la quantification en spectrométrie de masse triple...
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La quantification en spectrométrie de masse triple
quadripôles
Gilles Valette
Plate forme d’analyse et de caractérisation: PAC
• 1 ‐ Diffraction X / Diffusion X / Fluorescence X• 2‐ Spectrométrie infrarouge et RAMAN• 3 ‐ Calorimétrie et analyses thermiques• 4 ‐ Spectrométrie Mössbauer• 5 ‐ Spectrométrie de photoélectrons• 6 ‐Magnétisme, résonance paramagnétique électronique• 7 ‐Microscopies électronique et en champ proche• 8 ‐ Analyses texturales et propriété de surface• 9 ‐ Résonance magnétique nucléaire ‐ liquide et solide• 10 ‐ Analyses élémentaires, mesures chiroptiques• 11 ‐ Spectrométrie de masse
2A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ?
Plate forme d’analyse et de caractérisation: PAC
• 1 ‐ Diffraction X / Diffusion X / Fluorescence X• 2‐ Spectrométrie infrarouge et RAMAN• 3 ‐ Calorimétrie et analyses thermiques• 4 ‐ Spectrométrie Mössbauer• 5 ‐ Spectrométrie de photoélectrons• 6 ‐Magnétisme, résonance paramagnétique électronique• 7 ‐Microscopies électronique et en champ proche• 8 ‐ Analyses texturales et propriété de surface• 9 ‐ Résonance magnétique nucléaire ‐ liquide et solide• 10 ‐ Analyses élémentaires, mesures chiroptiques• 11 ‐ Spectrométrie de masse
3A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ?
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ?
4Nacelle 11: Spectrométrie de masse6 appareils
Nacelle 10: Analyses élémentaires, mesures
chiroptiques‐ Dichroisme circulaire – 2 Analyseurs CHNSO
‐ Polarimètre
Nacelle 9:
RMN liquide‐ 600‐ 500
‐3 x 400
Le Laboratoire de Mesures Physiques – Bâtiment 17 RdC
Karine ParraAurélien Lebrun
Magalie Lefeuvre
Guillaume CazalsGilles Valette
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ?
5Nacelle 11: Spectrométrie de masse6 appareils
Nacelle 10: Analyses élémentaires, mesures
chiroptiques‐ Dichroisme circulaire – 2 Analyseurs CHNSO
‐ Polarimètre
Nacelle 9:
RMN liquide‐ 600‐ 500
‐3 x 400
Le Laboratoire de Mesures Physiques – Bâtiment 17 RdC
Karine ParraAurélien Lebrun
Magalie Lefeuvre
Guillaume CazalsGilles Valette
Nacelle11 : Spectrométrie de Masse
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 6
Synapt G2S‐ Sources ESI, ASAP‐ Analyseurs Q‐Tof‐MS et HRMS
‐MSMS‐Mobilité ionique
Analyses structurales
Amazon Speed‐ Source ESI
‐ Analyseur trappe d’ion‐MS
‐MSn (n = 11)Analyses
structurales
RapifleX– Source MALDI‐ Analyseur: TOF
‐MS, MSMS, HRMS et imagerieAnalyses
structurales et imagerie
GCMS: FOCUS‐ Source EI
‐ Analyseur : Q‐MS
Analyses qualitatives
(bibliothèques de spectres) et quantitatives
Nacelle11 : Spectrométrie de Masse
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 7
TSQ Quantum Ultra‐ Source ESI
‐ Analyseurs TQ‐MS et MSMS
‐ Analyse en mode SIM ou MRM
Analyses Quantitatives
8050‐ Source ESI
‐ Analyseur TQ‐MS et MSMS
‐ Analyse en mode SIM ou MRM
Analyses Quantitatives
La spectrométrie de masse : Nobélisée
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 8
Dr FennESi
Dr TanakaMALDI
Prix Nobel de Chimie en 2002
Rappel sur la spectrométrie de masse
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 9
Définition:
La spectrométrie de masse est une technique physique d’analyse permettant de détecter et
d'identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse, et de caractériser leur structure
chimique grâce à leur fragmentation. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse
de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). C’est une
balance moléculaire. Elle est utilisée dans pratiquement tous les domaines scientifiques :
physique, astrophysique, chimie en phase gazeuse, chimie organique, dosages, biologie,
médecine ...
Schéma d’un spectromètre de masse
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 10
Source Analyseur Détecteur Enregistreur
Création des ions à l’état gazeux
(ESI; MALDI; EI; FAB, … )
Séparation des ions en fonction
du rapport masse/charge (Quadripôles, trappe d’ion,
temps de vol, …)
Comptages des ions
Traitement informatique –Visualisation des
spectres
Source de type ESI (electrospray)
• Mode d’ionisation douce: pas de fragmentation en source
• Formation d’ion multichargé: [M+nH]n+/n ; [M‐nH]n‐/n ; …
• pas besoin d’analyseur ayant une gamme de masse étendue:
compatible avec les analyseurs de type quadripôles;
• Nécessite la mise en solution des échantillons : permet le couplage
direct de la chromatographie liquide ou l’électrophorèse capillaire
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 11
Analyseur de type quadripôle (1)
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 12
• Un quadripôle est constitué de 4 électrodes métalliques parallèles raccordées électriquement 2 à 2, de section idéalement hyperbolique.
• La stabilité des ions dans le quadripôle dépend des paramètres U et V.
