digital 20214021 s147 modifikasi laninamivir
TRANSCRIPT
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
1/104
Universitas Indonesia
UNIVERSITAS INDONESIA
MODIFIKASI LANINAMIVIR SEBAGAI INHIBITOR
NEURAMINIDASE VIRUS INFLUENZA A SUBTIPE H1N1
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana
JOHANNES SALIM
0706263220
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM STUDI KIMIA
DEPOK
JULI 2011
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
2/104
Universitas Indonesia
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
3/104
Universitas Indonesia
HALAMAN PENGESAHAN
Skripsi ini diajukan oleh :
Nama : Johannes Salim
NPM : 0706263220
Program Studi : Kimia
Judul Skripsi : Modifikasi Laninamivir sebagai Inhibitor
Neuraminidase Virus Influenza A Subtipe H1N1
Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai
bagian persyaratan yag diperlukan untuk memperoleh Sarjana Sains pada Program
Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Indonesia
:
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
4/104
Universitas Indonesia
KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa dan atas
berkah dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini tepat
pada waktunya sesuai jadwal yang telah ditentukan. Penulisan skripsi ini
dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mendapatkan gelar
Sarjana Sains di jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Indonesia
Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan Skripsi ini adalah berkat bantuan dan dukungan dari banyak pihak. Meskipun penulis banyak mengalami
banyak hambatan dan rintangan yang dihadapi, namun hal-hal tersebut dapat
menjadi pelajaran dan pengalaman yang berarti.
Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada
seluruh pihak terkait yang membantu selama menyelesaikan penulisan skripsi ini.
Penulis banyak memperoleh bimbingan, bantuan dan pembelajaran dari berbagai
pihak, oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Usman Sumo F. Tambunan M.Sc., selaku dosen pembimbing
yang telah memberikan banyak hal yang sangat berarti dan berguna
selama menjalani penelitian ini, selalu memberikan bimbingan denan
tujuan membentuk kepribadian yang yang matang ditinjau dari softskill
maupun hardskill untuk menjadi manusia yang extraordinary.
2. Drs. Ridla Bakri selaku ketua Departemen Kimia F-MIPA UI
3. Drs. Tresye Utari selaku koodinator penelitian
4. Pak Rahmat Wibowo M.Sc dan Ir. Widyastuti Samadi M.Si., selaku
pembimbing akademis
5. Papa, mama, koko atas dukungan moril maupun materiil
6. Tyas, Iki, kak Tirta dan Arief yang telah berbagi kebersamaan, tekanan,
pengajaran dan segala macam hal
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
5/104
Universitas Indonesia
7. Agus L, Kak William, Kak Randy dan Pak Idrus atas bantuan dan
kebersamaan dalam menjalani berbagai lika-liku penelitian selama ini.
8. Rifan, Dante, Candra, Rafi, Reka Nova, Rohman, Tegar, Ikor, Riri, Sapi,
dan Sisil atas kebersamaan dan teman seperjuangan dalam menjalani
kehidupan di kampus ini.
9. Agnes, Karen, Sylvia, Febby V K, Atet, dan Selvia atas perhatian dan
kebaikannya.
10. Sally, Yoyo, Halim, Kiki, Vito dan Pepenk yang menjadi sahabat atas
kebersamaan dalam suka maupun duka.
11. Teman-teman Kimia 2007 dan Kimia 2008
12. Serta semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang
telah ikutserta dalam pengembangan dan kematangan diri penulis semasakuliah dan meupun penyusunan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa masih banayak kekurangan sehubung dengan
ketebatasan waktu, kemampuan dan pengetahuan yang penulis miliki, tetapi
penulis berusaha untuk membuat yang terbaik. Oleh karena itu penulis
mengharapkan saran dan kritik yang membangun sebagai masukan untuk
penyempurnaan di masa yang akan datang.
Akhir kata, penulis berharap semoga laporan ini dapat bermanfaat bagi
penulis khususnya dan rekan-rekan mahasiswa lainnya.
Penulis
2011
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
6/104
Universitas Indonesia
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS
AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Johannes Salim
NPM : 0706263220
Program Studi : Kimia
Departemen : Kimia
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Jenis Karya : Skripsi
demi pengembagan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepadaUniversitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif ( Non-exclusive Royalty- Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul:
Modifikasi Laninamivir sebagai Inhibitor Neuraminidase Virus Influenza ASubtipe H1N1
beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Noneksklusif ini Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalihmedia/formatkan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat, danmemublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta.
Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
7/104
Universitas Indonesia
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... iHALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii
KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH ...................................... iv
HALAMAN PENYATAAN PERSETUJUAN DAN PUBLIKASI TUGAS
AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ........................................... vi
ABSTRAK .......................................................................................................vii
ABSTRACT ...................................................................................................viii
DAFTAR ISI .................................................................................................... ix
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................xii
DAFTAR TABEL ..........................................................................................xiii
LAMPIRAN ...................................................................................................xiv
PENDAHULUAN……………………………………………………………….. 11.1 Pendahuluan ........... ........... .......... ......... .......... ........... ........... ......... ........ 1
1.2 Tujuan Penelitian ......... ........... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .... 3
TINJAUAN PUSTAKA………………………………………………………….4
2.1 Virus Influenza ......... .......... ........... ........... ......... ......... ........... ........... ..... 4
2.2 Struktur Virus Influenza A ....... ........... ........... ......... .......... ........... .......... 6
2.2.1 Hemaglutinin (HA) .......... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .... 6
2.2.2 Neuraminidase (N) .......... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .... 7
2.2.3 Polymerase B2 protein (PB2), Polymerase B1 Protein (PB1), danPolymerase A Protein (PA) ........................................................................... 7
2.2.4 Protein M2 ......... .......... ........... ........... ......... ......... ........... ........... ..... 8
2.2.5 Protein NS1 dan NS2 ........ ........... ........... ......... .......... ........... .......... 8
2.3 Daur Hidup Virus Influenza ........... ........... ......... ......... ........... ........... ..... 8
2.4 Mekanisme Pengobatan Influenza A .......... ........... ........... ......... ......... .... 9
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
8/104
Universitas Indonesia
2.5 Drug Design ........................................................................................ 11
2.5.1 Perancangan Obat Inhibitor Neuraminidase ......... ........... ........... ... 11
2.5.2 Zanavimir ........ ........... .......... ......... .......... ........... .......... .......... ...... 12
2.5.3 Oseltamivir ........... ........... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .. 13
2.5.4 Laninamivir .......... ........... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .. 13
2.6 Modifikasi Gugus Fungsi ......... ........... ........... ......... .......... ........... ........ 13
2.7 Bioinformatika ........ ........... .......... ......... .......... ........... .......... .......... ...... 14
2.7.1 Definisi ......................................................................................... 14
2.7.2 Perangkat dalam Bioinformatika ......... ........... ........... ......... ......... .. 15
2.7.3 Molecular Operating Enviroment (MOE) ......... .......... ........... ........ 19
2.8 ToxTree ........... .......... ......... ........... ........... ......... ......... ........... ........... ... 19
METODOLOGI…………………………………………………………….......203.1 Persiapan Neuraminidase Virus Influenza A (H1N1) ........ ........... ........ 20
3.1.1 Pencarian sequence neuraminidase Virus Influenza A (H1N1) ...... 20
3.1.2 Sequence alignment neuraminidase Virus Influenza A (H1N1) ..... 20
3.1.3 Pencarian struktur 3 dimensi neuraminidase Virus Influenza A ..... 20
3.1.4 Visualisasi Sisi Katalitik Neuraminidase Influenza A (H1N1) ....... 20
3.1.5 Optimasi Geometri dan Minimasi Neuraminidase ........... ........... ... 20
3.2 Perancangan Laninamivir Modifikasi ......... ........... ........... ......... ......... .. 21
3.2.1 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga DimensiLigan….. .................................................................................................... 21
3.3 Docking antara Neuraminidase Influenza A (H1N1) dengan Ligan ...... 21
3.4 Analisis Docking ......... ........... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .. 22
3.4.1 Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki) ........... ........... ......... ...... 22
3.4.2 Ikatan Hidrogen .......... .......... ......... .......... ........... .......... .......... ...... 22
3.5 Toxicological Properties ...................................................................... 22
HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………………....23
4.1 Preparasi Neuraminidase H1N1 .......... ........... ......... .......... ........... ........ 23
4.1.1 Penentuan Sequence Neuraminidase H1N1 ......... ........... ......... ...... 23
4.1.2 Pencarian Struktur 3D Neuraminidase H1N1 ....... ........... ........... ... 23
4.1.3 Visualisasi Sisi Aktif Enzim Neuraminidase Virus Influenza A .... 24
4.1.4 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi Neuraminidase H1N1................ .......... ......... .......... ........... ........... ......... ...... 26
4.2 Pemilihan Gugus Fungsi dalam Modifikasi Laninamivir ........ ........... ... 27
4.2.1 Gugus O-glikosida ........... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .. 27
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
9/104
Universitas Indonesia
4.2.2 Gugus Furan ......... ........... ......... .......... ........... ........... ......... ......... .. 27
4.2.3 Gugus Polar Sederhana ........... ........... ......... ......... ........... ........... ... 27
4.3 Preparasi Ligan Modifikasi Laninamivir ......... ........... .......... .......... ...... 28
