Une nécessité

Identification bactérienne

De la galerie Api à la spectrométrie de masse

Xavier NASSIF

Identification bactérienne : pourquoi ?

Identification des infections

Optimisation de la prise en charge du patientChoix de l’antibiogrammeTraitement probabilisteLecture interprétative de l’antibiogramme

Epidémiologie

Contrôle des épidémiesLutte contre les infections nosocomiales

Challenge : rapidité, spécificité, faible coût

Agents pathogènes / agents commensaux

3

Technique de spectrométrie MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight) et identifcation bactérienne

�1°étape: la formation d’un cristal entre l’échantillon à analyser (une colonie de l’espèce de pathogène) et une matrice organique sur une surface métallique;

�2°étape: la surface du cristal est irradiée avec un faisceau laser;

�La 3°étape: Les pics dominants sont extraits.

4

Le spectre est fonction de l’espèce bactérienne

S. aureus

S. epidermidis

S. Saprophyticus saprophyticus

S. warneri

S. haemolyticus

Limitation de l’emploi de la spectrométrie de masse pour l’identification bactérienne

= identification des pics spécifiques d ’espèce

5

La réduction du temps d’identification: un avantage essentiel

Prélèvement chez le patient

Culture Identification bactérienne et/ou antibiogramme

Prélèvement chez le patient

Culture Identification bactérienne

(en quelques minutes)J+1

Aujourd’hui - Systèmes Automatisés

Andromas – MALDI-TOFAndromas – MALDI-TOF

J+2J+1

La bactérie est identifiée pratiquement 12 heures plus tôt

qu’avec le « Gold Standard »d’aujourd’hui

6

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Exemple: S. hominis hominis – Pics constants > 0,1

7

Souches sélectionnées pour la réalisation des databases

S. aureusMicrococcus luteusMicrococcus lentusS. epidermidisS. w arneriS. xylosusS. intermedi usS. haemolyticusS. saprophyticus su b sp saprophytic usS. saprophyticus su b sp bovisS. lugdunensisS. hominis su b sp hominisS. hominis su b sp novobiosepticusS. capitis su b sp capitisS. capitis su b sp ureolyticusS. capraeS. pasteuriS. cohni su b sp cohniS. cohni su b sp urealyticumS. schei f eri su b sp schei f eriS. schei f eri su b sp coagulansS. sciuri su b sp sciuriS. simulans

8

Database:

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9

Bacteria Graphic Profile Data Base

10

Species Strain Micrococcus luteus CIP A270 S. epidermidis 81 clinical isolates S. warneri CIP 106511 CIP 8165 6 clinical isolates S. xylosus CIP 103720 CIP 104065 S. intermedius CIP 81.60 S. h aemolyticus CIP 104114 13 clinical isolates S. saprophyticus subsp saprophytic u s CIP 76.12 5 T CIP 103545 S. saprophyticus subsp bovis CIP 105262 CIP 105261 S. saprophyticus spp * 6 clinical isolates S. lugdunensis CIP 103584 S. hominis subsp homi nis CIP 81.57 CIP 104689 S. hominis subsp novobiosepticus CIP 105719T S. hominis spp * 10 clinical isolates S. capitis subsp capitis CIP 103688 S. capitis subsp ureolyticus CIP 104192T S. caprae CIP 104000T CIP 104520 S. pasteuri CIP 105540T CI P 103830 CIP 103832 S. cohni subsp urealyticum CIP 104024T CIP 104025 S. scheiferi subsp coagulans CIP 104366 S. sciuri subsp sciuri CIP 8162T CIP 103583 CIP 103825 S. aureus 68 clinical isolates

212 souches cliniques testées

11

Collaboration avec le Dr Ronco (Hopital Raymond Poincaré, Garches)et le Dr Sivadon (Hôpital Ambroise Paré, Boulogne Billancourt)

