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Rôle des bactéries dans la rétention et le transfert accéléré de multipollutions
métalliques dans les sols
DESAUNAY Aurélien
Sous la direction de Jean MARTINS
Financement: bourse CNRS-BDI
1
Contexte d’étude
?
• Ruissellement de surface• Transport fluvial• Transport dynamique• Bio transformations• Volatilisation
Nécessité d’identifier ces mécanismes pour mieux prédire le devenir des polluants et leur impact sanitaire et environnemental
Rôle de la fraction colloïdale dans le transport des métaux ?
2
Impact du transport colloïdalLes colloïdes abiotiques du sol (argiles, MO…) :
- Taille < 1µm
- Faible solubilité
- Réactivité importante
Colloïdes abiotiques sont connus pour la mobilisation et l’accélération du transport de contaminants (ETM et Radioéléments)
Encore peu de connaissances sur:- La présence de plusieurs polluants dans le milieu
- Le rôle joué par les biocolloïdes (bactéries)
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Les bactéries• Êtres vivants unicellulaires, procaryotes (pas de
noyau) micrométriques comportement colloïdal• Mobiles, fixées ou formant des biofilms
présentes dans tous types d’environnementNombreuses (106 à 1010 cellules/g sol sec) et actives Participation aux cycles biogéochimiques Réactivité importante
COMPARTIMENT REACTIF DU SOL
4
Copper encrustationson P. aeruginosa cells
(Little et al. 1997)
Se accumulation in R. metallidurans CH34
(Roux et al. 2001)
Contribution au transfert accéléré des polluants ?
Comprendre les mécanismes d’interactions métaux bactéries et leur prépondérance
Accumulation intracellulaire
Adsorption sur la membrane
Spécificité des bactéries vis-à-vis des métaux
Ln cristals sorptionon P. aeruginosa
(Fortin et al. 1997)
Sorption aux polymères de
surface
5
Prise en charge des métaux par les bactéries?
- A l’échelle subcellulaire
- A l’échelle Biofilm
Démarche expérimentale couplée
D’après Véronique Guiné
0
0.25
0.5
0.75
1
C/C
0
Bio-transported metal (C. metallidurans CH34) Bio-transported metal (E. coli DH5α) Cadmium
pH ≈ 6
0
0.25
0.5
0.75
1
C/C
0
Bio-transported metal (C. metallidurans CH34) Bio-transported metal (E. coli DH5α) Cadmium
pH ≈ 6
Cadmium
pH ≈ 6
0 1 2 3 4 5 6 7 8V/V0
0 1 2 3 4 5 6 7 8V/V0
Étude du transfertaccéléré des polluants
- Bactéries seules
- Métaux seuls
- Mélanges
Statique Dynamique
Impact d’une Multipollution
Photo MEB, Muris
6
Plan• Introduction
• Axe 1 : interactions bactéries/métaux
– Étude de la distribution subcellulaire des métaux– Visualisation en microscopie électronique
• Axe 2 : Étude du transfert accéléré des métaux
7
Réactivité Bactérie/Métaux
D’après Ledin, 2000
Adsorption(Propriétés de surface)
Accumulation intracellulaire
Fixation aux polymères de surface
Cytoplasme
Membrane
Polymères de surface
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Approche classique interactions bactéries/métaux
Conceptualisation simplisteNe décrit qu’une partie des mécanismes
Souvent mis en défaut
POH PO- + H+
ROH RO- + H+
COOH COO- + H+
OH
Acides carboxyliques
Neutres phosphatés
Basiques hydroxiles (amines)
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Approche insuffisante
AUTRES MECANISMES?