4.3.1 Desain Modifikasi Laninamivir Sebagai Ligan.......... ......... ......... .. 28
4.3.2 Optimisasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga DimensiLigan….. .................................................................................................... 28
4.4 Proses Docking antara Neuraminidase Influenza A dengan Ligan ........ 29
4.4.1 Hasil Screening Ligan ....... ........... ........... ......... .......... ........... ........ 30
4.5 Analisis Hasil Docking ........................................................................ 31
4.5.1 Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki) ........... ........... ......... ...... 31
4.5.2 Ikatan Hidrogen .......... .......... ......... .......... ........... .......... .......... ...... 32
4.5.3 Visualisasi intaraksi ligan dengan enzim ........ ........... ......... ......... .. 33
4.6 Toxicological Properties ...................................................................... 35
KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………………....37
5.1 Kesimpulan........... ......... .......... ........... ........... ......... .......... ........... ........ 37
5.2 Saran ................................................................................................... 37
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………..38
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
10/104
Universitas Indonesia
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2. 1 Struktur Virus Influenza................................................................... 5Gambar 2. 2 Mekanisme Pengandaan Virus dalam Sel Inang .......... ........... .......... 9Gambar 2. 3 Mekanisme Pengobatan terhadap Influenza A (H1N1) ........... ........ 10Gambar 2. 4 Mekanisme Inhibitor Neuraminidase.............................................. 12Gambar 4. 1 Visualisasi Sisi Katalitik Neuraminidase Virus Influenza A ........... 24Gambar 4. 2 Visualisasi Tiga Dimensi Neuraminidase Virus influenza A .......... 25Gambar 4. 3 Interaksi 2D dan 3D antara ligan AM3G1 dan Neuraminidase ....... 34Gambar 4. 4 Interaksi 2D dan 3D antara ligan CA3G1 dan Neuraminidase ........ 34Gambar 4. 5 Interaksi 2D dan 3D antara ligan F1G2 dan Neuraminidase ........ ... 35
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
11/104
Universitas Indonesia
DAFTAR TABEL
Tabel 4. 1 Energi ikatan dan konstanta inhibisi ligan-enzim ........... ......... ......... .. 32Tabel 4. 2 Interaksi antara ligan dengan nueraminidase ......... .......... ........... ........ 33Tabel 4. 3 Hasil ToxTree Prediction .................................................................. 36
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
12/104
Universitas Indonesia
LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan Kerja .................................................................................... 45Lampiran 2 Parameter Pencarian Sequence Neuraminidase ....... ........... ........... ... 47Lampiran 3 Hasil Pencarian Sequence Neuraminidase ....................................... 48Lampiran 4 Multiple Sequence Alignment dengan Clustal W2............................ 49Lampiran 5 Hasil Multiple Sequence Alignment ................................................. 50Lampiran 6 Neuraminidase (Influenza A virus (A/Auckland/1/2009(H1N1))] .... 60Lampiran 7 Sequence Nueraminidase dalam Format FASTA .......... ........... ........ 61Lampiran 8 Hasil Modeling Neuraminidase dengan SWISS-MODEL ........ ........ 62Lampiran 9 Design Modifikasi Laninamivir dan Gugus Substitute ..................... 63Lampiran 10 Tabel design 336 Ligan Modifikasi ............................................... 64
Lampiran 11 Tabel Hasil Docking 336 Ligan Modifikasi ................................... 65Lampiran 12 Tabel Ligan Hasil Screening Pertama (100 ligan terbaik) .............. 74Lampiran 13 Tabel Hasil Docking 100 Ligan Modifikasi Terbaik ........... ......... .. 75Lampiran 14 Tabel Ligan Hasil Screening Kedua dan Ketiga (20 dan 10 LiganTerbaik) ............................................................................................................. 78Lampiran 15 Tabel Hasil Docking 20 dan 10 Ligan Modifikasi Terbaik .......... ... 79Lampiran 16 Struktur 5 Ligan Terbaik Hasil Docking ........................................ 80Lampiran 17 Tiga Ligan Terbaik dan Hasil Docking .......................................... 81Lampiran 18 Interaksi Ligan AM3G1 dengan Neuraminidase ......... ........... ........ 82Lampiran 19 Interaksi Ligan CA3G1 dengan Neuraminidase .......... ........... ........ 85Lampiran 20 Interaksi Ligan F1G2 dengan Neuraminidase ....... ........... ........... ... 88
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
13/104
Universitas Indonesia
ABSTRAK
Nama : Johannes Salim
Program Studi : Kimia
Judul : Modifikasi Laninamivir sebagai Inhibitor Neuraminidase VirusInfluenza A Subtipe H1N1
Virus influenza A subtipe H1N1 menjadi perhatian kesehatan global karenamemiliki patogenisitas yang tinggi disebabkan gen penyusunnya berupa RNAyang mudah mengalami mutasi. Pengobatan dengan antiviral (oseltamivir danzanamivir) adalah salah satu upaya untuk mencegah pandemik influenza, namun
terjadi resistansi terhadap obat antiviral tersebut. Resistansi ini sudah diatasidengan penemuan laninamivir. Laninamivir terbukti mampu menginhibisiaktivitas neuraminidase virus influenza A dan B, termasuk subtipe N1 sampai N9dan virus yang resistan terhadap oseltamivir. Penelitian ini akan dilakukan drugdesign berbasis laninamivir, hal ini disebabkan laninamivir dapat menghambatkerja neuraminidase secara efektif, sehingga hasil modifikasi dari laninamivirdapat menghambat kerja neuraminidase lebih efektif daripada laninamivir itusendiri. Proses molecular docking dilakukan untuk mendapatkan 3 ligan terbaikdari 336 ligan modifikasi. Hasil molecular docking menunjukkan bahwa AM3G1,CA3G1 dan F1G2 memiliki energi bebas ikatan dan interaksi yang lebih baikdaripada standar. Selanjutnya dari hasil analisis toxicological properties secarakeseluruhan ligan AM3G1, CA3G1, dan F1G2 tidak bersifat carcinogen danmutagen
Kata kunci: Virus Influenza A, neuraminidase, laninamivir, molecular docking,inhibitor
xiv + 90 halaman: 9 gambar; 3 tabel
Daftar Pustaka: 61 (1990 – 2011)
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
14/104
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
15/104
Universitas Indonesia
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Pendahuluan
Influenza A (H1N1) merupakan penyakit pernapasan akut yang dapat
menyebabkan kematian pada penderita. Penyakit pernapasan ini disebabkan oleh
virus influenza tipe A, dimana virus ini merupakan virus yang penyebarannya
sangat tinggi dan patogen yang sering menular pada manusia. Virus influenza tipe
A menginfeksi sejumlah besar spesies avian, babi, kuda hewan liar dan manusia
(Xu et al., 2008; Easterday et al., 1997). Virus Influenza A diklasifikasikan ke
dalam subtipe-subtipe berdasarkan pada antigenisitas molekul hemaglutinin (HA)dan neuraminidase (NA) dan sampai saat ini terdapat 16 subtipe HA dan 9 subtipe
NA
Dalam 100 tahun terakhir ini, dalam sejarah manusia sudah terjadi pandemik
influenza sebanyak tiga kali: pertama kali pada tahun 1918, kedua pada tahun
1957 (H2N2) dan ketiga di tahun 1957 (H3N2) (Wright, P. F., 2001). Pada tahun
2009, virus influenza tipe A (H1N1) telah menjadi wabah pandemik karena virus
ini merupakan virus strain baru yang teridentifikasi pada musim semi di Meksiko,
umumnya virus H1N1 disebut sebagai “swine flu” (Wang et al., 2009) dan WHO
mengumumkan wabah pandemik ini pada Juni 2009 (http://www.who.int/media
centre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/index.html).
Pada wabah pandemik ini, virus influenza A (H1N1) telah menyebabkan infeksi
fatal dan lebih dari 80 kematian di lebih dari 40 negara yaitu dari Meksiko ke
beberapa negara lainnya di utara dan selatan Amerika, Eropa, dan Asia
(http://www.who.int.csr/disease/swineflu/en/index .html).
Saat ini virus influenza subtipe H1N1 menjadi perhatian karena memiliki patogenisitas yang tinggi sehingga memungkinan terbentuknya strain virus baru
yang mampu menular dari manusia ke manusia dan menjadi pandemik global
berikutnya (Peter et al., 2009). Saat ini terdapat dua cara untuk melawan
pandemik tersebut, yaitu dengan vaksinasi dan pengobatan dengan antiviral.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
16/104
Universitas Indonesia
Meskipun vaksinasi berperan penting dalam pencegahan influenza, namun cara
tersebut belum cukup untuk menghindari dan melawan pandemik virus influenza.
Maka, antiviral merupakan cara yang tepat dalam mencegah pandemik influenza.
Saat ini, tersedia dua tipe obat anti-virus influenza: M2 ion channel blockers
(adamantane) dan inhibitor neuraminidase (NA). Sejak 2005, Amerika Serikat
sudah tidak direkomendasikan penggunaan adamantane untuk melawan dan
mencegah influenza, hal ini disebabkan terdapat laporan mengenai resistan
adamantane terhadap virus influenza A (Bright et al., 2006; Gubareva 2009).
Tipe kedua dan sampai sekarang terus dikembangkan untuk melawan viru
influenza A adalah inhibitor neuraminidase, dimana inhibitor ini akan berikatan
dengan neuraminidase virus influenza yang terbentuk dan mencegah peranan
neuraminidase untuk melepaskan virus dari sel host (Gubareva, L. V, 2004). Saat
ini sudah terdapat dua buah inhibitor neuraminidase yang beredar di pasar,
zanamivir (inhalasi, 10 mg/dosis; Relenza) dan oseltamivir (oral, 75 mg/dosis;
Tamiflu). Oseltamivir lebih banyak digunakan di seluruh dunia untuk mengobati
virus influenza A, namun terdapat laporan mengenai resistansi oseltamivir dari
seluruh belahan dunia. Pengujian pada isolat neuraminidase menunjukan bahwa
95% isolat neuraminidase dari kuarter keempat tahun 2008 sampai januari 2009
dan hampir semua isolat yang diuji pada sejak Oktober 2008 di Amerika Serikat
dilaporkan resistan terhadap oseltamivir. Semua virus-virus tersebut memiliki
mutasi H274Y pada gen NA dan menunjukkan reduksi hingga 1000 lipatan dalam
kerentanan terhadap oseltamivir yaitu peningkatan konsentrasi penghambatan
dari 0,5 nmol/L menjadi 500 nmol/L (Cheng et al., 2009).
Resistansi oseltamivir sudah diatasi dengan penemuan obat baru yaitu
laninamivir (R-125489) dibuat dalam bentuk laninamivir oktanoat (prodrug dari
laninamivir). Laninamivir terbukti mampu menginhibisi aktivitas neuraminidase
virus influenza A dan B, termasuk subtipe N1 sampai N9 dan virus yang resistanterhadap oseltamivir (Yamashita et. al, 2009). Studi praklinik laninamivir
oktanoat terhadap mencit menunjukan bahwa pemberian satu kali laninamivir
oktanoat sama manjurnya dengan pemberian beberapa kali dari zanamivir atau
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
17/104
Universitas Indonesia
oseltamivir (Kubo et al, 2010) dan laninamivir masih berada pada jalur
pernapasan pada waktu yang lama (Koyama et al., 2009).