234 souches cliniques de SCoN

20 espèces différentes

Gold standard sodA

Systèmes automatisésMALDI-TOF-MS

BD Phoenix

Vitek-2

Banques d’identification Necker

Comparaison de trois systèmes d’identification

12

DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%)S. auricularis (1) y 1 (100) y 1 (100)S. capitis (20) y 20 (100) y 20 (100)S. caprae (14) y 13 (92.9) 1 (7.1) y 9 (64.3) 5 (35.7)S. cohnii (15) y 14 (93.3) 1 (6.7) y 10 (66.7) 5 (33.3)S. epidermidis (56) y 56 (100) y 50 (89.3) 6 (10.7)S. haemolyticus (14) y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1) y 14 (100)S. hominis (29) y 29 (100) y 20 (69) 9 (31)S. intermedius (1) y 1 (100) y 1 (100)S. lugdunensis (14) y 14 (100) y 13 (92.9) 1 (7.1)S. pasteuri (12) y 10 (83.3) 2 (16.7) y 5 (41.7) 7 (58.3)S. saprophyticus (12) y 12 (100) y 11 (91.7) 1 (8.3)S. schleiferi (2) y 2 (100) y 2 (100)S. sciuri sciuri (1) y 1 (100) y 1 (100)S. simulans (14) y 14 (100) y 11 (78.6) 3 (21.4)S. warneri (16) y 16 (100) y 8 (50) 8 (50)S. xylosus (3) y 3 (100) y 3 (100)S. equorum (1) n 1 (100) y 1 (100)S. condimenti (1) n 1 (100) n 1 (100)S. piscifermentans (2) n 2 (100) n 1 (50) 1 (50)S. saccharolyticus (6) n 6 (100) n 4 (66.7) 2 (33.3)Total all strains (234) 218 (93.2) 4 (1.7) 12 (5.1) 177 (75.6) 54 (23.1) 3 (1.3)

Species (Nb)MALDI Phoenix

DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) Low Id (%)S. auricularis (1) y 1 (100)S. capitis (20) y 12 (60) 3 (15) 1 (5) 4 (20)S. caprae (14) y 14 (100)S. cohnii (15) y 13 (86.7) 2 (13.3)S. epidermidis (56) y 52 (92.9) 4 (7.1)S. haemolyticus (14) y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)S. hominis (29) y 25 (86.2) 3 (10.4) 1 (3.4)S. intermedius (1) y 1 (100)S. lugdunensis (14) y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1)S. pasteuri (12) y 2 (16.7) 10 (83.3)S. saprophyticus (12) y 10 (83.4) 1 (8.3) 1 (8.3)S. schleiferi (2) y 1 (50) 1 (50)S. sciuri sciuri (1) y 1 (100)S. simulans (14) y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)S. warneri (16) y 9 (56.3) 3 (18.7) 4 (25)S. xylosus (3) y 3 (100)S. equorum (1) y 1 (100)S. condimenti (1) n 1 (100)S. piscifermentans (2) n 2 (100)S. saccharolyticus (6) n 6 (100)Total all strains (234) 176 (75.2) 32 (13.7) 2 (0,9) 24 (10.3)

Species (Nb)VITEK-2

Résultats de la comparaison de trois systèmes d’identification (1/2)

13

DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%)1 S. auricularis (1) y 1 (100) y 1 (100)2 S. capitis (20) y 20 (100) y 20 (100)3 S. caprae (14) y 13 (92.9) 1 (7.1) y 9 (64.3) 5 (35.7)4 S. cohnii (15) y 14 (93.3) 1 (6.7) y 10 (66.7) 5 (33.3)5 S. epidermidis (56) y 56 (100) y 50 (89.3) 6 (10.7)6 S. haemolyticus (14) y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1) y 14 (100)7 S. hominis (29) y 29 (100) y 20 (69) 9 (31)8 S. intermedius (1) y 1 (100) y 1 (100)9 S. lugdunensis (14) y 14 (100) y 13 (92.9) 1 (7.1)

10 S. pasteuri (12) y 10 (83.3) 2 (16.7) y 5 (41.7) 7 (58.3)11 S. saprophyticus (12) y 12 (100) y 11 (91.7) 1 (8.3)12 S. schleiferi (2) y 2 (100) y 2 (100)13 S. sciuri sciuri (1) y 1 (100) y 1 (100)14 S. simulans (14) y 14 (100) y 11 (78.6) 3 (21.4)15 S. warneri (16) y 16 (100) y 8 (50) 8 (50)16 S. xylosus (3) y 3 (100) y 3 (100)

Total database species only (224) 218 (97.4) 3 (1.3) 3 (1.3) 177 (79) 47 (21) 0 (0)