Calcul théorique de densité de sites membranaires:
2 atomes de Zn/Cd par nm-2
Capacité de sorption mesurée:
30 à 60 atomes Zn/Cd par nm-2
Ratio:
15 à 30 X
Adsorption de Zn/Cd sur 3 bactéries (Guiné et al., 2006)
10
1. Mieux comprendre les mécanismes de prise en charge des métaux par les bactéries
- Étude de la distribution subcellulaire des métaux- Microscopie électronique
2. Ces mécanismes sont-ils conservés en présence de plusieurs métaux (2) ?
Objectif de l’Axe 1
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Les modèles : les bactéries (Gram-)
Sensibilité aux métaux
Morphologie et taille
Cellules en forme de bâtonnets1.2 x 0.4 µm 2.1 x 0.6 µm
Guiné , 2006
Très résistante à de nombreux métaux
Cupriavidus metallidurans CH34
Escherichia coliK12DH5α
Plus sensible aux métaux àforte concentration
Bactéries maintenant bien connues au laboratoire:Capacités d’échange et groupes réactifs sont
identifiés et caractérisés
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• ZINC (Zn):Oligo-élément essentiel à la vie (métalloenzymes)Toxique à fortes concentrationsPrincipale utilisation : industrielle (galvanisation)
• CADMIUM (Cd):Aucune fonction biologique connueMétal très toxiquePrincipales utilisations: cadmiage, accumulateurs électriques, pigments colorés…
Les modèles : Métaux (ETM)
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Démarche expérimentale
« Contact passif » « Contact actif »
Culture en présence de
métal
48h à 30°C
Culture en absence de
métal
(48h à 30°C)
Resuspensiondans H2O
Mise en contact avec le métal
2h à 4°C
Centrifugation et rinçage du milieu de culture (3X)
Distribution subcellulaire
14
Distribution subcellulaire des métaux
surnageantCulot
Bactérie + Métal
Centrifugation 5000g / 10 min
Casse cellulaire par une presse de French à 1500kgf/cm2
Resuspension dans H2O
Ultracentrifugation 20000g / 20 min
surnageant Culot
Compartimentmembranaire
Compartimentintracellulaire
Compartimentextracellulaire
X2
Analyse des métaux par ICP-MS Sarah Bureau
15
Interactions bactéries/CdContact passif (2h à 4°C)
Comportement dépendant de la bactérie
Forte accumulation dans les compartiments intracellulaireet extracellulaire
Accumulation faible dans les membranes
C. metallidurans CH3446%
43%
11%
65%
31%
4%
E. coli K12DH5α
10-5M10-5M
16
Interactions bactéries/ZnContact passif (2h à 4°C)
E. coli K12DH5α
10-5M
9%
2%
89%
10-5M
55%
39%
6%
C. metallidurans CH34
Comportement dépendant de la bactérie
Forte accumulation dans les compartiments extracellulaireet intracellulaire ( surtout C. metallidurans CH34)
Accumulation faible dans les membranes
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Interactions bactéries/ZnContact actif (48h à 30°C)
10%
3%
87%
E. coli K12DH5α
88%
7%
5%
C. metallidurans CH34
16%
3%
81%80%
17%
3%
Cadmium
Zinc
• Prise en charge « similaire » pour les 2 bactéries
• 80 à 90 % du métal dans le fluide extracellulaire
18
Interactions bactéries/CdC. metallidurans CH34
• Distribution très différente selon la mise en contact
• Mise en évidence de mécanismes de résistance
• Contact actif = comportement en milieu naturel
46%
43%
11%
Contact actifContact passif
88%
7%
5%
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Microscopie électroniqueMET/EDX
Confirmation d’ accumulation intracellulaire
Control
Zn 1000ppm
Control
Zn 1000ppm
Présence de nanogranulesextracellulaire contenant du
métal
Collaboration avec Roland Hellmann (LGIT)
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Travaux en cours• Poursuivre la microscopie pour confirmer ces résultats
• Mise au point d’un protocole d’ultrafiltration pour isoler les polymères extracellulaires (manip en cours)
Bactéries Exopolymères:
- ADN
- Polysaccharides
- Protéines
• Effet d’un mélange (Zn/Cd) sur la distribution de ces métaux chez les bactéries
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Conclusions• Mise au point du protocole:
– Manip. Reproductibles
• Étude de distribution des métaux
– Faible importance de la membrane– Forte accumulation intracellulaire et extracellulaire
• Microscopie électronique