Penelitian ini akan dilakukan drug design berbasis laninamivir, hal ini
disebabkan laninamivir dapat menghambat kerja neuraminidase secara efektif,
sehingga hasil modifikasi dari laninamivir dapat menghambat kerja neuraminidase
lebih efektif daripada laninamivir itu sendiri
1.2 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah melakukan modifikasi pada laninamivir
sehingga dapat menjadi inhibitor yang lebih efektif untuk menghambat kerja
neuraminidase virus influenza A subtipe H1N1.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
18/104
Universitas Indonesia
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Virus Influenza
Virus influenza termasuk dalam famili Orthomyxoviridae, yang memiliki
genom bersegmen tunggal. Famili Orthomyxoviridae terdiri dari influenza A,
influenza B, influenza C, Thogovirus, dan Isavirus (Klenk et al., 1995; van
Regenmortel, 2000). Asam nukleat virus influenza beruntai tunggal dan terdiri
atas 8 segmen gen yang mengkode 11 jenis protein. Pada bagian permukaan, virus
ini memiliki tonjolan (spikes) yang digunakan untuk menempel pada reseptor
yang spesifik pada sel-sel hostesnya pada saat menginfeksi sel. Virus influenza
memiliki 2 jenis spikes yang tersusun dari glikoprotein, yaitu yang mengandung
hemaglutinin (HA) dan yang mengandung neuraminidase (NA), yang terletak
dibagian terluar dari virion (Horimoto dan Kawaoka, 2001). Antigen yang
terdapat pada lapisan permukaan merupakan pembeda atau yang menjadi
perbedaan antar virus influenza. Virus influenza A diklasifikasikan ke dalam
subtipe-subtipe berdasarkan antigenisitas molekul HA dan NA. sampai saat ini,
sudah dikenal 16 subtipe H (H1, H2, dll) (Fouchier et al., 2005) dan 9 subtipe N
(N1, N2, dll).
Ada 3 tipe virus influenza yang telah dikenal banyak orang yaitu influenza
A, B dan C. Influenza A dan B memiliki 8 segmen sebagai berikut:
1. Polymerase B2 protein (PB2)
2. Polymerase B1 protein (PB1)
3. Polymerase A protein (PA)
4. Hemaglutinin (H atau HA)
5. Nucleocapsid protein (NP)
6. Neuraminidase (N atau NA)
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
19/104
Universitas Indonesia
7. Matrik protein (M), terdiri atas M1 yang menyusun matrik; dan hanya
terdapat pada virus influenza A, M2 yang berperan sebagai ion channel untuk
menurunkan atau mempertahankan pH endosome.
8. Protein non-struktural (NS) yang terdiri dari NS1 dan NS2
Sedangkan influenza C hanya memiliki 7 segmen yaitu permukaannya
hanya terdiri atas satu glikoprotein. Struktur umum virus influenza ditunjukkan
dalam Gambar 2.1.
RNA aktif (RNA polymerase) yang berfungsi untuk replikasi dan transkripsi
tersusun atas PB2, PB1, dan PA. Ini mempunyai aktifitas endonuklease dan terikat
pada RNP. Protein NS1 dan NS2 berfungsi dalam regulasi virus di dalam sel yang
telah terinfeksi. Virus ini dibungkus oleh membran yang berupa lipid bilayer yang
terdiri atas hemaglutinin (HA), neuraminidase (NA) dan matrik (Gurtler, 2007).
Subtipe virus influenza A yang telah ditemukan sampai saat ini adalah 105
subtipe dan semuanya endemik pada burung. Namun demikian beberapa subtipe
telah ditemukan dalam ayam dan mamalia (Cinati et al., 2007).
Gambar 2. 1 Struktur Virus Influenza
(Horimoto et al., 2005)
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
20/104
Universitas Indonesia
2.2 Struktur Virus Influenza A
2.2.1 Hemaglutinin (HA)
Hemaglutinin (HA) adalah glikoprotein homotriomer yang terdiri atas 3
situs glikosilasi, mempunyai berat molekul 76.000. Hemaglutinin terdapat di
membran dan merupakan bagian utamanya dan memiliki 5 antigen yang dominan
yang terdapat di permukaan. Hemaglutinin ini merupakan homotrimer dan
masing-masing merupakan polipeptida tunggal yang terpisah menjadi H1 dan H2.
Peranan dari hemaglutinin adalah reseptor yang akan berikatan dengan “sialic
acid ” (N– acetyl–neuraminic acid ) dan membantu asuknya genom viral kedalam
sel melalui fussion antara membran endosome inang dengan membran viral
(White et al., 1997).
Hemaglutinin adalah antigen yang utama pada virus. Sejauh ini telah
diketahui ada 16 jenis antigen hemaglutinin. Subtipe ini diberi nama H1 sampai
H16. Namun, sampai saat ini hanya H1, H2, dan H3 yang mampu menyebar antar
manusia dan menjadi pandemik. Perubahan pengenalan dari sialic acid pada
glukosanya yaitu dari α2 –3 menjadi α2 –6 merupakan penyebab utama dari virus
influenza A dapat menginfeksi spesies baru dan merubah inang (Stevens et al.,
2006).
Mutasi yang terjadi pada antigen akan mengurangi atau mencegah
penetralan oleh antibodi, hal ini memungkinkan terjadinya subtipe baru yang
menyebar dalam populasi non-imun. Fenomena ini dikenal dengan “antigenic
drift ”. Respon imun terhadap antigen hemaglutinin diikuti produksi antibodi
penetralan yang merupakan dasar penyembuhan infeksi olah setiap individu
(Gurtler et al., 2007).
Antigenic shift merupakan perpindahan antigen yang terjadi pada saat
sebuah sel terinfeksi dua virus yang berbeda tipe. Genom ini mengalami pertukaran pada saat terjadi replikasi didalam sel, misalnya H1 yang digantikan
oleh H5 yang menghasilkan virus influenza dengan subtipe baru. (Gurtler et al.,
2007).
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
21/104
Universitas Indonesia
2.2.2 Neuraminidase (N)
Neuraminidase (NA) merupakan suatu glikoprotein seperti hemaglutinnin
yang juga terdapat pada permukaan virus. Memiliki struktur tetramer dan berat
molekul rata-rata 220.000. Molekul NA menampilkan bagian utamanya pada
permukaan luar dari sel, menempel pada lipid bilayer , dan memiliki ekor
sitoplasma yang kecil (Gurtler et al., 2007).
Neuraminidase disebut juga sialidase, karena berfungsi sebagai suatu
enzim yang memisahkan antara molekul hemaglutinin dengan “sialic acid ”, dari
molekul NA yang lain, dan dari glikoprotein dan glikolipid pada permukaan sel.
NA juga merupakan antigen yang berperan penting pada penetrasi saat virus
memasuki lapisan mucin pada epithelium (Gurtler et al., 2007) dan proses infeksi,
replikasi, pendewasaan dan pengiriman virus influenza (Gong et al., 2007).
Karena neuraminidase memiliki aktivitas enzimatik dan sisi aktif enzim ini
terletak di dalam kantung pada permukaan masing-masing subunit glikoprotein
dan ini dipertahankan oleh asam amino yang conserved diantara semua NA pada
virus influenza A dan B, hal ini menjadi pertimbangan sebagai target utama untuk
mendesain obat untuk melawan virus influenza.
Antigenic drift juga memungkinkan terjadi pada Neuraminidase.
Neuraminidase membawa residu asam amino yang penting, dan jika mengalamimutasi dapat bertahan pada N inhibitor (Gurtler et al., 2007). Ketika asam amino
arginin (R) pada posisi 292 digantikan oleh lisin (K) misalnya, maka kekebalan
akan terbentuk. Mutasi ini terjadi ketika satu nukleotida berubah, yaitu dari AGA
menjadi AAA pada gen N. Posisi 292 sangat signifikan karena mutasi pada posisi
ini dapat membentuk neuraminidase yang kebal (resistant ) terhadap inhibitor
seperti zanamivir dan oseltamivir (Gurtler et al., 2007).
2.2.3 Polymerase B2 protein (PB2), Polymerase B1 Protein (PB1), dan
Polymerase A Protein (PA)
Virus influenza A terdiri atas 8 negatif native-strand sequence DNA
genom yang dikode oleh 11 protein. Polymerase influenza merupakan sebuah
heterotrimeric ~250 kD terdiri atas 3 protein kompleks, yaitu PA, PB1, dan PB2.
Protein PB1, PB2, dan PA merupakan RNA-RNA polymerase aktif yang mampu
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
22/104
Universitas Indonesia
melakukan replikasi dan transkripsi dan replikasi. Fungsi dari protein ini adalah
sebagai enzim yang akan menggandakan rantai RNA pada virus pada saat terjadi
replikasi didalam sel inang (Gurtler et al., 2007; Liu, H and Yao, X. 2009).
2.2.4 Protein M2
Protein M2 merupakan protein matrik yang terdapat dibawah kapsid.
Fungsi protein M2 pada saat replikasi adalah mempengaruhi keadaan didalam sel
seperti pH sehingga proses pemasukkan RNA kedalam inti sel akan berjalan
lancar (Gurtler et al., 2007).
2.2.5 Protein NS1 dan NS2
Protein NS1 merupakan M–RNA yang memiliki berat molekul 26.000.
Protein ini akan membantu transport Viral RNA ke ribosom untuk ditranslasikan.Sedangkan NS2 merupakan molekul yang lebih kecil dengan berat molekul
11.000. Protein ini dipercaya memiliki fungsi memfasilitasi transport RNP yang
baru disintesis dari inti sel menuju sitoplasma untuk mempercepat penggandaan
virus (Gurtler et al., 2007).
2.3 Daur Hidup Virus Influenza
Virus influenza memperbanyak diri (replikasi) dengan sangat cepat sehingga
mengakibatkan lisis pada sel epitel dan terjadi deskuamasi lapisan epitel saluran
pernafasan. Pada tahap infeksi awal, respon imun akan menghambat replikasi
virus. Apabila kemudian terjadi pemaparan kembali, respon imun adaptif yang
bersifat antigen spesifik mengembangkan memori imunologis yang akan
memberikan respon yang lebih cepat. Replikasi virus akan merangsang
pembentukan proinflammatori sitokin termasuk IL–1, IL–6 dan TNF–Alfa yang
kemudian masuk ke sirkulasi sistemik dan menyebabkan gejala sistemik influenza
seperti demam.
