el suero.

Limulus polyphemusCangrejo de herradura

Ensayo colorimétrico basado en zimógenos de proteasas (1→3)-β-D-glucano activa el factor G El factor G activado, activa la coagulante, la cual divide la

para-nitroanilida (pNA) del sustrato de péptido cromógeno

Fungitell®

Alto valor predictivo negativo

Detección de hongos con presencia

de (1→3)-β-D-glucano

– No mucorales y Cryptococcus spp

Alto riesgo de contaminación

exógena

Costoso

¿Porque debemos se cuidadosos con las especies raras de microorganismos?

Candida auris:“El hongo que se cree bacteria”

C. auris: primer reporte publicado, 2009 (Japón)

Global emergence of C. auris

2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017

Japan

South Korea

India

KenyaKuwait

South Africa

U.K.Israel

PakistanAustralia

Venezuela

USASpain

PanamaColombia

First isolate identifiedauris as “ear”

Oldest isolate identified (1996)

Chowdhary et al., 2017

ChinaCanadaNorway

Germany

South Americanclade

African clade

South Asianclade

East Asianclade

C. auris ha emergido de forma simultanea, pero, independiente

Lockhart, S., et al. Clinical Infectious Dis, 2016, Oct 20

C. auris representa nuevos retos

1. Identificación errónea

Principalmente como C. haemulonii

2. Resistencia a antifúngicos

>90% FCZ, 35% AmpB

>40% MDR

3. Transmisión en ambientes hospitalarios

1. Identificación errónea

Identificación errónea

Se confunde por otras especias con métodos fenotípicos (API, Microscan, VITEK-2 versionas anteriores 8.01)

Las más comunes son: C. haemulonii, Rhodotorula glutinis, C. albicans, Candida spp.

¿Como se identifica correctamente C. auris?

MALDI-TOF: desorción/ionización láser asistida por matriz

Microflex® (Bruker)

VITEK MS bioMérieux

Identificación molecular

Dos PCRs Tiempo real:

1. Específica para C. auris.2. Para especies del complejo C. haemulonii.

Validación in-vitro; 100% concordancia con la secuenciación de cultivos puros.

Pendiente validación en muestras clínicas y ambientales.

Kordalewska M, et al. J Clin Microbiol. 2017 Aug;55(8):2445-2452.

Identificación molecular

Secuencias blanco universales: gen que codifica el rRNA. Incluye 4 genes; 18S

(subunidad pequeña), 5.8S y 28S (subunidad larga) y 5S. Las regiones ITS y

D1/D2 (28S), son las regiones filogenéticamente mas variables (útiles para

identificar especie).

Interpretative criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; aproved guidelines. CLSI MM18A, 2008

Lockhart, S., et al. Clinical Infectious Dis, 2016, Oct 20

Identificación molecular

Interpretative criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; aproved guidelines. CLSI MM18A, 2008

Lockhart, S., et al. Clinical Infectious Dis, 2016, Oct 20

Análisis del genoma completo (WGS):

• Muy diferentes entre regiones geográficas (>40K-400K SNPs)

• Muy parecidos entre países de la región geográfica (<70 SNPs)

*SNPs (Single nucleotide polymorphisms)

2. Resistencia a antifúngicos

Resistencia a antifúngicos

FCZ >90% AnfoB ≈50% EQUI ≈7%

41% MDR 4% resistentes a todos los antifúngicos

3. Trasmisión hospitalarios: colonización

Persistencia medioambiental

Candida auris puede sobrevivir al menos durante 2 semanas en superficies de plástico

RM Welsh et al J Clin Microbiol 55:2996 –3005.

Conclusiones

Diagnosticando enfermedades en el siglo XXI

Utilizando tecnología de siglos anteriores…Cuando es posible

Mrs. Shirley, USA

Karen, Colombia

Debemos se cuidadosos con las especies raras de microorganismos

Vigilancia y notificación

Vigilar

Trabajo en red

Piense en hongos!!!

Fungal Disease Awareness WeekSeptember 23–27, 2019

For more information, contact CDC1-800-CDC-INFO (232-4636)TTY: 1-888-232-6348 www.cdc.gov

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

NO hay áreas libres de micosis...

Pero, si hay áreas libres de micólogos.

Diego H. Caceres: xju7@cdc.gov