– Mise en évidence de l’accumulation intracellulaire– Présence de nanogranules extracellulaires
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Plan• Introduction
• Axe 1 : interactions bactéries/métaux (seuls et en mélange)
• Axe 2 : Étude du transfert accélérédes métaux
- Comprendre ce que deviennent les métaux dans le sol après prise en charge
Étude du transfert en milieu poreux
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Analyses:- Dosage des métaux- Énumération cellulaire- pH- conductivité…
Pompepéristaltique
Collecteur defractions
Balance
C/C0
V/V0
T
C
Sable
Colonne de laboratoire
Métaux et/ou
bactéries
2 sols modèles:- Sable de Fontainebleau
- Sable d’Hostun
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Démarche expérimentale pour l’étude du transfert:
– Bactéries seules et en mélange
– Métaux seuls et en mélange
– Bactéries et métaux
Et Modélisation…
25
Sable de Fontainebleau (Guiné 2006)
Importance de la souche bactérienne et des conditions physico-chimique (FI, pH, q, Conc…)
Transfert des bactéries
0
0.25
0.5
0.75
1
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5V/V0
C/C
0
C. metallidurans CH34E. coli DH5αE. coli HMS174A. tumefaciens C58
KBr 1g L-1
Pour le transport de mélanges de bactéries :
nécessité d’outils plus puissants et nouveaux
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Énumération cellulaire
La cytométrie renseigne sur:
• Taille relative (Forward scatter - FSC)
• Granularité relative (Side scatter - SSC)
• Intensité de fluorescence (Fluorochrome)
• Méthodes classiques:Dénombrement / DAPI / Densité Optique (600nm)
Inutilisable pour l’étude du mélange de bactéries
• Utilisation de la cytométrie en flux (Sylvie)
27
Résultats préliminairesDensité optique
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
V/V0
C/C
0
CytométrieDilution x 10000
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
V/V0
C/C
0
DO
H2O non filtré
H2O filtré 0.1µm
CytométrieDilution x 1000
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
V/V0
C/C
0
DO
H2O non filtré
H2O filtré 0.1µm
CytométrieDilution x 5000
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
V/V0
C/C
0
DO
H2O non filtré
H2O filtré 0.1µm
Outil « puissant et rapide »
Mise au point à compléter
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Sable de Fontainebleau Sable d’Hostun
Faible rétention des 2 bactéries
KBr 1g L-1
0
0.25
0.5
0.75
1
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5V/V0
C/C
0
C. metallidurans CH34
E. coli DH5α
KBr 1g L-1KBr 1g L-1
0
0.25
0.5
0.75
1
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5V/V0
C/C
0
C. metallidurans CH34
E. coli DH5α
Transfert des bactéries
Rétentions réversible et irréversible plus
importantes
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
V/V0
C/C
0
C. metallidruansCH34
E.coli K12DH5
29
Transfert des métauxSable Fontainebleau
Retard importantAccélération par les bactéries
Rétention totale des métaux
0
0,25
0,5
0,75
1
0 2 4 6 8V/V0
C/C0
67%Cadmium
Transport en présence des bactéries:-E. coli DH5a-R. metallidurans CH34
Transport en l'absence des bactéries
14%13%
0
0,25
0,5
0,75
1
0 2 4 6 8V/V0
C/C0
53%
Zinc
20%
17%
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 2 4 6 8 10 12
Cd
Zn
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80 100
% de metal total
Prof
. de
colo
nne
(en
cm)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80 100
% de metal total
Prof
. de
colo
nne
(en
cm)
ZnCd
Sable d’Hostun
30
Travaux en cours
-Terminer la mise au point du cytométre pour l’étude des mélanges de bactéries
- Étude du transport des bactéries et des métaux seuls ou en mélange dans une colonne de sable
- Modélisation du transfert
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Conclusions
• Mise au point de la cytométrie en flux:
– Résultats préliminaires prometteurs (forme de la courbe de percée,mise au point à affiner)
• Étude du transfert accéléré des métaux
– 1 sable peu réactif accélération du transfert
– 1 sable trop réactif remobilisation des polluants
32
MERCI DE VOTRE ATTENTION
Remerciements:
Erwann, Aline, Jean, Sylvie, Lorenzo, Véronique LTHE
Sarah Bureau LGCA
Géraldine Sarret, Roland Hellmann