Replikasi virus terdiri atas beberapa tahap (Gambar 2.2). Tahap pertamahemaglutinin virus influenza terikat pada gula sialic acid pada bagian permukaan
sel, umumnya pada bagian hidung dan paru-paru dari mamalia atau burung. Tahap
kedua virus masuk kedalam sel melalui endositosis, dalam keasaman endosom
hemaglutinin dari virus berdifusi memasuki dan melepaskan molekul viral RNA
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
23/104
Universitas Indonesia
Gambar 2. 2 Mekanisme Pengandaan Virus dalam Sel Inang[Sumber: Kamps et al, 2006: Modified from Cox and Kawaoka, 1997]
(vRNA) protein aksesoris, dan RNA – polymerase ke dalam sitoplasma. Tahap
ketiga protein yang dilepaskan pada tahap kedua dan vRNA menuju ke inti sel dan
RNA polymerase mulai mentransripsikan rantai komplemennya (viral RNA
(vRNA) dikopi dari (–) sense menjadi (+) cRNA dan mRNA). Tahap keempat
vRNA dikeluarkan kembali kedalam sitoplasma dan mulai ditranslasikan. Tahap
kelima viral protein yang baru terbentuk kembali lagi ke inti sel untuk membentuk
vRNA lagi atau Viral protein yang baru terbentuk dikeluarkan menuju aparatus
golgi pada permukaan selnya. Tahap keenam vRNA dan inti viral meninggalkan
sel dan membentuk virus baru. (Rahmania, 2011)
2.4 Mekanisme Pengobatan Influenza A
Saat ini terdapat beberapa jenis obat antiviral untuk pengobatan ataupun
pencegahan terhadap influenza, yaitu amantadine, rimantadine, zanamivir
(relenza), oseltamivir (tamiflu) dan laninamivir. Obat-obatan ini bekerja dengan
menghambat kerja bagian-bagian virus yang berperan dalam proses penginfeksiansel inang dan replikasi virus, namun obat-obatan ini bekerja dengan menghambat
target yang berbeda. Mekanisme kerja amantadine dan rimantadine adalah obat
yang menghambat replikasi virus dengan menghalangi pelepasan komponen virus
ke dalam sel inang. Amantadine dan rimantadine merupakan suatu inhibitor M2
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
24/104
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
25/104
Universitas Indonesia
untuk mencari obat baru yang dapat berfungsi sebagai antiviral terhadap infeksi
virus H1N1 dengan menggunakan data dari pustaka yang sudah ada.
2.5 Drug Design
Drug design adalah suatu metode perancangan obat yang didasarkan pada
analisis biologis dan fisik dari targetnya. Targetnya merupakan molekul-molekul
atau bagian dari makromolekul yang berperan vital dalam proses metabolik dari
kondisi patologis seseorang akibat penyakit yang disebabkan oleh mikroba
patogen. Umumnya obat dirancang untuk menginhibisi atau menghentikan
aktivitas makromolekul tersebut dengan cara membentuk ikatan terhadap sisi
katalitik dari molekul-molekul tersebut sehingga molekul obat berperan sebagai
inhibitor. Hal yang harus dipertimbangkan dalam merancang inhibitor sebagai
drug, antara lain adalah spesifitas dan potensi inhibisinya. Spesifitas dan potensi
inhibisi yang tinggi akan mengurangi efek samping dan tingkat toksisitasnya
(Gubernator, 1998).
Perancangan obat dapat dilakukan secara komputasional atau in silico.
Sebelum teknologi informasi berkembang pesat, metode yang digunakan untuk
menemukan inhibitor yang tepat adalah dengan melakukan modifikasi berbagai
komponen lalu mengujikannya pada target biologis secara trial-and-error . Tetapi
kini, dengan mengetahui sisi katalitik dan struktur tiga dimensi target biologis,secara in silico dapat diprediksikan molekul yang dapat berperan sebagai inhibitor
sehingga proses modifikasi dan pengujian secara eksperimental menjadi lebih
rasional dan efisien.
2.5.1 Perancangan Obat Inhibitor Neuraminidase
Neuraminidase merupakan molekul target dari senyawa inhibitor
neuraminidase yang akan memotong reseptor selular residu sialic acid (Gambar
2.4). Pemotongan ini melepaskan virus-virus, yang nantinya akan menyerang sel-
sel baru. Tanpa neuraminidase, infeksi akan dibatasi pada satu putaran replikasi,
yang cukup jarang menyebabkan penyakit. Neuraminidase dapat juga
memfasilitasi invasi viral bagian atas, kemungkinan dengan memotong sialic acid
menjadi setengahnya pada mucin yang mengelilingi sel epitel bagian atas.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
26/104
Universitas Indonesia
Gambar 2. 4 Mekanisme Inhibitor Neuraminidase
[Sumber: Moscona, 2005]
Kemampuan analog sialic acid pada keadaan transisi dalam menghambat
neuraminidase virus influenza yang pertama kali dikenal pada tahun 1970, namun
desain inhibitor yang efektif dapat dilakukan ketika analisis struktur tiga dimensi
neuraminidase virus influenza terbuka baik lokasinya maupun struktur sisi
katalitiknya (Moscona, 2005).
2.5.2 Zanavimir
Zananamivir memiliki bioavaibilitas yang rendah, sehingga dipasarkan
dalam bentuk bubuk dan digunakan secara inhalasi (Miller, 1999) supaya
langsung menuju ke sistem respirasi. Zanamivir sebagian besar menumpuk pada
sistem pernapasan; 10-15 persen dari senyawa aktifnya mencapai paru-paru, dan
sisinya berada pada oropharynx (Cass et al., 1999). Namun terdapat beberapa
laporan mengenai terjadinya komplikasi pernapasan seperti bronchospasm yang
disebabkan oleh penggunaaan zanamivir secara inhalasi (Loughlin et al., 2002;
Williamson, 2002).
Zanamivir berinteraksi sesuai dengan residu asam amino conserved pada
sisi katalitik neuraminidase virus influenza A dan B, dan efek penghambatannya
terhadap enzim telah membuktikan bahwa zanamivir dapat digunakan secara
inhalasi sebagai obat.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
27/104
Universitas Indonesia
2.5.3 Oseltamivir
Oseltamivir digunakan secara oral dalam bentuk prodrug ester, biasanya
dalam bentuk oseltamivir karboksilat. Dalam penggunaannnya, prodrug diproses
oleh enzim pada manusia yaitu karboksiesterase menjadi bentuk aktifnya (Reece,
2007).
2.5.4 Laninamivir
Laninamivir merupakan inhibitor pada neuraminidase yang digunakan
secara inhalasi untuk mengobati penyakit influenza A (H1N1) yang akan
diproduksi oleh perusahaan dari Jepang (Daiichi Sankyo), obat ini sekarang
sedang memasuki fasa pengujian pada manusia. Obat ini juga disebutkan lebih
efektif daripada obat-obat anti virus yang lainnya (oseltamivir dan zanamivir).
(http://expresslayout.com/pharmaceuticallitigation/?p=74 diakses pada tanggal 21
Januari 2011).
Laninamivir terbukti mampu menginhibisi aktivitas neuraminidase virus
influenza A dan B, termasuk subtipe N1 sampai N9 dan virus yang resistan
dengan oseltamivir (Yamashita, et al, 2009). Studi praklinik laninamivir oktanoat
terhadap mencit menunjukan bahwa pemberian satu kali laninamivir oktanoat
sama manjurnya dengan pemberian beberapa kali dari zanamivir atau oseltamivir
(Kubo et al, 2010). Laninamivir masih terdapat pada jalur pernapasan pada waktuyang lama (Koyama et al, 2009), dan terdegradasi secara perlahan-lahan dari
tubuh pasien, sekitar 6 hari atau lebih setelah diberikan (Ishizuka et al., 2009).
2.6 Modifikasi Gugus Fungsi
Kemujaraban suatu obat yang berkurang dapat mengurangi fungsi obat itu
sendiri dalam mengatasi suatu penyakit. Kemujaraban obat yang berkurang salah
satunya dapat disebabkan oleh adanya resisten terhadap obat tertentu. Menurut
Sardjoko (1992) modifikasi struktur obat yang mengalami penurunan
kemujaraban yang ditujukan pada suatu eksplorasi dan eksploitasi lead
compounds yaitu senyawa yang memiliki aktivitas biologis memiliki tujuan salah
satunya yaitu untuk mengatur farmakokinetik suatu senyawa. Usaha ini mengatur
ketersediaan biologis dengan cara modifikasi molekul, meliputi usaha untuk
mengatur hubungan antara dosis dan efek, hubungan antara kadar dan waktu,
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
28/104
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
29/104
Universitas Indonesia
Pesatnya perkembangan teknologi informasi dan peningkatan ilmu
komputer khususnya pada bidang biologi molekuler, menjadikan bioinformatika
sebagai ilmu yang membuka sudut pandang baru dalam menyelesaikan persoalan
biologi molekuler (Baxevanis dan Oulette, 2005).
2.7.2 Perangkat dalam Bioinformatika
2.7.2.1 Database
Database adalah kumpulan data yang diatur sedemikian rupa untuk
memudahkan penggunanya. Pada database bioinformatika, data yang diatur
merupakan data sequences DNA atau protein yang didapat melalui percobaan
laboratorium yang biasanya disimpan dalam file komputer. Setiap file dari suatu
sequence berisi informasi mengenai asal organisme, nama sequence, dan juganomor akses yang digunakan untuk mengidentifikasi sequence tersebut (Mount,
2004).
Dalam analisis bioinformatika, keberadaan database merupakan syarat
utama. Database DNA yang utama adalah GenBank di Amerika Serikat,
sedangkan database untuk protein dapat ditemukan di SWISS-PROT, Protein
Information Resource (PIR) dan Protein Data Bank (PDB) (Baxevanis dan
Ouellette, 2005).
2.7.2.2 Multiple Sequence Alignment
Pencarian database umumnya berdasar hasil sequence alignment , baik
sequence DNA maupun protein. Metode ini digunakan berdasar kenyataan bahwa
sequence DNA/protein bisa berbeda sedikit tetapi memiliki fungsi yang sama.
Misalnya protein hemoglobin dari manusia hanya sedikit berbeda dengan yang
berasal dari ikan paus. Kegunaan dari pencarian ini adalah ketika mendapatkan
suatu sequence DNA/protein yang belum diketahui fungsinya maka dengan
membandingkannya dengan yang ada dalam database bisa diperkirakan fungsidari sequence tersebut. Algoritma untuk pattern recognition seperti Neural
Network , Genetic Algorithm dan lain lain telah dipakai dengan sukses untuk
pencarian database ini. Salah satu software pencari database yang paling berhasil
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
30/104
Universitas Indonesia
dan bisa dikatakan menjadi standar sekarang adalah BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) (Woodsmall and Benson, 1993).
