Download - Profil de Croissance Virale 1 Éclipse Temps # de virus Infection Latence Lyse Rendement de lyse
Profil de Croissance Virale
1
Éclipse
Temps
# de
viru
s
Infection
Latence
Lyse
Rendement de lyse
Rendement de Lyse
• Définition du rendement de lyse:– No de virus générés par une cellule infectée suite à
un cycle infectieux complet
• Paramètres: – La multiplicité d’infection (M.I.) est No de virus
infectieux disponible par cellule– La M.I. sert aussi à déterminer le No de cellules
infectées
2
Multiplicité d’Infection
•3
Nombre de cellules = 6
Nombre de virus = 4
M.I. = 4/6 = 0.67Ou
4 sur 6 cellules seront infectées
Multiplicité d’Infection
4
Nombre de cellules = 6
Nombre de virus = 10
M.I. = 10/6 = 1.6Ou
6 sur 6 cellules seront infectées
Calcul de la M.I.
• 108 cellules sont exposées à 104 virus – Quelle est la multiplicité d’infection?
• 104/108 = 10-4 Virus/cellule
• Combien de cellules seront infectées? • 104 cellules seront infectées
• Combien de cellules restent non-infectés?• 108-104 = approx. 108 cellules (et non 104)
5
Calcul du Rendement de Lyse
6
Nombre de cellules infectées = 4
Nombre de virus produit =10Ou
10 virus/4 cellulesDonc rendement de lyse = 2.5 virus produits/cellule
Calcul du Rendement de Lyse
• M.I.=0.0001; # de cellules = 108 ; Après 10 heures il y a 106 virus– Quel est le rendement de lyse?
• 0.0001 virus/cellule x 108 cellules = 104 virus ensuite le rendement de lyse est 106/104=100 virus/cellule
– Quelle est la multiplicité d’infection après le premier cycle infectieux?
• 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.0001 x 100 = 0.01.
7
Calcul du Rendement de Lyse (suite)
– Quelle est la multiplicité d’infection après le deuxième cycle infectieux?
• 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.01 x 100 = 1
– Quelle est No de cycle infectieux total? • 3 cycles
– Combien de virus sont produit à la fin du dernier cycle infectieux?
• Rendement x nombre total de cellule = 100 x 108
8
Énumération et Typage des Virus
• Compte direct– Détermine nombre de virus totaux
• Essai de plages– Détermine nombre de virus infectieux
• Essai d’hémagglutination– Détermine nombre total de virus– Possible seulement avec les virus hémagglutinant
• Qui possède l’hémmaglutinine – Ex. influenza• Infectieux et non infectieux
• Essai d’inhibition d’hémagglutination– Typage antigénique de virus hémagglutinants
9
Comptes Directs
• Coloration négative• Microscopie électronique• Ne distingue pas particules infectieuses de
non-infectieuses• Utile pour les virus qui ne peuvent pas être
crus en laboratoire• Utilise des billes à une concentration connue
pour estimer le volume du champ de vision
1010
Comptes Directs Viraux
11
Ajouter billes (104/mL)
Observer au microscope
10 billes dans un champDonc un champ = 1µL
21 virus dans un champDonc 21 virus/1µL = 2.1 X 104 virus/mL
Essai de Plages
• Infecter monocouches de cellules ou tapis bactériens avec différentes dilutions de virus
• Déterminer le nombre de plages pour chaque dilution– Chaque plage est le résultat d’une seule cellule
infectée par une seule particule virale• 1 UFP
12
Les Plages
• Effet cytopathique localisé– Lyse cellulaire
• Chaque plage représente un foyer d’infection– Chaque foyer d’infection est initié par une cellule
infectée
13
14
33 UFP/0.1ml d’une dilution de 10-4
Donc le titre de la suspension originale est:
330 33 3
Facteur de dilution
9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu
Préparation virale
3.3 X 106 UFP/mL3.3 X 106 UFP/mL
Essai d’Hémagglutination
• Mesure de la quantité minimale de virus requise pour agglutiner les globules rouges– 1 unité d’hémagglutination (UHA)
15
Hémagglutination complète
Hémagglutination partielle
Pasd’hémagglutination
≥1UHA < 1UHA 0 UHA
Essai d’Hémagglutination
16
1:8
1:2 1:21:21:21:2
8 16 32 64 128 256
virus
Dilution
Mélanger avec globules rouges
Titre = 32 UHA1:8
1:2 1:21:21:21:2
8 16 32 64 128 256
Vu de côté
Vu du haut
Essai d’Inhibition d’Hémagglutination
17
Anticorps anti-virus présentAnticorps anti-virus absent
Ac lie le virusLiaison du virus au GR
inhibéeVirus lient GR
HémagglutinationHémagglutination inhibé
Points importants à connaîtreCours_08 Nov 2013
• Les cellules sanguines– Connaître les noms– Leur origine– Les fonctions– Lieu d’action
• Phagocytose (les différentes étapes)• Les deux cascades du complément (en détail)
– Alterne– MB-Lectine (MBL)– Les sentiers communs et différents entre les 2 cascades
– Comprendre comment les antigènes sont présentés aux Lymphocytes
Cellules sanguines
19
Cellule souche hématopoïétique
Plaquettes
ÉrythrocytesÉosinophile
Neutrophile
Mégacaryocyte
Mastocyte
Basophile
Lymphocyte T
Cellule NK
Cellule dendritique
Lymphocyte B
Cellule progénitrice lymphoïde
Cellule myeloïde
progénitrice
Monocyte
MoelleOs
Macrophage
Cellules Polymorphonucléaires - Granulocytes• Cellules qui relâchent des granules
– Enzymes digestives, antiseptiques et initiateurs de la réponse inflammatoire
• Neutrophile– Cellule phagocytaire (cellules qui mangent)– Une concentration élevée indique d’une infection– Normalement ils restent dans système sanguin– Mais vont dans les tissus seulement s’il y a infection dans le tissu
• Éosinophile– Phagocytaire pour les complexes antigènes/anticorps (étiquettes)– Combats les infections parasitiques– Impliqué dans les réactions allergiques
• Basophile (dans le circulation)/Mastocyte (dans les tissus)– Initie et amplifie la réponse inflammatoire
20
Cellules sanguines
21
Cellule souche hématopoïétique
Plaquettes
ÉrythrocytesÉosinophile
Neutrophile
Mégacaryocyte
Mastocyte
Basophile
Lymphocyte T
Cellule NK
Cellule dendritique
Lymphocyte B
Cellule progénitrice lymphoïde
Cellule myeloïde
progénitrice
Monocyte
MoelleOs
Macrophage
Leucocytes Non Granulaires
• Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique– Cellules phagocytaires– Relâchent les initiateurs de la réponse
inflammatoire– Fait appel au système adaptatif (la 3ème ligne)– Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ou
cellules professionnelles• Molécule présentatrice - CMHII
• Cellules NK– Lymphocyte qui tue cellules infectées et tumorales22
Cellules sanguines
23
Cellule souche hématopoïétique
Plaquettes
ÉrythrocytesÉosinophile
Neutrophile
Mégacaryocyte
Mastocyte
Basophile
Lymphocyte T
Cellule NK
Cellule dendritique
Lymphocyte B
Cellule progénitrice lymphoïde
Cellule myeloïde
progénitrice
Monocyte
MoelleOs
Macrophage
Processus de la Phagocytose
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•Reconnaissance•PRR (TLR) – PMAP•Opsonines
•Ingestion•Formation de phagosome
•Fusion avec lysosome•Phagolysosome
•Digestion/Destruction•Enzymatique & Chimique
•Expulsion
Phagocytose - Conséquences
• Digestion enzymatique– Lysozyme, Lipases, Glycosidases, Protéases,
Nucléases• Destruction oxydative par radicaux libres
• Superoxide dismutase : 2O2- + H2O à H2O2 + O2.