Species (Nb) MALDI Phoenix

1 S. auricularis (1)2 S. capitis (20)3 S. caprae (14)4 S. cohnii (15)5 S. epidermidis (56)6 S. haemolyticus (14)7 S. hominis (29)8 S. intermedius (1)9 S. lugdunensis (14)

10 S. pasteuri (12)11 S. saprophyticus (12)12 S. schleiferi (2)13 S. sciuri sciuri (1)14 S. simulans (14)15 S. warneri (16)16 S. xylosus (3)

Total database species only (224)

Species (Nb) DB Id (%) Mis Id (%) No Id (%) Low Id (%)y 1 (100)y 12 (60) 3 (15) 1 (5) 4 (20)y 14 (100)y 13 (86.7) 2 (13.3)y 52 (92.9) 4 (7.1)y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)y 25 (86.2) 3 (10.4) 1 (3.4)y 1 (100)y 12 (85.8) 1 (7.1) 1 (7.1)y 2 (16.7) 10 (83.3)y 10 (83.4) 1 (8.3) 1 (8.3)y 1 (50) 1 (50)y 1 (100)y 11 (78.6) 2 (14.3) 1 (7.1)y 9 (56.3) 3 (18.7) 4 (25)y 3 (100)

176 (78.6) 23 (10.3) 2 (0.9) 23 (10.3)

VITEK-2

Résultats de la comparaison de trois systèmes d’identification (2/2)

14

� Bases de données

� Cocci Gram + catalase positive � Cocci Gram + catalase négative � Cocci Gram négatif� Bacilles Gram + � Bacilles Gram - oxydase -� Bacilles Gram - oxydase +� Bacilles Gram - ne cultivant pas sur milieux ordinaires� (Anaérobies stricts)� (Campylobacter/Helicobacter)� (Mycobactéries)� Champignons filamenteux� Levures

Edification des bases de données

15

3 étapes

�Edification des bases de données (Choix des espèces bactériennes à inclure dans chaque base)

�Validation des bases de données (rassembler une collection de souches dont l’identification est certaine et nécessité de plusieurs souches par espèces)

�Passage en routine

16

En fonction des résultats de la validation, création de databases supplémentaires pour certaines espèces ou certains milieux de culture.

Espèces très proches :

création de « sous-databases » avec mise en évidence d’un ou plusieurs

pics spécifiques d’espèce: nécessité d ’un grand nombre de souches

cliniques parfaitement caractérisées.

� Les différentes espèces du complexe Burkholderia cepacia

� Streptocoques oraux : en cours (vérification des identifications par BM : SOD + rpoB)

Enterococcus spp : spectres de faible amplitude sur milieux Uri 4

Enterobacter spp : spectres de faible amplitude sur milieux ESBL

� construction des databases « URI4 » et « ESBL »

17

Incorporation de la technique MALDI-TOF dans la routine du laboratoire depuis janvier 2009

18

Secteur 1 Secteur 2 Secteur 3

19

Saisie automatique des n°de dossiers dans le spectromètre grâce àune douchette de codes barre

20

Analyse des hémocultureset des bouillons d’enrichissement des liquides articulaires

� Méthode � Prélèvement de 1 ml de bouillon à partir d’un flacon d’hémoculture positive

� Action d’un détergent

� Lavage à l’eau puis analyse MALDI-TOF

� Essais effectués sur des bouillons artificiellement ensemencés puis sur des hémocultures positives de malades� S. aureus

� staphylocoques à coagulase négative

� P. aeruginosa (création d’une base « hémoculture »)

� K.pneumoniae

� E. faecalis

� K. kingae

Identification des germes dans 100% des cas

� Actuellement � Poursuite des tests sur d’autres bactéries

� passage systématique des hémocultures positive à J0 et comparaison des identifications MALDI J0 - culture J1

21

Les principaux avantages de l’identification des pathogènes par spectrométrie de masse

� La rapidité

� La généralisation

� La flexibilité

� L’accès au diagnostic pour certains pathogènes (Champignons)

22

Remerciements

Maldi team

P. BercheJL. BerettiA. FerroniM.E BougnouxS. CottynB.DauphinN.DegandJ. MeyerX.Nassif

LogicielsV. BerettiE. Frapy

Collaborations

R. CourcolJL. GaillardA. Le MonnierJL. HerrmannC. PoyartE. RoncoM. SimonetV. Sivadon

Plateforme ProtéomeA. Edelman