Software ini telah diadaptasi untuk melakukan alignment terhadap
berbagai sequence seperti DNA (blastn), protein (blastp). Baru-baru versi yang
fleksibel untuk dapat beradaptasi dengan database yang lebih variatif telah
dikembangkan dan disebut Gapped BLAST serta PSI (Position Specific Iterated).
BLAST (Altschul, 1990). Sementara itu software yang digunakan untuk
melakukan alignment terhadap sequence terbatas di antaranya yang lazim
digunakan adalah CLUSTAL dan CLUSTAL W (Altschul, 1997) dengan
menggunakan algoritma HMM ( Hidden Markov Model).
2.7.2.3
Protein Data Bank Database struktural menyimpan data mengenai struktur protein. Sumber
primer untuk data struktur protein adalah Protein Data Bank (PDB) yang tersedia
pada situs http://www.pdb.org/. Ini adalah arsip data struktural tunggal tingkat
dunia yang dibuat oleh Research Collaboratory for Structural Bioinformatics
(RSCB), di Universitas New Jersey di Rutgers (Westhead et al., 2001).
PDB merupakan data yang berisi koleksi struktur tiga dimensi protein,
DNA dan molekul kompleks lainnya yang telah dipublikasikan dan ditentukan
secara eksperimen dengan menggunakan X-ray crystallography atau NMR
spectroscopy. Pada X-ray crystallography, sinar-X dipancarkan kepada kristal
yang mengandung jutaan salinan suatu molekul. Sinar-X kemudian akan
didifraksikan oleh kristal dan membentuk suatu pola yang bila dianalisis secara
matematis akan menunjukkan posisi tiap atom dalam molekul. NMR spectroscopy
menggunakan molekul dalam larutan dan akan memperlihatkan orientasi atom
dalam medan magnetik (Baxevanis dan Ouellette, 2005).
Format PDB merupakan format yang dapat dimengerti baik olehkomputer maupun manusia (machine-human-readable), dimana di dalam format
ini ditampilkan informasi tentang sumber, sequence, struktur sekunder dan juga
koordinat tiga dimensi protein (Baxevanis dan Ouellette, 2005).
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
31/104
Universitas Indonesia
2.7.2.4 Molecular Modeling
Molecular modeling merupakan suatu metode untuk merancang dan
menganalisis struktur dan sifat-sifat molekul tertentu dengan mengunakan teknik
kimia komputasional dan teknik visualisasi grafis yang bertujuan untuk
menyediakan struktur geometri tiga dimensi yang sesuai dengan parameter
kondisi yang telah ditentukan. Molecular modeling merupakan gabungan dari data
empiris dan teknik komputasional untuk menirukan dan memodelkan perilaku
molekul sehingga dapat digunakan untuk mempelajari sistem molekular tertentu
(Leach, 2001).
Salah satu aspek penting dalam molecular modeling adalah mekanika
molekular yang menggunakan prinsip mekanika Newtonian untuk menjelaskan
karakter fisika dari suatu model. Mekanika molekular mengabaikan gerak elektron
sehingga sistem yang sebelumnya merupakan sistem kuantum menjadi sistem
klasik sehingga sistem menjadi lebih sederhana. Sistem ini memodelkan atom –
atom sebagai bola yang terhubung satu sama lain oleh pegas. Dengan demikian
energi total (disebut forcefield ) molekul dapat ditentukan oleh hukum Hooke yang
secara umum dinyatakan sebagai:
= + + + + + ,
dimana Etotal adalah energi total molekul, Estr adalah energi bond streching, E bend
adalah energi angle bending, Etor adalah energi torsional, Eoop adalah energi out -
of - plane, Evdw adalah energi van der Waals dan Eelec adalah energi elektrostatik
(Sutarto, 2008).
Energi total molekul berhubungan dengan energi internal sistem atau
energi potensial. Molekul berada dalam keadaan atau konformasi paling stabil
ketika energi potensialnya mencapai nilai paling minimum. Keadaan ini
mempengaruhi karakter molekul dalam peranannya pada proses kimia dan biologi(Leach, 2001). Parameter-parameter yang berhubungan dengan energi total
molekul disebut juga sebagai forcefield . Terdapat beberapa macam forcefield yang
penggunaannya disesuaikan dengan molekulnya, seperti MM+ untuk molekul
organik dan AMBER untuk peptida, protein dan DNA (Hypercube Inc., 2002).
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
32/104
Universitas Indonesia
2.7.2.5 Molecular Docking
Molecular docking merupakan suatu teknik yang digunakan untuk
mempelajari interaksi yang terjadi dari suatu kompleks molekul. Molecular
docking dapat memprediksikan orientasi dari suatu molekul ke molekul yang lain
ketika berikatan membentuk kompleks yang stabil. Terdapat dua aspek penting
dalam molecular docking, yaitu fungsi scoring dan penggunaan algoritma
(Funkhouser, 2007).
Fungsi scoring dapat memperkirakan afinitas ikatan antara
makromolekul dengan ligan (molekul kecil yang memiliki afinitas terhadap
makromolekul). Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi
bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa
konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang
besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan
penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang
paling stabil ( favourable) dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).
Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking,
yaitu:
- Docking protein – protein
- Docking ligan – protein
- Docking ligan – DNA
Saat ini molecular docking banyak diaplikasikan di dalam drug design
untuk memprediksikan orientasi ikatan antara kandidat molekul drug dengan
protein target sehingga dapat diketahui afinitas dari molekul drug tersebut. Untuk
melakukan molecular docking, hal pertama yang dibutuhkan adalah struktur tiga
dimensi dari ligan (drug) dan protein target. Struktur tiga dimensi ligan dapat
dimodelkan dengan menggunakan teknik molecular modeling sedangkan strukturtiga dimensi protein target dapat ditentukan secara empiris dengan menggunakan
teknik NMR spectroscopy dan X-ray crytallography yang terdapat pada database
Protein Data Bank dan secara in silico dengan teknik homology modelling
(Lucientes, 2004).
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
33/104
Universitas Indonesia
Ada beberapa software untuk molecular docking, antara lain:
- AutoDock (http://www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock/)
- FlexX (http://www.biosolveit.de/FlexX/)
- Dock (http://www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz/dock.html)- Gold (http://www.ccdc.cam.ac.uk/products/life_sciences/gold/)
Permasalahan utama untuk pemanfaatan komputer ini adalah keberadaan
aplikasi kimia komputasi yang memadai dan lengkap. Salah satu aplikasi kimia
komputasi yang cukup memadai untuk penemuan obat adalah Molecular
Operating Environment (MOE) yang dikembangkan Chemical Computing Group
(www.chemcomp.com). MOE selain menawarkan fasilitas yang cukup lengkap
juga user-friendly sehingga cocok digunakan dalam pembelajaran. Hanya sajaaplikasi kimia komputasi yang user-friendly biasanya mahal sehingga alasan
efisiensi biaya tidak lagi relevan.
2.7.3 Molecular Operating Enviroment (MOE)
Molecular Operating Enviroment (MOE) merupakan suatu software yang
dirancang oleh Chemical Computing Group untuk membantu cheminformatics,
molecular modeling, bioinformatics, virtual screening, structured-based design
(McCarthy, 2009). Molecular Operating Enviroment (MOE) menyediakan
aplikasi untuk mendesain dan menganalisis senyawa serta merupakan software
yang terintegrasi kimia komputasi, pemodelan molekul dan software aplikasi ilmu
informatika.
2.8 ToxTree
Studi toksikologi dengan menggunakan hewan memiliki beberapa
keterbatasan seperti waktu, dana yang besar, ketersediaan laboratorium yang
memadai dan serta adanya masalah tentang etika dalam penggunaan hewan
sebagai bahan uji (Antonio et al., 2009). Untuk membantu mengatasi masalahtersebut, ToxTree adalah software open source yang mampu memperkirakan
toksikologi dari suatu molekul secara cepat dan murah.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
34/104
Universitas Indonesia
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Persiapan Neuraminidase Virus Influenza A (H1N1)
3.1.1 Pencarian sequence neuraminidase Virus Influenza A (H1N1)
Sequence neuraminidase Influenza A diunduh dari database yang ada di
NCBI melalui situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/flu/. Sistem operasi
yang digunakan adalah Microsoft Windows XP.
3.1.2 Sequence alignment neuraminidase Virus Influenza A (H1N1)
Sequence yang diperoleh dari pencarian di NCBI di-alignment dengan
menggunakan program Clustal W2. Program Clustal W2 tersedia secara online
dan dapat diakses melalui situs http://www.ebi.ac.uk/inc/head.html. Hasil dari
alginment diinterpretasikan dengan nilai paling tinggi dan digunakan sebagai
neuraminidase target, yang akan ditentukan struktur 3 dimensinya.
3.1.3 Pencarian struktur 3 dimensi neuraminidase Virus Influenza A
Pencarian struktur tiga dimensi dilakukan dengan menggunakan SWISS-
MODEL yang dapat diakses melalui http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html. Template yang dipilih oleh program dalam SWISS-MODEL
adalah template yang mempunyai kesamaan terhadap Receptor Binding Domain
sequence neuraminidase yang diperoleh dari hasil sequence alignment .
3.1.4 Visualisasi Sisi Katalitik Neuraminidase Influenza A (H1N1)
Visualisasi sisi katalitik neuraminidase Influenza A (H1N1) ditentukan
dengan MOE 2008.10 dalam program surfaces and maps. Sisi katalitik enzim
terdiri atas beberapa sisi yang ditunjukkan dengan adanya beberapa sisi residu.
3.1.5 Optimasi Geometri dan Minimasi Neuraminidase
Optimasi geometri dan minimisasi energi dari struktur tiga dimensi
neuraminidase dilakukan menggunakan software MOE 2008.10. Mula-mula
dilakukan penambahan atom hidrogen dan protonasi dengan aplikasi protonate
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
35/104
Universitas Indonesia
3D. Setelah itu dilakukan pengaturan muatan partial dengan menggunakan partial
charge dan optimasi dengan forcefield MMFF94x. Saat optimasi, solvasi enzim
dalam bentuk gas phase dan dilakukan fix charge dengan RMS gradient adalah
0.05 kcal.mol-1.Ǻ-1, dan parameter yang lain menggunakan default yang telah ada
di software MOE. Kemudian di simpan dalam format .moe.