• Myéloperoxidase: Cl- + H2O2 à hypochlorite (javel)
• Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire
• Synthèse et sécrétion de cytokines• Présentation sur CMHII (CPA seulement)
25
Cellules NK
• Le CMHI est exprimé sur toutes les cellules sauf les neurones et les globules rouges
• Tue cellules qui n’ont pas ou peu de CMHI– Cellules infectées par des virus– Cellules cancéreuses
• Deux récepteurs de surface• Récepteur inhibiteur (dominant sur le récepteur activateur)
– Interagit avec CMHI des cellules nucléées
• Récepteur activateur– Interagis avec glycoprotéines induites par le stress
26
NK
Action des Cellules NK
27
Cellule
NK CelluleInfectée
Récepteur inhibiteur
Récepteur activateur
CMHI
Protéine activatrice
CelluleSurvie
CelluleInfectée
Cascades du Complément• La réponse innée comporte deux cascades
– Alterne et MB-Lectine (MBL=Mannose Binding Ligand):• Implique une collection de protéines sériques (libre
dans le serum et inactives)– Protéines du complément:
• C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9– Protéines accessoires: B et P– Lectine qui lie le mannose qui se trouve seulement chez
les bactérie (Voie MBL)– Protéases: MASP-1 et MASP-2
• Initié par la liaison à des composantes communes à une grande variété de bactéries:– Alterne: Liaison de C3b à lipide A, acide téchoïque– MBL: Liaison de MBL au mannose des capsules
28
C9
C9
Voie Alterne
29Bactérie Gram Négative
C3 + H2O + C3b
C3b
Ba
PBBb
C3 Convertase
C3 C3aC3b
C3bC5 Convertase
C5C5a
C5b
+
C5b C6 C7
Complexe CAM
C3a
C8C9C
9C9C9
C9
C9
C9
•29
C9
C9
30
Voie de la MB-Lectine
30Capsule BactérienneC5b C6 C7 C8
C9C9
C9C9C9
C9C9
MBL
MASP1MASP2MASP2
C4
C4a
C4b
C4bC2a
C2
C2bC2a
C3 C3aC3b
C5C5a
C5b
+
Conséquences des Voies du Complément• Opsonisation (étiquettes indiquant que les pathogènes
doivent être détruits)– Liaison de C3b et C4b sur la bactérie
• Bactéries, virus et parasites• Anaphylatoxines (des alarmes)
– C3a et C5a• Activent granulocytes et monocytes
– Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire– Dégranulation– Recrutement des autres cellules dans la région
• CAM (pore)– Lyse osmotique
• Bactéries Gram négatives – Permet lysozyme d’atteindre la paroi
• Parasites – Perte de solutés31
Présentation & Activation
• La présentation par les CPA est faite seulement aux lymphocytes Ta
• Reconnaissance par les paratopes des RCT appropriés des lymphocytes Ta
– Les CPA sécrètent des cytokines activatrices (substances solubles que agissent sur d’autres cellules)
– Amplification clonale des Ta qui sont sélectionnées
– Donc la réponse acquise est initiée!32
Lymphocytes TA
• Récepteur cellulaire – RCT– Reconnaissance d’épitopes non-soi
présenté par le CMHII• Modes d’action: Sécrétion de cytokines pour
– Activer d’autres lymphocytes (Tc, B) et les CPA (Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique)
33
RCT
TA
CD4
Lymphocytes TA
• Un Lymphocyte TA possède des RCT avec un paratope capable de reconnaître un épitope associé au CMHII– Cette cellules reconnait seulement cet épitope toute
sa vie– Elle ne pourra pas reconnaitre d’autres épitopes
• Pour reconnaître un autre épitope on a besoin d’un autre lymphocyte TA avec un paratope spécifique pour ce nouvel epitope– C’est la raison pour laquelle on a un répertoire élevé