Analyseur de type quadripôle (2)
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 13
Selon les valeurs de U et de V, certains ions adoptent des trajectoires stables et peuvent êtres détectés, d’autres vont mourir sur les barres du quadripôles.
Avantage de l’analyseur quadripolaire
• Le contrôle de U et de V est aisée et permet une grande vitesse de
balayage;
• Le passage de l’ionisation positive à négative (et l’inverse) est aisée et
peut être pulsé;
• Appareils peu couteux.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 14
Spectromètre de masse simple Quad
• 2 modes d’utilisation:
‐ Full scan
‐mode SIM (single Ion monitoring)
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 15
Spectromètre de masse simple Quad
• Mode: full scan
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 16
Full scan: l’analyseur est scanné de manière séquentielle pour qu’un seul rapport m/z à la fois arrive au détecteur
Spectromètre de masse simple Quad
• Mode SIM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 17
Un ion cible de rapport m/z donné est
recherché. Le mode SIM sur un quadripôle
permet d’obtenir la meilleure sensibilité pour la
quantification.
Problème dans les matrices complexes, il peut
y avoir des ions de même masses provenant de
ses matrices → manque de sélectivité
Spectromètre de mase MSMS
• Technique mise au point par Beynon et Cooks d’une part et Mac
Lafferty d’autre part,
• Constituée de 3 étapes :
sélection d’un ion à fragmenter;
Fragmentation de l’ion sélectionné;
Analyse des ions issus de la fragmentation.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 18
Spectromètre de mase MSMS
• Trois catégories d’instruments:
La MS/MS dans l’espace (deux analyseurs séparés par une cellule de
collision tel que :TripleQ, Q‐ToF, …)
La MS/MS dans le temps (un seul analyseur tel que : trappe ionique,
FTICR)
Post‐Source Decay qui est une catégorie hybride des deux premières et
que l‘on retrouve sur les instruments de type maldi‐tof,
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 19
Spectromètre de mase MSMS
• Trois catégories d’instruments:
La MS/MS dans l’espace (deux analyseurs séparés par une cellule de
collision tel que :TripleQ, Q‐ToF, …);
La MS/MS dans le temps (un seul analyseur tel que : trappe ionique,
FTICR);
Post‐Source Decay qui est une catégorie hybride des deux premières et
que l‘on retrouve sur les instruments de type maldi‐tof.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 20
Schéma général d’un spectromètre en tandem
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 21
Source Q1 Cellule de collision Q3 Détecteur Enregistreur
Formation des ions à l’état gazeux
Sélection de l’ion de masse
m/z
Fragmentation en ion fils
Séparation des ions en fonction du rapport m/z
Comptage des ions
Traitement et visualisation des spectres
La cellule de collision
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 22
ArQ1 Q3
Différents mode d’utilisation d’un TQ
• Le balayage des ions fragments (Product ion scan);
• Le balayage des ions parents (precursor ion scan);
• Le balayage en perte de neutre (neutral loss scan);
• La Multi reaction monitoring (MRM).
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 23
Le balayage des ions fragments
Permet d’identifier une substance inconnue dans un mélange complexe.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 24
S Q1 Q2 Q3 D
M+
P1+
P2+
P3+
Le balayage des ions parents
Permet d’identifier une famille de molécule ayant une partie de leur structure similaire.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 25
S Q1 Q2 Q3 D
M1+
F+M2+
M3+
Le balayage en perte de neutre
Permet d’identifier une famille de molécule ayant une partie de leur structure chimique similaire.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 26
S Q1 Q2 Q3 D
M1+
M2+ ‐ nM2
+
M3+
M1+ ‐ n
M3+ ‐ n
Le mode Multi Reaction Monitoring (MRM).
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 27
S Q1 Q2 Q3 D
M+ P2+
Le mode Multi Reaction Monitoring (MRM).
Permet de quantifier simultanément de très nombreux composes.
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 28
S Q1 Q2 Q3 D
M+ P2+
La sélectivité en mode MRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 29
La sélectivité en mode MRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 30
269 → 181
La sélectivité en mode MRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 31
269 → 181
269 → 181
Sensibilité: Full scan, SIM et MRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 32
Détection de pesticides dans un extrait de sol en full scan
Sensibilité: Full scan, SIM et MRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 33
Détection de pesticides dans un extrait de sol en full scan
En mode SIM
Sensibilité: Full scan, SIM et MRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 34
Détection de pesticides dans un extrait de sol en full scan
En mode SIMEn mode MRM
SIM vsMRM
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 35
MRM : + sensible+ sélectif
L’étalonnage interne
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 36
• Réponse d’un TQ par toujours proportionnel
L’étalonnage interne
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 37
• Réponse d’un TQ par toujours proportionnel à la concentration de l’analyte cible
Nécessité d’un étalonnage interne
Principe de l’étalonnage interne
• Ajout en quantité parfaitement connue de l’étalon interne dans tous
les échantillons
• Le dosage se fait de façon relative: Signal du composé/Signal de
l’étalon en fonction du rapport des concentrations
[composé]/[l’étalon]
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 38
Propriété d’un bon étalon interne
Ne doit pas se trouver dans l’échantillon
Etre distinguables des analytes cibles
Avoir des propriétés physiques et chimiques proches
Idéalement: la molécule marquée au 13C, 15N ou 2H
A quoi sert la spectrométrie de masse triple quadripolaire ? 39