3.2 Perancangan Laninamivir Modifikasi
Pemodelan modifikasi gugus fungsi Laninamivir (ligan) dilakukan dengan
menggunakan software ACD/ChemSketch. Setelah dilakukan pemodelan dalam
bentuk dua dimensi, kemudian diubah kedalam bentuk tiga dimensi dengan
aplikasi 3D optimization pada ACD/ChemSketch. Struktur tiga dimensi disimpan
dalam format .MDL molfile. Selanjutnya format .MDL Molfile diubah kedalam
format .MDL Mol menggunakan software VegaZZ agar sesuai untuk proses
docking.
3.2.1 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi
Ligan
Optimasi geometri dan minimisasi energi struktur tiga dimensi ligan
menggunakan software MOE 2008.10. Kandidat ligan yang sudah dirancang
dibuka dengan software MOE 2008.10 dalam bentuk database viewer .
Selanjutnya ligan dilakukan “wash” dalam menu compute, dilakukan penyesuaianmuatan partial ligan dengan “ partial charge” dan dioptimasi menggunakan
forcefield MMFF94x. Selanjutnya ligan diminimasi menggunakan energy
minimize dengan RMS gradient adalah 0.001 kcal.mol-1.Ǻ-1. Parameter lainnya
disesuaikan dengan default yang ada dalam software MOE 2008.10. Kemudian
disimpan dalam format .mdb
3.3 Docking antara Neuraminidase Influenza A (H1N1) dengan Ligan
Proses simulasi docking antara neuraminidase dengan ligan dilakukan
dengan software MOE 2008.10 dengan sistem operasi Microsoft Windows XP
2007. Proses ini diawali dengan preparasi file docking yang dilakukan dengan
membuka file enzim dalam format .moe, setalah itu memilih residu asam amino
yang menjadi target docking. Selanjutnya membuka file kandidat ligan dalam
format .mdb. Setelah proses preparasi selesai, dilakukan docking dengan
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
36/104
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
37/104
Universitas Indonesia
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Preparasi Neuraminidase H1N1
4.1.1 Penentuan Sequence Neuraminidase H1N1
Sequence neuraminidase yang menjadi enzim target diperoleh dengan
mengunduh dari database sequence virus influenza yang terdapat di situs NCBI.
Parameter – paremeter yang digunakan pada pencarian adalah: tahun pencarian
dari tahun 2009 sampai tahun 2010, tipe sequence yang dipilih adalah sequence
protein neuraminidase virus influenza A subtipe H1N1 yang berasal dari seluruh
negara, dengan host manusia. Dari parameter tersebut didapatkan sebanyak 391
sequence protein neuraminidase, seluruh sequence yang diperoleh dilakukan
multiple sequence alignment dengan program Clustal W2 yang diakses melalui
http://www.ebi.ac.uk/inc/head, alignment ini dilakukan dengan tujuan untuk
mencari satu sequence yang dapat mewakili seluruh 391 sequence protein yang
akan dijadikan sebagai nerumanidase target, algoritma yang digunakan oleh
program Clustal W2 adalah algoritma Hidden Markov Model (HMM). Sequence
protein neuraminidase yang dipilih adalah sequence yang memiliki similarity
score tertinggi (100) yang paling banyak dari tiap perbandingan antar sequence.
Sequence yang menjadi perwakilan adalah sequence protein yang berasal dari
Auckland, New Zealand pada tahun 2009, >gi|237651250|gb|ACR08499.1|
neuraminidase [Influenza A virus (A/Auckland/1/2009(H1N1))] dengan GenBank
code: ACR08499.1.
4.1.2 Pencarian Struktur 3D Neuraminidase H1N1
Sequence protein neuraminidase target yang telah ditentukan diunduh
dengan format file FASTA, kemudian format FASTA dari protein neuraminidase
target dimasukkan ke dalam software online SWISS-MODEL, hasil dari
pembuatan ini berupa file struktur 3 dimensi dengan format .pdb, yang merupakan
hasil pembandingan dengan satu template dari database situs PDB (Protein Data
Bank). Hasil yang diperoleh dari SWISS-MODEL memiliki persentase identitas
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
38/104
Universitas Indonesia
sebesar 99.479 % dengan neuraminidase 3nssB (PDB Code). Satu kondisi yang
perlu diperhatikan dari hasil yang diperoleh yaitu persentase identitas (% identity)
harus minimal 60% antara struktur yang dibuat dengan template sebagai
pembanding. Maka dapat disimpulkan bahwa struktur 3D protein neuraminidase
yang dibuat dapat digunakan untuk proses selanjutnya.
4.1.3 Visualisasi Sisi Aktif Enzim Neuraminidase Virus Influenza A
Penentuan sisi katalitik dari neuraminidase yang digunakan diperoleh dari
NCBI dengan melihat GenPept dari sequence neuraminidase target, dengan
memasukkan kode GenBank dari neuraminidase target yaitu ACR08499.1. Dari
informasi yang tersebut didapatkan tujuh residu asam amino yang menjadi sisi
katalitiknya, yaitu: Arg 118, Asp 151, Glu 278, Arg 293, Arg 368, Tyr 402 dan
Glu 425. Ketujuh residu tersebut akan menjadi residu target dalam proses docking
(Gambar 4.1).
Setelah ditentukan sisi katalitik pada neuraminidase target, kemudian
dilakukan visualisasi terhadap neuraminidase dengan menggunakan software
MOE 2008.10 pada aplikasi Surfaces and Maps pada menu compute sebelumnya
Gambar 4. 1 Visualisasi Sisi Katalitik Neuraminidase Virus Influenza A
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
39/104
Universitas Indonesia
Gambar 4. 2 Visualisasi Tiga Dimensi Neuraminidase Virus influenza A
dilakukan pemilihan residu katalitik pada Sequences Editor , lalu pada aplikasi
Surfaces and Maps, dipilih permukaan (surface) gaussian contact (Gambar 4.2).
Dalam struktur 3 tersier protein atau enzim, residu asam amino yang bersifat
hidrofilik terdapat di bagian eksterior (permukaan) sedangkan residu hidrofobik
umumnya terdapat di bagian interior protein (Lehninger, 2004). Hasil darivisualisasi dari neuraminidase menunjukkan bahwa warna hijau menunjukan
residu yang bersifat hidrfobik, warna ungu menunjukan residu yang memiliki
ikatan hidrogen dan warna biru merupakan residu yang bersifat mild – polar.
Binding site neuraminidase ada disekitar Arg 118, Glu 119, Leu 134, Gln 136, Lys
150, Asp 151, Arg 152, Arg 156, Trp 179, Ser 180, Ala 181, Ile 223, Arg 225, Thr
226, Gln 227, Glu 228, Ser 247, Glu 277, Glu 278, Arg 293, Asn 295, dan Tyr
402 yang umumnya residu tersebut cenderung bermuatan positif dan polar
sehingga lebih menyukai substrat yang memiliki gugus bermuatan negatif.
4.1.4 Optimasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi
Neuraminidase H1N1
Proses optimasi geometri dan minimisasi energi enzim dilakukan dengan
menggunakan software MOE 2008.10. Pertama-tama dilakukan protonasi
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
40/104
Universitas Indonesia
terhadap enzim dengan menggunakan aplikasi Protonate 3D pada menu compute.
Hal ini dilakukan agar enzim berubah menjadi keadaan terprotonasi (ionisasi) dan
posisi atom hidrogen pada enzim terlihat dalam bentuk 3 dimensi dari stuktur
kristal, penambahan atom hidrogen dilakukan karena pada struktur kristal dari
suatu makromolekul (dalam hal ini adalah enzim) terdapat sedikit atau tidak ada
koordinat dari atom hidrogen dikarenakan keterbatasan resolusi dari alat.
Keberadaan atom hidrogen diperlukan dalam proses molecular docking, dynamic,
bahkan perhitungaan elektrostatik. Setelah itu, dilakukan penambahan muatan
( partial charge) dengan method: current forcefield . Tujuan penambahan muatan
adalah agar muatan pada enzim terprotonasi dengan tepat sesuai dengan keadaan
alaminya, sehingga proses docking berjalan sesuai dengan keadaan nyata.
Kemudian dilakukan minimisasi energi ( Energy Minimize) pada enzim.
Mula-mula dilakukan pengaturan pada aplikasi potensial setup, parameter yang
digunakan yaitu forcefield . Forcefield yang sesuai untuk keadaan sistem adalah
MMFF94x dengan pemilihan solvasi dalam gas phase karena pada tahapan untuk
molecular docking, enzim dibuat dalam keadaan rigid maka perlu dilakukan
penghilangan energi solvasi (Fadilah, 2010). Penggunaan forcefield MMFF94x
dinilai lebih baik dibandingkan forcefield yang lain karena memiliki kepekaan
terhadap optimasi geometri enzim dengan inhibitor cukup tinggi. Saat ini
forcefield MMFF94x sangat banyak digunakan dalam computational biology
karena memiliki keakuratan dan penggunaannya yang luas (Panigrahi & Desiraju,
2007). Proses minimisasi dilakukan dengan nilai RMS gradient adalah 0.05
kcal.mol-1.Ǻ-1 yang sesuai untuk protein. Proses minimisasi dilakukan untuk
mencari koordinat dari posisi atom agar berada pada keadaan minimum dari
energi molekulnya. Proses ini dilakukan dengan menghitung konformasi enzim
dimana tidak ada gaya yang bekerja pada antar atom. Algoritma yang digunakan
adalah alpha sphere yang dapat menyesuaikan molekul kecil sehingga tepat posisi
pada makromolekul dan dapat menghitung afinitas pengikatan (Kataoka et al.,
2004). Lalu parameter yang lainnya menggunakan parameter default pada MOE
2008.10
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
41/104
Universitas Indonesia
4.2 Pemilihan Gugus Fungsi dalam Modifikasi Laninamivir
Daerah binding dan catalytic site dari neuraminidase target, pada umumnya
memiliki residu asam amino yang bersifat polar dan hidrofilik. Penentuan gugus
yang digunakan dalam modifikasi ini adalah berdasarkan pada sifat-sifat dari
residu asam amino pada binding dan catalytic site dari Neuraminidase.