34
TACD4
Présentation aux Cellules TA
35
CD4TA
CD4TA
CD4TA
CD4TA
CD4TA
Amplification clonale
RCTParatope
CPA
CMHII
TACD4
3e Ligne-Le Système Adaptatif
• Caractéristiques:
– Spécifique
– Acquiert une mémoire après une première rencontre
– Capable d’apprendre et de s’améliorer suite à des infections subséquentes
– Contrairement ou système innée il fait la discrimination entre le “soi” et le “non-soi”
36
Deux Fronts
37
Extracellulaire• Réponse Humorale• Antigènes exogènes:
– Bactéries– Virus– Mycètes– Parasites– Toxines
Intracellulaire• Réponse Cellulaire• Antigènes endogènes:
– Quelques bactéries• Ex. Mycoplasmes• Mycobactérium
– Virus
Participants Cellulaires
• CPA– Lymphocytes B, monocytes, macrophages et cellules
dendritiques
• Lymphocytes Ta (T auxiliaire)– TH1: Réponse cellulaire (contre antigène endogène)– TH2: Réponse humorale (contre antigène exogène)
• Lymphocytes B – Réponse Humorale (contre antigène exogène)
• Lymphocytes Tc– Réponse cellulaire (contre antigène endogène)
38
La Réponse Humorale
1. Choisir un lymphocyte B avec un RCB qui reconnait un épitope de l’antigène
– C’est la sélection clonale2. Si l’antigène se lie à la RCB, l’endocytose du complexe
RCB-Ag se fait3. Ensuite il y a digestion du complexe RCB-Ag4. Présentation d’épitopes complexés sur le CMHII à des
cellules TH2 avec RCT approprié préalablement activées– Donc c’est la deuxième fois que la TH2 se fait présenter l’Ag
5. La TH2 secrète des cytokines pour activer le lymphocyte B6. Ensuite l’activation du lymphocyte B fait l’amplification
clonale et se différence en plasmocytes et cellule B mémoire
39
Lymphocytes B
• Un Lymphocyte B possède un RCB capable de reconnaître un épitope avec un paratope
• Le RCB est formé de 2 isotypes d’anticorps– IgM & IgD membranaire
• C’est une molécule présentatrice – Donc elle possède un CMHII
• Les lymphocytes B secrètent aussi des molécules effectrices (Anticorps)
– 5 isotypes: IgD, IgM, IgG, IgA, IgE40
RCBIgM & IgD membranaire
La Réponse Humorale
• Les plasmocytes secrètent des anticorps– Une cellule peu seulement produire des
anticorps avec un paratope (le même paratope que la cellule mère)
– Elle ne peut pas changer le paratope ni l’épitope qu’il reconnait
• Les cellules B mémoire gardent une mémoire pour l’épitope– Cela fait aussi que la représentation de cette
cellule est plus grande– Donc la prochaine réponse est plus rapide
41
La Réponse Humorale
42
Répe
rtoi
re d
e ly
mph
ocyt
es B
Naï
f
Antigène
TH2Activée
Activation
PP
PP
Plasmocytes
MM
B Mémoires
Amplification clonale et différentiationSécrétion d’Ac
ÉpitopesCMHIIRCB: IgM ou IgDCytokines
Les Anticorps (Immunoglobulines)
43
Chaîne lourde
Région variable
Région constanteLiens disulfures
Chaîne légère
Région variable
Région constante
Isotype
Idiotype
Sites de liaisons d’épitopes antigéniques
2 X Fab
1 X Fc
• Fab (Fragment Antigen Binding)– Région responsable de la reconnaissance de
l’épitope– N’est pas responsable de la fonction
• Fc (Fragment constant)– Région responsable de la fonction– N’est pas implique dans le reconnaissance
44
Les Anticorps (Immunoglobulines)
Immunoglobulines - Cinq Isotypes
45
• IgD
• IgM
• IgG
• IgA
• IgE
