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Spectrométrie de masse – Introduction
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Intérêts de la Spectrométrie de masse :
• Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions )
• Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions.
• Progrès technologique rapide
Spectrométrie de masse – Introduction - Principes
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- Un spectromètre comprend :
- Système d’introduction ( GC, LC , sas d’intro direct, … )
- Source d’ionisation
- Analyseur ( un ou plusieurs )
- Détecteur pour compter les ions
- Système de traitement de donnée
Introduction, GC, LC
Ionisation, EI, CI
ESI, APCI FAB, …
Analyseur SQ D,TQD,
EB, TOF Détecteur Logiciel
Spectrométrie de masse – Introduction - Principes
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Principes de la MS :
• 1er étape : Produire des ions
• La quantité de fragments produit dépend de la « force » de l’ionisation
Les ions sont ensuite séparés d’après leur masse et leur charge dans le système dispersif
Ils sont ensuite détectés.
Introduction, GC, LC
Ionisation, EI, CI
ESI, APCI FAB, …
Analyseur SQ D,TQD,
EB, TOF Détecteur Logiciel
Spectrométrie de masse – Analyse de Biomolécules
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- Electrospray (ESI)
Ion moléculaire ou pseudo-moléculaire
Ion pseudo-moléculaire :
En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)+ (masse : M+1, charge+1)
En mode négatif : perte d’un proton : (M-H)- (masse : M-1, charge -1)
Electrospray
Spectrométrie de masse - QQQ
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- MS : mode « Full scan »
Balayage d ’Ions moléculaires
Balayage d ’ions fragments
Introduction, GC, LC
Ionisation, EI, CI
ESI, APCI FAB, …
Analyseur SQ D,TQD,
EB, TOF Détecteur Logiciel
- MS : mode « Product ION »
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- MS : mode « Full scan »
Balayage d ’Ions moléculaires
Principaux isotopes en chimie organique
Elément isotope % Masse isotopique
isotope % Masse isotopique
isotope % Masse isotopique
Masse moyenne
C 12C 100 12.0000 13C 1.1 13.0033 12.011
H 1H 100 1.0078 2H 0.015 2.0140 1.0079
N 14N 100 14.0031 15N 0.37 15.0001 14.0067
O 16O 100 15.9949 17O 0.04 16.9991 18O 0.20 17.9992 15.9994
S 32S 100 31.9721 33S 0.789 32.9715 34S 4.44 33.9679 32.066
F
Cl
19F
35Cl
100
100
18.9984
34.9688
37Cl
31.98
36.9659
35.453
Br 79Br 100 78.9183 81Br 97.28 80.9163 79.904
Massifs isotopiques complexes
Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl
En Conclusion :
analyse de spectres de masse 10
Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre
Pour des molécules de masse < 500 Da :
L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :
M+1/M ≈ (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100
L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne sur la présence d’éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :
Spectrométrie de masse – Analyse de Biomolécules
Q1 Q2 Q3
Source ESI
Détecteur
Spectrométrie de masse - QQQ
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- Possibilité de la spectrométrie de masse pour l’analyse de biomolécules.
- MS², quantification.
Balayage d ’Ions moléculaires
Balayage d ’ions fragments
Spectre “Produit” de l’Atrazine à Ce =5, 19,33,47 eV
Spectre “Produit” de l’Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 eV
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Transition M.R.M pour l’ATRAZINE et son étalon interne
MRM Compound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage Polarity ATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 179.1 Unit 200 120 17 7 Positive ATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 69.1 Unit 200 120 41 7 Positive ATRAZINE False 216.1 Unit 174.1 Unit 200 110 13 7 Positive ATRAZINE False 216.1 Unit 104 Unit 200 110 29 7 Positive
Spectrométrie de masse – Quantification
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La sensibilité = recherche de la limite de détection(LOD) et Quantification (LOQ).
En analyse Qualitative, la LOD est la quantité minimal d’échantillon nécessaire à l’obtention d’un spectre de masse de qualité.
En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d’une molécule par rapport au bruit de fond.
LOD = 3 S/N
LOQ = 10 S/N
Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ :
- Paramètre de source du spectromètre de masse
- La technique d’ionisation
- les solvants et tampon en ESI
Spectrométrie de masse – Analyse de Biomolécules
MRM, des limitations … 1. La molécule doit s’ioniser, surtout en ESI 2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop 3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu’à 6 (TQD ) 4. Précision des mesures : 10% 5. LOD , LOQ variable en fonction des molécules, des appareil et des modes
d’acquisition. 6. Répétabilité des aires : mauvais d’un jour à l’autre
1. lié à l’encrassement 2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ). On préfère toujours la solution de l’étalon interne à la courbe de calibration
externe Idéalement, l’étalon interne est la molécule marqué iso topiquement (
Testostérone D3, Carnitine D3.
Spectrométrie de masse – Quantification
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La spécificité est obtenu par :
- La purification de l’échantillon
- Extraction ( liquide liquide )
- SPE / MIP
- La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d’intêret et ciblage d’ion caractéristique de masse supérieur.
- Le spectromètre de masse.
- Augmenter la résolution
- R= 2000 TQD
- R= 20 000 Q-TOF
- - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ) .
HPLC : colonne type C18 2.1 x 100 mm, 1.9µm
Debit 450µl/min Temps B%
Solvant A H2O 0.1% FA 0 10
Solvant B Acétonitrile 6 90 7 90
7.01 10 8 10
QQQ. Vcap 3500 V GAS Temp 350 °C Drying gaz 12 L/min Nebuliseur 45 psi Fragmenteur 120 V ESI Positif
Qualitatif
1. Définir les Transitions MRM -> Spectre « Produit » 1. Isolation de la molécule sur MS1 2. Fragmentation sur MS2 ( chambre de collision à l’Azote) 3. Définition des fragments ( intérêt et intensité) pour la quanti et la qualification.
2. Définir les paramètres optimaux de sources. 3. Réaliser la Courbe de calibration
1. Toujours la même quantité d’étalon interne dans les 200µl 2. Faire varier la quantité
4. Comparer le rapport de l’aire de l’atrazine / Aire de l’atrazine D5.
Quantitatif
IS-1 ( 2mg/L) : Diluer 100µl IS-0 (19mg/L) dans 900µl MEOH
Courbe étalon : -Préparer les LEVEL : 20,10,5,2,0.5,0.1ng dans 200µl de MeOH - Recalculer la concentration réel après ajout IS. Mélanger : -180µl solution STD-Lx - 20µ solution IS-1
-Injecter 20µl en LC-MSMS
Echantillon : - Prélever 250 ml Eau de ville - Ajouter 20 µl IS-1
SPE – C18 : - Equilibrer : 2x5 ml Acétone , 2x5ml H2O MilliQ - Percolation : 250 ml D’eau +IS - Lavage : 6 ml H2O MilliQ - Séchage 10 min - Elution : 3x3 ml Acétone dans ballon
Evaporation: - Evaporation sous vide
Reprise: - Reprendre par 200 µl de MeOH
LC-MS/MS: - Injecter 20µl en LC-MSMS
Quantitatif
1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d ’étalon interne. 2. Concentré l’échantillon avec la même quantité d’étalon interne que pour la calibration 3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d’étalon interne.
Cpd # Formula RT Mass [M+H]+
DEDIA C3H4N5Cl 145.0155 146.0227
DIA C5H8N5Cl 173.0468 174.0540
DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697
ATRAZINE C8H14N5Cl 5.01 215.0938 216.1010
ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl 5.02 220.1252 221.1324
Quantitatif
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