4.2.1 Gugus O-glikosida
Pemilihan gugus O-glikosida yang digunakan untuk modifikasi
laninamivir disebabkan karena struktur substrat dari neuraminidase yaitu sialic
acid yang memiliki gugus O-glikosida. Sehingga penggunaan gugus O-glikosida
dalam modifikasi oseltamivir dapat digunakan sebagai inhibitor kompetitif. (Guo
et al., 2002), menyatakan derivatif O-glikosida sialic acid dapat digunakan untuk
menghambat aktivitas sialidase (neuraminidase) virus influenza. Selain itu gugus
O-glikosida juga bersifat hidrofilik dan memiliki kepolaran yang tinggi karena
memiliki banyak gugus alkohol yang bersifat hidrofilik
4.2.2 Gugus Furan
Pemilihan gugus furan yang digunakan untuk modifikasi laninamivir
berdasarkan pada penelitian Ryu et al., yang menyatakan bahwa senyawa yang
mengandung cincin eter beranggotakan 5 menunjukkan aktivitas inhibisi yang
lebih tinggi dibanding senyawa lainnya yang tidak mengandung cincin eter beranggotakan lima dalam menghambat aktivitas neuraminidase. Selain itu gugus
furan juga memiliki kepolaran yang tinggi dan bersifat hidrofilik karena memiliki
gugus alkohol.
4.2.3 Gugus Polar Sederhana
Beberapa gugus-gugus polar sederhana yang digunakan dalam modifikasi
gugus fungsi oseltamivir yaitu alkohol, aldehid, keton, asam karboksilat, ester dan
amida. Gugus-gugus polar sederhana ini memiliki kepolaran yang berbeda,
dimana gugus alkohol merupakan gugus yang paling polar diantara gugus-gugus
tersebut. Sedangkan gugus amida merupakan gugus yang kepolarannya paling
kecil (Rachmania, 2010).
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
42/104
Universitas Indonesia
4.3 Preparasi Ligan Modifikasi Laninamivir
4.3.1 Desain Modifikasi Laninamivir Sebagai Ligan
Desain pada modifkasi laninamivir (ligan) ini dilakukan secara acak
dengan mengganti dua dari empat gugus fungsi yang terdapat pada laninamivir,
namun struktur stereokimia dari laninamivir tetap dipertahakan. Hasil dari
modifikasi ini menghasilkan 336 kombinasi laninamivir modifikasi. Perancangan
modifikasi laninamivir menggunakan software ACD/ChemSketch, hasil
perancangan ini disimpan dalam format .MDLmolfile, kemudian diubah dengan
VegaZZ menjadi format .MDLmol, pengubahan ini dilakukan supaya ligan hasil
modifikasi dapat terbaca dalam software MOE 2008.10 yang nantinya akan
digunakan untuk docking antara enzim dengan ligan
4.3.2 Optimisasi Geometri dan Minimisasi Energi Struktur Tiga Dimensi
Ligan
Ligan – ligan hasil modifikasi di-import kedalam database viewer dengan
software MOE 2008.10. Dalam optimasi geometri dari ligan, dimulai dengan
melakukan wash terhadap seluruh ligan, hal ini bertujuan untuk membersihkan
struktur ligan seperti memperbaiki posisi atom hidrogen atau menyesuaikan
keadaan terprotonasi, supaya setiap struktur ligan berada dalam bentuk yang
paling sesuai sehingga proses selanjutnya dapat dilakukan (docking). Kemudianoptimasi menggunakan forcefield MMFF94x dan perbaikan muatan dalam tiap-
tiap atom dengan aplikasi partial charge. Minimisasi energi pada ligan dilakukan
dengan RMS gradient 0.001 kcal.mol-1.Ǻ-1 dan parameter method adalah
MMF94x, yang digunakan pada molekul kecil seperti ligan. RMS gradient yang
digunakan ligan dipengaruhi oleh besarnya molekul, semakin besar molekul,
maka RMS gradient -nya juga semakin besar. Dalam hal ini ligan memiliki berat
molekul yang lebih kecil dibandingkan dengan protein sehingga RMS gradient -
nya lebih kecil. Hal ini disebabkan semakin besar molekul maka akan memilikiefek sterik yang tinggi sehingga RMS gradient harus semakin kecil.
4.4 Proses Docking antara Neuraminidase Influenza A dengan Ligan
Dalam molecular modelling, proses docking adalah metode untuk
memprediksi konfigurasi ikatan yang lebih disukai antara ligan yang berukuran
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
43/104
Universitas Indonesia
kecil-sedang dan target makromolekul yang rigid , yang biasanya berbentuk
protein. Dalam penelitian ini, dilakukan proses docking antara ligan modifikasi
dan neuraminidase menggunakan software MOE 2008.10. Proses docking
dilakukan pada 336 ligan modifikasi (yang selanjutnya disebut ligan) dan 3 ligan
standar yaitu: oseltamivir, zanamivir dan laninamivir terhadap residu sisi aktif dari
neuraminidase yaitu: Arg 118, Asp 151, Glu 278, Arg 293, Arg 368, Tyr 402 dan
Glu 425, yang dipilih pada aplikasi sequence editor . Hal ini bertujuan agar proses
docking hanya dilakukan pada terhadap ketujuh asam amino tersebut.
Pada placement method , digunakan triangle matcher merupakan placement
method yang standar yang software MOE 2008.10. Metode ini digunakan untuk
menunjukkan gerak acak ligan dalam sisi aktif enzim untuk menghasilkan
orientasi ikatan yang optimal berdasarkan charge group dan spatial fit (Cook et
al., 2009). Selain itu, triangle matcher lebih baik daripada alpha matcher karena
dapat menghasilkan pose yang lebih sistematis dan akurat (Manavalan et al.,
2010). Fungsi scoring yang digunakan adalah London dG dengan retain sebesar
100, tanpa duplikasi (Mazur et al., 2009). Fungsi scoring akan mengukur aktivitas
biologi berdasarkan ikatan dan interaksi yang terjadi antara ligan dengan target
protein (Nylander, 2007). London dG mengestimasi besarnya energi bebas ikatan
(ΔG binding) dari pose ligan terhadap enzim berdasarkan perhitungan:
∆ = + +∑ +∑ +∑ ∆ ,
dimana c = rata-rata entropi rotasi dan translasi yang didapat atau dilepaskan, E flex
= energi yang menyatakan berkurangnya fleksibilitas dari ligan, c HB = energi dari
ikatan hidrogen ideal, f HB = ukuran ketidaksempurnaan geometri dari ikatan
hidrogen, Σh-bonds menyatakan total ikatan hidrogen yang terbentuk dari interaksi
antara ligan dengan enzim, c M = energi dari ideal metal ligation, f M = ukuran
ketidaksempurnaan geometri dari metal ligations, dan Di = energi desolvasi atom
ke-i (MOE tutorial, 2008).
Selanjutnya tahapan refinement digunakan untuk perbaikan lebih lanjut,
refinement yang digunakan adalah forcefield dengan konfigurasi sesuai default .
Konfigurasi diatur dengan ukuran pengulangan populasi sebanyak 100.
Pengaturan default dari refinement forcefield menggunakan pocket cut off 6Ǻ,
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
44/104
Universitas Indonesia
yaitu jarak reseptor yang diikutsertakan pada proses docking (Feher et al., 2009).
Retain terakhir diatur hanya menampilkan satu konfigurasi yang paling sesuai dan
terbaik. Menurut Gohlke et al., (2003) refinement menggunakan forcefield
memberikan hasil yang lebih akurat bila dibandingkan dengan yang lain. Hal ini
disebabkan forcefield menggunakan model Generalized Born solvation (GB/VI)
pada tahap evaluasi energi akhir. GB/VI menggunakan perhitungan elektrostatik
pada proses minimisasi.
4.4.1 Hasil Screening Ligan
Proses docking akan menghasilkan tiga hal yaitu: (1) menghasilkan
orientasi dan posisi suatu ligan sebagai inhibitor terhadap enzim, (2)
mengidentifikasi senyawa yang memiliki afinitas terhadap protein dari database
senyawa yang tersedia, (3) memprediksi afinitas yang dimiliki suatu molekul
terhadap enzim. Ketiga hal tersebut berupa fungsi scoring ( London dG) yang
dikalkulasi sebagai nilai energi bebas ikatan, G binding dalam kkal/mol.
Screening terhadap 336 ligan dilakukan sebanyak 4 kali. Pertama-tama
dari 336 ligan dipilih 100 ligan terbaik, pemilihan ligan berdasarkan pada nilai
energi bebas pengikatan yang paling rendah. Hasil docking diatas digunakan
sebagai screening pertama. Selanjutnya dari 100 ligan terbaik, dilakukan docking
ulang untuk mendapatkan 20 ligan terbaik dengan nilai energi bebas pengikatan
terendah. Hasil docking ini digunakan sebagai screening kedua. Kemudian 20
ligan terbaik di-docking ulang kembali untuk mencari 10 ligan terbaik yang
memiliki energi bebas pengikatan terendah. Hasil 10 ligan terbaik digunakan
sebagai screening ketiga, 10 ligan terbaik ini dilakukan docking kembali untuk
mendapatkan 5 ligan terbaik, lalu dari 5 terbaik dilakukan docking untuk
menentukan 3 kandidat ligan terbaik berdasarkan pada energi bebas ikatan dan
interaksi yang terjadi antara ligan dengan reseptor berupa ikatan hidrogen antara
ligan dengan residu-residu sisi aktif neuraminidase. Pengulangan ini dimaksudkan
agar refinement perhitungan energinya makin baik.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
45/104
Universitas Indonesia
4.5 Analisis Hasil Docking
4.5.1 Energi Ikatan dan Konstanta Inhibisi (Ki)
Energi bebas ikatan (ΔG binding) pada proses docking ini merupakan afinitas
dari ligan yang berikatan dengan enzim membentuk kompleks enzim-ligan dalam
keadaaan kesetimbagan. Dengan melihat energi bebas ikatan, kita dapat
memperkirakan kestabilan dari kompleks enzim-ligan yang terbentuk. Energi
bebas ikatan juga berhubungan dengan harga konstanta inhibisi (K i), konstanta ini
juga memberikan gambaran mengenai afinitas antara ligan dengan enzim. Afinitas
ligan-enzim diperngaruhi oleh interaksi intermolekular non kovalen antara dua
molekul seperti ikatan hidrogen, interaksi elektrostastik, hidrofobik, dan gaya van
der Waals. Persamaan K i dirumuskan sebagai berikut:
=[ ][ ]
[ ] dengan persamaan ⇌ + ,
dengan E, L, dan EL berturut-turut adalah enzim, ligan, dan kompleks enzim-
ligan. Konstanta inhibisi memiliki satuan molar (M), yang berkaitan dengan
konsentrasi ligan yang menempati sisi binding enzim tertentu [L]. Semakin kecil
konstanta inhibisi, semakin kuat penempelan ligan atau semakin tinggi afinitas
antara ligan dengan enzim. Lalu hubungan antara energi bebas ikatan dengan
konstanta inhibisi adalah sebagai berikut:
Δ = × × [ ],
dengan R dan T berturut-turut adalah tetapan gas ideal dan suhu dalam Kelvin.