• Les cellules B peuvent produire 5 isotypes (Le mode d’action des Ac est déterminé par l’isotype)
• Mais seulement 1 idiotype (resposable de la reconnaissance de l’epitope)
Déterminé par la région ConstanteConfère fonctionnalité
IgD
• Monomère valence de 2– Peut reconnaitre 2 molecules d’un même epitopes
• Ac exclusivement membranaire– Pas secrété
• Ac de surface des cellules B• Represente le RCB
46
IgM
47
• Pentamère (valence de 10)• Anticorps de surface• RCB
– Forme membranaire mais peut être secrété
• Premier Ac sécrété• Fixation du complément• Agglutinant• Agit comme étiquette (ADCC) reconnue
par cellules NK
IgG
• Monomère (valence de 2)• Ac sérique prédominant
– Plus abondant dans le sérum
• Le seul que peut traverser le placenta– Donc peu protéger le fétus
• Fait la fixation du complément• Région Fc est une opsonine
– Reconnue par phagocytes
• Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules NK
48
IgA
• Dimère (valence de 4)• Principalement associé aux muqueuses
– Dans les orifices (la bouche, le nez, l’anus, etc..)
• Neutralisant et agglutinant
49
IgE
• Monomère– Secrété par les lymphocyte B
• Leurs régions Fc se lient aux membranes des macrophages, basophiles et mastocytes– Deviennent donc des Ac membranaires
• Impliqué dans les réactions allergiques– Ces cellules du système innée acquièrentdes récepteurs qui les rendent spécifiques
50
Modes d’Actions des Anticorps
51
• Agglutination
• Neutralisation
• Opsonisation
• ADCC
• Dégranulation des macrophages
• Fixation du complément– Voie classique du complément
IgM et IgA
IgM, IgA et IgG
IgG et IgM
IgG et IgM
IgE
IgM et IgG
Agglutination
52
• Favorise la phagocytose• Inactive l’envahisseur
Neutralisation
53
• Liaison à des composantes essentielles causant l’inactivation
Opsonisation par IgG ou IgM
54
• Régions Fc d’IgM et d’IgG sont des opsonines reconnues par les cellules phagocytaire– Le lysozyme tue toute les cellules dans l’environnement
ADCC
55
• Régions Fc d’IgM et d’IgG sont reconnues par des récepteurs des cellules NK– La destruction est ciblée (tue les cellules ciblées)
Dégranulation des Mastocytes par les IgE
56
IgE
Lysosome
Granules de médiateurs préformés
Récepteur de région Fc
Allergène
•Antigène (pas nécessairement une bactérie)
Voie Classique du Complément
57
C1qC1r C1s
Complexe C1C4
C4a
C4b
+
C4b
C2
C2a
C2a C2b+
C5 ConvertaseC3
C3b
C3a
+
C5bC6 C7C3b
C3 ConvertaseC5
C5a
C5b
+
C9
C9 C8
C9C9
C9C9C9
C9C9
Conséquences de la Voie Classique
• Opsonisation– C3b & C4b
• Analphylatoxines– C3a & C5a
• CAM– Lyse osmotique
58
Décours de la Réponse Humorale
59
Rencontre avec Ag
0 7 14 >30Jours après l’exposition
Nom
bre
de c
ellu
les
BSp
écifi
ques
à l’
antig
ène Reconnaissance
Présentation
B naïve
Élimination
Immunité
Mémoire
B mémoireB activé
Expansion Clonale
Activation
Réponses Immunes: 1re et 2e Rencontres
60
ÉlémentÉlément Réponse primaireRéponse primaire Réponse secondaireRéponse secondaire
Réponse maximale Plus faible Plus forte
Isotype d’Ac
Habituellement commence avec
IgM ensuite passe à IgG
Augmentation des IgG (on passe directement
à IgG)
Nombre d’antigène requis
Relativement élevée Faible
Latence Entre 10-21 jours Entre 1-3 jours
Types d’Immunités Humorales
61
Naturelle
Active Passive
Artificielle
Active Passive
Immun. Acquise Naturelle Active/Passive
• Exposition naturelle à l’antigène– En général se fait de façon naturelle
• Ex. Une infection
• Défense humorale active: – L’individu monte ses propres défenses – Mémoire acquise
• Défense humorale passive: – Réponse humorale chez hôte 1– Transfert naturel des Ac de hôte 1 à hôte 2– Pas de mémoire acquise
• Ex. IgG transmit dans le lait maternel62
Immun. Acquise Artificielle Active/Passive
• Exposition artificielle à l’antigène– En général se fait avec intervention humaine
• Ex. Vaccination, transfusion• Défense humorale active:
– L’individu monte ses propres défenses– Mémoire acquise
• Défense humorale passive: – Réponse humorale chez hôte 1– Transfère artificiel des Ac à un autre hôte
• Ex. Les antivenins; générés chez les chevaux et administré à l’homme
– Aucune mémoire acquise
63
• Pour des antigènes endogènes– Ag fabriqués à l’intérieur de la cellule
• Ex. une cellule infectée par un virus et qui fabrique les protéines du virus à l’intérieur
• Tout les antigènes endogènes sont présentés sur le CMHI
• Le CMHI présente les antigènes aux lymphocytes Tc
64
Réponse Acquise à Médiation Cellulaire
Réponse Acquise à Médiation Cellulaire
65
1. Choisir un lymphocyte Tc avec un RCT qui à le bon paratope pour reconnaitre un épitope de l’antigène associé au CMHI d’une cellule infectée
– Sélection clonale
2. Activation du lymphocyte Tc– Armement par cellules TH1 préalablement activées
• Reconnaissance par RCT approprié d’épitopes complexés au CMHII de CPA
– Amplification clonale– Tuer cellule infectée
Lymphocytes Tc
• Récepteur cellulaire – RCT– Reconnaissance du non-soi présenté par
CMHI– Un lymphocyte Tc possède un RCT capable
de reconnaître un épitope associé au CMHI
• Tc naïfs doivent être armés– Deux signaux sont requis :
• Reconnaissance par un RCT d’un épitope spécifique associé au CMHI
• Cytokines activatrices produites par TH166
RCT
TcCD8
Réponse à Médiation Cellulaire
• Habituellement initié par cellules dendritiques– Associées aux tissus connexes aux
surfaces externes• Poumons, peau, tractus gastro-
intestinal, etc.
– Possède des récepteurs qui permettent l’infection par la majorité des virus
– Expriment CMHI( ) et CMHII( )– Font la présentation d’antigènes
exogènes et endogènes67
Réponse à Médiation Cellulaire
68
Infection Présentation d’épitopes endogènes sur CMHI
Phagocytose
Présentation d’épitopes exogènes sur CMHII
T A
CD 4 Reconnaissance par RCT de TH1 - activation
T A
CD 4
TcCD8TcCD8
Reconnaissance par RCT de Tc - armement
TcCD8
TcCD8Tc
CD8TcCD8 Tc
CD8TcCD8
Amplification clonale de Tc armée
Attaque par les Cellules TC Armées
69
Survol des Réponses Immunes Acquises
70
Antigène
Phagocytose par CPA
Présentation d’épitopes
Activation de cellule T auxiliaire
Cellule T auxiliaire activéeEndocytose par cellule B
Plasmocytes
Anticorps
Infection cellulaire
Cellule T cytotoxique
Cellule T cytotoxique activée
Tuer
Réponse humorale Réponse cellulaire
Interaction des Systèmes Innée et Acquis
71
Immunité Innée
Barrières Physiques Barrières ChimiquesCellules
GranulocytesMonocytes et Macrophages
Cellules NK
Anticorps
Lymphocytes B Lymphocytes T
Immunité Acquise
Cytokines
CytokinesCyto
kine
s