Semakin kuat ikatan (binding) berarti semakin negatif harga ΔG dan semakin
kecil harga K i dan demikian sebaliknya, semakin rendah afinitas berarti semakin
kurang negatif harga ΔG dan semakin besar harga K i dilambangkan S. Berikut ini
adalah hasil analisis energi bebas ikatan dan harga pK i (pK i = – log K i) dari 3
kandidat ligan terbaik dibandingkan dengan standar (Tabel 4.1).
Dapat dilihat dari tabel 4.1 bahwa 3 kandidat ligan modifikasi memiliki
perkiraan harga pK i yang lebih baik (lebih besar) dari ligan standar, demikian juga
pada energi bebas ikatan yang lebih rendah daripada ligan standar.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
46/104
Universitas Indonesia
Tabel 4. 1 Energi ikatan dan konstanta inhibisi ligan-enzim
Ligan ΔGbinding (kkal.mol-1
) pKi
S t a n d a
r
Oseltamivir -16.6823 9.499
Laninamivir -16.6877 11.474
Zanamivir -16.9679 9.745
M o d i f i k a s i
AM3G1 -22.1757 13.054
CA3G1 -27.6636 15.787
F1G2 -28.0250 14.282
4.5.2 Ikatan Hidrogen
Interaksi antara ligan dan enzim menjadi salah satu parameter untuk
menentukan aktivitas dari suatu ligan terhadap enzim. Target dari interaksi ligan
terhadap enzim (neuraminidase) adalah residu-residu sisi aktif dari neuraminidase.
Hal ini bertujuan agar ligan yang dibuat diharapkan dapat berfungsi sebagai
inhibitor pada neuraminidase yang memiliki fungsi enzimatik. Telah diketahui
sebelumnya, terdapat tujuh residu asam amino yang menjadi sisi aktif dari
neuraminidase, diharapkan bahwa semakin banyak interaksi dari ligan dengan
residu sisi aktif neuraminidase maka fungsi ligan sebagai inhibitor semakin baik.
Interkasi yang terbentuk antara ligan dengan enzim adalah interkasi ikatan
hidrogen, dimana terjadinya ikatan hidrogen adalah jika jarak antara hidrogen
dengan atom elektronegatif berada dalam rentang 2.5 – 3.5 Å. Berikut ini adalah
tabel interaksi ligan dengan neuraminidase (Tabel 4.2).
Dari tabel tersebut dapat terlihat bahwa ligan AM3G1, CA3G1, dan F1G2
membentuk 8, 11, dan 14 ikatan hidrogen dengan residu asam amino enzim,
sedangkan pada ligan standar oseltamivir, laninamivir dan zanamivir hanya
membentuk 5, 6, dan 7 ikatan hidrogen. Dalam pengikatan terhadap sisi aktifnya
ligan AM3G1, CA3G1, dan F1G2 membentuk 6, 6, dan 9 ikatan hidrogen
sedangkan pada ligan standar, terdapat 3 ikatan hidrogen untuk oseltamivir, 2
ikatan hidrogen untuk laninamivir dan 4 ikatan hidrogen untuk zanamivir. Ikatan
hidrogen memberikan kontribusi terhadap afinitas ligan dengan enzim, karena
terjadinya interkasi elektrostatik antara atom oksigen atau nitrogen ligan dengan
atom hidrogen residu asam amino enzim atau sebaliknya (Rachmania 2010).
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
47/104
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
48/104
Universitas Indonesia
Gambar 4. 3 Interaksi 2D dan 3D antara ligan AM3G1 dan Neuraminidase
glikosida, Glu 278 dengan atom hidrogen pada gugus propanatriol, Arg 293dengan hidroksi pada gugus propanatrioldengan dan Arg 368 terdapat dua ikatan
hidrogen antara atom N pada arginin dengan hidroksi pada gugus glikosida. Selain
iut juga terdapat interaksi ligan dengan binding site nueraminidase yaitu Trp 179
dan Arg 152.
Pada interaksi antara ligan CA3G1 dan residu sisi aktif neuraminidase
mirip dengan interaksi dengan ligan AM3G1 hanya terdapat beberapa interkasi
tambahan yaitu: Asp 151 terdapat dua interaksi pertama pada atom nitrogen
dengan atom hidrogen pada gugus glikosida dan yang kedua atom oksigen dengan
atom hidrogen pada gugus amina, Glu 278 dengan atom hidrogen pada gugus
Gambar 4. 4 Interaksi 2D dan 3D antara ligan CA3G1 dan Neuraminidase
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
49/104
Universitas Indonesia
hidroksi, Arg 293 juga terdapat dua interaksi ikatan hidrogen yaitu gugus NH
dengan atom oksigen pada epoksida dan gugus NH yang lain dengan atom
oksigen pada propanatriol dan Arg 368 terdapat ikatan hidrogen dengan hidroksi
pada gugus glikosida.
Interaksi ligan F1G2 terjadi lebih merata pada setiap sisi aktif
neuraminidase yaitu: Asp 151 dengan atom hidrogen pada furan, Glu 278 dengan
atom hidrogen pada gugus glikosida, Arg 293 terdapat dua ikatan hidrogen
dengan atom oksigen pada gugus glikosida dan atom oksigen yang lain pada
gugus glikosida, Arg 368 juga terdapat 2 interaksi yaitu gugus NH dengan atom
oksigen pada propanatriol dan Tyr 402 terdapat tiga ikatan hidrogen dengan 1
ikatan dengan atom oksigen pada gugus furan dan 2 ikatan hidrogen pada gugs
propanatriol.
4.6 Toxicological Properties
Dalam desain suatu obat, penentuan sifat toksikologi dalam desain obat
perlu diperhatikan. Hal ini bertujuan untuk memprediksi efek yang merugikan
bagi suatu spesies makhluk hidup (Antonio et al., 2009). Penetuan sifat
toksikologi ini dilakukan dengan menggunakan software ToxTree. Sifat
toksikologi difokuskan pada carcinogenicity dan mutagenicity karena menjadi
perhatian penting dalam kesehatan manusia dan berhubungan langsung dengantujuan desain ligan yang merupakan desain obat. Pada ToxTree, dasar penentuan
Gambar 4. 5 Interaksi 2D dan 3D antara ligan F1G2 dan Neuraminidase
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
50/104
Universitas Indonesia
sifat toksikologi menggunakan aturan dari Benigni/Bossa rulebase untuk
carcinogenicity dan mutagenicity yang dikembangkan oleh Romualdo Benigni
dan Cecilia Bossa dari Instituto Superiore di Sanita, Rome, Italy dan disetujui oleh
European Chemical Bureau, Institute for Health and Consumers Protection,
European Commision-Joint Research Centre (JRC) pada tahun 2008. Hal yang
perlu diperhatikan dalam penentuan sifat toksikologi dengan menggunakan
ToxTree antara lain ada atau tidaknya suatu structural alerts (SAs) yang bersifat
genotoxic maupun nongenotoxic dan penentuan secara (Q)SARs.
Dari hasil toxicological prediction (Tabel 4.3) menggunakan software
ToxTree terlihat bahwa ketiga ligan tidak memiliki structural alerts (SAs) yang
bersifat genotoxic maupun nongenotoxic dan juga dengan pendekatan (Q)SARs
tidak bersifat mutagen maupun carcinogen. Tabel 4. 3 Hasil ToxTree Prediction
ToxTree Toxicity Prediction AM3G1 CA3G1 F1G2
Structural alert for genotoxic carcinogenicity No No No
Structural alert for nongenotoxic
carcinogenicity No No No
Potential carcinogen based on QSAR No No No
Potential S.typhimurium TA100 mutagen based
on QSAR No No No
Negative for genotoxic carcinogenicity Yes Yes Yes
Negative for nongenotoxic carcinogenicity Yes Yes Yes
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
51/104
Universitas Indonesia
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Modifikasi pada laninamivir dilakukan untuk mencari inhibitor potensial
untuk neuraminidase virus influenza A subtipe H1N1. Modifikasi gugus fungsi
pada laninamivir diperoleh 336 laninamivir modifikasi. Screening dilakuakan
sebanyak 4 kali dengan menggunakan proses docking sampai didapatkan 3
kandidat ligan terbaik dibandingkan dengan ligan standar. Proses docking
mendapatkan AM3G1, CA3G1 dan F1G2 menjadi tiga ligan terbaik. Tiga
kandidat ligan terbaik ini dilakukan analisis dengan membandingkan nilai
G binding, untuk melihat kestabilan kompleks yang terbentuk antara ligan dengan
enzim. Lalu yang kedua dengan melihat interaksi ligan terhadap sisi aktif enzim
berupa ikatan hidrogen, untuk menjadi inhibitor pada neuraminidase yang
memiliki fungsi enzimatik.
Tiga kandadat ligan terbaik ini, selanjutnya diuji sifat toksikologinya
dengan menggunakan ToxTree, untuk melihat carcinogenicity dan mutagenicity
dari kandidat ligan. Dari hasil analisis, secara keseluruhan ligan AM3G1, CA3G1,
dan F1G2 tidak bersifat carcinogen dan mutagen.
5.2 Saran
Perlu dilakukan molecular dynamic simulation terhadap 3 kandidat ligan
terbaik ini, untuk melihat pengaruh dari pelarut dan suhu pada interaksi ligan
dengan neuraminidase, Perlu juga dilakukan analisis ADME dan bioactivity dari
ligan untuk mengetahui perlakuan dari sistem tubuh manusia terhadap ligan.
Modifikasi laninamivir ..., Johannes Salim, FMIPA UI, 2011
-
8/19/2019 Digital 20214021 S147 Modifikasi Laninamivir
52/104
Universitas Indonesia
DAFTAR PUSTAKA
Altschul, S.F. 1990. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular
Bio